ES2378985T3 - Bacterias productoras de L-treonina y un procedimiento para preparar L-treonina - Google Patents

Abstract

Bacterias de la especie Escherichia coli, productoras de L-treonina, que son resistentes a ácido -amino-ß-hidroxivalérico, en donde dichas bacterias contienen 1) dentro de la región codificadora del gen rpoS un (1) codón de terminación del tipo ámbar y (2) el correspondiente supresor ámbar, supE, en donde el codón de terminación del tipoámbar se encuentra dentro de la región codificadora del gen rpoS correspondiente a la posición 33 en la secuencia de aminoácidos de la proteína RpoS, de acuerdo con SEQ ID No. 2.

Description

Bacterias productoras de L-treonina y un procedimiento para preparar L-treonina

Campo de la invención

La invención se refiere a bacterias de la especie Escherichia coli, productoras de L-treonina, que contienen un codón de terminación del tipo ámbar en la secuencia de nucleótidos de la región codificadora del gen rpoS y el correspondiente supresor para el codón de terminación, el supresor ámbar SupE. Esta invención se refiere también a un procedimiento para preparar L-treonina utilizando estas bacterias.

Técnica anterior

L-aminoácidos, en particular L-treonina, se utilizan en la medicina humana y en la industria farmacéutica, en la industria alimentaria y, de manera muy particular, en piensos para animales.

Es conocido que los L-aminoácidos se preparan mediante fermentación de cepas de Enterobacteriaceae, en particular Escherichia coli (E. coli) y Serratia marcescens. Se han buscado siempre mejoras en los métodos de preparación debido a la gran importancia de este procedimiento. Las mejoras en el procedimiento pueden referirse a las medidas tecnológicas de la fermentación tales como, p. ej., agitación y suministro de oxígeno, o la composición de los medios nutricios tales como, p. ej., la concentración de azúcar durante la fermentación, o el tratamiento para obtener la forma de producto, p. ej., mediante cromatografía de intercambio de iones, o las características de comportamiento intrínseco del propio microorganismo.

Para mejorar las características de comportamiento de estos microorganismos, se utilizan los métodos de mutagénesis, selección y selección de mutantes. De este modo, se obtienen cepas que son resistentes a antimetabolitos tales como p. ej., el análogo de treonina, ácido a-amino-�-hidroxivalérico (AHV), o son auxotróficas para importantes metabolitos reguladores y producen L-aminoácidos tales como p. ej., L-treonina.

Los métodos de la ingeniería de ADN recombinante también se han utilizado durante un cierto número de años para la mejora de la cepa de cepas productoras de L-aminoácidos de la familia Enterobacteriaceae, al multiplicar genes individuales para la biosíntesis de aminoácidos y someter a ensayo el efecto sobre la producción.

El gen rpoS, que también se conoce bajo el nombre de gen katF, codifica una proteína que se denomina el factor 038

o factor 0S, la proteína 038 o la subunidad 038 o incluso la proteína RpoS. En la bibliografía se encuentran también los siguientes nombres para el gen rpoS, aunque menos habitualmente: abrD, dpeB, appR, sigS, otsX y snrA. El factor 0S, en calidad de una subunidad de ARN-polimerasa, controla la expresión de una amplia diversidad de diferentes grupos de genes (Loewen et al.; Canadian Journal of Microbiology 44 (8): 707-717 (1998)), en donde los mecanismos de regulación son a menudo poco claros.

Datos sobre la secuencia de nucleótidos del gen rpoS o katF se pueden encontrar en Mulvey y Loewen (Nucleic Acids Research 17 (23): 9979-9991 (1989)) y en Blattner et al. (Science 277: 1453-1462 (1997)). Datos correspondientes también se pueden encontrar en el Centro Nacional para la Información de Biotectonología (NCBI) de la Biblioteca Nacional de Medicina (Bethesda, MD, EE.UU.) bajo los números de acceso X16400 y AE000358. El inicio de la traducción o el codón de iniciación para el gen rpoS se determinó por Loewen et al. (Journal of Bacteriology 175 (7): 2150-2153 (1993)).

Además, se conoce un cierto número de alelos rpoS en cepas de Escherichia coli, por ejemplo en cepas del tipo W3110 (Ivanova et al.; Nucleic Acids Research 20 (20): 5479-5480 (1992) y Jishage e Ishihama; Journal of Bacteriology 179 (3): 959-963 (1997)).

En el documento WO 01/05939 se demuestra que, después de una desconexión completa del factor 038 al incorporar una deleción en el gen rpoS de un productor de ácido L-glutámico, se mejora la producción de ácido glutámico.

Nagano et al. (Bioscience Biotechnology and Biochemistry 64 (9): 2012-2017 (2000)) informan sobre una cepa W3110 de Escherichia coli y los mutantes W196 productores de L-lisina, conteniendo ambos un alelo rpoS que contiene un codón de terminación ámbar (TAG) en el punto correspondiente a la posición 33 en la secuencia de aminoácidos de la proteína 0 38. La cepa W196 contiene también una mutación en el gen serU que codifica ARNt de L-serina que se denomina supD.

Descripción de la invención

Siempre que se mencionen aminoácidos o L-aminoácidos en lo que sigue, estos pretenden cubrir todos los aminoácidos proteinogénicos, con la excepción de L-lisina. Esto significa, en particular, L-treonina, L-isoleucina, Lhomoserina, L-metionina, ácido L-glutámico, L-valina y L-triptófano, en donde se prefiere L-treonina.

“Aminoácidos proteinogénicos” se entiende que son aquellos aminoácidos que son constituyentes de proteínas. Estos incluyen los aminoácidos L-glicina, L-alanina, L-valina, L-leucina, L-isoleucina, L-serina, L-treonina, L-cisteína, L-metionina, L-prolina, L-fenilalanina, L-tirosina, L-triptófano, L-asparagina, L-glutamina, ácido L-aspártico, ácido Lglutámico, L-arginina, L-lisina, L-histidina y L-selenocisteína.

La invención proporciona bacterias de la especie Escherichia coli, productoras de L-treonina, que son resistentes al ácido a-amino-�-hidroxivalérico (= AHV) y que 1) contienen un codón de terminación del tipo ámbar en la secuencia de nucleótidos de la región codificadora del gen rpoS, y 2) contienen el correspondiente supresor para el codón de terminación, supresor ámbar supE, en donde el codón de terminación del tipo ámbar se encuentra dentro de la región codificadora del gen rpoS correspondiente a la posición 33 en la secuencia de aminoácidos de la proteína RpoS de acuerdo con SEQ ID NO. 2.

Las bacterias proporcionadas por la presente invención, pueden producir L-treonina a partir de glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melazas, opcionalmente almidón, opcionalmente celulosa o a partir de glicerol y etanol. Son representantes de la familia Enterobacteriaceae, elegidos de la especie Escherichia coli.

Las bacterias productoras de L-treonina proporcionadas por la presente invención pueden, entre otros, producir opcionalmente L-lisina como un producto secundario, además del L-aminoácido deseado. Bacterias de acuerdo con la invención producen a lo sumo 0 a 40% o 0 a 20%, preferiblemente a lo sumo 0 a 10%, de manera particularmente preferida a lo sumo 0 a 5% de L-lisina en comparación con la cantidad de L-aminoácido deseada. Estos datos de porcentaje corresponden al porcentaje en peso.

Cepas productoras de L-treonina de la familia Enterobacteriaceae poseen, preferiblemente, entre otros, uno o más de los rasgos genéticos o fenotípicos seleccionados del grupo: resistencia a ácido -amino-�-hidroxivalérico,

a resistencia a tialisina, resistencia a etionina, resistencia a a-metilserina, resistencia a ácido diaminosuccínico, resistencia a ácido a -aminobutírico, resistencia a borrelidina, resistencia a rifampicina, resistencia a análogos de valina tales como, por ejemplo, hidroxamato de valina, resistencia a análogos de purina tales como, por ejemplo, 6dimetilaminopurina, una necesidad de L-metionina, una necesidad, opcionalmente parcial y compensable, de Lisoleucina, una necesidad de ácido meso-diaminopimélico, una auxotrofía con respecto a dipéptidos con contenido en treonina, resistencia a L-treonina, resistencia a L-homoserina, resistencia a L-lisina, resistencia a L-metionina, resistencia a ácido L-glutámico, resistencia a L-aspartato, resistencia a L-leucina, resistencia a L-fenilalanina, resistencia a L-serina, resistencia a L-cisteína, resistencia a L-valina, sensibilidad a fluoropiruvato, treonina deshidrogenasa defectuosa, opcionalmente una capacidad para hacer uso de sacarosa, potenciación del operón treonina, potenciación de homoserina deshidrogenasa I-aspartato quinasa I, preferiblemente la forma resistente a la retroalimentación, potenciación de homoserina quinasa, potenciación de treonina sintasa, potenciación de aspartato quinasa, opcionalmente la forma resistente a la retroalimentación, potenciación de aspartato semialdehído deshidrogenasa, potenciación de fosfoenolpiruvato carboxilasa, opcionalmente la forma resistente a la retroalimentación, potenciación de fosfoenolpiruvato sintasa, potenciación de transhidrogenasa, potenciación del producto génico RhtB, potenciación del producto génico RhtC, potenciación del producto génico YfiK, potenciación de un piruvato carboxilasa, y atenuación de la formación de ácido acético.

Se entiende que un codón de terminación del tipo ámbar es un codón de terminación con la secuencia de bases TAG en la cadena codificadora en una molécula de ADN correspondiente a UAG en el ARNm leído por esta molécula de ADN.

Un codón de terminación del tipo ocre de acuerdo con la descripción se entiende que es un codón de terminación con la secuencia de bases TAA en la cadena codificadora en una molécula de ADN correspondiente a UAA en el ARNm leído por esta molécula de ADN.

Un codón de terminación del tipo opal de acuerdo con la descripción se entiende que es un codón de terminación con la secuencia de bases TGA en la cadena codificadora en una molécula de ADN correspondiente a UGA en el ARNm leído por esta molécula de ADN.

Los codones de terminación mencionados se denominan también mutaciones sin sentido (Edward A. Birge: Bacterial and Bacteriophage Genetics (tercera edición), editorial Springer, Berlín, Alemania, 1994).

La secuencia de nucleótidos para el gen rpoS se puede obtener de la técnica anterior. La secuencia de nucleótidos para el gen rpoS correspondiente al nº de acceso AE000358 se proporciona como SEQ ID NO. 1. La secuencia de aminoácidos del producto génico o proteína RpoS relevante se da en SEQ ID NO. 2.

5 La secuencia de nucleótidos para un alelo rpoS que contiene un codón de terminación del tipo ámbar en el punto en la secuencia de nucleótidos correspondiente a la posición 33 en la secuencia de aminoácidos del producto génico o proteína RpoS, correspondiente a SEQ ID NO. 1 y SEQ ID NO. 2, respectivamente, se da en SEQ ID NO. 3.

La concentración de factor 0 38 se puede determinar por el método de “transferencia Western” cuantitativo según se 10 describe en Jishage e Ishima (Journal of Bacteriology 177 (23): 6832-6835 (1995)), Jishage et al. (Journal of Bacteriology 178 (18): 5447-5451 (1996)) y Jishage e Ishima (Journal of Bacteriology 179 (3): 959-963 (1997)).

La supresión se entiende generalmente que es el efecto mediante el cual los efectos de mutación en un “primer” gen se compensan o quedan suprimidos por una mutación en un “segundo” gen. El segundo gen mutado o la segunda 15 mutación se denomina generalmente un supresor o gen supresor.

Un caso especial de supresores se refiere a alelos de genes de ARNt que codifican moléculas de ARNt anormales que pueden reconocer codones de terminación, de modo que tiene lugar la incorporación de un aminoácido en lugar de la terminación de la cadena durante la traducción. Explicaciones amplias de supresión se pueden encontrar en 20 libros de texto de genética tales como, por ejemplo, el libro de texto de Rolf Knippers “Molekulare Genetik” (6ª edición, editorial Georg Thieme, Stuttgart, Alemania, 1995) o el libro de texto de Ernst-L. Winnacker “Gene und Klone, Eine Einführung in die Gentechnoligie” (tercera, reimpresión modificada (VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemania, 1990) o el libro de texto de F. C. Neidhard (Ed.) “Escherichia coli and Salmonella, Cellular and Molecular Biology” (2ª edición, ASM Press, Washington, D. C., EE.UU., 1996). 25 Los supresores listados en las Tablas 1, 2 y 3 son, entre otros, genes o alelos de ARNt o supresores de ARNt conocidos de la técnica anterior que pueden suprimir codones de terminación del tipo ámbar, ocre u opal y, así, se denominan supresores ámbar, supresores ocre o supresores opal. Los nombres para los genes o alelos particulares y supresores se tomaron de las referencias citadas. 30 Tabla 1

Lista de supresores ámbar

Nombre del gen/alelo supresor

Nombre del ARNt Aminoácido incorporado Ref.

supD (= Su1)

ARNt 2 de serina Ser 1

supE (= Su2, supY)

ARNt 2 de glutamina Gln 1

supF

ARNt 1 de tirosina Tyr 1

supP (= Su6)

ARNt 5 de leucina Leu 1

supU (= su7)

ARNt de triptófano Trp 1

supZ

ARNt 2 de tirosina Tyr 1

ARN-tAspCUA

ARNt de Asp (CUA) Lys, Ala, Gln, Arg 2

ARNtPheCUA

ARNt de fenilalanina Phe 3

ARNtCysCUA

ARNt de cisteína Cys 3

suIII+ ámbar

ARNt 1 de tirosina Tyr 4

Su+271

ARNt de Gln/Trp Gln 5

ARG

ARNt de arginina Arg, Lys 6

ARGII

ARNt de arginina Arg, Gln 6

LysA20

ARNt de lisina Lys 6

trpT175

ARNt de triptófano Gln 7

Su79 (= trpT179)

ARNt de triptófano Trp 8

ARNtCysCUA

ARNt de cisteína Cys 9

ARN-tAsnCUA

ARNt de asparagina Gln 10

Ala2

ARNt de alanina Ala 11

Cys

ARNt de cisteína Lys 11

ProH

ARNt de prolina Pro 11

HisA

ARNt de histidina His 11

Gly2

ARNt de glicina Gly, Gln 11

Gly1

ARNt de glicina Gly 11

Ile1

ARNt de isoleucina Gln, Lys 11

Met(f)

ARNt de metionina Lys 11

Ile2

ARNt de isoleucina Lys 11

AspM

ARNt de asparagina Lys 11

Arg

ARNt de arginina Lys, Arg 11

Thr2

ARNt de treonina Lys, Thr 11

Val

ARNt de valina Lys, Val 11

GluA

ARNt de ácido glutámico Glu, Gln, Tyr, Arg 11

ECF

ARNt de fenilalanina Phe 12

ECF9

ARNt de fenilalanina Phe 12

ECF5-2

ARNt de fenilalanina Phe, Thr, Tyr 12

ECF10

ARNt de fenilalanina Phe 12

ECF602

ARNt de fenilalanina Phe, Lys, Thr, Val 12

ECF606

ARNt de fenilalanina Phe 12

ECF11

ARNt de fenilalanina Phe 12

ECF12

ARNt de fenilalanina Phe 12

ECF6

ARNt de fenilalanina Phe, Thr 12

ECF401

ARNt de fenilalanina Phe 12

ECF402

ARNt de fenilalanina Phe 12

ECF403

ARNt de fenilalanina Phe 12

ECF403G45

ARNt de fenilalanina Lys 12

ECF5

ARNt de fenilalanina Phe 12

ECFG73

ARNt de fenilalanina Phe, Gln 12

Referencias (Ref.) para la Tabla 1: 1) Neidhard (comp.) “Escherichia coli and Salmonella, Cellular and Molecular Biology” (2ª edición, ASM Press, 5 Washington, D. C., EE.UU., 1996) 2) Martin et al, RNA 2 (9): 919-927, 1996 3) Normanly et al, Proceedings of the National Academy of Science USA, 83 (17): 6548-6552, 1986 10 4) Número de Acceso K01197 5) Yarus et al, Proceedings of the National Academy of Science USA, 77 (9): 5092-5096, 1990 15 6) McClain et al, Proceedings of the National Academy of Science USA, 87 (23): 9260-9264, 1990 7) Raftery et al, Journal of Bacteriology 158 (3): 849-859, 1984 8) Raftery et al, Journal of Molecular Biology 190 (3): 513-517, 1986 20 9) Komatsoulis y Abelson, Biochemistry 32 (29): 7435-7444, 1993 10) Martin et al, Nucleic Acids Research 23 (5): 779-784, 1995 25 11) Normanly et al, Journal of Molecular Biology 213 (4): 719-726, 1990 12) McClain y Foss, Journal of Molecular Biology, 202 (4): 697-709, 1988

Tabla 2 Lista de supresores ocre de acuerdo con la descripción

Nombre del gen/alelo supresor

Nombre del ARNt Aminoácido incorporado Ref.

supB

ARNt 1 de glutamina Gln 1

supC

ARNt 1 de tirosina Tyr 1

supD

ARNt 3 de serina Ser 1

supG (= supL, supN)

ARNt de lisina Lys 1

supM (= supB15)

ARNt 2 de tirosina Tyr 1

supU (= su8)

ARNt de triptófano Trp 1

supV

ARNt de triptófano Trp 1

ARNtGlu-Suoc205

ARNt de ácido glutámico Glu 2

suIII+ ocre

ARNt 1 de tirosina Tyr 3

trpT177

ARNt de triptófano Gln 4

Su79 (= trpT179)

ARNt de triptófano Trp 5

5 Referencias (Ref.) para la Tabla 2:

1) Neidhard (comp.) “Escherichia coli and Salmonella, Cellular and Molecular Biology” (2ª edición, ASM Press, Washington, D. C., EE.UU., 1996) 10 2) Raftery y Yarus, EMBO Journal 6 (5): 1499-1506, 1987

3) Número de Acceso K01197

15 4) Raftery et al, Journal of Bacteriology 158 (3): 849-859, 1984

5) Raftery et al, Journal of Molecular Biology 190 (3): 513-517, 1986

Tabla 3 20 Lista de supresores opal de acuerdo con la descripción

Nombre del gen/alelo supresor

Nombre del ARNt Aminoácido incorporado Ref.

supT

ARNt 1 de glicina Gly 1

sumA

ARNt 2 de glicina Gly 1

ims, mutA

ARNt 3 de glicina Gly 1

supU (= su9)

ARNt de triptófano Trp 1

selC

ARNt de serina Selenocisteína 2

GLNA3U70

ARNt de glutamina Gln 3

trpT176

ARNt de triptófano Trp 4

ARG

ARNt de arginina Arg 5

ARGII

ARNt de arginina Arg 5

LysA20

ARNt de lisina Arg 5

Referencias (Ref.) para la Tabla 3: 25 1) Neidhard (Ed.) “Escherichia coli and Salmonella, Cellular and Molecular Biology” (2ª edición, ASM Press, Washington, D. C., EE.UU., 1996)

2) Schön et al, Nucleic Acids Research 17 (18): 7159-7165, 1989 30 3) Weygand-Durasevic et al, Journal of Molecular Biology 240 (2): 111-118, 1994

4) Raftery et al, Journal of Bacteriology 158 (3): 849-859, 1984

35 5) McClain et al, Proceedings of the National Academy of Science USA, 87 (23): 9260-9264, 1990.

En un primer aspecto de la invención, se encontró que bacterias de la especie Escherichia coli, productoras de Ltreonina, que son resistentes a AHV y que contienen un codón de terminación del tipo ámbar están adicionalmente mejoradas en su potencia para producir aminoácidos cuando en ellas se incorpora un ARNt supresor procedente del supresor ámbar, en donde el codón de terminación del tipo ámbar se encuentra dentro de la región codificadora del gen rpoS correspondiente a la posición 33 en la secuencia de aminoácidos de la proteína RpoS de acuerdo con SEQ ID No. 2.

Como resultado de las medidas de acuerdo con la invención, la actividad o concentración de la proteína RpoS o factor 038 se reduce en general a > 0 hasta 75%, por ejemplo 1 a 75%, a > 0 hasta 50%, por ejemplo 0,5 a 50%, a > 0 hasta 25%, por ejemplo 0,25 a 25%, a > 0 hasta 10%, por ejemplo 0,1 a 10%, o a > 0 hasta 5%, por ejemplo 0,05 a 5% de la actividad o concentración de la proteína de tipo salvaje, o de la actividad o concentración de la proteína en el microorganismo inicial. La presencia del o de los supresores mencionados previene la actividad de las proteínas RpoS o factor 038 que caen hasta 0.

Por consiguiente, la invención proporciona un procedimiento para disminuir la actividad intracelular o concentración de las proteínas RpoS o factor 0 38 en bacterias de la especie Escherichia coli, productoras de L-treonina, que son resistentes a AHV, y en donde en estas bacterias 1) un codón de terminación del tipo ámbar se incorpora en la región codificadora del gen rpoS, y 2) en estas bacterias se incorporan el o los genes o el o los alelos de ARNt supresores correspondientes que codifican el ARNt supresor ámbar, supE, en donde el codón de terminación del tipo ámbar se encuentra dentro de la región codificadora del gen rpoS correspondiente a la posición 33 en la secuencia de aminoácidos de la proteína RpoS, de acuerdo con SEQ ID No. 2

La invención proporciona también un procedimiento para preparar bacterias de la especie Escherichia coli, productoras de L-treonina, que son resistentes a AHV, y en donde en estas bacterias 1) un codón de terminación del tipo ámbar se incorpora en la región codificadora del gen rpoS, y 2) en estas bacterias se incorpora un ARNt supresor ámbar, supE, en donde el codón de terminación del tipo ámbar se encuentra dentro de la región codificadora del gen rpoS correspondiente a la posición 33 en la secuencia de aminoácidos de la proteína RpoS, de acuerdo con SEQ ID No. 2

Finalmente, la invención proporciona bacterias de la especie Escherichia coli, productoras de L-treonina, que son resistentes a AHV y que contienen un codón de terminación del tipo ámbar en la región codificadora del gen rpoS y contienen el correspondiente ARNt supresor, supE, en donde el codón de terminación del tipo ámbar se encuentra dentro de la región codificadora del gen rpoS correspondiente a la posición 33 en la secuencia de aminoácidos de la proteína RpoS, de acuerdo con SEQ ID No. 2

Con respecto a la región codificadora del gen rpoS, los siguientes segmentos han demostrado ser particularmente ventajosos para la incorporación de un codón de terminación elegido del grupo ámbar, ocre y opal, preferiblemente ámbar:

•

segmento de la región codificadora entre las posiciones 2 y 95, por ejemplo la posición 33, correspondiente a la secuencia de aminoácidos de la proteína RpoS, dado en SEQ ID No. 1 o SEQ ID No. 2,

•

segmento de la región codificadora entre las posiciones 99 y 168, por ejemplo la posición 148, correspondiente a la secuencia de aminoácidos de la proteína RpoS, dado en SEQ ID No. 1 o SEQ ID No. 2,

•

segmento de la región codificadora entre las posiciones 190 y 245, correspondiente a la secuencia de aminoácidos de la proteína RpoS, dado en SEQ ID No. 1 o SEQ ID No. 2,

•

segmento de la región codificadora entre las posiciones 266 y 281, por ejemplo la posición 270, correspondiente a la secuencia de aminoácidos de la proteína RpoS, dado en SEQ ID No. 1 o SEQ ID No. 2, y

•

segmento de la región codificadora entre las posiciones 287 y 314, por ejemplo la posición 304, correspondiente a la secuencia de aminoácidos de la proteína RpoS, dado en SEQ ID No. 1 o SEQ ID No.

2.

De acuerdo con la descripción, en el caso de que la región codificadora del gen rpoS tenga un codón de terminación del tipo ámbar, se utiliza preferiblemente un supresor ámbar elegido del grupo en la Tabla 1.

De acuerdo con la descripción, en el caso de que la región codificadora del gen rpoS tenga un codón de terminación del tipo ocre, se utiliza preferiblemente un supresor ocre elegido del grupo en la Tabla 2.

De acuerdo con la descripción, en el caso de que la región codificadora del gen rpoS tenga un codón de terminación del tipo opal, se utiliza preferiblemente un supresor opal elegido del grupo en la Tabla 3.

Dependiendo del supresor utilizado, las bacterias forman un producto génico RpoS o factor 038 que contiene, en la posición 33 de la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO. 2, en lugar de L-glutamina, un aminoácido elegido del grupo L-serina, L-tirosina, L-leucina, L-triptófano, L-lisina, L-alanina, L-arginina, L-fenilalanina, L-cisteína, L-prolina, L-histidina, L-treonina y L-valina. Así, por ejemplo, cuando se utiliza el supresor supD, se incorpora Lserina en lugar de L-glutamina. Cuando se utilizan supresores que incorporan el aminoácido L-glutamina en la posición 33 del producto génico RpoS o factor 038 tal como, por ejemplo, supE, no se altera la secuencia de aminoácidos.

Son muy particularmente preferidas bacterias de la especie Escherichia coli, productoras de L-treonina, que contienen el alelo rpoS dado en SEQ ID NO. 3 y el supresor supE dado en SEQ ID NO. 4.

La invención proporciona también, correspondiente al primer aspecto de la invención, un procedimiento para preparar aminoácidos o aditivos para piensos con contenido en aminoácidos, en el que se realizan las siguientes etapas:

a) fermentación de bacterias de a

la especie Escherichia coli, que son resistentes al ácido -amino-hidroxivalérico y que contienen 1) dentro de la región codificadora del gen rpoS correspondiente a la posición 33 en la secuencia de aminoácidos de la proteína RpoS de acuerdo con SEQ ID No. 2 un codón de terminación del tipo ámbar y 2) el correspondiente supresor ámbar, supE,

b) enriquecimiento de la L-treonina en el medio o en las células de los microorganismos, y

c) aislamiento de la L-treonina, en donde opcionalmente constituyentes procedentes del caldo de fermentación y/o de la biomasa en su totalidad, o una proporción de los mismos (> 0 a 100) permanecen en el producto.

Los aditivos para piensos de acuerdo con la invención se pueden procesar ulteriormente en la forma líquida y también en la forma sólida.

Mutaciones por medio de las cuales se introduce un codón de terminación en el marco de lectura del gen rpoS se pueden producir directamente en el hospedante relevante por métodos de mutagénesis clásicos utilizando sustancias mutagénicas tales como, por ejemplo, N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina, o luz ultravioleta.

Además, para la mutagénesis se pueden utilizar métodos in vitro que utilizan ADN de rpoS aislado tal como, por ejemplo, tratamiento con hidroxilamina (J. H. Miller: A Short Course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1992). Finalmente, se pueden utilizar procedimientos para la mutagénesis orientada al lugar utilizando oligonucleótidos mutagénicos (T. A. Brown: Gentechnologie für Einsteiger, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1993) o la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) tal como se describe en el libro de Newton y Graham (PCR, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1994). Las mutaciones producidas se pueden determinar y someter a ensayo mediante secuenciación del ADN, por ejemplo utilizando el método de Sanger et al. (Proceedings of the National Academy of Science USA 74 (12): 5463-5467 (1977)).

Mutaciones adecuadas se pueden incorporar en las cepas deseadas con ayuda de procedimientos de recombinación por medio de reemplazo de genes o alelos. Un método comúnmente utilizado es el método del reemplazo de genes con ayuda de un derivado de pSC101, pMAK705, de replicación condicional, según se describe por Hamilton et al. (Journal of Bacteriology 171 (9): 4617-4622 (1989)). También se pueden utilizar otros métodos descritos en la técnica anterior tales como, por ejemplo, el método de Martínez-Morales et al. (Journal of Bacteriology 181 (22): 7143-7148 (1999)) o el método de Boyd et al. (Journal of Bacteriology 182 (3): 842-847 (2000)).

También es posible transferir mutaciones mediante conjugación o transducción a las cepas deseadas.

Finalmente, es posible utilizar alelos del gen rpoS conocidos de la técnica anterior, que contienen un codón de terminación en el marco de lectura e introducir éstos en las cepas deseadas utilizando los métodos arriba descritos.

Las cepas obtenidas de la manera descrita anteriormente son preferiblemente mutantes, transformantes, recombinantes, transductantes o transconjugantes.

Con el fin de producir mutaciones supresoras en genes de ARNt, se pueden utilizar básicamente los mismos métodos que los descritos para el gen rpoS. También se pueden utilizar métodos que utilicen la manipulación por ingeniería de oligonucleótidos tales como los que fueron utilizados, por ejemplo, por Khorana (Science 203 (4381): 614-625 (1979)). Además, en particular, se pueden utilizar los genes supresores de ARNt utilizados en la técnica anterior.

Métodos para la búsqueda, caracterización y determinación de la eficacia de supresores de ARNt se describen en la técnica anterior, por ejemplo en Miller y Albertini (Journal of Molecular Biology 164 (1): 59-71 (1983)), en McClain y Foss (Journal of Molecular Biology 202 (4): 697-709 (1988)), en Normanly et al. (Journal of Molecular Biology 213 (4): 719-726 (1990)), en Kleina et al. (Journal of Molecular Biology 213: 705-717 (1990)), en Lesley et al. (Promega Notes Magazine 46, pág. 02. (1994)) y en Martin et al. (Nucleic Acids Research 23 (5): 779-784 (1995)).

Además de ello, para la producción de L-treonina con bacterias de la especie Escherichia coli, puede ser ventajoso, además de incorporar un codón de terminación en la región codificadora del gen rpoS y un correspondiente supresor para un codón de terminación para potenciar una o más enzimas de la conocida vía de la biosíntesis de treonina, o enzima o enzimas para el metabolismo anaplerótico o enzimas para la producción de nitocotinamida-adeninadinucleótido fosfato reducido o enzimas para la glucólisis o enzimas PTS o enzimas para el metabolismo del azufre.

La expresión “potenciación” a este respecto describe un aumento en la actividad intracelular o concentración de una

o más enzimas o proteínas en un microorganismo que son codificadas por el correspondiente ADN, por ejemplo aumentando el número de copias del gen o genes, utilizando un promotor fuerte o un gen que codifica una correspondiente enzima o proteína con una mayor actividad y, opcionalmente, combinando estas medidas.

El uso de genes endogénicos es generalmente preferido. “Genes endogénicos” o “secuencias de nucleótidos endogénicos” se entienden que son los genes o las secuencias de nucleótidos que están presentes en la población de una especie.

Utilizando las medidas de potenciamiento, en particular la sobre-expresión, la actividad o concentración de la correspondiente proteína se incrementa generalmente en al menos un 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% o 500%, hasta a lo sumo 1000% o 2000%, con respecto a la proteína de tipo salvaje o a la actividad o concentración de la proteína en el microorganismo inicial.

Así, por ejemplo, se pueden potenciar, en particular sobre-expresar, uno o más genes elegidos del siguiente grupo:

•

el operón thrABC que codifica aspartato quinasa, homoserina deshidrogenasa, homoserina quinasa y treonina sintasa (documento US-A-4.278.765),

•

el gen pyc que codifica piruvato carboxilasa (documento DE-A-19 831 609),

•

el gen pps que codifica fosfoenolpiruvato sintasa (Molecular and General Gentics 231 (2): 332-336 (1992)),

•

el gen ppc que codifica fosfoenolpiruvato carboxilasa (Gene 31: 279-283 (1984)),

•

los genes pntA y pntB que codifican transhidrogenasa (European Journal of Biochemistry 158: 647-653 (1986)),

•

el gen rhtB que imparte resistencia a homoserina (documento EP-A-0 994 190),

•

el gen mqo que codifica malato:quinona oxidorreductasa (documento DE 100 348 33.5),

•

el gen rhtC que imparte resistencia a treonina (documento EP-A-1 013 765),

•

el gen thrE procedente de Corynebacterium glutamicum que codifica la proteína de exportación de treonina (documento DE 100 264 94.8),

•

el gen gdhA que codifica glutamato deshidrogenasa (Nucleic Acids Research 11: 5257-5266 (1983); Gene

23: 199-209 (1983)),

•

el gen hns que codifica la proteína HLP-II de unión a ADN (Molecular and General Genetics 212: 199-202 (1988)),

•

el gen pgm que codifica fosfoglucomutasa (Journal of Bacteriology 176: 5847- 5851 (1994)),

•

el gen fba que codifica fructosa bifosfato aldolasa (Biochemical Journal 257: 529-534 (1989)),

•

el gen ptsI procedente del operón ptsHIcrr que codifica la enzima I en el sistema de fosfotransferasa (PTS) (Journal of Biological Chemistry 262: 16241-16253 (1987)),

•

el gen ptsH procedente del operón ptsHIcrr que codifica la proteína de fosfohistidina, hexosa fosfotransferasa en el sistema de fosfotransferasa (PTS) (Journal of Biological Chemistry 262: 16241-16253 (1987)),

•

el gen crr procedente del operón ptsHIcrr que codifica el componente IIA específico para glucosa en el sistema de fosfotransferasa (PTS) (Journal of Biological Chemistry 262: 16241-16253 (1987)),

•

el gen ptsG que codifica el componente IIBC específico para glucosa en el sistema de fosfotransferasa (PTS) (Journal of Biological Chemistry 261: 16398-16403 (1986)),

•

el gen lrp que codifica el regulador para el regulón de leucina (Journal of Biological Chemistry 266: 1076810774, (1991)),

•

el gen csrA que codifica el regulador global (Journal of Bacteriology 175: 4744-4755 (1993)),

•

el gen fadR que codifica el regulador para el regulón fad (Nucleic Acids Research 16: 7995-8009 (1988)),

•

el gen iclR que codifica el regulador para el metabolismo intermedio central (Journal of Bacteriology 172: 2642-2649 (1990)),

•

el gen mopB que codifica la chaperona de 10 kd (Journal of Biological Chemistry 261: 12414-12419 (1986)), que también se conoce por el nombre groES,

•

el gen ahpC procedente del operón ahpCF que codifica la subunidad pequeña en la alquil hidroperóxido reductasa (Proceedings of the National Academy of Sciences USA 92: 7617-7621 (1995)),

•

el gen ahpF procedente del operón ahpCF que codifica la subunidad grande en la alquil hidroperóxido reductasa (Proceedings of the National Academy of Sciences USA 92: 7617-7621 (1995)),

•

el gen cysK que codifica cisteína sintasa A (Journal of Bacteriology 170: 3150- 3157 (1988)),

•

el gen cysB que codifica el regulador para el regulón cys (Journal of Biological Chemistry 262: 5999-6005 (1987)),

•

el gen cysJ procedente del operón cysJIH que codifica la flavoproteína en NADPH sulfito reductasa (Journal of Biological Chemistry 264: 15796-15808 (1989), Journal of Biological Chemistry 264: 15726-15737 (1989)),

•

el gen cysH procedente del operón cysJIH que codifica adenilsulfato reductasa (Journal of Biological Chemistry 264: 15796-15808 (1989), Journal of Biological Chemistry 264: 15726-15737 (1989)), y

•

el gen cysI procedente del operón cysJIH que codifica la hemoproteína en NADPH sulfito reductasa (Journal of Biological Chemistry 264: 15796-15808 (1989), Journal of Biological Chemistry 264: 15726-15737 (1989)).

Además de ello, puede ser ventajoso para la producción de L-treonina con bacterias de la especie Escherichia coli, además de incorporar un codón de terminación en la región codificadora del gen rpoS y el correspondiente supresor para el codón de terminación, atenuar, en particular desconectar o reducir la expresión de uno o más genes elegidos del siguiente grupo:

•

el gen tdh que codifica treonina deshidrogenasa (Ravnikar y Somerville; Journal of Bacteriology 169: 47164721 (1987)),

•

el gen mdh que codifica malato deshidrogenasa (E. C. 1. 1. 1. 37) (Vogel et al.; Archives in Microbiology

149: 36-42 (1987));

•

el producto génico del marco de lectura abierto (orf – siglas en inglés) yjfA (Número de Acceso AAC77180 en el Centro Nacional para la Información de Biotecnología (NCBI, Bethesda, MD, EE.UU.)),

•

el producto génico del marco de lectura abierto (orf) ytfP (Número de Acceso AAC77179 en el Centro Nacional para la Información de Biotecnología (NCBI, Bethesda, MD, EE.UU.)),

•

el gen pckA que codifica la enzima fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (Medina et al.; Journal of Bacteriology

172: 7151-7156 (1990)),

•

el gen poxB que codifica piruvato oxidasa (Grabau y Cronan; Nucleic Acids Research 14 (13): 5449-5460 (1986)),

•

el gen aceA que codifica la enzima isocitrato liasa (Matsuoko y McFadden; Journal of Bacteriology 170: 4528-4536 (1988)),

•

el gen dgsA que codifica el regulador DgsA en el sistema de fosfotransferasa (Hosono et al.; Bioscience, Biotechnology and Biochemistry 59: 256-261 (1995)), que también se conoce por el nombre de gen mlc, y

•

el gen fruR que codifica el represor de fructosa (Jahreis et al.; Molecular and General Genetics 226: 332336 (1991)), que también se conoce por el nombre de gen cra.

La expresión “atenuación” a este respecto describe la disminución o la desconexión de la actividad intracelular o concentración de una o más enzimas o proteínas en un microorganismo que son codificadas por el correspondiente ADN, por ejemplo utilizando un promotor débil o un gen o alelo que codifica una enzima correspondiente con una baja actividad o que inactiva la correspondiente enzima, proteína o gen y, opcionalmente, combinar estas medidas.

Utilizando las medidas de atenuación, incluyendo la disminución de la expresión, la actividad o concentración de la proteína correspondiente se reduce generalmente a 0 hasta 75%, 0 hasta 50%, 0 hasta 25%, 0 hasta 10% o 0 hasta 5% de la actividad o concentración de la proteína de tipo salvaje, o la actividad o concentración de la proteína en el microorganismo inicial.

También se ha demostrado que en el caso de los genes tdh, mdh, pckA, poxB, aceA, dgsA y fruR arriba mencionados y de los marcos de lectura abiertos (ORF) yjfA e ytfP y también para los genes ugpB (gen que codifica la proteína del enlace periplástico en el sistema de transporte sn-glicerina-3-fosfato), aspA (gen aspartato-amonioliasa (= gen aspartasa), aceB (gen que codifica la enzima malato sintasa A) y aceK (gen que codifica la enzima isocitrato deshidrogenasa quinasa/fosfatasa), la atenuación se puede conseguir 1) incorporando un codón de terminación, elegido del grupo ámbar, ocre y opal, en la región codificadora de estos genes, y 2) utilizando simultáneamente un supresor para el correspondiente codón de terminación, elegido del grupo supresor ámbar, supresor ocre y supresor opal. El uso del codón de terminación del tipo ámbar y el supresor ámbar supE ha demostrado ser particularmente ventajoso. La metodología descrita se puede trasladar a cualesquiera genes para los que se pretenda producir una atenuación o desconexión.

Microorganismos de acuerdo con la invención se pueden cultivar en un proceso discontinuo, en un proceso discontinuo de alimentación o en un proceso discontinuo de alimentación repetida. Una revisión de métodos de cultivo conocidos se da en el libro de texto de Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) o en el libro de texto de Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig(/Wiesbaden, 1994)).

El medio de cultivo a utilizar ha de satisfacer de manera apropiada las demandas de las cepas particulares. Descripciones de medios de cultivo para diferentes microorganismos se proporcionan en el libro “Manual of Methods for General Bacteriology” por The American Society for Bacteriology (Washington D. C., EE.UU., 1981)).

Fuentes de carbono que se pueden utilizar son azúcares e hidratos de carbono tales como, p. ej., glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melazas, almidón y, opcionalmente, celulosa, aceites y grasas tales como, p. ej., aceite de soja, aceite de girasol, aceite de cacahuete y aceite de coco, ácidos grasos tales como, p. ej., ácido palmítico, ácido esteárico y ácido linoleico, alcoholes tales como, p. ej., glicerol y etanol, y ácidos orgánicos tal como, p. ej., ácido acético. Estas sustancias se pueden utilizar individualmente o como mezclas.

Fuentes de nitrógeno que se pueden utilizar son compuestos con contenido en nitrógeno orgánico tales como peptonas, extracto de levaduras, extracto de carne, extracto de malta, líquido de maceración de maíz, harina de habas de soja y urea, o compuestos inorgánicos tales como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio. Las fuentes de nitrógeno se pueden utilizar individualmente o como mezclas.

Fuentes de fósforo que se pueden utilizar son ácido fosfórico, dihidrógeno-fosfato potásico o hidrógeno-fosfato dipotásico, o las correspondientes sales con contenido en sodio. El medio de cultivo debe contener también sales de metales tales como, p. ej., sulfato de magnesio o sulfato de hierro, los cuales se requieren para el crecimiento. Además de las sustancias arriba mencionadas se han de utilizar finalmente sustancias para el crecimiento esenciales tales como aminoácidos y vitaminas. Precursores adecuados también se pueden añadir al medio de cultivo. Los materiales de alimentación mencionados se pueden añadir al cultivo en forma de una porción excepcional o se pueden alimentar de una manera adecuada durante el cultivo.

Con el fin de controlar el pH del cultivo, se utilizan de manera apropiada compuestos de carácter básico tales como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, amoníaco o agua amoniacal, o compuestos ácidos tales como ácido fosfórico o ácido sulfúrico. Para controlar el desarrollo de la espuma, se utilizan agentes antiespumantes tales como,

p.

ej., ésteres poliglicólicos de ácidos grasos. Para mantener la estabilidad de los plásmidos, se pueden añadir al medio sustancias de acción selectiva adecuadas tales como, p. ej., antibióticos. Con el fin de mantener unas condiciones aerobias, se introducen en el cultivo oxígeno o mezclas gaseosas con contenido en oxígeno tales como,

p.

ej., aire. La temperatura del cultivo es normalmente de 25ºC a 45ºC y, preferiblemente, es de 30ºC a 40ºC. El cultivo se continúa hasta que se haya formado un máximo de L-aminoácidos. Este objetivo se consigue normalmente en el espacio de 10 horas a 160 horas.

El análisis de aminoácidos se puede realizar utilizando cromatografía de intercambio de aniones, seguido de derivación de ninhidrina, según se describe en Spackman et al. (Analytical Chemistry 30: 1190-1206 (1958)), o se puede realizar utilizando HPLC de fase inversa, según se describe en Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174).

El siguiente microorganismo se depositó como un cultivo puro el 9 de septiembre del 2002 en la Colección Alemana de Microorganismo y Cultivos Celulares (DSMZ, Braunschweig, Alemania) de acuerdo con el Tratado de Budapest:

• Cepa DM1690 de Escherichia coli como DSM 15189

La cepa DSM 15189 contiene un codón de terminación del tipo ámbar en el punto correspondiente a la posición 33 en la secuencia de aminoácidos de la proteína RpoS y un supresor ámbar, y produce treonina.

El procedimiento de acuerdo con la invención se utiliza para la preparación fermentativa de L-treonina.

La presente invención se explica con mayor detalle en lo que sigue, haciendo uso de ejemplos de trabajo.

Los medios mínimo (M9) y universal (LB) para E. coli se describen por J. H. Miller (A Short Course in Bacterial Genetics (1992), Cold Spring Harbor Laboratory Press). El aislamiento de ADN del plásmido procedente de E. coli y todas las técnicas relacionadas con la restricción y tratamiento de Klenow y fosfatasa alcalina se realizan según se describe por Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press). La transformación de E. coli, a menos que se describa de modo diferente, se realiza según se describe en Chung et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 86: 2172-2175 (1989)). Las transducciones P1 se realizan tal como se describe por Lengeler et al. (Journal of Bacteriology 124: 26-38 (1975)).

Ejemplo 1

Transducción del locus del gen scr en la cepa MG1655 de E. coli K12

El regulón scr en el plásmido pUR400 que se produce de forma natural (Schmid et al., Molecular Microbiology 2: 1-8 (1988)) fomenta la capacidad de utilizar sacarosa como una fuente de carbono. Con ayuda del plásmido pKJL710 (Ulmke et al., Journal of Bacteriology 181: 1920-1923 (1999)), que contiene el regulón scr entre las dos repeticiones de secuencia inversa del transposón Tn1721 (Ubben y Schmitt, Gene 41: 154-152 (1986)), seguido de transformación, transposición, conjugación y traducción, el regulón scr se puede transferir al cromosoma de Escherichia coli K12. Una cepa denominada LJ210 contiene el regulón scr integrado en el cromosoma en la posición 6 de acuerdo con Berlyn-Karte. El bacteriófago P1 se multiplica en esta cepa, y la cepa MG1655 de E. coli K12 (Guyer et al., Cold Spring Harbor Symp., Quant. Biology 45: 135-140 (1981)) se infesta con el lisado del fago aislado.

Mediante la extensión en placas sobre medio mínimo con contenido en sacarosa (2 g/l) se obtienen transductantes de MG1655 que pueden utilizar sacarosa como una fuente de carbono. A un clon seleccionado se le da el nombre MG1655scr.

Ejemplo 2

Mutagénesis in-vivo de la cepa MG1655scr

Partiendo de MG1655scr, después de incubación a 37ºC en agar mínimo, al que se le han añadido 2 g/l de sacarosa y 4 g/l de DL-�-hidroxinorvalina (Sigma, Deisenhofen, Alemania), se aíslan mutantes espontáneos que son resistentes al análogo de treonina, ácido a -amino-�-hidroxivalérico (AHV). A un mutante seleccionado se le da el nombre MG1655scrAHVR1.

Ejemplo 3

Incorporación de una mutación del codón de terminación en el gen rpoS en MG1655scrAHVR1 mediante mutagénesis específica del sitio

3.1 Clonación del gen rpoS procedente de MG1655

La cepa MG1655 de Escherichia coli se utiliza como donante de ADN cromosómico. Un fragmento de ADN que contiene la región del gen rpoS a ser mutada en la región central se amplifica utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y oligonucleótidos sintéticos. Partiendo de la secuencia conocida del gen rpoS (Número de Acceso AE000358, SEQ ID No. 1) para Escherichia coli K12, se eligen los siguientes oligonucleótidos cebadores (MWG Biotech, Ebersberg, Alemania) para la PCR:

rpoS9 (SEQ ID No. 7): 5’ CAGTTATAGCGGCAGTACC 3’

rpoS4 (SEQ ID No. 8): 5’ GGACAGTGTTAACGACCATTCTC 3’

El ADN cromosómico de E. coli K12 se aísla de acuerdo con los datos del fabricante utilizando “Qiagen Genomic-tips 100/G” (Qiagen, Hilden, Alemania). Un fragmento de ADN de aproximadamente 2 kpb de longitud se puede aislar utilizando los cebadores específicos bajo condiciones de PCR convencionales (Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press) con vent polimerasa (New England Biolabs GmbH, Frankfurt, Alemania).

El fragmento de ADN amplificado se identifica utilizando electroforesis en gel en un gel de agarosa (al 0,8%) y se purifica con el kit de purificación por PCR QIAquick (Qiagen, Hilden, Alemania). El producto de PRC purificado se liga de acuerdo con los datos del fabricante utilizando el vector pCR-Blunt II-TOPO (kit de clonación por PCR Zero Blunt TOPO, Invitrogen, Groningen, Holanda) y se transforma en la cepa TOP10 de E. coli (Invitrogen, Groningen, Holanda). La selección de las células con contenido en plásmido se realiza en agar LB al que se han añadido 50 mg/l de kanamicina. Después del aislamiento del ADN del plásmido, el vector se somete a ensayo utilizando escisión por restricción y separación en gel de agarosa (al 0,8%). El fragmento de ADN amplificado se somete a ensayo mediante análisis de la secuencia. La secuencia en el producto de PCR concuerda con la secuencia dada en SEQ ID NO. 9. Al plásmido obtenido se le da el nombre de pCRBluntrpoS9-4

3.2 Reemplazo de un codón glutamina por un codón de terminación ámbar mediante mutagénesis específica del sitio

La mutagénesis dirigida al sitio se realiza con el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange (Stratagene, La Jolla, EE.UU.). Para la amplificación lineal se eligen los siguientes oligonucleótidos cebadores:

rpoSamber1 (SEQ ID No. 10): 5’ GGCCTTAGTAGAA (TAG) GAACCCAGTGATAACG 3’

rpoSamber2 (SEQ ID No. 11): 5’ CGTTATCACTGGGTTC (CTA) TTCTACTAAGGCC 3’

Estos cebadores se sintetizan por parte de MWG Biotech. El codón de terminación ámbar, que está destinado a reemplazar a la glutamina en la posición 33 en la secuencia de aminoácidos, se marca con paréntesis en las secuencias de nucleótidos arriba mostradas. El plásmido pCRBluntrpoS9-4 descrito en el Ejemplo 3.1 se utiliza con cada uno de los dos cebadores complementarios a una cadena en el plásmido para la amplificación lineal por medio de la ADN polimerasa PfuTurbo. Durante este alargamiento del cebador se produce un plásmido mutado con cadenas circulares rotas. El producto procedente de la amplificación lineal se trata con DpnI. Esta endonucleasa porta específicamente al ADN molde metilado y semi-metilado. El ADN del vector mutado, roto y recientemente sintetizado se transforma en la cepa XL1 Blue de E. coli (Bullock, Fernández y Short, BioTechniques 5(4) 376-379 (1987)). Después de la transformación, las células XL1 Blue reparan las roturas en los plásmidos mutados. La selección de los transformantes se realiza en medio LB con 50 mg/l de kanamicina. El plásmido obtenido se somete a ensayo después del aislamiento del ADN por medio de escisión por restricción y separación en gel de agarosa (al 0,8%). La secuencia de ADN del fragmento de ADN mutado se somete a ensayo mediante análisis de la secuencia. La secuencia concuerda con la secuencia dada en SEQ ID NO. 3 en la región del gen rpoS. Al plásmido obtenido se le da el nombre pCRBluntrpoSamber.

3.3 Construcción del vector de reemplazo pMAK705rpoSamber

El plásmido pCRBluntrpoSamber descrito en el Ejemplo 3.2 se escinde con las enzimas de restricción BamHI y XbaI (Gibco Life Technologies GmbH, Karlsruhe, Alemania). Después de la separación en un gel de agarosa (al 0,8%), el fragmento rpoS de una longitud de aproximadamente 2,1 kpb, que contiene la mutación, se aísla con el kit de extracción en gel QIAquick (Qiagen, Hilden, Alemania). El plásmido pMAK705 descrito en Hamilton et al. (Journal of Bacteriology 171: 4617-4622 (1989)) se escinde con las enzimas de restricción BamHI y XbaI y se liga con el fragmento de rpoS aislado (T4-ADN-ligasa, Amersham-Pharmacia, Freiburg, Alemania). Después, la cepa DH5a de

E. coli (Grant et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 87: 4645-4649 (1990)) se transforma con la tanda de ligamiento (Hanahan, In. DNA Cloning. A Practical Approach. Vol. 1, ILR-Press, Cold Spring Habor, Nueva York, 1989). La selección de células que contienen el plásmido se realiza extendiendo en placas la tanda de transformación sobre agar LB (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989) que está suplementado con 20 mg/l de cloranfenicol.

El ADN del plásmido se aísla de un transformante utilizando el kit QIAquick Spin Miniprep de Qiagen y se somete a ensayo mediante escisión por restricción con las enzimas BamHI, EcoRI, EcoRV, StuI y XbaI, seguido de electroforesis en gel de agarosa. Al plásmido se le da el nombre pMAK705rpoSamber. En la figura 1 se muestra un mapa del plásmido.

3.4 Mutagénesis específica del sitio del gen rpoS de la cepa MG1655scrAHVR1 de E. coli

Para la mutagénesis específica del sitio del gen rpoS, la cepa MG1655scrAHVR1 descrita en el Ejemplo 2 se transforma con el plásmido pMAK705rpoSamber. El reemplazo del gen se realiza utilizando el proceso de selección descrito en Hamilton et al. (Journal of Bacteriology 171: 4617-4622 (1989)). La prueba de que la mutación del alelo rpoSamber ha tenido lugar en el cromosoma se realiza utilizando el LightCycler de Roche Diagnostics (Mannheim, Alemania). El LightCycler es un instrumento combinado que consiste en un termociclador y un fluorímetro.

En la primera fase, una sección de ADN de aproximadamente 0,3 kpb de longitud que contiene el sitio de mutación, se amplifica por medio de PCR (Innis et al., PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press) utilizando los siguiente oligonucleótidos cebadores:

rpoSLC1 (SEQ ID No. 12): 5’ CGGAACCAGGCTTTTGCTTG 3’

rpoSLC2 (SEQ ID No. 13): 5’ GCGCGACGCGCAAAATAAAC 3’

En la segunda fase, la presencia de la mutación se demuestra utilizando el análisis de la curva de fusión (Lay et al., Clinical Chemistry 43: 2262-2267 (1997)) con dos oligonucleótidos adicionales de diferentes longitudes y marcados con diferentes colorantes fluorescentes (LighCycler (LC) – Red640 y fluoresceína) que se hibridan en la región del sitio de mutación, utilizando el método de “Transferencia de Energía por Resonancia de Fluorescencia” (FRET – siglas en inglés).

rpoSamberC (SEQ ID No. 14): 5’ LC-Red640 – CTTAGTAGAACAGGAACCCAGTG – (P) 3’

rpoSamberA (SEQ ID No. 15): 5’ GATGAGAACGGAGTTGAGGTTTTTGACGAAAAGG – Fluoresceína 3’

Los cebadores mostrados para PCR son sintetizados por MWG Biotech (Ebersberg, Alemania), y los oligonucleótidos para la hibridación se sintetizan por TIB MOLBIOL (Berlín, Alemania).

De este modo, se identifica un clon que contiene una base timidina en lugar de una base citosina en la posición 952 en la secuencia de ADN para el producto de PCR rpoS (SEQ ID No. 9). El triplete de bases timina-adenina-guanina está presente en las posiciones 97 – 99 de la secuencia codificadora para el alelo rpoS (SEQ ID No. 3) y codifica un codón de terminación ámbar que conduce a la terminación de la traducción. A este clon se le da el nombre MG1655scrAHVR1rpoS.

Ejemplo 4

Selección in-vivo de una mutación del supresor ámbar en la cepa MG1655scrAHVR1rpoS

4.1 Construcción de un vector con un codón de terminación ámbar en el gen Cat

Para la selección de una mutación del supresor, un codón de terminación ámbar se incorpora en el gen Cat que codifica cloranfenicol acetil transferasa y que imparte resistencia al antibiótico cloranfenicol.

Para este fin, el bloque del gen Cat se liga en el vector pTrc99A linearizado con HindIII (ambos de Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemania). La cepa Dh5a de E. coli (Grant et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 87: 4645-4649 (1990)) se transforma con la tanda de ligamiento (Hanahan, In. DNA Cloning. A Practical Approach. Vol. 1, ILR-Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989). La selección de células que contienen el plásmido se realiza extendiendo en placas la tanda de transformación sobre agar LB (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2ª Ed., Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989) que está suplementado con 50 mg/l de ampicilina. El ADN del plásmido se aísla de un transformante utilizando el kit QIAquick Spin Miniprep de Qiagen y se somete a ensayo mediante escisión por restricción, seguido de electroforesis en gel de agarosa. Al plásmido se le da el nombre pTrc99Acat.

Con el fin de incorporar un codón de terminación ámbar en la región codificadora del gen cat, partiendo de la secuencia para el gen cat, cebadores que contienen los sitios de escisión para las enzimas de restricción AccIII y MscI son sintetizados por MWG Biotech, Ebersberg, Alemania. Los sitios de reconocimiento para las enzimas de restricción se marcan mediante subrayado en las secuencias de nucleótidos mostradas más abajo. En el cebador catAccIII, detrás del sitio de escisión AccIII, dos codones ATG que codifican el aminoácido metionina en las posiciones 75 y 77 en la proteína cat se transforman en codones TAG. Los codones ámbar se muestran dentro de paréntesis en las secuencias de nucleótidos dadas más abajo.

catAccIII: 5’ GCTCATCCGGAATTCCGT (TAG) GCA (TAG) AAAG 3’ (SEQ ID No 16)

catMscI: 5’ GTCCATATTGGCCACGTTTAAATC 3’ (SEQ ID No. 17)

Para la PCR se utiliza ADN del plásmido procedente del vector pTrc99Acat. Un fragmento de ADN de aproximadamente 300 pb de longitud se puede amplificar con los cebadores específicos bajo condiciones de PCR convencionales (Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press) utilizando ADN polimerasa de Pfu (Promega Corporation, Madison, EE.UU.). El producto de PCR se escinde con las enzimas de restricción AccIII y MscI. El vector pTrc99Acat también se digiere con las enzimas AccIII y MscI, se separa en gel y se aísla un fragmento de 4,7 kpb de longitud utilizando el kit de extracción en gel QIAquick. Los dos fragmentos se ligan con T4 ADN ligasa (Amersham-Pharmacia, Freiburg, Alemania). La cepa XL1-Blue MRF’ de E. coli (Stratagene, La Jolla, EE.UU.) se transforma con la tanda de ligamiento, y células que contienen el plásmido se seleccionan en agar LB al que se han añadido 50ug/ ml de ampicilina. La clonación con éxito se puede demostrar, después del aislamiento del ADN del plásmido, mediante escisión control utilizando las enzimas EcoRI, PvuII, SspI y StyI. Al plásmido se le da el nombre pTrc99Acatamber. En la figura 2 se muestra un mapa del plásmido.

4.2 Selección de clones con un supresor ámbar

La cepa MG1655scrAHVR1rpoS descrita en el ejemplo 3 se transforma con los vectores pTrc99Acat y pTrc99Acatamber. La selección se realiza en agar LB que ha sido suplementado con 20 ó 50 ug/ml de cloranfenicol. Clones resistentes a cloranfenicol, que han sido transformados con el vector pTrc99Acatamber se transfieren a agar LB, al que se han añadido 50 ug/ml de am picilina, utilizando un mondadientes. El ADN del plásmido se aísla de cloranfenicol y clones resistentes a ampicilina. El vector pTrc99Acatamber se identifica mediante escisión por restricción.

Un transformante resistente a cloranfenicol MG1655scrAHVRrpoS/pTrc99Acatamber se cura mediante el plásmido pTrc99Acatamber mediante sobre-inoculación varias veces en medio LB y se le da el nombre DM1690.

4.3 Identificación de la mutación del supresor ámbar en DM1690 4.3.1. Testado de la mutación supD

Una mutación conocida, que conduce a la supresión de codones ámbar, está presente en el gen serU que codifica ARNt-2 de serina. El alelo se denomina supD, el ARNt reconoce codones ámbar e incorpora serina. En la secuencia para el gen supD60 (Número de Acceso M10746), el anticodón citosina adenina adenina en el gen serU de tipo salvaje se modifica mediante reemplazo de bases para dar citosina timina adenina y, así, reconoce codones uracilo adenina guanina.

Una posible mutación en el gen serU cromosómico se puede detectar utilizando el LightCycler de Roche Diagnostics (Mannheim, Alemania). El LightCycler es un instrumento combinado que consiste en un termociclador y un fluorímetro.

En la primera fase, una sección de ADN de aproximadamente 0,3 kpb de longitud que contiene el sitio de mutación se amplifica mediante PCR (Innis et al., PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press) utilizando los siguientes oligonucleótidos:

serULC1 (SEQ ID No. 18): 5’ CTTGTACTTTCCAGGGCCAC 3’

serULC2 (SEQ ID No. 19): 5’ TTTAGGAAAAGCAAGGCGGG 3’

En la segunda fase, la presencia de la mutación se demuestra utilizando el análisis de la curva de fusión (Lay et al., Clinical Chemistry 43: 2262-2267 (1997)) con dos oligonucleótidos adicionales de diferentes longitudes y marcados con diferentes colorantes fluorescentes (LightCycler (LC) – Red640 y fluoresceína) que se hibridan en la región del sitio de mutación, utilizando el método de “Transferencia de Energía por Resonancia de Fluorescencia” (FRET).

serUC (SEQ ID No. 20): 5’ LC-Red640 – TCCGGTTTTCGAGACCGGTC – (P) 3’

serUA (SEQ ID No. 21): 5’ GAGGGGGATTTGAACCCCCGGTAGAGTTGCCCCTA– Fluoresceína 3’

Los cebadores mostrados para PCR son sintetizados por MWG Biotech (Ebersberg, Alemania), y los oligonucleótidos para la hibridación son sintetizados por TIB MOLBIOL (Berlín, Alemania).

Se puede demostrar que el gen serU de tipo salvaje está presente en DM1690 y, así, no existe mutación supD alguna.

4.3.2. Análisis de la secuencia del alelo supE en DM1690

Otra mutación conocida, que conduce a la supresión de codones ámbar, está presente en el gen glnV que codifica ARNt-2 de glutamina. El alelo se denomina supE, el ARNt reconoce codones ámbar e incorpora glutamina. En la secuencia para el gen glnV (Número de Acceso AE000170), el anticodón citosina timina guanina en el gen glnV de tipo salvaje está modificado por reemplazo de bases para dar citosina timina adenina, y reconoce codones de uracilo adenina guanina.

Partiendo de la secuencia conocida de la región glnV de Escherichia coli K12 (Número de Acceso AE000170), los siguientes oligonucleótidos cebadores (MWG Biotech, Ebersberg, Alemania) se eligen para la PCR:

glnX1 (SEQ ID No. 22): 5 5’ CTGGCGTGTTGAAACGTCAG 3’

glnX2 (SEQ ID No. 23):

5’ CACGCTGTTCGCAACCTAACC 3’

El ADN cromosómico procedente de DM1690, utilizado para la PCR, se aísla de acuerdo con los datos del fabricante utilizando “Qiagen Genomic-tips 100/G” (Qiagen, Hilden, Alemania). Un fragmento de ADN de aproximadamente 1 kpb de longitud se puede aislar utilizando los cebadores específicos bajo condiciones de PCR convencionales (Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press) con vent polimerasa (New England Biolabs GmbH, Frankfurt, Alemania). El producto de PCR se purifica con el kit de purificación por PCR

15 QIAquick y se secuencian por los Servicios de Secuenciación de Qiagen (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania). La secuencia obtenida concuerda con la SEQ ID No. 4 en la región del gen glnV.

La cepa DM1690 posee el alelo supE y suprime codones ámbar al incorporar glutamina.

Ejemplo 5

Preparación de L-treonina utilizando las cepas MG1655scrAHVR1, MG1655scrAHVR1rpoS y DM1690

Las cepas MG1655scrAHVR1, MG1655scrAHVR1rpoS y DM1690 se multiplicaron en medio mínimo con la siguiente

25 composición: 3,5 g/l de Na2HPO4*2H2O, 1,5 g/l de KH2PO4, 1 g/l de NH4Cl, 0,1 g/l de MgSO4*7H2O, 2 g/l de sacarosa, 20 g/l de agar. Los cultivos se incuban durante 5 días a 37ºC. La formación de L-treonina se vigila en cultivos en tandas de 10 ml que están contenidos en matraces Erlenmeyer de 100 ml. Para este fin, se inoculan 10 ml de medio de precultivo con la siguiente composición: 2 g/l de extracto de levaduras, 10 g/l de (NH4)2SO4, 1 g/l de KH2PO4, 0,5 g/l de MgSO4*7H2O, 15 g/l de CaCO3, 20 g/l de sacarosa, y la mezcla se incuba durante 16 horas a 37ºC y 180 rpm en una incubadora ESR de Kühner AG (Birsfelden, Suiza). Porciones de 250 ul de este precultivo en cada uno de los casos se transfieren a 10 ml de medio de producción (25 g/l de (NH4)2SO4, 2 g/l de KH2PO4, 1 g/l de MgSO4*7H2O, 0,03 g/l de FeSO4*7H2O, 0,018 g/l de MnSO4*1H2O, 30 g/l de CaCO3, 20 g/l de sacarosa) y se incuban durante 48 horas a 37ºC. Después de la incubación, se determina la densidad óptica (DO) de la suspensión de cultivo utilizando un fotómetro LP2W de Dr. Lange (Berlín, Alemania) a una longitud de onda de medición de 660 nm.

35 Después, la concentración de L-treonina formada se determina en el líquido sobrenadante filtrado en condiciones estériles utilizando un analizador de aminoácidos de Eppendorf-BioTronik (Harmburgo, Alemania) por medio de cromatografía de intercambio de iones y reacción post-columna con detección con ninhidrina.

La Tabla 4 proporciona los resultados del ensayo

Cepa

DO (660 nm) L-treonina g/l

MG1655scrAHVR1

5,6 2,15

MG1655scrAHVR1rpoS

5,3 2,34

DM1690

5,2 2,46

Breve descripción de las Figuras: 45 Figura 1: pMAK705rpoSamber

Figura 2: pTrc99Acatamber

Los datos relativos a la longitud han de considerarse como datos aproximados. Las abreviaturas y nombres

utilizados se definen como sigue: cat: gen de resistencia a cloranfenicol rep-ts: región de replicación sensible a la temperatura del plásmido pSC101

55 rpoS: región codificadora del gen rpoS 17

Amp: gen de resistencia a ampicilina lacI: gen para el gen represor en los promotores trc Ptrc: región del promotor trc, inducible por IPTG 5S: región de ARNr de 5S rrnBT: región del terminador de ARNr Las abreviaturas para las enzimas de restricción se definen como sigue:

•

AccIII: endonucleasa de restricción de Acinetobacter calcoaceticus

•

BamHI: endonucleasa de restricción de Bacillus amyloliquefaciens

•

EcoRI: endonucleasa de restricción de Escherichia coli

•

EcoRV: endonucleasa de restricción de Escherichia coli

•

MscI: endonucleasa de restricción de especies de Microcossus

•

PvuII: endonucleasa de restricción de Proteus vulgaris

•

SspI: endonucleasa de restricción de especies de Sphaerotilus

•

StuI: endonucleasa de restricción de Streptomyces tubercidius

•

StyI: endonucleasa de restricción de Salmonella typhi

•

XbaI: endonucleasa de restricción de Xanthomonas badrii

Listado de Secuencias:

<110> Degussa AG

<120> Bacterias productoras de aminoácidos y un procedimiento para preparar L-aminoácidos 5

<130> 010319 BT

<160> 23

<170> PatentIn version 3.1 10 <210> 1

<211> 993

<212> DNA

<213> Escherichia coli

5

<220> <221><222><223> Alelo (1) … (990) Alelo rpoS

21

<220>

<221>

misc_feature

<222>

(97) … (99)

5

<223> codón ámbar

10

<220>

<221>

ARNt

<222>

(1) … (75)

<223>

alelo supE

15

5

<210>

7

24

<211><212><213>

19 DNA secuencia sintética

5

<220> <221><222> <223> Cebador (1) … (19) rpoS9

15

<210><211><212><213> 8 23 DNA secuencia sintética

20

<220> <221><222> <223> Cebador (1) … (23) rpoS4

<210> 10

<211> 31

<212> DNA

<213> secuencia sintética

<220>

<221> Cebador

<222> (1) … (31)

<223> rpoSamber1

<210>

11

<211>

31

<212>

DNA

<213>

secuencia sintética

<220>

<221>

Cebador

<222>

(1) … (31)

<223>

rpoSamber2

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> secuencia sintética

<220>

<221> Cebador

<222> (1) … (20)

<223> rpoSLC1

<210> 13

<211> 20

<212>

DNA

<213>

secuencia sintética

<220>

<221>

Cebador

<222>

(1) … (20)

<223>

rpoSLC2

<210>

14

<211>

23

<212>

DNA

<213>

secuencia sintética

<220>

<221>

Cebador

<222>

(1) … (23)

<223>

rpoSamberC

<210>

15

<211>

34

<212>

DNA

<213>

secuencia sintética

<220>

<221>

Cebador

<222>

(1) … (34)

<223>

rpoSamberA

<210>

16

<211>

31

<212>

DNA

<213>

secuencia sintética

<220>

<221>

Cebador

<222>

(1) … (31)

<223>

catAccIII

<210>

17

<211>

24

<212>

DNA

<213>

secuencia sintética

<220>

<221>

Cebador

<222>

(1) … (24)

<223>

catMscI

<210>

18

<211>

20

<212>

DNA

<213>

secuencia sintética

<220>

<221>

Cebador

<222>

(1) … (20)

<223>

serULC1

<210>

19

<211>

20

<212>

DNA

<213>

secuencia sintética

<220>

<221>

Cebador

<222>

(1) … (20)

<223>

serULC2

<210>

20

<211>

20

<212>

DNA

<213>

secuencia sintética

<220>

<221>

Cebador

<222>

(1) … (20)

<223>

serUC

<210>

21

<211>

35

<212>

DNA

<213>

secuencia sintética

<220>

<221>

Cebador

<222>

(1) … (35)

<223>

serUA

<210> 22

<211> 20

<212><213>

DNA secuencia sintética

5

<220> <221><222> <223> Cebador (1) … (20) glnX1

10

<210>

23

<211>

21

<212>

DNA

<213>

secuencia sintética

15

<220>

<221>

Cebador

<222>

(1) … (21)

<223>

glnX2

20

Claims (8)

1. REIVINDICACIONES

   1.- Bacterias de la especie Escherichia coli, productoras de L-treonina, que son resistentes a ácido a -amino-hidroxivalérico, en donde dichas bacterias contienen 1) dentro de la región codificadora del gen rpoS un (1) codón de terminación del tipo ámbar y (2) el correspondiente supresor ámbar, supE, en donde el codón de terminación del tipo ámbar se encuentra dentro de la región codificadora del gen rpoS correspondiente a la posición 33 en la secuencia de aminoácidos de la proteína RpoS, de acuerdo con SEQ ID No. 2.
2. 2.- Bacterias productoras de L-treonina según la reivindicación 1, en donde producen no más de 40% de L-lisina como un producto secundario, comparado con la cantidad de L-treonina deseada.
3. 3.- Bacterias productoras de L-treonina según la reivindicación 2, en donde producen no más de 10% de L-lisina como un producto secundario, comparado con la cantidad de L-treonina deseada.
4. 4.- Bacterias productoras de L-treonina según la reivindicación 2, en donde producen no más de 5% de L-lisina como un producto secundario, comparado con la cantidad de L-treonina deseada.
5. 5.- Bacterias productoras de L-treonina según las reivindicaciones 1-4, en donde uno o más de los genes elegidos del grupo indicado más abajo se potencian simultáneamente, en particular se sobre-expresan:

   a)

   el operón thrABC que codifica aspartato quinasa, homoserina deshidrogenasa, homoserina quinasa y

   treonina sintasa,

   b)

   el gen pyc que codifica piruvato carboxilasa,

   c)

   el gen pps que codifica fosfoenolpiruvato sintasa,

   d)

   el gen ppc que codifica fosfoenolpiruvato carboxilasa,

   e)

   los genes pntA y pntB que codifican transhidrogenasa,

   f)

   el gen rhtB que imparte resistencia a homoserina,

   g)

   el gen mqo que codifica malato:quinona oxidorreductasa,

   h)

   el gen rhtC que imparte resistencia a treonina,

   i)

   el gen thrE procedente de Corynebacterium glutamicum que codifica la proteína de exportación de treonina,

   j)

   el gen gdhA que codifica glutamato deshidrogenasa,

   k)

   el gen hns que codifica la proteína HLP-II de unión a ADN,

   l)

   el gen pgm que codifica fosfoglucomutasa,

   m)

   el gen fba que codifica fructosa bifosfato aldolasa,

   n)

   el gen ptsI en el operón ptsHIcrr que codifica la enzima I en el sistema de fosfotransferasa (PTS),

   o)

   el gen ptsH en el operón ptsHIcrr que codifica la proteína de fosfohistidina, hexosa fosfotransferasa en el

   sistema de fosfotransferasa (PTS),

   p)

   el gen crr en el operón ptsHIcrr que codifica el componente IIA específico para glucosa en el sistema de

   fosfotransferasa (PTS),

   q) el gen ptsG que codifica el componente IIBC específico para glucosa en el sistema de fosfotransferasa (PTS),

   r) el gen lrp que codifica el regulador en el regulón de leucina,

   s) el gen csrA que codifica el regulador global, 6.- Bacterias productoras de L-treonina según las reivindicaciones 1-5, en donde están atenuados otros genes.

   t)

   el gen fadR que codifica el regulador para el regulón fad,

   u)

   el gen iclR que codifica el regulador para el metabolismo intermedio central,

   v)

   el gen mopB que codifica la chaperona de 10 kd, que también se conoce por el nombre groES,

   w)

   el gen ahpC en el operón ahpCF que codifica la subunidad pequeña de alquil hidroperóxido reductasa,

   x)

   el gen ahpF en el operón ahpCF que codifica la subunidad grande en la alquil hidroperóxido reductasa,

   y)

   el gen cysK que codifica cisteína sintasa A,

   z)

   el gen cysB que codifica el regulador para el regulón cys,

   aa)

   el gen cysJ en el operón cysJIH que codifica la flavoproteína en NADPH sulfito reductasa,

   bb)

   el gen cysH en el operón cysJIH que codifica adenilsulfato reductasa, y

   cc)

   el gen cysI en el operón cysJIH que codifica la hemoproteína en NADPH sulfito reductasa,

6. 7.- Un procedimiento para preparar L-treonina o aditivos de piensos con contenido en L-treonina, que contiene las siguientes etapas

   a) fermentación de bacterias de la especie Escherichia coli, que son resistentes al ácido -amino-

   a hidroxivalérico y que contienen 1) dentro de la región codificadora del gen rpoS correspondiente a la posición 33 en la secuencia de aminoácidos de la proteína RpoS de acuerdo con SEQ ID No. 2 un codón de terminación del tipo ámbar y 2) el correspondiente supresor ámbar, supE,

   b) enriquecimiento de la L-treonina en el medio o en las células de los microorganismos, y

   c) aislamiento de la L-treonina, en donde opcionalmente constituyentes procedentes del caldo de fermentación y/o de la biomasa en su totalidad, o una proporción de los mismos (> 0 a 100) permanecen en el producto.
7. 8.- Un procedimiento según la reivindicación 7, en el que se utiliza la cepa DM1690 de E. coli, depositada como DSM 15189.
8. 9.- Cepa DM1690 de Escherichia coli depositada como DSM 15189 en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (DSMZ, Braunschweig, Alemania).

   pbs

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