ES2587352T3

ES2587352T3 - Procedimiento para preparar L-aminoácidos usando cepas de la familia Enterobacteriaceae

Info

Publication number: ES2587352T3
Application number: ES04803898.8T
Authority: ES
Inventors: Mechthild Rieping
Original assignee: Evonik Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2003-12-24
Filing date: 2004-12-15
Publication date: 2016-10-24
Anticipated expiration: 2024-12-15
Also published as: WO2005064001A2; EP1697531B1; DK1697531T3; HUE029884T2; EP1697531A2; DE10361192A1; PL1697531T3; WO2005064001A3

Abstract

Un microorganismo recombinante de la familia Enterobacteriaceae que ya produce L-aminoácidos y que contiene un ORF de yodA sobreexpresado y que produce L-aminoácidos de una manera mejorada en comparación con los microorganismos que no son recombinantes para el ORF de yodA y que no contienen ningún ORF de yodA potenciado.

Description

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Las secuencias de nucleótidos para el ORF de yodA son conocidas asimismo a partir de Shigella flexneri, que también pertenece a la familia Enterobacteriaceae.

Se describe el ORF de yodA de Escherichia coli K12, entre otros, por los siguientes datos:

Denominación:: marco abierto de lectura

Función:: referida como que es una proteína de unión a metal putativa; expresión aumentada en relación a cadmio y tensión de peróxido de hidrógeno

Descripción:: el marco abierto de lectura de yodA codifica una proteína de 24,8 KD; el punto isoeléctrico es 5,9; estando localizado de manera cromosómica, está presente, por ejemplo en el caso de Escherichia coli K12 MG1655, en la región intergénica entre el marco abierto de lectura b1972, que codifica una proteína de membrana putativa y el ORF de yodB, que codifica un citocromo b putativo

Referencias:: Blattner et al., Science 5; 277 (5.331): 1.453-1.474 (1.997).

imagen4: Puskarova et al., Microbiology 148 (PT 12): 3.801-3.811 (2.002),

imagen5: David et al., Acta Crystallographica Section D. Biological Crystallography 58 (PT 7): 1.243-1.245 (2.002),

imagen6: David et al., The Journal of Biological Chemistry 278 (44): 43.728-43.735 (2.003)

Nº Acceso:: AE000288

Nombre del gen alternativo:: b1973

5 Las secuencias de ácidos nucleicos se pueden obtener de las bases de datos que pertenecen al Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI, por sus siglas en inglés) de la Biblioteca Nacional de Medicina (Bethesda, MD, USA), de la base de datos de secuencias de nucleótidos que pertenece a los Laboratorios Europeos de Biología Molecular (EMBL, Heidelberg, Alemania y Cambridge, RU) o de la base de datos de ADN japonesa (DDBJ, Mishima, Japón).

10 Para mayor claridad, se proporciona la secuencia de nucleótidos conocida del ORF de yodA de Escherichia coli en la SEC ID Nº 3 y la secuencia conocida para yaaU-ORF de Shigella flexneri (AE015219) en la SEC ID Nº 5. Las secuencias de aminoácidos de las proteínas codificadas por estos marcos de lectura se representan como SEC ID Nº 4 y, respectivamente, SEC ID Nº 6.

Los marcos abiertos de lectura descritos en el texto proporcionado se pueden usar según la invención. Es posible

15 además usar alelos de los genes o marcos abiertos de lectura que resultan de la degeneración del código genético o como resultado de mutaciones de sentido funcionalmente neutro. Se prefiere el uso de genes endógenos o marcos abiertos de lectura endógenos.

“Genes endógenos” o “secuencias de nucleótidos endógenos” se entiende que son los genes o marcos abiertos de lectura o alelos o secuencias de nucleótidos que están presentes en la población de una especie.

20 Se describe que los alelos adecuados del ORF de yodA que contienen mutaciones de sentido funcionalmente neutras incluyen, entre otros, los que conducen a, a lo sumo 20 o a lo sumo 10, preferiblemente a, a lo sumo 5 o a, a lo sumo 3, muy en particular preferiblemente a, a lo sumo 2 o a, a lo sumo una, sustitución de aminoácidos conservadora en la proteína que codifican.

En el caso de los aminoácidos aromáticos, se dice que las sustituciones son conservadoras cuando se sustituyen

25 entre sí fenilalanina, triptófano y tirosina. En el caso de los aminoácidos hidrófobos, se dice que las sustituciones son conservadoras cuando se sustituyen entre sí leucina, isoleucina y valina. En el caso de los aminoácidos polares, se dice que las sustituciones son conservadoras cuando se sustituyen entre sí glutamina y asparagina. En el caso de los aminoácidos básicos, se dice que las sustituciones son conservadoras cuando se sustituyen entre sí arginina,

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Los métodos para conseguir la sobreexpresión se describen adecuadamente en la técnica anterior, por ejemplo, en Makrides et al. (Microbiological Reviews 60 (3), 512-538 (1.996)). Usar vectores aumenta el número de copias por al menos una (1) copia. Los vectores usados pueden ser plásmidos, como se describe, por ejemplo, en la patente de EE.UU. 5.538.873. Los vectores usados pueden ser asimismo fagos, por ejemplo, el fago Mu, como se describe en la Patente Europea EP 0 332 448, o el fago lambda (λ). Se puede conseguir también un aumento en el número de copias por incorporación de una copia adicional a otro sitio en el cromosoma, por ejemplo, en el sitio att del fago λ (Yu y Court, Gene 223, 77-81 (1.998)). La patente de EE.UU. 5.939.307 indica que fue posible aumentar la expresión por incorporación de casetes de expresión o activadores, tales como el activador de tac, el activador de trp, el activador de lpp, o el activador PL o activador de PR del fago λ, por ejemplo, aguas arriba del operón de treonina cromosómico. Es posible usar los activadores del fago T7, los activadores de engranaje o el activador de nar de la misma manera. Los casetes de expresión o activadores de esta naturaleza también pueden ser usados para sobreexpresar genes ligados a plásmido, como se describe en la patente europea EP 0 593 792. Usar el alelo lacIQ hace posible, a su vez, controlar la expresión de los genes ligados a plásmido (Glascock y Weickert, Gene 223, 221-231 (1.998)). Es posible además que las actividades de los activadores se aumenten modificando sus secuencias mediante el uso de inserción o inserciones y/o supresión o supresiones para efectuar una o más sustituciones de nucleótidos. Se puede conseguir una expresión de genes cronológica diferente, por ejemplo, usando el activador fis dependiente de la fase de crecimiento, como se describe en Walquer et al. (Journal of Bacteriology 181: 1.269-80 (1.999)).

El experto en la materia puede encontrar instrucciones generales con respecto a esto en, entre otros, Chang y Cohen (Journal of Bacteriology 134: 1.141-1.156 (1.978)), Hartley y Gregori (Gene 13: 347-353 (1.981)), Amann y Brosius (Gene 40: 183-190 (1.985)), de Broer et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 80: 21-25 (1.983)), LaVallie et al. (BIO/TECHNOLOGY 11: 187-193 (1.993)), Patente de EE.UU. PCT/US97/13359, Llosa et al. (Plasmid 26: 222-224 (1.991)), Quandt y Klipp (Gene 80: 161-169 (1.989)), Hamilton et al. (Journal of Bacteriology 171: 4.617-4.622 (1.989)) y Jensen y Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191-195 (1.998)) y en libros de texto conocidos que tratan de genética y biología molecular.

Es posible usar vectores de plásmidos que se puedan replicar en Enterobacteriaceae, tales como vectores de clonación procedentes de pACYC184 (Bartolomé et al.; Gene 102: 75-78 (1.991)), pTrc99A (Amann et al.; Gene 69: 301-315 (1.988)) o derivados de pSC101 (Vocke y Bastia; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80 (21): 6.557-6.561 (1.983)). En un procedimiento de acuerdo con la invención, es posible usar una cepa transformada de vector de plásmido, soportando el vector de plásmido al menos una secuencia de nucleótidos o alelo que codifica el ORF de yodA o su producto génico.

El término “transformación” se entiende que significa la aceptación de un ácido nucleico aislado por un huésped (microorganismo).

Es posible asimismo usar intercambio de secuencias (Hamilton et al.; Journal of Bacteriology 171: 4.617-4.622 (1.989)), conjugación o transducción para transferir mutaciones, que afectan a la expresión de los respectivos genes

o marcos abiertos de lectura, en diferentes cepas.

Explicaciones más detalladas con respecto a los conceptos de genética y biología molecular se pueden encontrar en libros de texto que tratan de genética y biología molecular, tales como el libro de texto por Birge (Bacterial and Bacteriophage Genetics, 4ª ed., Springer Verlag, Nueva York (USA), 2.000) o el libro de texto por Berg, Tymoczko y Stryer (Biochemistry, 5ª ed., Freeman y Company, Nueva York (USA), 2.002) o el manual de Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, (Conjunto de 3 Volúmenes), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2.001).

Cuando se usan cepas de la familia Enterobacteriaceae para producir L-aminoácidos, en particular L-treonina, también puede ser ventajoso, además de sobreexpresar el marco abierto de lectura de yodA, para potenciar una o más enzimas de la ruta de biosíntesis de treonina conocida o enzimas del metabolismo anaplerótico o enzimas para producir nicotinamida adenina dinucleótido fosfato reducido o enzimas de glicolisis, o enzimas PTS, o enzimas de metabolismo del azufre. Se da preferencia en general a usar genes endógenos.

Así, es posible, por ejemplo, potenciar de manera simultánea, en particular sobreexpresar, uno o más de los genes seleccionados del grupo:

 al menos un gen del operón thrABC codificador de la aspartato cinasa, homoserina deshidrogenasa, homoserina cinasa y treonina sintasa (Patente de EE.UU. A-4.278.765),

 el gen pyc codificador de piruvato carboxilasa Corynebacterium glutamicum (Patente Internacional WO 99/18228),

 el gen pps codificador de la fosfoenolpiruvato sintasa (Molecular and General Genetics 231 (2): 332-336 (1.992)), 7

 el gen ppc codificador de la fosfoenolpiruvato carboxilasa (Patente Internacional WO 02/064808),  los genes pntA y pntB codificadores de las subunidades de la piridina transhidrogenasa (European Journal of Biochemistry 158: 647-653 (1.986)),  el gen rhtB codificador de la proteína mediadora de la resistencia a homoserina (Patente Europea EP-A-0 5 994 190),  el gen rhtC codificador de la proteína mediadora de la resistencia a treonina (Patente Europea EP-A-1 013 765),  el gen thrE de Corynebacterium glutamicum codificador de la proteína portadora de exportación de treonina (Patente Internacional WO 01/92545), 10  el gen gdhA codificador de glutamato deshidrogenasa (Nucleic Acids Research 11: 5.257-5.266 (1.983);

Gene 23: 199-209 (1.983)),  el gen pgm codificador de la fosfoglucomutasa (Patente Internacional WO 03/004598),  el gen fba codificador de la fructosa bifosfato aldolasa (Patente Internacional WO 03/004664),  el gen ptsH de operón ptsHIcrr codificador de la proteína fosfohistidina hexosa fosfotransferasa del sistema

15 PTS de la fosfotransferasa (Patente Internacional WO 03/004674),  el gen ptsI del operón ptsHIcrr codificador de la enzima I del sistema PTS de la fosfotransferasa (Patente Internacional WO 03/004674),  el gen crr del operón ptsHIcrr codificador del componente IIA específico de la glucosa del sistema PTS de la fosfotransferasa (Patente Internacional WO 03/004674), 20  el gen ptsG codificador del componente IIBC específico de la glucosa (Patente Internacional WO

03/004670),  el gen lrp codificador del regulador del regulón leucina (Patente Internacional WO 03/004665),  el gen fadR codificador del regulador del regulón fad (Patente Internacional WO 03/038106),  el gen iclR codificador del regulador del metabolismo intermediario central (Patente Internacional WO

25 03/038106),  el gen ahpC del operón ahpCF codificador de la subunidad pequeña de la alquilhidroperóxido reductasa (Patente Internacional WO 03/004663),  el gen ahpF del operón ahpCF codificador de la subunidad grande de la alquilhidroperóxido reductasa (Patente Internacional WO 03/004663),

30  el gen cysK codificador de la cisteina sintasa A (Patente Internacional WO 03/006666),  el gen cysB codificador del regulador de regulón cys (Patente Internacional WO 03/006666),  el gen cysJ del operón cysJIH codificador de la flavoproteína sulfito reductasa de NADPH (Patente

Internacional WO 03/006666),  el gen cysI del operón cysJIH codificador de la hemoproteína sulfito reductasa de NADPH (Patente 35 Internacional WO 03/006666),  el gen cysH del operón cysJIH codificador de la adenilil sulfato reductasa (Patente Internacional WO 03/006666),  el gen rseA del operón rseABC codificador de una proteína de membrana que posee actividad anti-sigmaE (Patente Internacional WO 03/008612), 40  el gen rseC del operón rseABC codificador de un regulador global del factor SigmaE (Patente Internacional WO 03/008612), 8

 el gen sucA del operón sucABCD codificador de la subunidad descarboxilasa de 2-cetoglutarato deshidrogenasa (Patente Internacional WO 03/008614),

 el gen sucB del operón sucABCD codificador de la subunidad E2 de dihidrolipoil transsuccinasa de 2cetoglutarato deshidrogenasa (Patente Internacional WO 03/008614),

5  el gen sucC del operón suc ABCD codificador de la subunidad β de la succinil-CoA sintetasa (Patente Internacional WO 03/008615),

 el gen sucD del operón sucABCD codificador de la subunidad α de la succinil-CoA sintetasa (Patente Internacional WO 03/008615),

 el gen aceE codificador del componente E1 del complejo piruvato deshidrogenasa (Patente Internacional 10 WO 03/076635),

 el gen aceF codificador del componente E2 del complejo piruvato deshidrogenasa (Patente Internacional WO 03/076635),

 el gen rseB codificador del regulador de la actividad del factor SigmaE (Molecular Microbiology 24 (2): 355371 (1.997)),

15  el producto génico del marco abierto de lectura (ORF) de yaaU de Escherichia coli (Número de Acceso AE005181 del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI, Bethesda, MD, USA, (Patente Alemana DE10361268.8)).

Para el fin de producir L-aminoácidos, en particular L-treonina, también puede ser ventajoso, además de sobreexpresar el marco abierto de lectura de yodA, para atenuar, en particular eliminar o reducir, la expresión de

20 uno o más de los genes seleccionados del grupo:

 el gen tdh codificador de la treonina deshidrogenasa (Journal of Bacteriology 169: 4.716-4.721 (1.987)),

 el gen mdh codificador de la malato deshidrogenasa (E.C. 1.1.1.37) (Archives in Microbiology 149: 36-42 (1.987)),

 el producto génico del marco abierto de lectura (ORF) de yjfA de Escherichia coli (Número de Acceso 25 AAC77180 del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI, Bethesda, MD, USA, (Patente Internacional WO 02/29080)),

 el producto génico del marco abierto de lectura (ORF) ytfP de Escherichia coli (Número de Acceso AAC77179 del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI, Bethesda, MD, USA, (Patente Internacional WO 02/29080)),

30  el gen pckA codificador de la enzima fosfoenolpiruvato carboxicinasa (Patente Internacional WO 02/29080),

 el gen poxB codificador de la piruvato oxidasa (Patente Internacional WO 02/36797),

 el gen dgsA (Patente Internacional WO 02/081721), que también se conoce con la denominación gen mlc, codificador del regulador de DgsA del sistema de la fosfotransferasa,

 el gen fruR codificador de represor de la fructosa (Patente Internacional WO 02/081698), que también se 35 conoce con la denominación gen cra,

 el gen rpoS codificador de factor Sigma38 (Patente Internacional WO 01/05939), que también se conoce con la denominación gen katF, y

 el gen aspA codificador de la aspartato amonio liasa (Patente Internacional WO 03/008603).

Con relación a esto, el término "atenuación" describe la reducción o eliminación de la actividad intracelular o la

40 concentración de una o más enzimas o proteínas, que están codificadas por el correspondiente ADN, en un microorganismo, haciéndose uso, por ejemplo, de un activador que es más débil que en el microorganismo o cepa precursora que no es recombinante para la correspondiente enzima o proteína, o de un gen o alelo que codifica una correspondiente enzima o proteína con una actividad menor, o la correspondiente enzima o proteína, o el marco abierto de lectura o el gen, que está inactivado, y, cuando sea apropiado, combinándose estas mediciones.

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Los microorganismos que se han preparado según la invención se pueden cultivar en un procedimiento discontinuo, en un procedimiento de lote alimentado, en un procedimiento de lote alimentado repetido o en un procedimiento continuo (Patente Alemana DE102004028859.3 o Patente de EE.UU. 5.763.230). Un sumario de métodos de cultivo conocidos se proporciona en el libro de texto por Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik [Bioprocess technology 1. Introduction to bioprocess technology] (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1.991)) o en el libro de texto por Storhas (Bioreaktoren und perifere Einrichtungen [Bioreactors and periferal installations] (Vieweg Verlag, Braunschweig/ Wiesbaden, 1.994)).

El medio de cultivo que se tiene que usar debe satisfacer adecuadamente los requerimientos de las cepas determinadas. El manual "Manual of Methods for General Bacteriology" de la Sociedad Americana para la Bacteriología (Washington D.C., USA, 1.981) contiene descripciones de medios de cultivos para diferentes microorganismos.

Los azúcares y carbohidratos, tales como glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, molasas, almidón y, donde sea apropiado, celulosa, aceites y grasas, tales como aceite de soja, aceite de girasol, aceite de cacahuete y aceite de nuez de coco, ácidos grasos, tales como ácido palmítico, ácido esteárico y ácido linoleico, alcoholes, tales como glicerol y etanol y ácidos orgánicos, tales como ácido acético, se pueden usar como la fuente de carbono. Estas sustancias se pueden usar individualmente o como una mezcla.

Los compuestos que contienen nitrógeno, orgánicos, tales como peptonas, extracto de levadura, extracto de carne, extracto de malta, licor de maceración del maíz, harina de soja y urea o compuestos inorgánicos tales como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio, se pueden usar como la fuente de nitrógeno. Las fuentes de nitrógeno se pueden usar individualmente o como mezclas.

El ácido fosfórico, dihidrogenofosfato de potasio o hidrogenofosfato de dipotasio o las correspondientes sales que contienen sodio, se pueden usar como la fuente de fósforo. Además, el medio de cultivo tiene que contener sales de metal, tales como sulfato de magnesio o sulfato de hierro, que se requieren para el crecimiento. Finalmente, es posible usar sustancias que activen el crecimiento esencial, tales como aminoácidos y vitaminas, además de las sustancias ya mencionadas. Además, se pueden añadir precursores adecuados al medio de cultivo. Se pueden añadir sustancias de adición ya mencionadas al cultivo en la forma de una mezcla de una sola vez o alimentadas, de una manera adecuada, como proceda el cultivo.

En general, la fermentación se lleva a cabo a un pH de 5,5 a 9,0, en particular de 6,0 a 8,0. Los compuestos básicos, tales como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, amoníaco o agua amoniacal, o compuestos ácidos, tales como ácido fosfórico o ácido sulfúrico, se usan, de una manera adecuada, para controlar el pH del cultivo. Los antiespumantes, tales como ésteres de poliglicol y ácido graso, se pueden usar para controlar la formación de espuma. Se pueden añadir sustancias adecuadas con una acción selectiva, por ejemplo, antibióticos, al medio para mantener la estabilidad de los plásmidos. Se introduce oxígeno o mezclas de gases que contienen oxígeno, tales como aire, en el cultivo para mantener las condiciones aerobias. La temperatura del cultivo es normalmente de 25°C a 45°C y preferiblemente de 30°C a 40°C. El cultivo se continúa hasta que se ha formado un máximo de Laminoácidos o L-treonina. Este objetivo normalmente se consigue en 10 a 160 horas.

Se pueden analizar L-aminoácidos mediante cromatografía de intercambio aniónico seguido por derivatización de ninhidrina, como se describe en Spackman et al. (Analytical Chemistry 30: 1.190-1.206 (1.958)); de otro modo, se pueden analizar por HPLC de fase inversa como se describe en Lindroth et al. (Analytical Chemistry 51: 1.167-1.174 (1.979)).

El procedimiento según la invención se usa para preparar de manera fermentativa L-aminoácidos, tales como Ltreonina, L-isoleucina, L-valina, L-metionina, L-homoserina, L-triptófano y L-lisina, en particular L-treonina.

Se ha depositado el siguiente microorganismo en el Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen [German collection of Microorganisms and cell cultures] (DSMZ, Braunschweig, Alemania) según el Tratado de Budapest:

 cepa E. coli MG442 de Escherichia coli, como DSM 16574.

La presente invención se clarifica a continuación con la ayuda de los ejemplos de implementación.

El medio mínimo (M9) y completo (LB) para Escherichia coli que se usa se describe por J. H. Miller (A short course in bacterial genetics (1.992), Cold Spring Harbor Laboratory Press). El aislamiento de ADN de plásmido de Escherichia coli y todas las técnicas para restricción, ligadura y tratamiento con fosfatasa Klenow y fosfatasa de álcali, se realizan de acuerdo con Sambrook et al. (Molecular Cloning -A Laboratory Manual (1.989) Cold Spring Harbor Laboratory Press). A menos que se describa de otro modo, se transforma Escherichia coli según Chung et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 86: 2.172-2.175 (1.989)).

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La temperatura de incubación cuando se preparan cepas y transformantes es 37°C.

Ejemplo 1

Construcción del plásmido de expresión pTrc99AyodA.

Se multiplica el marco abierto de lectura de yodA de E. coli K12 usando la reacción en cadena de polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) y oligonucleótidos sintéticos. Se sintetizan cebadores de PCR (MWG Biotech, Ebersberg, Alemania) sobre la base de la secuencia de nucleótidos del marco abierto de lectura de yodA en E. coli K12 MG1655 (Número de Acceso AE000288, Blattner et al. (Science 277: 1.453-1.474 (1.997)). Los cebadores contienen secuencias para enzimas de restricción, marcándose estas secuencias por subrayado en las secuencias de nucleótidos que se representan a continuación. El cebador yodA_5' contiene el sitio de escisión de restricción para NcoI, mientras el cebador yodA_3' contiene ese para HincII.

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El ADN cromosómico de E. coli K12 MG1655 que se emplea para el PCR se aísla, según las instrucciones del fabricante, usando "Qiagen Genomic-tips 100/G" (QIAGEN, Hilden, Alemania). Los cebadores específicos pueden multiplicar un fragmento de ADN de aprox. 830 pb de tamaño (SEC ID Nº 3) en condiciones PCR estándar (Innis et al. (1.990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press) usando polimerasa de ADN Pfu (Promega Corporation, Madison, USA).

El producto PCR está ligado, según las instrucciones del fabricante, al vector pCR-Blunt II-TOPO (estuche de clonación Zero Blunt TOPO, Invitrogen, Groningen, Países Bajos), según las instrucciones del fabricante y lo último se transforma en la cepa de E. coli TOP10. Las células hospedadoras de plásmido se seleccionan de agar LB al que se ha añadido kanamicina a una concentración de 50 µg/ml. Después de que se ha aislado el ADN de plásmido, se escinde el vector con las enzimas de restricción EcoRI y EcoRV y, después de haber sido comprobado siendo separado en un gel de agarosa al 0,8%, se denomina pCRBluntyodA.

El vector pCRBluntyodA se restringe después con las enzimas de restricción NcoI y HincII y el fragmento de yodA se aísla usando un estuche de extracción de gel QIAquick (QIAGEN, Hilden, Alemania) después de que se haya separado en un gel de agarosa al 0,8%. El vector pTrc99A (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) se escinde con las enzimas NcoI y SmaI y se liga al fragmento de yodA aislado. La cepa de E. coli XL1-Blue MRF' (Stratagene, La Jolla, USA) se transforma con la mezcla de ligadura y se seleccionan las células hospedadoras de plásmido sobre agar LB al que se ha añadido ampicilina a una concentración de 50 µg/ml. Después de que se haya aislado el ADN de plásmido, el hecho de que la clonación haya tenido éxito se puede demostrar llevando a cabo una escisión de control con la enzima EcoRV.

El plásmido se denomina pTrc99AyodA (Figura 1).

Ejemplo 2

Preparación de L-treonina usando la cepa MG442/pTrc99AyodA.

La cepa MG442 de E. coli productora de L-treonina se describe en la solicitud de patente de EE.UU. A-4.278.765 y se ha depositado en la colección nacional rusa de microorganismos industriales (VKPM, Moscú, Rusia) como CMIM B-1628 y en el Deutsche Sammlung für Mikroorganisms und Zellkulturen [German collection of microorganisms and cell cultures] (DSMZ, Braunschweig, Alemania), según el Tratado de Budapest, como DSM 16574.

La cepa MG442 se transforma con el plásmido de expresión pTrc99AyodA, como se describe en el ejemplo 1 y con el vector pTrc99A y las células hospedadoras de plásmido se seleccionan en agar LB que contiene 50 µg de ampicilina/ml. Esto da como resultado las cepas MG442/pTrc99AyodA y MG442/pTrc99A. Las colonias individuales seleccionadas se propagan después más sobre medio mínimo con la siguiente composición: 3,5 g de Na2HPO4*2H2O/l, 1,5 g de KH2PO4/l, 1 g de NH4Cl/l, 0,1 g de MgSO4*7H2O/l, 2 g de glucosa/l, 20 g de agar/l y 50 mg de ampicilina/l.

La formación de L-treonina se examina en cultivos de lotes de 10 ml que están contenidos en matraces Erlenmeier de 100 ml. Para esto, se inoculan y se incuban 10 ml de medio de cultivo preliminar de la siguiente composición: 2 g de extracto de levadura/l, 10 g de (NH4)2SO4/l, 1 g de KH2PO4/l, 0,5 g de MgSO4*7H2O/l, 15 g de CaCO3/l, 20 g de

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