ES2689754T3

ES2689754T3 - Procedimiento para la preparación fermentativa de L-aminoácidos utilizando cepas mejoradas de la familia Enterobacteriaceae

Info

Publication number: ES2689754T3
Application number: ES12181028.7T
Authority: ES
Inventors: Brigitte Dr. Bathe; Stella Molck; Horst Dr. Priefert
Original assignee: Evonik Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2012-08-20
Filing date: 2012-08-20
Publication date: 2018-11-15
Anticipated expiration: 2032-08-20
Also published as: PL2700715T3; CN104812906B; RU2672614C2; US10077457B2; KR102109440B1; JP2015525576A; KR20150041803A; MY175904A; US20150353973A1; RU2015109636A; WO2014029592A1; EP2700715B1; CN104812906A; EP2700715A1

Abstract

Procedimiento para la preparación de L-aminoácidos o de aditivos de alimentos para animales con contenido en L-aminoácido, mediante fermentación de un microorganismo de la familia de las Enterobacteriaceae, caracterizado por que se emplea un microorganismo en el que está debilitado el gen proP, de modo que la actividad o concentración de la proteína ProP se redujo a 0 hasta 75 % de la actividad o concentración de la proteína en el microorganismo no recombinante para la correspondiente proteína.

Description

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DESCRIPCION

Procedimiento para la preparación fermentativa de L-aminoácidos utilizando cepas mejoradas de la familia Enterobacteriaceae

La presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación fermentativa de L-aminoácidos utilizando microorganismos de la familia de las Enterobaceriaceae, que contienen un gen proP debilitado, los microorganismos adecuados para la producción, así como polinucleótidos que codifican variantes del transportador ProP.

Compuestos orgánico-químicos, en particular L-aminoácidos con contenido en azufre, tienen una gran importancia industrial. L-cisteína se utiliza como aditivo para alimentos, como sustancia de partida para sustancias activas farmacológicas (p. ej., N-acetilcisteína) y para cosméticos. El aminoácido L-metionina juega un papel preponderante en la alimentación animal. Pertenece a los aminoácidos esenciales que no puede prepararse mediante biosíntesis en el metabolismo de los vertebrados. Por consiguiente, en la cría animal se ha de garantizar que el respectivo aminoácido sea ingerido con el alimento en cantidades suficientes. Dado que, por ejemplo, L-metionina está presente, sin embargo, en pequeñas cantidades en plantas forrajeras clásicas (tales como soja o cereales), en particular para cerdos y aves de corral, con el fin de garantizar una alimentación animal óptima, es ventajoso añadir por mezcladura al pienso metionina como sustancia aditiva. D-metionina puede ser transformada por los vertebrados en L-metionina biológicamente activa. Por lo tanto, al pienso se le añade la mayoría de las veces un racemato a base de D- y L-metionina. L-homocisteína puede ser transformada por los animales, mediante transmetilación, en L- metionina y, por consiguiente, reemplazar a la primera.

Si en lo que sigue se mencionan compuestos orgánico-químicos, se quiere dar a entender con ello uno o varios compuestos elegidos del grupo de los L-aminoácidos, preferiblemente L-aminoácidos con contenido en azufre, en particular L-metiona, L-cisteína, L-cistina, L-homocisteína y L-homocistina. Se prefiere L-metionina.

En el estado de la técnica se preparan aminoácidos tales como metionina mediante síntesis química. En este caso, primeramente, se hace reaccionar acroleína y metilmercaptano para dar 3-metilpropionaldehído, el cual, de nuevo, con cianuro, amoníaco y monóxido de carbono, conduce a hidantoína. Ésta puede ser hidrolizada en última instancia en un racemato, una mezcla equimolar de los dos estereoisómeros D- o bien L-metionina. Dado que la forma biológicamente activa de la molécula representa exclusivamente la forma L, la forma D contenida en el pienso debe ser transformada, primeramente, mediante desaminación y transaminación, en la forma L activa.

A diferencia de metionina, la mayoría de los otros aminoácidos naturales, proteinógenos tales como, p. ej., L- treonina se preparan predominantemente mediante fermentación de microorganismos. En este caso se aprovecha el que microorganismos disponen de vías de biosíntesis correspondientes para la síntesis de los aminoácidos naturales. Además, muchos procedimientos de fermentación con eductos económicos tales como glucosa y sales minerales alcanzan costes de preparación muy favorables y proporcionan, además, la forma L biológicamente activa del aminoácido respectivo.

Es conocido que compuestos orgánico-químicos pueden ser preparados mediante fermentación de cepas de las Enterotacteriaceae, en particular Escherichia coli (E. coli) y Serratia marcescens. Debido a la gran importancia se trabaja constantemente en la mejora de los procedimientos de preparación. Mejoras en el procedimiento pueden afectar a medidas técnicas de la fermentación tales como, p. ej., agitación y abastecimiento de oxígeno, o la composición de los medios nutricios tales como, por ejemplo, la elección del azúcar utilizado o la concentración de azúcar durante la fermentación, o el tratamiento para dar la forma de producto, p. ej., mediante cromatografía de intercambio iónico, o las propias propiedades de rendimiento intrínsecas del microorganismo.

Vías de biosíntesis de aminoácidos son sometidas en cepas de tipo salvaje a un control metabólico estricto, el cual garantiza que los aminoácidos solo se produzcan para la demanda propia de la célula. Una premisa importante para procesos de producción eficientes es, por lo tanto, que estén disponibles microorganismos adecuados que, a diferencia de organismos de tipo salvaje, presentan un rendimiento de producción drásticamente incrementado más allá de la demanda propia (superproducción) para la producción del aminoácido deseado.

Microorganismos superproductores de aminoácidos de este tipo pueden generarse mediante procedimientos de mutación/selección clásicos y/o mediante técnicas recombinantes modernas preestablecidas (“ingeniería metabólica”). En el caso de estas últimas, primeramente, se identifican genes o alelos que, mediante su modificación, activación o inactivación, determinan una superproducción de aminoácidos. Estos genes/alelos son incorporados entonces mediante técnicas de biología molecular en una cepa de microorganismos o son inactivados, de modo que alcanza una superproducción óptima. Sin embargo, a menudo solo la combinación de varias medidas diferentes conduce a una producción realmente eficiente.

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L-metionina se deriva, junto con lisina y treonina de aspartato. Azufre es incorporado en forma de L-cisteína (a través de cistationina como producto intermedio) por trans-sulfuración en L-metionina. El grupo CH3 de la L- metionina procede del metabolismo C1 y es transferida por las metionina-sintasas MetE o MetH a L-homocisteína (véanse: Greene RC (1996) en Neidhardt FC et al. (comp.) "Escherichia coli and Salmonella", 2a edición, págs. 542560). Cepas y procedimientos para la producción fermentativa de L-metionina se describen para E. coli, p. ej., en el documento WO 2006/001616 o WO 2009/043803.

Hondrop et al. describen el crecimiento de E. coli en un medio con contenido en metionina (Protein Engineering for Therapeutics, parte B, tomo 290, n° 11, pág. 59). En el documento EP 2479279 A1 se describe la producción fermentativa de aminoácidos con contenido en azufre, presentando los microorganismos utilizados actividades incrementadas o debilitadas de enzimas y/o transportadores o bien exportadores de metionina participantes.

ProP es el importador de protones/solutos compatibles de E. coli y, por consiguiente, uno de los transportadores activos bajo condiciones hiperosmóticas en E. coli ((Grothe et al., Journal of Bacteriology 166, 253-259 (1986); Racher et al., Biochemistry 38, 1676-1684 (1999); Wood, Methods in Enzymology 428, 77-107 (2007)). Cuando aumenta la osmolalidad del medio que rodea a la célula, disminuye su potencial de agua y las moléculas difunden de la célula a lo largo del gradiente osmótico. El turgor de la célula disminuye y, como consecuencia, a las proteínas citoplasmáticas se les retira la envolvente de hidrato relevante para la función. En virtud de esta deshidratación pasan a paralizarse el metabolismo celular y la división celular.

Con el fin de evitar esto, los microorganismos han desarrollado en el transcurso de la evolución diferentes estrategias, p. ej., a través de la síntesis y/o absorción de los denominados solutos compatibles. En el caso de una disponibilidad externa de estas sustancias protectoras que se presentan de forma natural tales como, p. ej., prolina o glicinbetaína, se prefiere su absorción más rápida y, además, energéticamente más favorable frente a la síntesis propia (Wood, Microbiology and Molecular Biology Reviews 63, 230-262 (1999)). El simportador proP pertenece a la familia MFS (siglas inglesas de superfamilia del facilitador principal) y cataliza, bajo condiciones hiperosmóticas, la absorción de prolina, glicinbetaína, prolinbetaína, ectoína y otros sustratos de estructura similar en el simporte con protones en la célula. ProP fue el primer transportador del que en el sistema reconstituido se pudieron detectar propiedades osmosensoriales y osmorreguladoras. El dominio C-terminal está en condiciones de configurar un denominado motivo de doble espiral. La configuración de estos dominios es importante para la osmorregulación y posiblemente para la percepción de estímulos osmóticos (Culham et al., Journal of Molecular Recognition 13, 309322 (2000)). ProP es activado mediante aumentos internos de la concentración de iones potasio y mediante amontonamiento macromolecular que fue imitado en proteoliposomas mediante el uso de polietilenglicol (PEG) de diferente longitud de cadena (Racher et al., Biochemistry 40, 7324-7333 (2001); Culham et al., Biochemistry 42, 410-420 (2003)). Ciertamente, ProP está en condiciones de percibir, sin factores adicionales, situaciones de estrés osmóticas, no obstante, para la total actividad del portador in vivo es necesaria la presencia de la proteína citoplasmática ProQ (Kunte et al., Journal of Bacteriology 181, 1537-43 (1999)).

Mellies et al. describen la desconexión del gen proP en E. coli, con el fin de examinar el papel del gen en el caso de choque osmótico (Journal of Bacteriology, tomo 177, n° 1, págs. 144-151).

Por consiguiente, el transportador ProP de E. coli ya era conocido desde hace tiempo en su función en la osmorregulación.

Sorprendentemente, de acuerdo con la invención se encontró ahora que la producción de L-aminoácidos por parte de microorganismos de la familia de las Enterobacteriaceae puede ser aumentado mediante el debilitamiento del gen proP.

Misión de la presente invención era proporcionar un procedimiento y microorganismos que posibiliten una superproducción mayor de aminoácidos con contenido en azufre, en particular de L-metionina.

Descripción de la invención

Un primer objeto de la presente invención es un procedimiento para la preparación de L-aminoácidos o de aditivos de alimentos para animales con contenido en L-aminoácido, mediante fermentación de un microorganismo de la familia de las Enterobacteriaceae, caracterizado porque se emplea un microorganismo en el que está debilitado el gen proP, de modo que la actividad o concentración de la proteína ProP se redujo a 0 hasta 75 % de la actividad o concentración de la proteína en el microorganismo no recombinante para la correspondiente proteína.

El microorganismo produce el L-aminoácido y le segrega preferiblemente al medio circundante.

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El microorganismo enriquece el L-aminoácido, además, preferiblemente en el medio y/o en el interior de la célula (acumulación), siendo particularmente preferida una acumulación en el medio.

Otro objeto de la presente invención es un microorganismo de la familia de las Enterobacteriaceae, que contiene un gen proP debilitado, caracterizado porque superproduce L-metionina y preferiblemente la segrega al medio, enriqueciendo preferiblemente los L-aminoácidos en el medio y/o en el interior de la célula, preferiblemente en medio, caracterizado porque posee una o varias de las características elegidas del siguiente grupo:

a) polinucleótido sobre-expresado que codifica uno o varios componentes del sistema de transporte de tiosulfato/sulfato CysPUWA (EC 3.6.3.25),

b) polinucleótido sobre-expresado que codifica una 3'-fosfoadenosina 5'-fosfosulfato reductasa CysH (EC 1.8.4.8),

c) polinucleótido sobre-expresado que codifica uno o varios componentes de la sulfito reductasa CysJI (EC 1.8.1.2),

d) polinucleótido sobre-expresado que codifica una cisteína sintasa A CysK (EC 2.5.1.47),

e) polinucleótido sobre-expresado que codifica una cisteína sintasa B CysM (EC 2.5.1.47),

f) polinucleótido sobre-expresado que codifica una serina acetiltransferasa CysE (EC 2.3.1.30),

g) polinucleótido sobre-expresado que codifica uno o varios componentes del sistema de escisión de glicina GcvTHP-Lpd (EC 2.1.2.10, EC 1.4.4.2, EC 1.8.1.4),

h) polinucleótido sobre-expresado que codifica una lipoil sintasa LipA (EC 2.8.1.8),

i) polinucleótido sobre-expresado que codifica una lipoil-proteína ligasa LipB (EC 2.3.1.181),

j) polinucleótido sobre-expresado que codifica una fosfoglicerato deshidrogenasa SerA (EC 1.1.1.95),

k) polinucleótido sobre-expresado que codifica una 3-fosfoserina fosfatasa SerB (EC 3.1.3.3),

l) polinucleótido sobre-expresado que codifica una 3-fosfoserina/fosfohidroxitreonina aminotransferasa SerC (EC 2.6.1.52),

m) polinucleótido sobre-expresado que codifica una serina hidroximetiltransferasa GlyA (EC 2.1.2.1),

n) polinucleótido sobre-expresado que codifica una aspartoquinasa I y homoserina deshidrogenasa I ThrA (EC 2.7.2.4, EC 1.1.1.3),

o) actividad enzimática reforzada de la aspartatoquinasa, en particular un polinucleótido sobre-expresado que codifica una aspartatoquinasa LysC (EC 2.7.2.4),

p) polinucleótido sobre-expresado que codifica una homoserina-deshidrogenasa Hom (EC 1.1.1.3),

q) polinucleótido sobre-expresado que codifica una homoserina O-acetiltransferasa MetX (EC 2.3.1.31),

r) polinucleótido sobre-expresado que codifica una homoserina O-succiniltransferasa MetA (EC 2.3.1.46),

s) polinucleótido sobre-expresado que codifica una cistationina gamma-sintasa MetB (EC 2.5.1.48),

t) polinucleótido sobre-expresado que codifica una p-C-S-liasa AecD (EC 4.4.1.8, también denominada beta-liasa),

u) polinucleótido sobre-expresado que codifica una cistationina beta-liasa MetC (EC 4.4.1.8),

v) polinucleótido sobre-expresado que codifica una homocisteína S-metiltransferasa MetE, independiente de B12 (EC 2.1.1.14),

w) polinucleótido sobre-expresado que codifica una homocisteína S-metiltransferasa MetH, independiente de B12 (EC 2.1.1.13),

x) polinucleótido sobre-expresado que codifica un tetrahidrofolato de metileno reductasa MetF (EC 1.5.1.20),

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y) polinucleótido sobre-expresado que codifica uno o varios componentes del exportador de L-metionina BrnFE de Corynebacterium glutamicum,

z) polinucleótido sobre-expresado que codifica uno o varios componentes del exportador de valina YgaZH de Escherichia coli (b2682, b2683),

aa) polinucleótido sobre-expresado que codifica el supuesto transportador YjeH de Escherichia coli (b4141),

bb) polinucleótido sobre-expresado que codifica uno o varios componentes de la piridina nucleótido transhidrogenasa PntAB (EC 1.6.1.2),

cc) polinucleótido sobre-expresado que codifica una O-succinilhomoserina sulfhidrilasa MetZ (EC 2.5.1.48),

dd) polinucleótido sobre-expresado que codifica una fosfoenoilpiruvato carboxilasa Pyc (EC 4.1.1.31),

ee) polinucleótido sobre-expresado que codifica una tiosulfato-sulfotransferasa RDL2 (EC 2.8.1.1),

ff) polinucleótido sobre-expresado que codifica una tiosulfato-tiol sulfotransferasa (EC 2.8.1.3),

gg) polinucleótido sobre-expresado que codifica una tiosulfato-ditiol sulfotransferasa (EC 2.8.1.5),

hh) actividad incrementada de la homoserina O-succiniltransferasa MetA (EC 2.3.1.46),

ii) actividad incrementada de la serina acetiltransferasa CysE (EC 2.3.1.30),

jj) debilitamiento del gen metJ (b3938, ECK3930) que codifica el regulador de la transcripción de la biosíntesis de L- metionina (MetJ),

kk) debilitamiento del gen pgi (b4025, ECK4017) que codifica el regulador de la glucosa-6-fosfato-isomerasa (Pgi, EC N° 5.3.1.9),

ll) debilitamiento del gen thrB (b0003, ECK0003) que codifica la homoserinaquinasa (ThrB, EC 2.7.1.39),

mm) debilitamiento del gen metK (b2942, ECK2937) que codifica la S-adenosilmetionina sintasa (MetK, EC N° 2.5.1.6),

nn) debilitamiento del gen dapA (b2478, ECK2474) que codifica la dihidropicolinato sintasa (DapA, EC N° 4.2.1.52),

oo) debilitamiento del gen pck (b3403, ECK3390) que codifica la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (Pck, EC N° 4.1.1.49),

pp) debilitamiento del gen purU (b1232, ECK1227) que codifica la formiltetrahidrofolato hidrolasa (PurU, EC N° 3.5.1.10),

qq) debilitamiento del gen pykA (b1854, ECK1855) que codifica la piruvatoquinasa II (PykA, EC N° 2.7.1.40),

rr) debilitamiento del gen pykF (b1676, ECK1672) que codifica la piruvatoquinasa I (PykF, EC N° 2.7.1.40),

ss) debilitamiento del gen metQ (b0197, ECK0197) que codifica una subunidad del transportador de L-metionina (MetQNI),

tt) debilitamiento del gen metí (b0198, ECK0198) que codifica una subunidad del transportador de L-metionina (MetQNI),

uu) debilitamiento del gen metN (b0199, ECK0199) que codifica una subunidad del transportador de L-metionina (MetQNI),

vv) debilitamiento del gen dcd (b2065, ECK2059) que codifica la desoxicitidina 5'-trifosfato desaminasa (Dcd, EC N° 3.5.4.13),

ww) debilitamiento del gen yncA (b1448, ECK1442) que codifica la supuesta N-aciltransferasa (YncA, explorador metabólico documento WO 2010/020681),

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xx) debilitamiento del gen rpoS (b2741, ECK2736) que codifica el factor Sigma RpoS,

yy) debilitamiento de la proteína reguladora MetJ,

zz) debilitamiento de la S-adenosilmetionina sintasa MetK;

entendiéndose por “debilitamiento” que la actividad o concentración de la proteína correspondiente fue reducida a 0 hasta 75 % de la actividad o concentración de la proteína en el microorganismo no recombinante para la correspondiente proteína, y en donde por “sobre-expresión”, “refuerzo” o “actividad incrementada” se ha de entender que la actividad de la correspondiente proteína está incrementada en un factor de al menos 2 con respecto a la cepa de tipo salvaje.

El microorganismo muestra en este caso preferiblemente una producción y preferiblemente una secreción del L- aminoácido deseado, en un proceso de fermentación, incrementada en comparación con la cepa de partida o bien cepa parental empleada sin gen proP debilitado.

Por “debilitado” se ha de entender de acuerdo con la invención que el gen proP es expresado a un nivel bajo o está totalmente desconectado.

El término “debilitamiento” describe en este sentido, de acuerdo con la invención, la reducción o desconexión de la actividad intracelular o concentración de una o varias enzimas o bien proteínas, en el presente caso, en particular, del transportador ProP, en un microorganismo que es codificado por el correspondiente ADN, en el presente caso, en particular, por el gen proP, utilizando, por ejemplo, un promotor más débil que el microorganismo o la cepa parental no recombinante para la correspondiente enzima o bien proteína o un gen o bien alelo que codifica con una baja actividad una correspondiente enzima o bien proteína o bien inactiva la correspondiente enzima o bien proteína o el marco de lectura abierto o el gen y eventualmente combina estas medidas.

Mediante las medidas del debilitamiento, se reduce la actividad o concentración de la correspondiente proteína, en general, a 0 hasta 75%, 0 hasta 50%, 0 hasta 25%, 0 hasta 10% o 0 hasta 5% la actividad o concentración de la proteína de tipo salvaje o bien de la actividad o concentración de la proteína en el microorganismo o cepa parental no recombinante para la correspondiente enzima o bien proteína. Por microorganismo o cepa parental (parent strain) no recombinante se entiende el microorganismo en el que se lleva a cabo el debilitamiento o la desconexión de acuerdo con la invención.

Para conseguir un debilitamiento pueden reducirse o bien desconectarse, por ejemplo, la expresión de los genes o marcos de lectura abiertos o las propiedades catalíticas de las proteínas enzimáticas. Eventualmente, pueden combinarse ambas medidas.

La disminución de la expresión génica puede tener lugar mediante una realización adecuada del cultivo, mediante modificación genética (mutación) de las estructuras de señal de la expresión génica o también mediante técnica de ARN anti-sentido. Estructuras de señal de la expresión génica son, por ejemplo, genes represores, genes activadores, operadores, promotores, atenuadores, puntos de unión de ribosomas, el codón de iniciación y terminadores. Datos con respecto a ello los encuentra el experto en la materia, entre otros, por ejemplo en Jensen y Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191-195 (1998)), en Carrier y Keasling (Biotechnology Progress 15: 58-64 (1999)), Franch y Gerdes (Current Opinion in Microbiology 3: 159-164 (2000)), Kawano et al. (Nucleic Acids Research 33(19), 6268-6276 (2005)) y en libros de texto conocidos de genética y biología molecular tales como, por ejemplo, el libro de texto de Knippers ("Molekulare Genetik", 6a edición, editorial Georg Thieme, Stuttgart, Alemania, 1995) o del de Winnacker ("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemania, 1990).

Mutaciones que conducen a una modificación o bien reducción de las propiedades catalíticas de proteínas enzimáticas son conocidas del estado de la técnica. Como ejemplos se pueden mencionar los trabajos de Qiu y Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997)), Yano et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 95: 5511-5515 (1998)), Wente y Schachmann (Journal of Biological Chemistry 266: 20833-20839 (1991)). Explicaciones recopilatorias pueden tomarse de libros de texto conocidos de genética y biología molecular tales como, p. ej., del de Hagemann (“Allgemeine Genetik” editorial Gustav Fischer, Stuttgart, 1986).

Como mutaciones entran en consideración transiciones, transversiones, inserciones y deleciones de al menos un (1) par de bases o bien nucleótido. En función del efecto del intercambio de aminoácidos provocado por la mutación sobre la actividad enzimática, se habla de mutaciones de sentido erróneo (“missense mutations”) o de mutaciones sin sentido (“nonsense mutations”). La mutación de sentido erróneo conduce a un intercambio de un aminoácido dado en una proteína por otro, tratándose, en particular, de un intercambio de aminoácidos no conservativo. Con

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ello, se perjudica la funcionalidad o bien actividad de la proteína y se reduce a un valor de 0 a 75%, 0 a 50%, 0 a 25%, 0 a 10% o 0 a 5%. La mutación sin sentido conduce a un codón de terminación en la zona de codificación del gen y, con ello, a una interrupción prematura de la traducción. Inserciones o deleciones de al menos un par de bases en un gen conducen a mutaciones de desplazamiento del marco de lectura (“frame shift mutations”), que conducen a que se incorporen aminoácidos falsos o que se interrumpa prematuramente la traducción. Si como consecuencia de la mutación se forma un codón de terminación en la zona de codificación, esto conduce asimismo a una interrupción prematura de la traducción. Deleciones de al menos uno (1) o varios codones conducen típicamente asimismo a una suspensión completa de la actividad enzimática. La reducción de la expresión génica mediante supresión de una mutación del codón de parada en la zona de codificación mediante supresores de ARN-t adecuados se describe en el documento WO 03/074719.

Instrucciones para generar mutaciones de este tipo pertenecen al estado de la técnica y pueden deducirse de libros de texto conocidos de genética y biología molecular tales como, p. ej., el libro de texto de Knippers ("Molekulare Genetik", 6a edición, editorial Georg Thieme, Stuttgart, Alemania, 1995), el de Winnacker ("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemania, 1990) o el de Hagemann ("Allgemeine Genetik", editorial Gustav Fischer, Stuttgart, 1986).

En particular, en relación con el gen proP se ha de entender por “debilitamiento” y “expresión a un nivel bajo” que la actividad y/o concentración del transportador ProP se reduce, mediante las medidas previamente expuestas, a 0 hasta 75%, a 0 hasta 50%, a 0 hasta 25%, a 0 hasta 10% o a 0 hasta 5% de la actividad y/o concentración de la proteína de tipo salvaje o bien de la actividad y/o concentración de la proteína en el microorganismo o cepa parental no recombinante para el transportador ProP.

El L-aminoácido se superproduce de acuerdo con la invención preferiblemente por parte del microorganismo. Por “superproducción” se ha de entender de acuerdo con la invención, que en relación con el L-aminoácido existe un rendimiento de producción drásticamente incrementado por encima de la demanda propia.

En el caso del L-aminoácido se trata, de acuerdo con la invención, preferiblemente de un aminoácido con un contenido en azufre, en particular de L-metionina, L-cisteína, L-cistina, L-homocisteína o L-homocistina, de manera particularmente preferida de L-metionina.

Los microorganismos de acuerdo con la invención y empleados en procedimientos de acuerdo con la invención se caracterizan, preferiblemente, porque presentan una tolerancia a metionina incrementada en comparación con los microorganismos sin gen proP debilitado. Preferiblemente, en este caso están en condiciones de crecer todavía en el caso de una concentración de L-metionina de 50 o 60 gramos por litro, de manera particularmente preferida todavía en el caso de una concentración de L-metionina de 70, 75, 80, 90 o 100 gramos por litro, dado que son resistentes frente a concentraciones de metionina de este tipo. Los datos de tolerancia en relación con la L- metionina se refieren en este caso, preferiblemente, a un agar mínimo que presenta las correspondientes concentraciones de L-metionina.

Cepas resistentes a metionina de este tipo pueden aislarse partiendo de una cepa de E. coli ya productora de L- metionina, mediante selección en agar mínimo con contenido en metionina.

Para la producción de las bacterias resistentes a metionina de acuerdo con la invención se utilizan preferiblemente métodos de selección descritos en el estado de la técnica. Estos podrían tomarse, entre otros, de Miller (A Short Course in Bacterial Genetics, A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992)) o en el manual "Manual of Methods for General Bacteriology" de American Society for Bacteriology (Washington D.C., EE.UU.).

Con el fin de realizar mutaciones preestablecidas en el gen proP, pueden utilizarse procedimientos de la mutagénesis dirigida al lugar utilizando oligonucleótidos mutagénicos (T. A. Brown: Gentechnologie für Einsteiger, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1993) o de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), tal como se describen en el manual de Gait: Oligonukleotide synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, Reino Unido, 1984) o de Newton y Graham (PCR, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1994). Para la construcción de mutaciones puede utilizarse, por ejemplo, el kit de mutagénesis dirigida al sitio Quick Change de la razón social Stratagene (Amsterdam, Holanda). En el caso de utilizar estos métodos, se amplifica el gen proP descrito en el estado de la técnica partiendo de ADN total aislado de una cepa de tipo salvaje con ayuda de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), se clona en vectores de plásmidos adecuados y, a continuación, el ADN se somete al procedimiento de mutagénesis. Mediante “GeneSOEing” (Gene Splicing by Overlap Extension - Corte y empalme de genes mediante extensión por solapamiento, Horton, Molecular Biotechnology 3: 93-98 (1995)) pueden obtenerse las mutaciones puntuales ya por pCr. También una síntesis de genes de novo (p. ej., por parte de la razón social GENEART AG (Regensburg, Alemania)) de las secuencias de nucleótidos puede utilizarse para la producción de

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mutaciones en el gen proP. Las mutaciones generadas pueden determinarse y examinarse mediante secuenciación del ADN, por ejemplo, según el método de Sanger et al. (Proceedings of the National Academy of Science USA 74 (12): 5463-5467 (1977)).

Los alelos generados pueden incorporarse en el cromosoma de cepas adecuadas, por ejemplo, mediante transformación y el procedimiento del intercambio de genes o bien alelos.

Un método habitual es el método del intercambio de genes descrito por Hamilton et al. (Journal of Bacteriology 174, 4617 - 4622 (1989)) del intercambio de genes con ayuda de un derivado de pSC101 replicador condicional pMAK705 o con pKO3 (Link et al., Journal of Bacteriology 179: 6228 - 6237). Pueden utilizarse asimismo otros métodos descritos en el estado de la técnica tales como, por ejemplo, los de Martinez-Morales et al. (Journal of Bacteriology 1999, 7143-7148 (1999)) o los de Boyd et al. (Journal of Bacteriology 182, 842-847 (2000)).

Otro método habitual consiste en incorporar en el cromosoma un fragmento de ADN generado mediante PCR o síntesis génica a través de secuencias flanqueantes cortas homólogas directamente con ayuda de la recombinasa lambda roja, o bien realizar un intercambio (Proc Natl Acad Sci U S A.97(12), 6640-6645 (2o0o); Nature Genetics 20, 123 -128 (1998)).

Asimismo, es posible transferir a diferentes cepas los alelos generados mediante conjugación o transducción.

Las secuencias de ácidos nucleicos de proP pueden tomarse de los bancos de datos de National Center for Biotechnology Information (NCBI) de la National Library of Medicine (Bethesda, MD, EE.UU.), del banco de datos de secuencias de nucleótidos de European Molecular Biologies Laboratories (EMBL, Heidelberg, Alemania, o bien Cambridge, Reino Unido) o de los bancos de datos de Japón (DDBJ, Mishima, Japón).

Para la explicación bajo la SEQ ID NO: 1 se representa la secuencia conocida del gen proP de Escherichia coli y bajo la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 5 se representan las secuencias conocidas de los genes proP de Salmonella enterica y Shigella sonnei, que pertenecen asimismo a la familia de las Enterobacteriaceae. Las proteínas codificadas por estos marcos de lectura están representados como SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 6. Otras secuencias de nucleótidos para el gen proP se encuentran, por ejemplo, de las siguientes Enterobacteriaceae Shigella boydii (N° de Acceso NO:: NC_007613); Shigella flexneri (N° de Acceso NO: NC_004741); Shigella dysenteriae (N° de Acceso :: NC_007606); Citrobacter rodentium (N° de Acceso :: NC_013716); Erwinia pyrifoliae (N° de Acceso :: NC_012214); Klebsiella pneumoniae (N° de Acceso :: NC_011283).

La proteína codificada mediante el gen proP de Escherichia coli K12 se denomina también transportador ProP de MFS osmosensorial o bien como simportador de protones/solutos compatibles (N° de Acceso NO: 11612 (Región: 4328525-4330027); nombre alternativo del gen: b4111, ECK4104); Grothe et al., Journal of Bacteriology 166, 253259 (1986); Racher et al., Biochemistry 38, 1676-1684 (1999); Wood, Methods in Enzymology 428, 77-107 (2007)).

En una forma de realización preferida de acuerdo con la invención, en el caso del gen proP a debilitar se trata de un gen con una identidad de la secuencia de al menos 80%, preferiblemente de al menos 90%, en particular de al menos 95%, ante todo de al menos 98, 99 o 100%, en relación con preferiblemente las secuencias de polinucleótidos completas conforme a SEQ ID NO: 1, 3, 5 o 7, de manera particularmente preferida en relación con la secuencia de polinucleótidos completa conforme a SEQ ID NO:1.

Indicaciones de bibliografía con respecto a los genes proP y marcos de lectura abiertos de estos genes proP ya se indicaron previamente. Estos pueden utilizarse de manera correspondiente de acuerdo con la invención, con el fin de debilitar el gen proP. Además, también pueden utilizarse alelos de los genes o marcos de lectura abiertos que resultan de la degeneración del código genético o mediante mutaciones sentido (“sense mutations”) de función neutra, con el fin de producir un gen proP debilitado. Se prefiere el uso de genes endógenos o bien de marcos de lectura abiertos endógenos.

A los alelos del gen proP que contienen mutaciones sentido de función neutra pertenecen, entre otros, aquellos que conducen en a lo sumo 40 o a lo sumo 30 o a lo sumo 20, preferiblemente a lo sumo 10 o a lo sumo 5, de manera muy particularmente preferida a lo sumo 3 o a lo sumo 2 o exactamente a un intercambio de aminoácidos conservativo en la proteína codificada por ellos.

En el caso de los aminoácidos aromáticos se habla de intercambios conservativos cuando se intercambian entre sí fenilalanina, triptófano y tirosina. En el caso de los aminoácidos hidrofóbicos se habla de intercambios conservativos cuando se intercambian entre sí leucina, isoleucina y valina. En el caso de los aminoácidos polares se habla de intercambios conservativos cuando se intercambian entre sí glutamina y asparagina. En el caso de los aminoácidos básicos se habla de intercambios conservativos cuando se intercambian entre sí arginina, lisina e histidina. En el

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caso de los aminoácidos de carácter ácido se habla de intercambios conservativos cuando se intercambian entre sí ácido aspártico y ácido glutámico. En el caso de los aminoácidos con contenido en grupos hidroxilo se habla de intercambios conservativos cuando se intercambian entre sí serina y treonina.

De igual manera, también pueden utilizarse aquellas secuencias de nucleótidos que codifican variantes de las proteínas mencionadas que contienen adicionalmente en el extremo N o C una prolongación o un acortamiento en al menos uno (1) aminoácido. Esta prolongación o este acortamiento no asciende a más de 10, 5, 3 o 2 aminoácidos o restos de aminoácidos.

A las variantes adecuadas pertenecen también aquellas que codifican proteínas en las que al menos está introducido (inserción) o eliminado (deleción) un (1) aminoácido. El número máximo de modificaciones de este tipo, denominadas indeles (contracción de introducción o deleción) puede afectar a 2, 3, 5, pero en ningún caso a más de 10 aminoácidos.

A las variantes adecuadas pertenecen, además, aquellas que se pueden obtener mediante hibridación, en particular bajo condiciones rigurosas utilizando SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 5 o partes de las mismas, en particular de las regiones codificadoras o bien de las secuencias complementarias a ellas.

Indicaciones para la identificación de secuencias de ADN mediante hibridación las encuentra el experto en la materia, entre otros, en el manual "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" de la razón social Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Alemania, 1993) y en Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255-260 (1991)). La hibridación tiene lugar bajo condiciones rigurosas, es decir, se forman solo híbridos en los que sonda y secuencia diana, es decir, los polinucleótidos tratados con la sonda, son al menos 70% idénticos. Es conocido que la rigurosidad de la hibridación, incluidas las etapas de lavado, se ve afectada o bien determinada por variaciones de la composición tampón, la temperatura y la concentración de sales. La reacción de hibridación se lleva a cabo, en general, a una rigurosidad relativamente baja en comparación con las etapas de lavado (Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, Reino Unido, 1996).

Para la reacción de hibridación puede emplearse, por ejemplo, un tampón correspondiente al tampón 5x SSC a una temperatura de aprox. 50°C - 68°C. En este caso, sondas pueden hibridar también con polinucleótidos que presenten una identidad menor que 70% con la secuencia de la sonda. Híbridos de este tipo son menos estables y se separan mediante lavado bajo condiciones rigurosas. Esto puede alcanzarse, por ejemplo, mediante reducción de la concentración de sales a 2x SSC y eventualmente con posterioridad a 0,5x SSC (The DIG System User's Guide for Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania, 1995), ajustándose una temperatura de aprox. 50°C - 68°C, aprox. 52°C - 68°C, aprox. 54°C- 68°C, aprox. 56°C - 68°C, aprox. 58°C - 68°C, aprox. 60°C - 68°C, aprox. 62°C - 68°C, aprox. 64°C - 68°C, aprox. 66°C - 68°C. Se prefieren intervalos de temperaturas de aprox. 64°C - 68°C o aprox. 66 °C - 68°C. Eventualmente, es posible reducir la concentración de sales hasta una concentración correspondiente a 0,2x SSC o 0,1x SSC. Mediante el aumento escalonado de la temperatura de hibridación en pasos de aprox. 1 - 2°C de 50°C a 68°C, pueden aislarse fragmentos de polinucleótidos que, por ejemplo, poseen al menos 70% o al menos 80% o al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% de identidad con la secuencia de la sonda empleada o bien con las secuencias de nucleótidos representadas en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 5. Otras indicaciones para la hibridación se pueden adquirir en el comercio en forma de los denominados kits (p. ej., DIG Easy Hyb de la razón social Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania, N° de Catálogo: 1603558).

El gen proP a debilitar codifica la proteína transportadora ProP, que presenta preferiblemente una secuencia de aminoácidos que es al menos 85%, en particular al menos 90%, preferiblemente al menos 95%, de manera particularmente preferida al menos 98%, al menos 99% o hasta 100% idéntica con la secuencia de aminoácidos conforme a SeQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 8, preferiblemente con la secuencia de aminoácidos conforme a SEQ ID NO: 2, presentándose la identidad preferiblemente a lo largo de toda la longitud de la o las secuencias indicadas. La proteína transportadora ProP comprende o posee preferiblemente en esencia una longitud de 500 aminoácidos, siendo preferida una longitud de 500 aminoácidos. De manera muy particularmente preferida, la proteína ProP comprende o posee la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, pudiendo estar contenidos eventualmente en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 como máximo 40, como máximo 30, preferiblemente como máximo 20, como máximo 10, como máximo 5, como máximo 3, como máximo 2, de manera particularmente preferida como máximo uno o más intercambios de aminoácidos conservativos. Mediante los intercambios de aminoácidos conservativos no se modifica esencialmente la actividad del transportador ProP, lo que significa, preferiblemente de acuerdo con la invención, que la actividad no se modifica mediante los intercambios de aminoácidos conservativos en más de un 10% en relación con la secuencia de partida.

La expresión “esencialmente una longitud de 500 aminoácidos” considera este respecto el hecho de que mediante la inserción o deleción de uno (1) o varios, como máximo 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 o 2 aminoácidos dentro del polipéptido o

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en el extremo N- o C-terminal del polipéptido se varía ligeramente la longitud del polipéptido codificado en el caso de diferentes especies o cepas de la familia Enterobacteriaceae. Un ejemplo de ello es la proteína ProP de Erwinia pyrifoliae. La longitud del polipéptido (véase SEQ ID NO: 8) asciende en este caso a 501 aminoácidos.

En formas de realización preferidas de acuerdo con la invención, el debilitamiento del gen proP conforme a SEQ ID NO: 1 se alcanza debido a que el gen presenta una de las siguientes mutaciones:

a) intercambio de la nucleobase guanina en la posición 971 o una posición equiparable de la secuencia de polinucleótidos conforme a SEQ ID NO: 1 por la nucleobase timina;

b) intercambio de la nucleobase timina en la posición 1399 o una posición equiparable de la secuencia de polinucleótidos conforme a SEQ ID NO: 1 por la nucleobase citosina;

c) intercambio de la nucleobase guanina en la posición 1234 o una posición equiparable de la secuencia de polinucleótidos conforme a SEQ ID NO: 1 por la nucleobase timina;

d) deleción de la nucleobase adenina en la posición 854 de la secuencia de polinucleótidos conforme a SEQ ID NO: 1;

e) deleción de una o varias de las nucleobases de la posición 1173 a 1223, preferiblemente deleción de todas las nucleobases de la posición 1173 a 1223 de la secuencia de polinucleótidos conforme a SEQ ID NO: 1;

f) inserción de la nucleobase citosina en la posición 842 de la secuencia de polinucleótidos conforme a SEQ ID NO: 1;

g) inserción de una o varias nucleobases en la posición 973, preferiblemente inserción de 19 nucleobases en la posición 973 de la secuencia de polinucleótidos conforme a SEQ ID NO: 1;

h) inserción de una o varias nucleobases en la posición 183, preferiblemente inserción de 1359 nucleobases en la posición 183 de la secuencia de polinucleótidos conforme a SEQ ID NO: 1.

En formas de realización preferidas de acuerdo con la invención, por lo tanto en el caso del gen proP debilitado se trata de un polinucleótido que presenta una identidad de la secuencia de al menos 80 %, preferiblemente de al menos 90 %, en particular de al menos 95 %, de manera particularmente preferida de al menos 98, 99 o 100 % en relación con el polinucleótido conforme a SEQ ID NO:1, preferiblemente en relación con la secuencia completa del polinucleótido conforme a SEQ ID NO:1 y, además, con respecto al polinucleótido conforme a SEQ ID NO: 1 presenta obligatoriamente una o varias, de preferencia exactamente una de las siguientes mutaciones:

a) intercambio del triplete que codifica L-arginina en la posición 324 conforme a SEQ ID NO: 2 o una posición equiparable de la secuencia de aminoácidos por un triplete que codifica un aminoácido elegido del grupo L-leucina, L-isoleucina y L-valina, preferiblemente L-leucina;

b) intercambio del triplete que codifica L-tirosina en la posición 467 conforme a SEQ ID NO: 2 o una posición equiparable de la secuencia de aminoácidos por un triplete que codifica un aminoácido elegido del grupo L-lisina, L-arginina y L-histidina, preferiblemente L-histidina;

c) intercambio del triplete que codifica ácido L-glutámico en la posición 412 conforme a SEQ ID NO: 2 o una posición equiparable de la secuencia de aminoácidos por un triplete que codifica un

codón de parada;

d) deleción de la nucleobase adenina en la posición 854 del gen proP conforme a SEQ ID NO: 1;

e) deleción de una o varias de las nucleobases desde la posición 1173 a 1223, preferiblemente deleción de todas las nucleobases desde la posición 1173 a 1223 del gen proP conforme a SEQ ID NO: 1;

f) inserción de la nucleobase citosina en la posición 842 del gen proP conforme a SEQ ID NO: 1;

g) inserción de una o varias de las nucleobases en la posición 973, preferiblemente inserción de 19 nucleobases en la posición 973 del gen proP conforme a SEQ ID NO: 1;

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h) inserción de una o varias de las nucleobases en la posición 183, preferiblemente inserción de 1359 nucleobases en la posición 183 del gen proP conforme a SEQ ID NO: 1.

Los datos de identidad en relación con el polinucleótido conforme a SEQ ID NO: 1 se refieren con ello en cada caso a la secuencia de polinucleótidos sin la una o varias mutaciones obligatorias precedentemente mencionadas.

“Posiciones equiparables” se pueden identificar fácilmente mediante comparación de las secuencias de aminoácidos en forma de un “alineamiento”, por ejemplo, con ayuda del programa Clustal W (Thompson et al., Nucleic Acids Research 22, 4637-4680 (1994)) o con ayuda del programa MAFFT (Katoh et al., Genome Information 2005; 16(1),22-33).

En el caso del microorganismo de acuerdo con la invención y a emplear en el procedimiento de acuerdo con la invención de la familia de las Enterobacteriaceae se trata preferiblemente de una bacteria de los géneros Escherichia, Erwinia, Providencia o Serratia, en particular del género Escherichia. De manera particularmente preferida, se trata de Escherichai coli.

En el procedimiento de acuerdo con la invención para la preparación del L-aminoácido, en particular del L- aminoácido con contenido en azufre, la fermentación tiene lugar preferiblemente en un medio que contiene una fuente de azufre inorgánica. Como fuente de azufre puede emplearse una sal del ácido ditiosulfúrico (tiosulfato), eventualmente junto con otras fuentes de azufre tales como, por ejemplo, sulfato, sulfito o ditionito (véase también la solicitud EP 11151526.8).

El L-aminoácido se enriquece preferiblemente en el caldo de fermentación obtenido y, a continuación, se aísla, reúne y/o purifica eventualmente.

Asimismo, es posible aislar o enriquecer el L-aminoácido junto con componentes del caldo de fermentación y/o biomasa.

El rendimiento de las bacterias aisladas o bien del proceso de fermentación utilizando las mismas en relación con uno o varios de los parámetros elegidos del grupo de la concentración de producto (producto por volumen), del rendimiento de producto (producto formado por fuente de carbono consumida) y de la formación de producto (producto formado por volumen y tiempo) o también de otros parámetros del proceso y combinaciones de los mismos se mejora preferiblemente en al menos 0,5%, al menos 1%, al menos 1,5% o al menos 2%, referido a la cepa de partida o cepa parental o bien al proceso de fermentación utilizando la misma.

En el procedimiento de acuerdo con la invención, las bacterias se pueden cultivar de forma continua - tal como, por ejemplo, se describe en el documento PCT/EP2004/008882 - o de forma discontinua en tandas - (cultivo en tandas) o en el procedimiento fed batch (procedimiento de alimentación) o procedimiento de repeated fed batch (procedimiento de alimentación repetitiva) con el fin de la producción de L-aminoácidos. Una recopilación de tipo general sobre métodos de cultivo conocidos está disponible en el libro de texto de Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (editorial Gustav Fischer, Stuttgart, 1991)) o en el libro de texto de Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (editorial Vieweg, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)).

El medio de cultivo o bien el medio de fermentación a utilizar debe satisfacer de manera adecuada los requisitos de las cepas respectivas. Descripciones de medios de cultivo de diferentes microorganismos están contenidas en el manual “Manual of Methods for General Bacteriology” de la American Society for Bacteriology (Washington, D. C., EE.UU., 1981). Las expresiones medio de cultivo y medio de fermentación o bien el término medio son intercambiables mutuamente.

Como fuente de carbono pueden utilizarse azúcares e hidratos de carbono tales como, p. ej., glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melaza, soluciones con contenido en sacarosa de la producción de la remolacha azucarera o caña de azúcar, almidón, hidrolizado de almidón y celulosa, aceites y grasas tales como, por ejemplo, aceite de soja, aceite de girasol, aceite de cacahuete y grasa de coco, ácidos grasos tales como, por ejemplo, ácido palmítico, ácido esteárico y ácido linoleico, alcoholes tales como, por ejemplo, glicerol, metanol y etanol, y ácidos orgánicos tales como, por ejemplo, ácido acético. Estas sustancias pueden utilizarse individualmente o en forma de mezcla.

Como fuente de nitrógeno pueden utilizarse compuestos con contenido en nitrógeno orgánicos tales como peptonas, extracto de levadura, extracto de carne, extracto de malta, líquido de maceración de maíz, harina de soja y urea, o compuestos inorgánicos tales como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio. Las fuentes de nitrógeno pueden utilizarse individualmente o en forma de mezcla.

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Como fuente de fósforo pueden utilizarse ácido fosfórico, dihidrógeno-fosfato de potasio o hidrógeno-fosfato de dipotasio o las correspondientes sales con contenido en sodio.

El medio de cultivo contiene, además, preferiblemente sales, por ejemplo, en forma de cloruros, de metales tales como, por ejemplo, sodio, potasio, magnesio, calcio y hierro tales como, por ejemplo, sulfato de magnesio o sulfato de hierro, que son necesarios para el crecimiento. Finalmente, pueden emplearse sustancias de desarrollo esenciales tales como aminoácidos, por ejemplo, homoserina y vitaminas, por ejemplo, cobalamina, tiamina, biotina o ácido pantotenoico adicionalmente a las sustancias arriba mencionadas.

Al medio de cultivo pueden añadirse, además, precursores adecuados del aminoácido respectivo.

Las sustancias de partida mencionadas pueden añadirse al cultivo en forma de una tanda única o pueden alimentarse durante el cultivo de manera adecuada.

Para el control del pH del cultivo se emplean compuestos de carácter básico tales como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, amoníaco o bien agua amoniacal o compuestos de carácter ácido tales como ácido fosfórico o ácido sulfúrico. El pH se ajusta en general a un valor de 6,0 a 9,0, preferiblemente de 6,5 a 8. Para el control del desarrollo de espuma pueden emplearse agentes antiespumantes tales como, por ejemplo, ésteres poliglicólicos de ácidos grasos. Para el mantenimiento de la estabilidad de plásmidos pueden agregarse al medio, sustancias de efecto selectivo adecuadas tales como, por ejemplo, antibióticos. Con el fin de mantener condiciones aerobias, se incorporan en el cultivo oxígeno o mezclas gaseosas con contenido en oxígeno tales como, por ejemplo, aire. Asimismo, es posible el uso de líquidos que están enriquecidos con peróxido de hidrógeno. Eventualmente, la fermentación se realiza a sobrepresión, por ejemplo, a una presión de 0,03 a 0,2 MPa. La temperatura del cultivo se encuentra normalmente en 20°C a 45°C y preferiblemente en 25°C a 40°C. En el caso de procedimientos en tandas, el cultivo se prolonga hasta que se haya formado un máximo del aminoácido deseado. Este objetivo se alcanza normalmente en el espacio de 10 horas a 160 horas. En el caso de procedimientos continuos son posibles tiempos de cultivo mayores.

Medios de fermentación adecuados se describen, entre otros en el documento US 6.221.636, en el documento US 5.840.551, en el documento US 5.770.409, en el documento US 5.605.818, en el documento US 5.275.940 y en el documento US 4.224.409.

Métodos para la determinación de L-aminoácidos son conocidos del estado de la técnica. El análisis puede tener lugar, por ejemplo, tal como se describe por Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) mediante cromatografía de intercambio iónico con subsiguiente derivatización de ninhidrina, o puede tener lugar mediante HPLC de fase inversa, tal como se describe por Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174).

El caldo de fermentación producido de esta manera, se continúa elaborando a continuación, preferiblemente para formar un producto sólido o líquido.

Por un caldo de fermentación se entiende un medio de fermentación en el que un microorganismo fue cultivado durante un determinado tiempo y a una determinada temperatura. El medio de fermentación o bien el medio empleado durante la fermentación contiene preferiblemente todas las sustancias o bien componentes que garantizan una multiplicación del microorganismo y una formación del aminoácido deseado.

A la conclusión de la fermentación, el caldo de fermentación resultante contiene de manera correspondiente a) la biomasa del microorganismo que resulta como consecuencia de la multiplicación de las células del microorganismo,

b) el aminoácido deseado formado en el transcurso de la fermentación, c) los productos secundarios orgánicos formados en el transcurso de la fermentación y d) los componentes del medio de fermentación/de los medios de fermentación empleados, no consumidos por la fermentación, o bien las sustancias de partida tales como, por ejemplo, vitaminas tales como biotina, aminoácidos tales como homoserina o sales tales como sulfato de magnesio.

A los productos secundarios orgánicos pertenecen sustancias que se generan y eventualmente segregan por los microorganismos empleados durante la fermentación, eventualmente junto al L-aminoácido deseado respectivo. A ellos pertenecen L-aminoácidos que, en comparación con el aminoácido deseado, suponen menos de 30%, 20% o 10%. A ellos pertenecen, además, ácidos orgánicos que portan uno a tres grupos carboxilo tales como, por ejemplo, ácido acético, ácido láctico, ácido cítrico, ácido málico o ácido fumárico. Finalmente, a ellos pertenecen también azúcares tales como, por ejemplo, trehalosa.

Caldos de fermentación típicos adecuados para fines industriales y preferidos de acuerdo con la invención tienen un contenido en aminoácidos de 40 g/kg a 180 g/kg o de 50 g/kg a 150 g/kg. El contenido en biomasa (como biomasa seca) asciende, en general, a 20 hasta 50 g/kg.

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Otro objeto de la presente invención son de manera correspondiente también polinucleótidos con una identidad de al menos 80 %, preferiblemente al menos 90 %, en particular al menos 95 %, ante todo al menos 98, 99 o 100 %, en relación con la secuencia conforme a SEQ ID NO: 1, refiriéndose la identidad indicada, preferiblemente, a la secuencia total conforme a SEQ ID NO: 1, caracterizados porque el polinucleótido presenta obligatoriamente una o varias mutaciones con respecto al polinucleótido conforme a SEQ ID NO: 1, elegido de:

codón de parada;

De manera particularmente preferida, la una o varias mutaciones obligatorias se eligen en este caso de:

e) deleción de una o varias de las nucleobases desde la posición 1173 a 1223, preferiblemente deleción de todas las nucleobases desde la posición 1173 a 1223 de la secuencia de polinucleótidos conforme a SEQ ID NO: 1;

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Los polinucleótidos de acuerdo con la invención precedentemente mencionados se caracterizan, conforme a la invención, preferiblemente porque se hibridan con uno o varios de los polinucleótidos que son complementarios a SEQ ID NO: 1, 3 o 5, preferiblemente complementarios a SEQ ID NO:1, preferiblemente bajo condiciones de hibridación rigurosas, alcanzándose las condiciones rigurosas preferiblemente mediante una etapa de lavado en la que la temperatura se extiende a lo largo de un intervalo de 64°C a 68°C y la concentración de sales del tampón se extiende a lo largo de un intervalo de 2xSSC a 0,1xSSC.

Polinucleótidos de acuerdo con la invención particularmente preferidos presentan una identidad de la secuencia de al menos 90 %, preferiblemente al menos 95 %, en particular al menos 98, 99 o 100 % con respecto a los polinucleótidos conforme a SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23.

Polinucleótidos de acuerdo con la invención muy particularmente preferidos son y/o comprenden los polinucleótidos conformes a SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:21 y SEQ ID NO: 23.

Otro objeto de la presente invención son vectores que contienen los polinucleótidos de acuerdo con la invención.

Otro objeto de la presente invención son de manera correspondiente también polipéptidos con una identidad de al menos 80 %, preferiblemente al menos 90 %, en particular al menos 95 %, ante todo al menos 98, 99 o 100 % con relación a la secuencia conforme a SEQ ID NO: 2, caracterizados porque el polipéptido presenta obligatoriamente una o varias mutaciones con respecto al polipéptido conforme a SEQ ID NO: 2, elegidas de:

a. intercambio de la L-arginina en la posición 324 conforme a SEQ ID NO: 2 o una posición equiparable de la secuencia de aminoácidos por un aminoácido elegido del grupo L-leucina, L- isoleucina y L-valina, preferiblemente L-leucina;

b. intercambio de la L-tirosina en la posición 467 conforme a SEQ ID NO: 2 o una posición equiparable de la secuencia de aminoácidos por un aminoácido elegido del grupo L-lisina, L- arginina y L-histidina, preferiblemente L-histidina;

c. deleción de los 17 aminoácidos de la posición 392 a 408 conforme a SEQ ID NO: 2 o una posición equiparable de la secuencia de aminoácidos;

d. deleción de hasta 420 aminoácidos del extremo C en relación con la secuencia conforme a SEQ ID NO: 2, preferiblemente deleción de 88, 163, 202, 212 o 420 aminoácidos del extremo C de la secuencia de aminoácidos conforme a SEQ ID NO: 2.

Los datos de identidad se refieren con ello, en el caso de los mutantes conforme a a y b a la secuencia total conforme a SEQ ID NO: 2, en el caso de los mutantes conforme a c y d, en cada caso a las zonas parciales de la secuencia conforme a SEQ ID NO: 2 sin las zonas suprimidas indicadas.

Polipéptidos de acuerdo con la invención preferidos son polipéptidos con una identidad de la secuencia de al menos 90 %, preferiblemente al menos 95 %, en particular al menos 98, 99 o 100 % con respecto a los polipéptidos conforme a SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 o 24.

Polipéptidos de acuerdo con la invención particularmente preferidos son y/o comprenden polipéptidos conforme a SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 o 24.

Otro objeto de la presente invención son microorganismos recombinantes que contienen los polinucleótidos y/o vectores y/o polipéptidos de acuerdo con la invención.

Microorganismos de acuerdo con la invención y microorganismos empleados en procedimientos de acuerdo con la invención presentan preferiblemente una actividad enzimática potenciada de la aspartatoquinasa (EC 2.7.2.4), siendo preferidos alelos resistentes a la retroalimentación. En E. coli existen tres aspartatoquinasas diferentes que son codificadas por los genes thrA, metL o lysC. De manera particularmente preferida, está presente de acuerdo con la invención una actividad potenciada de la aspartatoquinasa ThrA.

Microorganismos de acuerdo con la invención y microorganismos empleados en procedimientos de acuerdo con la invención se distinguen, además, preferiblemente porque presentan una actividad incrementada de la homoserina O-succiniltransferasa MetA (EC 2.3.1.46) y/o de la serina acetiltransferasa CysE (EC 2.3.1.30).

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Además, mediante el debilitamiento o la deleción de la proteína reguladora MetJ, que es codificada por el gen metJ, se alcanza un aumento de la biosíntesis de L-metionina. MetJ representa el represor principal de la biosíntesis de L- metionina en E. coli. De manera correspondiente, de acuerdo con la invención se prefiere, además que el gen metJ esté debilitado.

Microorganismos de acuerdo con la invención y microorganismos empleados en procedimientos de acuerdo con la invención se distinguen, además, preferiblemente porque presentan una actividad debilitada de la S- adenosilmetionina sintasa MetK (EC 2.5.1.6).

Además, para la producción de aminoácidos con contenido en azufre con bacterias de la familia Enterobacteriaceae puede ser ventajoso potenciar adicionalmente una o varias enzimas de las vías de biosíntesis de aminoácidos conocidas o enzima o enzimas del metabolismo anaplerótico, o enzimas para la producción de nicotinamida-

adenina-dinucleótido-fosfato reducido o enzimas de la glucosilis o enzimas PTS o enzimas del metabolismo del

azufre, o bien aumentar su actividad.

En otras formas de realización preferida, las bacterias productoras de L-metionina poseen una o varias de las características elegidas del grupo:

n) polinucleótido sobre-expresado que codifica una aspartoquinasa I y homoserina deshidrogenasa I ThrA (EC

2.7.2.4, EC 1.1.1.3),

o) polinucleótido sobre-expresado que codifica una aspartatoquinasa LysC (EC 2.7.2.4),

r) polinucleótido sobre-expresado que codifica una homoseria O-succiniltransferasa MetA (EC 2.3.1.46),

s) polinucleótido sobre-expresado que codifica una cistationina-gamma-sintasa MetB (EC 2.5.1.48),

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cc) polinucleótido sobre-expresado que codifica una O-succinilhomoserina sulfhidrilasa MetZ (EC 2.5.1.48), dd) polinucleótido sobre-expresado que codifica una fosfoenoilpiruvato carboxilasa Pyc (EC 4.1.1.31), ee) polinucleótido sobre-expresado que codifica una tiosulfato-sulfotransferasa RDL2 (EC 2.8.1.1), ff) polinucleótido sobre-expresado que codifica una tiosulfato-tiol sulfotransferasa (EC 2.8.1.3), gg) polinucleótido sobre-expresado que codifica una tiosulfato-ditiol sulfotransferasa (EC 2.8.1.5),

Características preferidas son en este caso una o varias elegidas del grupo:

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2.7.2.4, EC 1.1.1.3),

q) polinucleótido sobre-expresado que codifica una homoserina acetiltransferasa MetX (EC 2.3.1.31),

r) polinucleótido sobre-expresado que codifica una homoseria O-transsuccinilasa MetA (EC 2.3.1.46),

y) polinucleótido sobre-expresado que codifica una tiosulfato-sulfotransferasa RDL2 (EC 2.8.1.1).

Características muy particularmente preferidas se eligen en este caso del grupo:

a) polinucleótido sobre-expresado que codifica una aspartoquinasa I y homoserina deshidrogenasa I ThrA (EC

2.7.2.4, EC 1.1.1.3),

b) polinucleótido sobre-expresado que codifica una serina acetiltransferasa CysE (EC 2.3.1.30),

c) polinucleótido sobre-expresado que codifica una aspartatoquinasa LysC (EC 2.7.2.4),

d) polinucleótido sobre-expresado que codifica una homoserina-deshidrogenasa Hom (EC 1.1.1.3),

e) polinucleótido sobre-expresado que codifica una homoserina acetiltransferasa MetX (EC 2.3.1.31),

f) polinucleótido sobre-expresado que codifica una homoseria O-transsuccinilasa MetA (EC 2.3.1.46),

g) polinucleótido sobre-expresado que codifica una cistationina gamma-sintasa MetB (EC 2.5.1.48),

h) polinucleótido sobre-expresado que codifica una p-C-S-liasa AecD (EC 4.4.1.8, también denominada beta-liasa),

i) polinucleótido sobre-expresado que codifica una cistationina beta-liasa MetC (EC 4.4.1.8),

j) polinucleótido sobre-expresado que codifica una homocisteína S-metiltransferasa MetE, independiente de B12 (EC 2.1.1.14),

k) polinucleótido sobre-expresado que codifica una homocisteína S-metiltransferasa MetH, independiente de B12 (EC 2.1.1.13),

l) polinucleótido sobre-expresado que codifica un tetrahidrofolato de metileno reductasa MetF (EC 1.5.1.20),

m) polinucleótido sobre-expresado que codifica una tiosulfato-sulfotransferasa RDL2 (EC 2.8.1.1).

Los términos “sobreexpresión”, “refuerzo” o la expresión “actividad incrementada” describen de acuerdo con la invención el aumento de la actividad enzimática intracelular de una o varias enzimas en un microorganismo que son codificadas por el ADN correspondiente.

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Básicamente, un aumento de la actividad enzimática se puede alcanzar, por ejemplo, debido a que se aumenta el número de copias de la secuencia génica o bien de las secuencias génicas que codifican la enzima, se utiliza un promotor fuerte o se aprovecha un gen o alelo que codifica una enzima correspondiente con una actividad incrementada, y eventualmente se combinan estas medidas. De acuerdo con la invención, células modificadas por tecnología genética se generan, por ejemplo, mediante transformación, transducción, conjugación o una combinación de estos métodos con un vector que contiene el gen deseado, un alelo de este gen o partes del mismo y un vector que posibilita la expresión del gen. La expresión heteróloga se alcanza, en particular, mediante integración del gen o de los alelos en el cromosoma de la célula o un vector de replicación extracromosómica.

Una perspectiva sobre las posibilidades para el aumento de la actividad enzimática en células en el ejemplo de la piruvato carboxilasa la proporciona el documento DE-A-100 31 999, al que con ello se hace referencia y cuyo contenido de divulgación en relación con las posibilidades para el aumento de la actividad enzimáticas en células forma una parte de la divulgación de la presente invención.

El aumento de la actividad enzimática se puede alcanzar, por ejemplo, debido a que se aumenta el número de copias de los correspondientes polinucleótidos de forma cromosómica o extracromosómica en al menos una copia.

Un método ampliamente difundido para aumentar el número de copias consiste en incorporar el correspondiente polinucleótido en un vector, preferiblemente un plásmido, que es replicado por una bacteria.

Vectores de plásmido adecuados para Enterobacteriaceae son, p. ej., vectores de clonación derivados de pACYC184 (Bartolomé et al.; Gene 102: 75-78 (1991)), pTrc99A (Amann et al.; Gene 69: 301-315 (1988)) o derivados de pSC101 (Vocke y Bastia; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80(21): 6557-6561 (1983)). Particularmente adecuados son, además, plásmidos derivados de pCL1920 (Lerner, C.G. e Inouye, M., Nucl. Acids Res. (1990) 18:4631 [PMID: 2201955]). Son asimismo adecuados vectores de plásmidos derivados de "Cromosomas Artificiales Bacterianos" (BAC) tales como, p. ej., pCC1BAC (EPICENTRE Biotechnologies, Madison, EE.UU.) para aumentar el número de copias de los polinucleótidos correspondientes en E. coli.

Además, como vectores pueden emplearse transposones, elementos de inserción (elementos IS) o fagos. Sistemas genéticos de este tipo se representan, por ejemplo, en los documentos de patente US 4.822.739, US 5.804.414 y US 5.804.414. De igual manera, puede utilizarse el elemento IS ISaB1 descrito en el documento WO 92/02627 o el transposón Tn 45 del plásmido pXZ10142 (citado en “Handbook of Corynebacterium glutamicum” (editor: L. Eggeling y M. Bott)).

Otro método difundido para conseguir una sobre-expresión es el procedimiento de la amplificación génica cromosómica. En el caso de este método, al menos una copia adicional del polinucleótido de interés se introduce en el cromosoma de una bacteria. Procedimientos de amplificación de este tipo se describen, por ejemplo, en el documento WO 03/014330 o el documento WO 03/040373.

Otro método para conseguir una sobreexpresión consiste en enlazar el gen o bien alelo correspondiente de una manera funcional (enlazado operativamente) con un promotor o bien un casete de expresión. Promotores adecuados para E. coli son los conocidos, p. ej., de Amann et al. (Gene (69)2, 301-315 (1988) y Amann y Brosius (Gene 40(2- 3), 183-190 (1985)) T3, T7, SP6, M13, lac, tac y trc. Un promotor de este tipo puede introducirse, por ejemplo, aguas arriba del gen correspondiente, típicamente a una distancia de aproximadamente 1 - 500 nucleobases del codón de iniciación. En el documento US 5.939.307 se describe que mediante incorporación de casetes de expresión o promotores tales como, por ejemplo, promotor tac, promotor trp, promotor lpp o promotor PL y promotor PR del fago A, por ejemplo, aguas arriba del operón de treonina cromosómico se pudo alcanzar un aumento de la expresión. De igual manera, pueden utilizarse los promotores del fago T7, los promotores de engranaje-caja, el promotor nar o los promotores de los genes rrsG, rnpB, csrA, csrB, ompA, fusA, pepQ, rplX o rpsG. Casetes de expresión o promotores de este tipo también pueden utilizarse con el fin de sobre-expresar, tal como se describe en el documento EP 0 593 792, genes unidos a plásmidos. Mediante el uso del alelo laclQ se puede controlar de nuevo la expresión de genes unidos a plásmidos (Glascock y Weickert, Gene 223, 221-231 (1998)). Además, es posible que la actividad de los promotores esté incrementada mediante modificación de su secuencia por medio de uno o varios intercambios de nucleótidos, mediante inserción o inserciones y/o deleción o deleciones.

Si el aumento de la actividad enzimática se consigue mediante mutación del gen endógeno, entonces pueden generarse de forma no dirigida mutaciones de este tipo según métodos clásicos tales como, por ejemplo, mediante irradiación UV o mediante productos químicos desencadenantes de mutaciones, o de manera preestablecida mediante métodos de tecnología genética tales como deleción o deleciones, inserción o inserciones y/o intercambio o intercambios de nucleótidos. Mediante estas mutaciones se obtienen células genéticamente modificadas. Mutantes de enzimas particularmente preferidos son también aquellas enzimas que ya no pueden ser inhibidas de forma retroalimentada o al menos lo son de manera dirigida en comparación con la enzima de tipo salvaje.

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Si el aumento de la actividad enzimática se realiza mediante el aumento de la expresión de una enzima, entonces se aumenta, por ejemplo, el número de copias de los genes correspondientes o se muta la región del promotor y de regulación o el punto de unión a los ribosomas que se encuentra aguas arriba del gen estructural. De igual manera actúan casetes de expresión que se incorporan aguas arriba del gen estructural. Mediante promotores inducibles es adicionalmente posible aumentar la expresión en cualquier instante arbitrario. Además de ello, al gen pueden asociarse como secuencias reguladoras, pero también como los denominados “potenciadores” que realizan a través de una interacción mejorada entre ARN-polimerasa y ADN, asimismo una expresión génica incrementada. Mediante medidas para la prolongación de la vida útil del mARN se mejora asimismo la expresión. Además, mediante el impedimento de la degradación de la proteína enzimática se potencia asimismo la actividad enzimática. Los genes o construcciones de genes se presentan en este caso en plásmidos con un número diferente de copias o están integrados y son amplificados en el cromosoma. Alternativamente, además, puede alcanzarse una sobreexpresión de los genes correspondientes mediante modificación de la composición de los medios y la realización del cultivo. Instrucciones para ello las encuentra el experto en la materia, entre otros, en Martin et al. (Bio/Technology 5, 137146 (1987)), en Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya y Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), en Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991)), en el documento eP-A-0 472 869, en el documento US 4,601,893 , en Schwarzer y Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991), en Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), en LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), en el documento WO-A- 96/15246, en Malumbres et al. (Gene 134, 15-24 (1993), en el documento JP-A-10-229891, en Jensen y Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)), y en libros de texto de genética y biología molecular conocidos. Las medidas precedentemente descritas conducen, asimismo, al igual que las mutaciones, a células genéticamente modificadas.

Además, se adecuan también vectores de plásmidos, con ayuda de los cuales se puede aplicar el procedimiento de la amplificación génica mediante integración en el cromosoma. Tras recombinación homóloga mediante un suceso de “cross-over (cruzamiento)”, la cepa resultante contiene al menos dos copias del gen correspondiente. Un procedimiento para E. coli se describe, por ejemplo, en Link, A. J., Phillips, D. y Church, G.M. (1997), J. Bacteriology 179: 6228-6237.

Para la inserción o deleción de ADN en el cromosoma pueden utilizarse también procedimientos inducidos por recombinasa tal como se describen, por ejemplo, por Datsenko KA, Wanner Bl., 2000, Proc Natl Acad Sci U S A., 97(12): 6640-5.

Por la formulación utilizada precedentemente y en las explicaciones posteriores, “una actividad de una enzima incrementada con respecto a su cepa de tipo salvaje o bien cepa de partida” se ha de entender preferiblemente siempre una actividad incrementada en un factor de al menos 2, de manera particularmente preferida de al menos 10, además preferiblemente de al menos 100, además todavía más preferiblemente de al menos 1.000 y lo más preferiblemente de al menos 10.000 de la enzima respectiva. Además, la célula de acuerdo con la invención que presenta “una actividad incrementada con respecto a su cepa de tipo salvaje o bien cepa de partida”, comprende en particular también una célula, cuyo tipo salvaje o bien cepa de partida no presenta o al menos no presenta actividad detectable alguna de esta enzima y que solo después del aumento de la actividad enzimática, por ejemplo, mediante sobre-expresión, muestra una actividad detectable de esta enzima. A este respecto, el término “sobre-expresión” o la formulación “aumento de la expresión”, utilizada en las siguientes explicaciones, comprende también el caso de que una célula de partida, por ejemplo, una célula de tipo salvaje no presente o al menos no presente expresión detectable alguna y solo sea inducida mediante procedimientos recombinantes una expresión detectable de la enzima.

Métodos para la determinación de la actividad enzimática de diferentes enzimas se pueden deducir de la bibliografía.

La expresión de las enzimas o bien genes precedentemente mencionados se puede detectar con ayuda de una separación del gel de proteínas monodimensional y bidimensional y subsiguiente identificación óptica de la concentración de proteínas con correspondiente software de evaluación en el gel. Cuando el aumento de una actividad enzimática se basa exclusivamente en un aumento de la expresión del gen correspondiente, entonces la cuantificación del aumento de la actividad enzimática se puede determinar de manera sencilla mediante una comparación de las separaciones de proteínas monodimensionales o bidimensionales entre tipo salvaje y célula genéticamente modificada. Un método habitual para la preparación de los geles de proteínas en el caso de bacterias y para la identificación de las proteínas es el modo de proceder descrito por Hermann et al. (Electrophoresis, 22: 1712.23 (2001). La concentración de proteínas puede asimismo analizarse mediante hibridación por transferencia Western con un anticuerpo específico para la proteína a detectar (Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2a ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. EE.UU., 1989) y subsiguiente evaluación óptica con correspondientes softwares para la determinación de la concentración (Lohaus y Meyer (1989) Biospektrum, 5: 32-39; Lottspeich (1999), Angewandte Chemie 111: 2630-2647). La actividad de proteínas de unión a aDn puede medirse mediante el ensayo de desplazamiento de banda de ADN (también denominado retardación

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en gel) (Wilson et al. (2001) Journal of Bacteriology, 183: 2151-2155). El efecto de proteínas de unión a ADN sobre la expresión de otros genes puede detectarse mediante diferentes métodos bien descritos del ensayo del gen informador (Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2a Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. EE.UU., 1989). Las actividades enzimáticas intracelulares pueden determinarse según diferentes métodos descritos (Donahue et al. (2000) Journal of Bacteriology 182 (19): 5624-5627; Ray et al. (2000) Journal of Bacteriology 182 (8): 2277-2284; Freedberg et al. (1973) Journal of Bacteriology 115 (3): 816-823). Si en las siguientes explicaciones no se indican métodos concretos para la determinación de la actividad de una determinada enzima, la determinación del aumento de la actividad enzimática y también la determinación de la disminución de una actividad enzimática tiene lugar preferiblemente mediante los métodos descritos en Hermann et al., Electophoresis, 22: 1712-23 (2001), Lohaus et al., Biospektrum 5 32-39 (1998), Lottspeich, Angewandte Chemie 111: 2630-2647 (1999) y Wilson et al., Journal of Bacteriology 183: 2151-2155 (2001).

Además, para la producción de L-aminoácidos, en particular L-metionina, puede ser ventajoso excluir reacciones secundarias indeseadas (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", en: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, Londres, Reino Unido, 1982).

Así, para la mejora de la producción de L-metionina en E. coli es eventualmente conveniente debilitar uno o varios de los genes, eventualmente desconectarlos o reducir la expresión, elegidos del grupo:

a) un gen metJ (b3938, ECK3930) que codifica el regulador de la transcripción de la biosíntesis de L-metionina (MetJ),

b) un gen pgi (b4025, ECK4017) que codifica la glucosa-6-fosfato-isomerasa (Pgi, EC N° 5.3.1.9),

c) un gen thrB (b0003, ECK0003) que codifica la homoserinaquinasa (ThrB, EC 2.7.1.39),

d) un gen metK (b2942, ECK2937) que codifica la S-adenosilmetionina sintasa (MetK, EC N° 2.5.1.6),

e) un gen dapA (b2478, ECK2474) que codifica la dihidropicolinato sintasa (DapA, EC N° 4.2.1.52),

f) un gen pck (b3403, ECK3390) que codifica la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (Pck, EC N° 4.1.1.49),

g) un gen purU (b1232, ECK1227) que codifica la formiltetrahidrofolato hidrolasa (PurU, EC N° 3.5.1.10),

h) un gen pykA (b1854, ECK1855) que codifica la piruvatoquinasa II (PykA, EC N° 2.7.1.40),

i) un gen pykF (b1676, ECK1672) que codifica la piruvatoquinasa I (PykF, EC N° 2.7.1.40),

j) un gen metQ (b0197, ECK0197) que codifica una subunidad del transportador de L-metionina (MetQNI),

k) un gen metí (b0198, ECK0198) que codifica una subunidad del transportador de L-metionina (MetQNI),

l) un gen metN (b0199, ECK0199) que codifica una subunidad del transportador de L-metionina (MetQNI),

m) un gen dcd (b2065, ECK2059) que codifica la desoxicitidina 5'-trifosfato desaminasa (Dcd, EC N° 3.5.4.13),

n) un gen yncA (b1448, ECK1442) que codifica la supuesta N-aciltransferasa (YncA, explorador metabólico documento WO 2010/020681),

o) un gen fnrS (b4699, ECK4511) que codifica ARNs regulador de FnrS,

p) un gen rpoS (b2741, ECK2736) que codifica el factor Sigma RpoS.

Características particularmente preferidas se eligen en este caso del grupo:

b) un gen metK (b2942, ECK2937) que codifica la S-adenosilmetionina sintasa (MetK, EC N° 2.5.1.6),

c) un gen pck (b3403, ECK3390) que codifica la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (Pck, EC N° 4.1.1.49),

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d) un gen purU (b1232, ECK1227) que codifica la formiltetrahidrofolato hidrolasa (PurU, EC N° 3.5.1.10),

e) un gen pykA (b1854, ECK1855) que codifica la piruvatoquinasa II (PykA, EC N° 2.7.1.40),

f) un gen pykF (b1676, ECK1672) que codifica la piruvatoquinasa I (PykF, EC N° 2.7.1.40),

g) un gen metQ (b0197, ECK0197) que codifica una subunidad del transportador de L-metionina (MetQNI),

h) un gen metí (b0198, ECK0198) que codifica una subunidad del transportador de L-metionina (MetQNI),

i) un gen metN (b0199, ECK0199) que codifica una subunidad del transportador de L-metionina (MetQNI),

j) un gen yncA (b1448, ECK1442) que codifica la supuesta N-aciltransferasa (YncA, explorador metabólico documento WO 2010/020681),

k) un gen rpoS (b2741, ECK2736) que codifica el factor Sigma RpoS.

c) un gen metQ (b0197, ECK0197) que codifica una subunidad del transportador de L-metionina (MetQNI),

d) un gen metI (b0198, ECK0198) que codifica una subunidad del transportador de L-metionina (MetQNI),

e) un gen metN (b0199, ECK0199) que codifica una subunidad del transportador de L-metionina (MetQNI),

f) un gen yncA (b1448, ECK1442) que codifica la supuesta N-aciltransferasa (YncA, explorador metabólico documento WO 2010/020681),

g) un gen rpoS (b2741, ECK2736) que codifica el factor Sigma RpoS.

Las medidas para el debilitamiento se llevan a cabo eventualmente de manera adicional a o bien en una combinación adecuada con las medidas indicadas del refuerzo de genes para aumentar la producción de metionina.

A los microorganismos productores de L-aminoácido antes de la medida de acuerdo con la invención no pertenecen conforme a la invención, las cepas de tipo salvaje y cepas de laboratorio a menudo utilizadas tales como, entre otras, DH5a, DH5amcr, W3110, MG1655, MC4100, Y1089, H560, BL21 y MM152.

Los microorganismos productores de L-aminoácido pueden derivarse, sin embargo, de estas cepas de tipo salvaje y de cepas de laboratorio a menudo utilizadas.

Así, la cepa de partida del microorganismo se deriva preferiblemente del grupo consistente en Escherichia coli MG1655, Escherichia coli W3110, Escherichia coli DH5a, Escherichia coli Dh10B, Escherichia coli BW2952, Escherichia coli REL606.

Una cepa secretora o bien productora de L-metionina preferida de acuerdo con la invención es, por ejemplo, la cepa de producción MG1655 AmetJ metA*11 Ptrc-metH Ptrc-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH ApykF ApykA Ptrc09-gcvTHP ApurU Ptrc36-ARNmst17-metF de E. coli que contiene los plásmidos de producción pME101- thrA*1-cysE-PgapmetA*11 y pCC1BAC-serB-glyA-serA-serC (documento WO 2009/j043803).

Otra cepa secretora o bien productora de L-metionina preferida de acuerdo con la invención es, por ejemplo, la cepa de producción MG1655 AmetJ Ptrc-metH Ptrc-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP que contiene el plásmido de producción pME101-thrA*1-cysE-Pgap-metA*11.

La clonación de la cepa de producción MG1655AmetJ Ptrc-metH Ptrc-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcFcysJIH Ptrc09-gcvTHP de E. coli puede tener lugar tal como se describe en la solicitud de patente WO 2009/043803, mediante una serie de transducciones P1 y curaciones. La cepa se basa en la cepa de tipo salvaje de E. coli K12 MG1655. En el genoma de esta cepa se introdujeron las siguientes modificaciones:

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• se suprimió el gen para el represor de la biosíntesis de L-metionina metJ.

• aguas arriba del gen metH (codifica la metioninasintasa dependiente de cobalamina) se insertó el promotor trc fuerte.

• aguas arriba del gen metF (codifica la 5,10-metilentetrahidrofolato-reductasa) se insertó el promotor trc fuerte.

• aguas arriba del operón cysPUWAM se insertó el promotor trcF fuerte. cysPUWA codifica un transportador de absorción sulfato/tiosulfato. cysM codifica la cisteína-sintasa B.

• aguas arriba del operón cysJIH se insertó el promotor trcF fuerte. cysJI codifica la sufito-reductasa y cysH codifica la 3'-fosfo-adenilsulfato-reductasa.

• aguas arriba del operón gcvTHP se insertó el promotor trc09 fuerte. gcvT, gcvH y gcvP codifican tres componentes del sistema de escisión de glicina.

La clonación del plásmido de producción pME101thrA*1-cysE-Pgap-metA*11 de E. coli se describe en las solicitudes de patente WO 2007/077041 y WO 2009/043803. Se trata de un plásmido de un bajo número de copias (plásmido de bajas copias) a base del vector pCL1920 (Lerner, C. G. e Inouye, M., Nucl. Acids Res. (1990) 18: 4631 [PMID: 2201955]). El plásmido vacío pME101 posee el gen lacIq que codifica un alelo expresado fuerte del represor lac. Aguas abajo de un promotor trc fuerte, reprimible por el represor Lac, se clonó el gen thrA*1. Codifica una variante resistente a la retroalimentación de la aspartatoquinasa / homoserinadeshidrogenasa ThrA de E. coli. En la misma orientación, detrás, se encuentra el gen cysEjunto con su promotor natural. Codifica la serina-acetiltransferasa de E. coli. Aguas abajo de cysE sigue el promotor gapA fuerte de E. coli que controla la expresión del gen metA*11. metA*11 codifica una variante resistente a la retroalimentación de la homoserina O-succiniltransferasa de E. coli.

Como ejemplos de otros microorganismos secretores o bien productores de L-metionina preferidos, de acuerdo con la invención, adicionales pueden mencionarse las siguientes cepas:

- E. coli TF4076BJF metA#10 + metYX(Lm) (documento WO2008/127240; página 46);

- E. coli W3110AJ/pKP451 (documento EP 1 445 310 B1, página 7 Ej. 4);

- E. coli WAthrBCAmetJmetK32 pMWPthrmetA4A5A9 (Yoshihiro Usuda y Osamu Kurahashi, 2005, Applied and Environmental Microbiology, Vol. 71, N°: 6, págs. 3228-3234);

- W3110/pHC34 (documento WO01/27307 página 13, Ej. 3);

- E. coli ECM2 (documentos EP2205754A2, EP2326724A1 y EP12156052.8).

Otros ejemplos de diferentes microorganismos adecuados se describen en Gomes et al. (Enzyme and Microbial Technology 37 (2005), 3-18).

Las secuencias de nucleótidos de los genes o marcos de lectura abiertos (ORF) de Escherichia coli pertenecen al estado de la técnica y pueden deducirse de la secuencia genómica de Escherichia coli publicada por Blattener et al. (Science 277: 1453-1462 (1997)). Es sabido que mediante enzimas propias del huésped (metionina-aminopeptidasa) se puede disociar el aminoácido N-terminal metionina.

Explicaciones más detalladas con respecto a los términos y expresiones de genética y biología molecular se encuentran en libros de texto de genética y biología molecular conocidos tales como, por ejemplo, el libro de texto de Birge (Bacterial and Bacteriophage Genetics, 4a ed., editorial Springer, Nueva York (EE.UU.), 2000) o libro de texto de Berg, Tymoczko y Stryer (Biochemistry, 5a ed., Freeman and Company, Nueva York (EE.UU.), 2002) o libro de texto de Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, (Conjunto de 3-Volúmenes), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (EE.UU.), 2001).

El término “gen” significa aquí un segmento en el ácido desoxirribonucleico (ADN) que contiene las informaciones para la preparación (transcripción) primeramente de un ácido ribonucleico (ARN) y éste la información para la preparación (traducción) de una proteína (polipéptido), en este caso un polipéptido con la actividad de una (p)ppGpp sintetasa II. El hecho de que un gen o un polinucleótido contenga las informaciones para la preparación de una proteína se designa también como codificación de una proteína o bien polipéptido por parte del gen o bien por parte del ARN. Por genes endógenos o bien polinucleótidos se entienden los marcos de lectura abiertos (ORF) presentes en la población de una especie, genes o alelos o bien sus polinucleótidos. Los términos “gen” y “ORF” (marco de lectura abierto) se utilizan de manera sinónima en esta invención.

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El término ”polinucleótido” se refiere, en general, a polirribonucleótidos y polidesoxirribonudeótidos, pudiéndose tratar de ArN o ADN no modificado o de ARN o aDn modificado.

El término “polipéptido” designa péptidos o proteínas que contienen dos o más aminoácidos unidos a través de enlaces peptídicos. Los términos polipéptido y proteína se utilizan como sinónimos. Las proteínas pertenecen a los elementos base de todas las células. Confieren a la célula son solo estructura, sino las “máquinas” moleculares que transportan sustancias, catalizan reacciones químicas y reconocen sustancias señal.

Por “aminoácidos proteinógenos” se entienden los aminoácidos que se presentan en proteínas naturales, es decir, en proteínas de microorganismos, plantas, animales y seres humanos. A ellos pertenecen, en particular L- aminoácidos, elegidos del grupo ácido L-aspártico, L-asparagina, L-treonina, L-serina, ácido L-glutámico, L- glutamina, glicina, L-alanina, L-cisteína, L-valina, L-metionina, L-isoleucina, L-leucina, L-tirosina, L-fenilalanina, L- histidina, L-lisina, L-triptófano, L-prolina y L-arginina, así como selenocisteína. Con ello, en el caso de los aminoácidos proteinógenos se trata siempre de a-aminoácidos. A excepción del aminoácido glicina, para todos los aminoácidos proteinógenos el átomo de carbono a es asimétrico (las moléculas son quirales): de cada uno de estos aminoácidos existen dos enantiómeros. En este caso, solo uno de los dos enantiómeros es proteinógeno, a saber, el L-aminoácido: el aparato necesario para la constitución de las proteínas - el ribosoma, el ARNt, la aminoacil-ARNt sintetasa (ésta carga el ARNt con aminoácidos) y otros - son por sí mismos también quirales y pueden reconocer solamente la variante L.

La expresión “expresión génica” (abreviada “expresión”) designa, por lo general, la manifestación de la información genética en un fenotipo. En un sentido más estrecho, la expresión génica designa la transcripción de un gen en un ARN, la subsiguiente traducción del ARN en un polipéptido, el cual puede poseer una actividad enzimática.

Por una “cepa de partida” (cepa parental) se entiende la cepa de microorganismos en la que se llevan a cabo medidas para aumentar la productividad de uno o varios aminoácidos, péptidos o proteínas, o bien medidas para aumentar la actividad de una o varias enzimas (p. ej., una medida que conduce a la sobre-expresión). En el caso de una cepa de partida puede tratarse de una cepa de tipo salvaje, pero también de una cepa ya previamente modificada (por ejemplo, de un microorganismo productor de L-aminoácidos (cepa de producción)).

Por un “tipo salvaje” de una célula se designa preferiblemente una célula, cuyo genoma está presente en un estado tal como se ha formado de modo natural a través de la evolución. La expresión se utiliza tanto para toda la célula como para genes individuales. Bajo la expresión “tipo salvaje” caen, por lo tanto, en particular no células o bien genes cuyas secuencias génicas hayan sido modificadas al menos en parte por el ser humano mediante procedimientos recombinantes.

La presente invención se explica con mayor detalle en lo que sigue con ayuda de ejemplos de realización.

Medios mínimos (M9) y completos (LB) utilizados para Escherichia coli se describen por J.H. Miller (A Short Course in Bacterial Genetics (1992), Cold Spring Harbor Laboratory Press). El aislamiento de ADN del plásmido a partir de Escherichia coli, así como todas las técnicas para la restricción, el ligamiento, el tratamiento Klenow y de fosfatasa alcalina se llevan a cabo, si no se describe de otro modo, según Sambrook et al. (Molecular Cloning - A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press). La transformación de Escherichia coli se lleva a cabo, si no se describe de otro modo, según Chung et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 86: 2172-2175 (1989)).

Si no se describe de otro modo, la temperatura de cultivo en la preparación de cepas y transformantes asciende a 37°C.

Ejemplo 1

Rastreo de mutantes tolerantes a L-metionina

La cepa ECM2 de E. coli. productora de L-metionina se basa en la cepa K12 MG1655 de tipo salvaje. La cepa ECM2 porta, tal como se describe en los documentos EP 2205754 A2, EP 2326724 A1 y EP 12156052.8 un alelo metA resistente a la retroalimentación, una deleción de los genes metJ, yncA y pykA y pykF, una variante del gen spoT, así como en cada caso un refuerzo del promotor de los genes metH, metF, gcvT, cysP y cysJ.

1.1 Clonación del gen serC en el plásmido pUC18

El gen serC de Escherichia coli MG1655 se amplificó con ayuda de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y, a continuación, se clonó en el plásmido pUC18 (Fermentas GmbH, St. Leon-Rot, Alemania).

Los cebadores de PCR serCF(Xbal) y serCR(HindNI) poseen en los extremos 5’ en cada caso 6 nucleótidos al azar, seguidos de secuencias de reconocimiento para las endonucleasas de restricción XbaI (TCTAGA), o bien HindNI(AAGCTT). Los nucleótidos 13 a 38 de serCF(XbaI) se unen en el genoma de E. coli MG1655 desde la pos. 956619 a 956644. Los nucleótidos 13 a 37 de serCR(HindIII) se unen en el genoma de E. coli MG1655 desde la pos. 5 958028 a 958004.

serCF(XbaI) (SEQ ID NO: 25)

5’ AGGTGCTCTAGAGTCCGCGCTGTGCAAATCCAGAATGG 3’

serCR(HindIII) (SEQ ID NO: 26)

5’ TACACCAAGCTTAACTCTCTACAACAGAAATAAAAAC 3’

10 El gen serC se amplificó con los cebadores serCF(XbaI) y serCR(HindIII) aplicando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con el ADN polimerasa Phusion (Finnzymes Oy, Espoo, Finlandia). Como molde servía ADN genómico de E. coli MG1655. El fragmento de ADN resultante tenía un tamaño de 1434 pb. Se disoció con las endonucleasas de restricción XbaI y HindIII y se purificó con ayuda de un kit de purificación de PCR QIAquick (Qiagen, Hilden, Alemania). El ADN no metilado del plásmido pUC18 se disoció con las endonucleasas de 15 restricción XbaI y HindIII y se purificó con ayuda de un kit de purificación de PCR QIAquick (Qiagen, Hilden, Alemania). A continuación, el plásmido disociado se ligó con el producto de PCR y se transformó en E. coli DH5a. Clones de plásmidos que contenían el gen serC se identificaron mediante disociación de restricción y secuenciación de ADN. El plásmido resultante se denominó pUC18-serC.

1.2 Clonación del gen serA en el plásmido pUC18-serC

20 El gen serA de Escherichia coli MG1655 se amplificó con ayuda de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y a continuación se clonó en el plásmido pUC18-serC.

El cebador de PCR serAF(XbaI) posee en el extremo 5’ 6 nucleótidos al azar, seguidos de una secuencia de reconocimiento para la endonucleasa de restricción XbaI (TCTAGA). Los nucleótidos 12 a 33 se unen en el genoma de E. coli MG1655 desde la pos. 3055199 a 3055220. El cebador de PCR serAR(SHSSNB) posee en el extremo 5’, 25 6 nucleótidos al azar, seguidos de secuencias de reconocimiento para las endonucleasas de restricción SacI, HindIII,

SphI, SmaI, NotI y BglII. Los nucleótidos 49 a 58 se unen en el genoma de E. coli MG1655 desde la pos. 3056880 a 3056861.

serAF(XbaI) (SEQ ID NO: 27)

5’ CTGTAGTCTAGATTAGTACAGCAGACGGGCGCG 3’

30 serAR(SHSSNB) (SEQ ID NO: 28)

5 '

CAAGAGCTCAAGCTTGCATGCGATTCCCGGGCGGCCGCAATAAGATCTCCGTCAGGGCG TGGTGACCG 3'

El gen serA se amplificó con los cebadores serAF(XbaI) y serAR(SHSSNB) utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con la ADN-polimerasa Phusion (Finnzymes Oy, Espoo, Finlandia). Como molde servía ADN genómico de E. coli MG1655. El fragmento de ADN resultante tenía un tamaño de 1731 pb.

35 Se disoció con las endonuclesas de restricción XbaI y SacI y se purificó con ayuda de un kit de purificación de PCR QIAquick (Qiagen, Hilden, Alemania). El plásmido pUC18-serC se disoció asimismo con las endonucleasas de restricción XbaI y SacI y se purificó con ayuda de un kit de purificación de PCR QIAquick (Qiagen, Hilden, Alemania). A continuación, el plásmido disociado se ligó con el producto de PCR y se transformó en E. coli DH5a. Clones de plásmidos que contenían el gen serA se identificaron mediante disociación de restricción y secuenciación de ADN. El 40 plásmido resultante se designó pUC18-serAC.

1.3 Clonación del gen serB en el plásmido pUC18-serAC

El gen serB de Escherichia coli MG1655 se amplificó con ayuda de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y, a continuación, se clonó en el plásmido pUC18-serAC.

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El cebador de PCR serB(Sphl) posee en el extremo 5’ 6 nucleótidos al azar seguidos de una secuencia de reconocimiento para la endonucleasa de restricción SphI (GCATGC). Los nucleótidos 13 a 34 se unen en el genoma de E. coli MG1655 desde la pos. 4622816 a 4622837.

El cebador de PCR serB(SmaI) posee en el extremo 5’ 6 nucleótidos al azar seguidos de una secuencia de reconocimiento para la endonucleasa de restricción SalI (GTCGAC) y SmaI (CCCGGG). Los nucleótidos 54 a 75 se unen en el genoma de E. coli MG1655 desde la pos. 4623887 a 4623866.

serB(Sphl) (SEQ ID NO: 29)

5’ CCATGCGCATGCCCACCCTTTGAAAATTTGAGAC 3’ serB(Smal) (SEQ ID NO: 30)

5' CCGCATGTCGACATCCCGGGGCAGAAAGGCCCACCCGAAGGTGAGCCAGTGTG ATTACTTCTGATTCAGGCTGCC 3'

El gen serB se amplificó con los cebadores serB(SphI) y serB(SmaI) utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con la ADN-polimerasa Phusion (Finnzymes Oy, Espoo, Finlandia). Como molde servía ADN genómico de E. coli MG1655. El fragmento de ADN resultante tenía un tamaño de 1137 pb.

Se disoció con las endonuclesas de restricción SphI y Smal y se purificó con ayuda de un kit de purificación de PCR QIAquick (Qiagen, Hilden, Alemania). El plásmido pUC18-serAC se disoció asimismo con las endonucleasas de restricción SphI y Smal y se purificó con ayuda de un kit de purificación de PCR QIAquick (Qiagen, Hilden, Alemania). A continuación, el plásmido disociado se ligó con el producto de PCR y se transformó en E. coli DH5a. Clones de plásmidos que contenían el gen serB se identificaron mediante disociación de restricción y secuenciación de ADN. El plásmido resultante se designó pUC18-serBAC.

1.4 Clonación del gen glyA en el plásmido pUC18-serBAC

El gen glyA de Escherichia coli MG1655 se amplificó con ayuda de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y, a continuación, se clonó en el plásmido pUC18-serBAC.

El cebador de PCR glyA-aguas abajo posee en el extremo 5’ 6 nucleótidos al azar seguidos de una secuencia de reconocimiento para la endonucleasa de restricción BglII (AGATCT). Los nucleótidos 13 a 35 se unen en el genoma de E. coli MG1655 desde la pos. 2682063 a 2682065.

El cebador de PCR gkyA-aguas arriba posee en el extremo 5’ 6 nucleótidos al azar seguidos de una secuencia de reconocimiento para la endonucleasa de restricción NotI (GCGGCCGC). Los nucleótidos 15 a 33 se unen en el genoma de E. coli MG1655 desde la pos. 2683762 a 2683744.

glyA-aguas abajo (SEQ ID NO: 31)

5’ ATCTAAAGATCTGTTACGACAGATTTGATGGCGCG 3’

glyA-aguas arriba (SEQ ID NO: 32)

5’ TTCATCGCGGCCGCGAAAGAATGTGATGAAGTG 3’

El gen glyA se amplificó con los cebadores glyA-aguas abajo y glyA-aguas arriba utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con la ADN-polimerasa Phusion (Finnzymes Oy, Espoo, Finlandia). Como molde servía ADN genómico de E. coli MG1655. El fragmento de ADN resultante tenía un tamaño de 1726 pb.

Se disoció con las endonuclesas de restricción BglII y NotI y se purificó con ayuda de un kit de purificación de PCR QIAquick (Qiagen, Hilden, Alemania). El plásmido pUC18-serBAC se disoció asimismo con las endonucleasas de restricción BglII y NotI y se purificó con ayuda de un kit de purificación de PCR QIAquick (Qiagen, Hilden, Alemania). A continuación, el plásmido disociado se ligó con el producto de PCR y se transformó en E. coli DH5a. Clones de plásmidos que contenían el gen glyA se identificaron mediante disociación de restricción y secuenciación de ADN. El plásmido resultante se designó pUC18-serB-glyA-serAC.

1.5 Clonación de los genes serB-glyA-serAC a partir de pUC18-serB-glyA-serAC según pCC1-BAC

El plásmido pUC18-serB-glyA-serAC se disolvió con la endonucleasa de restricción HindIII y los fragmentos de ADN se separaron mediante una electroforesis en gel de agarosa. Del gel se aisló un fragmento de ADN de 5,9 kb de tamaño. Contenía los genes serB, glyA, serA y serC. El fragmento se ligó con el plásmido pCC1BAC ya disociado

25

con HindlII Cloning-Ready Vector (Hind III) de la razón social Epicentre /Madison, EE.UU. y se transformó según E. coli EPI300. Clones de plásmidos que contenían el fragmento de ADN a base de serB, glyA, serA y serC se identificaron mediante disociación de restricción y secuenciación de ADN. El plásmido de producción resultante se designó pCC3.

5 1.6 Clonación del plásmido de producción pME-RDL2a

La clonación del plásmido de producción pME-RDL2a tuvo lugar tal como se describe en la solicitud EP 11151526.8. Contiene el gen cysE de Escherichia coli, alelos resistentes a la retroalimentación de los genes thrA y metA de Escherichia coli, así como el gen RDL2a que codifica la tiosulfato-sulfotransferasa RDL2p de Saccharomyces cerevisiae. Adicionalmente, contiene un gen de resistencia a estreptomicina.

10 1.7 Transformación de la cepa ECM2 con los plásmidos de producción

La cepa ECM2 se transformó con el plásmido de producción pCC3 del Ejemplo 1.5 y los transformantes se seleccionaron con 20 mg/l de cloranfenicol. A continuación, las células se transformaron con el plásmido pMe- RDL2a del Ejemplo 1.6, y los transformantes resultantes se seleccionaron con 20 mg/l de cloranfenicol + 100 mg/l de estreptomicina. La cepa resultante se designó ECM2/pCC3/pME-RDL2a.

15 1.8 Rastreo y secuenciación de mutantes tolerantes a L-metionina

Para la selección de mutantes tolerantes a L-metionina, de la cepa ECM2/pCC3/pME-RDL2a se sembró un cultivo previo sobre placas de medio mínimo PC1 (Tabla 1, con 14 g/l de agar) con 75 g/l de L-metionina (Merck, Frankfurt, Alemania). Como medio de cultivo se inocularon 10 ml de medio de cultivo previo (10% de medio LB con 2,5 g/l de glucosa y 90% de medio mínimo PC1) con 100 pl de cultivo celular y se cultivaron durante 10 horas a 37°C.

20 Tabla 1: Medio mínimo PC1

Sustancia: Concentración

ZnSO4 * 7 H2O: 4 mg/l

CuCl2 * 2 H2O: 2 mg/l

MnSO4 * H2O: 20 mg/l

H3BO3: 1 mg/l

Na2MoO4 * 2 H2O: 0,4 mg/l

MgSO4 * 7 H2O: 1 g/l

Ácido cítrico * 1 H2O: 6,56 g/l

CaCl2 * 2 H2O: 40 mg/l

K2HPO4: 8,02 g/l

Na2HPO4: 2 g/l

(NH4)2HPO4: 8 g/l

NH4Cl: 0,13 g/l

(NH4)2SO3: 5,6 g/l

MOPS: 5 g/l

NaOH 10M: ajustado a pH 6,8

FeSO4 * 7 H2O: 40 mg/l

Hidrocloruro de tiamina: 10 mg/l

Vitamina B12: 10 mg/l

Glucosa: 10 g/l

Sustancia: Concentración

Isopropil-tio-p-galactósido (IPTG): 2,4 mg/l

Espectinomicina: 50 mg/l

Cloranfenicol: 20 mg/l

Después de 5 días de incubación pudieron aislarse de las placas colonias individuales de mutantes tolerantes a L- metionina.

Para la preparación de la secuenciación, después de multiplicación en medio LB exento de antibióticos, se aislaron 5 para cerca de seis generaciones, derivados de los mutantes tolerantes a L-metionina de la cepa ECM2/pCC3/pME- RDL2a, que ya no portan los plásmidos pCC3 y pME-RDL2a. Las cepas obtenidas son sensibles a estreptomicina y cloranfenicol.

De los 8 mutantes se aisló ADN cromosómico. Este ADN se empleó para la secuenciación del genoma completo (GATC, Konstanz, Alemania).

10 En comparación con la cepa de partida ECM2, únicamente se manifestaban mutaciones en el gen proP. En la siguiente Tabla 2 se enumeran las mutaciones. Las secuencias de los alelos proP se representan en las SEQ ID NO: 9 a SEQ ID NO: 24.

15 Tabla 2:

Cepa: Mutación en el gen proP Tipo de mutación Denominación de la mutación

DM2321: E412* Intercambio AA M8 (SEQ ID NO:9-10)

DM2322: Inserción de C detrás de posición de nucleótido 842 Inserción de nucleótidos M3 (SEQ ID NO:11-12)

DM2323: Deleción de A detrás de posición de nucleótido 854 Deleción de nucleótidos M4 (SEQ ID NO:13-14)

DM2324: Y467H Intercambio AA M11 (SEQ ID NO:15-16)

DM2325: Deleción de 51pb de las posiciones de nucleótido 1173 a 1223 Deleción de nucleótidos M7 (SEQ ID NO:17-18)

DM2326: Inserción de 19 pb detrás de posición de nucleótido 973 Inserción de nucleótidos M6 (SEQ ID NO:19-20)

DM2327: R324L Intercambio AA M5 (SEQ ID NO:21-22)

DM2328: Inserción de 1359 pb detrás de posición de nucleótido 183 Inserción de nucleótidos M2 (SEQ ID NO:23-24)

Las cepas DM2321, DM2322, DM2323, DM2324, DM2325, DM2326, DM2327 y DM2328 se depositaron de acuerdo con el Tratado de Budapest el 23 de agosto de 2011 en la DMSZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmH, Inhoffenstrasse 7 B, 38124 Braunschweig, Alemania) bajo los números DSM 25095 (= DM2321), 20 25096 (= DM2322), 25097 (= DM2323), 25098 (= DM2324), 25099 (= DM2325), 25100 (= DM2326), 25101 (=

DM2327) y 25102 (= DM2328).

Ejemplo 2

Detección de la actividad de los mutantes proP tolerantes a L-metionina

Para la determinación de la actividad proP de los mutantes proP se analizó a modo de ejemplo la absorción de prolina para la cepa DM2328 en comparación con la cepa de partida ECM2. Para ello, un cultivo previo de 10 ml 1 se incubó en medio LB a lo largo del día a 37 °C con agitación. 1 ml del cultivo previo se transfirieron a 20 ml de medio M9 como cultivo previo 2 y se cultivó durante la noche. El cultivo previo 2 se inoculó a una DO600 de 0,2 en 5 50 ml de medio M9 reciente. Las células se cultivaron después de ello durante 3-4 h, a continuación, se lavaron tres

veces con tampón M9 enfriado con hielo, se ajustaron a una DO 600 de 2 y se almacenaron en hielo.

La absorción de prolina se determinó mediante [14C(U)]L-prolina marcada radiactivamente (actividad específica: 1,85 MBq; Hartmann Analytic, Alemania). En cada caso 2,3 ml de suspensión de células se añadieron para ello en un recipiente con agitación y se estimularon durante 2 min a 37°C mediante la adición de glucosa 10 mM. Bajo 10 agitación se inició la medición de transporte mediante la adición de 20 pl de L-[14C]-prolina con una concentración de 24,6 mM. En diferentes momentos (0, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105 y 120 s) se tomaron en cada caso 200 pl y se pipetearon en filtros de fibra de vidrio (Millipore). A través de una instalación de filtración múltiple en vacío, el medio circundante se filtró con succión y las células se lavaron subsiguientemente dos veces con 2,5 ml de solución de LiCl 0,1 M. Los filtros se mezclaron con 3,8 ml de líquido de centelleo (Roth, Karlsruhe, Alemania) y la radiactividad se 15 determinó con ayuda de un contador de centelleo (LS 6500, Beckman Instruments, München, Alemania). La actividad total en la tanda de reacción se determinó mediante la medición directa de una muestra sin filtración. Para cada una de las muestras se determinó la descomposición por minuto (dpm). La actividad de absorción se calculó en nmol/min (mg TG) (0,36 = relación de peso en seco de E. coli [mg/ml dO=1]). A partir de la parte lineal de la cinética de absorción se pudo derivar la tasa de transporte en nmol/mg*min. En la siguiente Tabla 3 se indican los valores 20 medios de tres mediciones paralelas.

Tabla 3:

Cepa: Tasa de transporte de L-prolina (nmol/mg*min)

ECM2: 2,39

DM2328: 1,27

Ejemplo 3

Transformación de las cepas DM2321, DM2322, DM2323, DM2324, DM2325, DM2326, DM2327 y DM2328 con los 25 plásmidos de producción

Las cepas DM2321, DM2322, DM2323, DM2324, DM2325, DM2326, DM2327 y DM2328 se transformaron con el plásmido de producción pCC3 del Ejemplo 1.5 y los transformantes se seleccionaron con 20 mg/l de cloranfenicol. A continuación, las células se transformaron con el plásmido pME-RDL2a del Ejemplo 1.6, y los transformantes resultantes se seleccionaron con 20 mg/ de cloranfenicol y 100 mg/l de estreptomicina. Las cepas resultantes se 30 designaron DM2321/pCC3/pME-RDL2a, DM2322/pCC3/pME-RDL2a, DM2323/pCC3/pME-RDL2a,

DM2324/pCC3/pME-RDL2a, DM2325/pCC3/pME-RDL2a, DM2326/pCC3/pME-RDL2a, DM2327/pCC3/pME-RDL2a y DM2328/pCC3/pME-RDL2a

Ejemplo 4

Test de rendimiento en el ensayo en matraz con agitación

35 La capacidad de rendimiento de las cepas de producción de L-metionina de E. coli se evaluó mediante ensayos de producción en matraces Erlenmeyer de 100 ml. Como cultivos previos se inocularon en cada caso 10 ml de medio de cultivo previo (10% de medio LB con 2,5 g/l de glucosa y 90% de medio mínimo PC1) con 100 pl de cultivo celular y se cultivaron durante 10 horas a 37°C. Con ello, a continuación, en cada caso 10 ml de medio mínimo PC1 (véase la Tabla 1 en el Ejemplo 1) se inocularon a una DO 600 nm de 0,2 (Bio-fotómetro Eppendorf; Eppendorf AG, 40 Hamburg, Alemania) y se cultivaron durante 24 horas a 37°C. La concentración extracelular de L-metionina se determinó con un analizador de aminoácidos (Sykam GmbH, Eresing, Alemania) mediante cromatografía de intercambio iónico y derivatización de la columna posterior con detección de ninhidrina. La concentración de glucosa extracelular se determinó con un analizador de glucosa YSI 2700 Select (YSI Life Sciences, Yellow Springs, Ohio, EE.UU.). Los resultados están representados en la Tabla 4. Al cabo de 24 horas, la glucosa se había consumido por 45 completo en ambos cultivos.

Tabla 4: Concentraciones de L-metionina en los caldos de fermentación de las cepas de E. coli examinadas

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Cepa: DO(600nm) L-metionina (g/l)

ECM2/pCC3/pME-RDL2a: 3,27 1,71

DM2321/pCC3/pME-RDL2a: 3,04 1,83

DM2322/pCC3/pME-RDL2a: 3,38 1,83

DM2323/pCC3/pME-RDL2a: 3,20 1,83

DM2324/pCC3/pME-RDL2a: 3,38 1,82

DM2325/pCC3/pME-RDL2a: 3,44 1,83

DM2326/pCC3/pME-RDL2a: 3,23 1,87

DM2327/pCC3/pME-RDL2a: 3,22 1,99

DM2328/pCC3/pME-RDL2a: 3,12 1,86

Ejemplo 5

Clonación de los alelos proP de M8, M4 y M6 en el plásmido pMAK705

Los alelos proP M8 de DM2321, M4 de DM2323 y M6 de DM2326 se amplificaron con ayuda de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y, a continuación, se clonaron en el plásmido pMAK705.

Sobre la base de las secuencias obtenidas para los alelos proP (véase el Ejemplo 1) se diseñó un par de cebadores con el que se puede amplificar en cada caso un fragmento que comprende la mutación respectiva. Éste puede ser clonado posteriormente en el plásmido pMAK705 (Hamilton CM, Aldea M, Washburn BK, Babitzke P, Kushner SR (1989); J Bacterio!.; 171(9): 4617-4622)

El cebador de PCR proPmut1 (Notl) posee en el extremo 5' 4 nucleótidos al azar, seguidos de la secuencia de reconocimiento para la endonucleasa de restricción Hindlll.

El cebador de PCR proPmut2 (BamHI) posee en el extremo 5' 4 nucleótidos al azar, seguidos de la secuencia de reconocimiento para la endonucleasa de restricción BamHI.

Los nucleótidos 13 a 32 de proPmut1 (Notl) se unen en el genoma de E. coli MG1655 desde la pos. 4328800 a 4328819. Los nucleótidos 13 a 37 de proPmut2 (Notl) se unen en el genoma de E. coli MG1655 desde la pos. 4330303 a 4330322.

proPmut1(HindIII) (SEQ ID NO: 33)

5' GTCAAAGCTT ATATGGTCGCCAGAAGATCC 3'

proPmut2(BamHI) (SEQ ID NO: 34)

5' GTCAGGATCC TCAGCCGCATTACACAGTTG 3'

Como molde servía ADN genómico de las cepas DM2321, DM2323 y DM2328 (véase el Ejemplo 1).

Se amplificó en cada caso un fragmento que abarca la correspondiente mutación en el gen proP aplicando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con la ADN-polimerasa Phusion (Finnzymes Oy, Espoo, Finlandia). El fragmento de DM2321 (porta proP-M8), que contiene la mutación E412*, tenía un tamaño de 1564 pb (SQ ID NO: 35). El fragmento de DM2323 (porta proP-M4), que contiene la deleción de una “A” después de la posición de nucleótido 854, tenía un tamaño de 15242 pb (SQ ID NO: 36). El fragmento de DM2326 (porta proP-M6), que contiene una inserción de 19 pb detrás de la posición de nucleótido 973, tenía un tamaño de 1563 pb (SQ ID NO: 37).

Los 3 fragmentos se disociaron con las endonucleasas de restricción HindIII y BamHI y se purificaron con ayuda de un kit de purificación de PCR QIA-quick (Qiagen, Hilden, Alemania). A continuación, los fragmentos se emplearon para el ligamento con el plásmido pMAK705.

El plásmido pMAK705 se disoció con las endonucleasas de restricción HindIII y BamHI, se desfoforiló con fosfatasa alcalina (fosfatasa alcalina, intestino de ternero, razón social New England Biolabs, Frankfurt, a. M.) y se purificó a

29

través de un kit de purificación de PCR QIA-quick (razón social Qiagen, Hilden). A continuación, el plásmido se mezcló con los fragmentos proP respectivos y se ligó mediante el ADN ligasa de Quick (New England, BioLabs, Frankfurt, Alemania). Las tandas de ligamiento se transformaron en E. coli DH5a (Grant et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649). Los clones de plásmidos correctos se seleccionaron

5 mediante 20 mg/l de cloranfenicol y se identificaron mediante disociación de restricción, así como subsiguiente

secuenciación de las inserciones. Los plásmidos, así obtenidos, se designaron pMAK_proP-M4, pMAK_proP-M6 y pMAK_proP-M8. A modo de ejemplo, pMAK_proP-M8 está representado en la Figura 3.

Ejemplo 6

Mutagénesis del gen proP en la cepa de E. coli ECM2

10 En la cepa de E. coli ECM2 productora de L-metionina (véase el Ejemplo 1), el alelo de tipo salvaje proP

cromosómico se intercambió en cada caso por un alelo proP M4, M6 y m8 que induce resistencia a metionina. Para

ello, la cepa se transformó mediante electroporación en cada caso con los plásmidos pMAK_proP-M4, pMAK_proP- M6 y pMAK_proP-M8 (véase el Ejemplo 5). Los plásmidos pMAK poseen un gen de resistencia a cloranfenicol y un origen de replicación sensible a la temperatura. El plásmido se replica a 30°C de E. coli, pero no a 44°C. Las tandas 15 de transformación se sembraron en cada caso sobre agar LB con 20 mg/l de cloranfenicol y se incubaron durante 40 horas a 30°C. A continuación, con un asa de inoculación se recogieron células, se resuspendieron en medio LB y se diluyeron 10.000 veces con medio LB. 100 pl de la dilución se sembraron en agar LB con 20 mg/l de cloranfenicol y se incubaron durante otras 24 horas a 44°C. Con ello, se seleccionaron colonias en las que los plásmidos pMAK_proP-M4, pMAK_proP-M6 o bien pMAK_proP-M8 se integraron en cada caso en el cromosoma. En cada 20 caso, una de estas colonias se individualizó con un asa de inoculación en agar LB con 20 mg/l de cloranfenicol y se incubó durante 24 horas a 44°C. La detección de las mutaciones incorporadas tuvo lugar mediante métodos de PCR estándares (Innis et al. (1990) PCR Protocols. A guide to methods and applications, Academic Press) con el siguiente par de cebadores (véase el Ejemplo 11).

proPmut1(HindIII) (SEQ ID NO: 33)

25 5' GTCAAAGCTT ATATGGTCGCCAGAAGATCC 3'

proPmut2(BamHI) (SEQ ID NO: 34)

5' GTCAGGATCC TCAGCCGCATTACACAGTTG 3'

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El producto de PCR resultante en cada caso se secuenció con los dos cebadores en GATC (Konstanz, Alemania). Los tres alelos proP se pudieron transferir en cada caso en la cepa de E. coli ECM2, las cepas resultantes se designaron con ECM2_proP-M4, ECM2_proP-M6 und ECM2_proP-M8.

Ejemplo 7

Transformación de las cepas ECM2 Prop-M4, ECM2 Prop-M6 y ECM2 Prop-M8 con los plásmidos de producción

Las cepas ECM2_proP-M4, ECM2_proP-M6 y ECM2_proP-M8 se transformaron con el plásmido de producción pCC3 del Ejemplo 1.5 y los transformantes se seleccionaron con 20 mg/l de cloranfenicol. A continuación, las células se transformaron con el plásmido pME-RDL2a del Ejemplo 1.6, y los transformantes resultantes se seleccionaron con 20 mg/l de cloranfenicol y 100 mg/l de estreptomcina. Las cepas resultantes se designaron ECM2_proPM4/ pCC3/pME-RDL2a, ECM2_proP-M6/pCC3/pME-RDL2a y ECM2_proP-M8/pCC3/pME-RDL2a.

Ejemplo 8

Ensayo de rendimiento en el ensayo en matraz con agitación

La capacidad de rendimiento de las cepas de producción de L-metionina de E. coli ECM2_proP-M4/pCC3/pME- RDL2a, ECM2_proP-M6/pCC3/pME-RDL2a y ECM2_proP-M8/pCC3/pME-RDL2a se evaluó mediante ensayos de producción en matraces Erlenmeyer de 100 ml. Como cultivos previos se inocularon en cada caso 10 ml de medio de cultivo previo (10% de medio Lb con 2,5 g/l de glucosa y 90% de medio mínimo PC1) con 100 pl de cultivo celular y se cultivó durante 10 horas a 37°C. Con ello se inocularon a continuación en cada caso 10 ml de medio mínimo PC1 (véase la Tabla 1 en el Ejemplo 1) a una DO 600 nm de 0,2 (Bio-fotómetro de Eppendorf; Eppendorf AG, Hamburg, Alemania) y se cultivó durante 24 horas a 37°C. La concentración extracelular de L-metionina se determinó con un analizador de aminoácidos (Sykam GmbH, Erising, Alemania), mediante cromatografía de intercambio iónico y derivatización de columna posterior con detección de ninhidrina. La concentración de glucosa extracelular se determinó con un analizador de glucosa YSI 2700 Select (YSI Life Sciences, Yellow Springs, Ohio, EE.UU.). Los resultados se representan en la siguiente Tabla 5. Después de 24 horas, la glucosa se había consumido por completo en ambos cultivos.

Tabla 5: Concentraciones de L-metionina en los caldos de fermentación de las cepas de E. coli examinadas

Cepa: DO(600nm) L-metionina (g/l)

ECM2/pCC3/pME-RDL2a: 3,27 1,71

ECM2_proP-M4/pCC3/pME-RDL2a: 3,38 1,83

ECM2_proP-M6/pCC3/pME-RDL2a: 3,04 1,87

ECM2_proP-M8/pCC3/pME-RDL2a: 3,22 1,83

5

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LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Evonik Industries AG

<120> Procedimiento para la preparación fermentativa de compuestos orgánico- químicos utilizando cepas mejoradas de la familia Enterobacteriaceae

<130> 2011E00314

<160> 38

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

< 211> 1503

< 212> ADN

< 213> Escherichia coli

<220>

< 221> CDS

< 222> (1)..(1503)

< 223> Región codificadora proP

Claims

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1. Procedimiento para la preparación de L-aminoácidos o de aditivos de alimentos para animales con contenido en L-aminoácido, mediante fermentación de un microorganismo de la familia de las Enterobacteriaceae, caracterizado por que se emplea un microorganismo en el que está debilitado el gen proP, de modo que la actividad o concentración de la proteína ProP se redujo a 0 hasta 75 % de la actividad o concentración de la proteína en el microorganismo no recombinante para la correspondiente proteína.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por que el gen proP está desactivado.
3. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado por que el microorganismo superproduce L- aminoácido.
4. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que el microorganismo enriquece el L-aminoácido en el medio.
5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que el microorganismo enriquece el L- aminoácido en las células.
6. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que en el caso del L-aminoácido se trata de un aminoácido con un contenido en azufre, preferiblemente de L-metionina, L-cisteína, L-cistina, L- homocisteína o L-homocistina.
7. Procedimiento según la reivindicación 6, caracterizado por que en el caso del aminoácido se trata de L-metionina.
8. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que el microorganismo presenta una tolerancia a metionina incrementada en comparación con el microorganismo sin gen proP debilitado, debiéndose entender por tolerancia a metionina incrementada que los microorganismos están en condiciones de crecer todavía a una concentración de L-metionina de 50 gramos por litro.
9. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que en el caso del microorganismo de la familia de las Enterobacteriaceae se trata de una bacteria de los géneros Escherichia, Erwinia, Providencia o Serratia, en particular del género Escherichia, de manera particularmente preferida, se trata de Escherichai coli.
10. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que en el caso del gen proP se trata de un gen con una identidad de la secuencia de al menos 80 %, preferiblemente de al menos 90 %, en particular de al menos 95 %, ante todo de al menos 98, 99 o 100 % en relación con las secuencias de polinucleótidos conforme a SEQ ID NO: 1, 3, 5 o 7 preferiblemente en relación con la secuencia de polinucleótidos conforme a SEQ ID NO: 1.
11. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que en el caso del gen proP debilitado se trata de un polinucleótido que presenta una identidad de la secuencia de al menos 80 %, preferiblemente de al menos 90 %, en particular de al menos 95 %, en particular de al menos 98, 99 o 100 % en relación con la secuencia del polinucleótido conforme a SEQ ID NO: 1 y, además, con respecto al polinucleótido conforme a SEQ ID NO: 1 presenta obligatoriamente una o varias de las siguientes mutaciones:

a. intercambio del triplete que codifica L-arginina en la posición 324 conforme a SEQ ID NO: 2 o una posición equiparable de la secuencia de aminoácidos por un triplete que codifica un aminoácido elegido del grupo L-leucina, L-isoleucina y L-valina, preferiblemente L-leucina;

b. intercambio del triplete que codifica L-tirosina en la posición 467 conforme a SEQ ID NO: 2 o una posición equiparable de la secuencia de aminoácidos por un triplete que codifica un aminoácido elegido del grupo L-lisina, L-arginina y L-histidina, preferiblemente L-histidina;

c. intercambio del triplete que codifica ácido L-glutámico en la posición 412 conforme a SEQ ID NO: 2 o una posición equiparable de la secuencia de aminoácidos por un triplete que codifica un

codón de parada;

d. deleción de la nucleobase adenina en la posición 854 del gen proP conforme a SEQ ID NO: 1;

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e. deleción de una o varias de las nucleobases desde la posición 1173 a 1223, preferiblemente deleción de todas las nucleobases desde la posición 1173 a 1223 del gen proP conforme a SEQ ID NO: 1;

f. inserción de la nucleobase citosina en la posición 842 del gen proP conforme a SEQ ID NO: 1;

g. inserción de una o varias de las nucleobases en la posición 973, preferiblemente inserción de 19 nucleobases en la posición 973 del gen proP conforme a SEQ ID NO: 1;

h. inserción de una o varias de las nucleobases en la posición 183, preferiblemente inserción de 1359 nucleobases en la posición 183 del gen proP conforme a sEq ID NO: 1.
12. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que la fermentación tiene lugar en un medio que contiene una fuente de azufre inorgánica.
13. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que el L-aminoácido se enriquece en el caldo de fermentación obtenido y, a continuación, se aísla, reúne y/o purifica.
14. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que el L-aminoácido se aísla o reúne junto con componentes del caldo de fermentación y/o biomasa.
15. Microorganismo de la familia de las Enterobacteriaceae, que contiene un gen proP debilitado, caracterizado porque superproduce L-metionina y preferiblemente la segrega al medio, caracterizado por que posee una o varias de las características elegidas del siguiente grupo:

a) polinucleótido sobre-expresado que codifica uno o varios componentes del sistema de transporte de tiosulfato/sulfato CysPUWA (EC 3.6.3.25),

b) polinucleótido sobre-expresado que codifica una 3'-fosfoadenosina 5'-fosfosulfato reductasa CysH (EC 1.8.4.8),

c) polinucleótido sobre-expresado que codifica uno o varios componentes de la sulfito reductasa CysJI (EC 1.8.1.2),

d) polinucleótido sobre-expresado que codifica una cisteína sintasa A CysK (EC 2.5.1.47),

e) polinucleótido sobre-expresado que codifica una cisteína sintasa B CysM (EC 2.5.1.47),

f) polinucleótido sobre-expresado que codifica una serina acetiltransferasa CysE (EC 2.3.1.30),

g) polinucleótido sobre-expresado que codifica uno o varios componentes del sistema de escisión de glicina GcvTHP-Lpd (EC 2.1.2.10, EC 1.4.4.2, EC 1.8.1.4),

h) polinucleótido sobre-expresado que codifica una lipoil sintasa LipA (EC 2.8.1.8),

i) polinucleótido sobre-expresado que codifica una lipoil-proteína ligasa LipB (EC 2.3.1.181),

j) polinucleótido sobre-expresado que codifica una fosfoglicerato deshidrogenasa SerA (EC 1.1.1.95),

k) polinucleótido sobre-expresado que codifica una 3-fosfoserina fosfatasa SerB (EC 3.1.3.3),

l) polinucleótido sobre-expresado que codifica una 3-fosfoserina/fosfohidroxitreonina aminotransferasa SerC (EC 2.6.1.52),

m) polinucleótido sobre-expresado que codifica una serina hidroximetiltransferasa GlyA (EC 2.1.2.1),

n) polinucleótido sobre-expresado que codifica una aspartoquinasa I y homoserina deshidrogenasa I ThrA (EC 2.7.2.4, EC 1.1.1.3),

o) actividad enzimática reforzada de la aspartatoquinasa, en particular un polinucleótido sobre-expresado que codifica una aspartatoquinasa LysC (EC 2.7.2.4),

p) polinucleótido sobre-expresado que codifica una homoserina-deshidrogenasa Hom (EC 1.1.1.3),

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q) polinucleótido sobre-expresado que codifica una homoserina O-acetiltransferasa MetX (EC 2.3.1.31),

r) polinucleótido sobre-expresado que codifica una homoseria O-succiniltransferasa MetA (EC 2.3.1.46),

s) polinucleótido sobre-expresado que codifica una cistationina gamma-sintasa MetB (EC 2.5.1.48),

t) polinucleótido sobre-expresado que codifica una p-C-S-liasa AecD (EC 4.4.1.8, también denominada beta-liasa),

u) polinucleótido sobre-expresado que codifica una cistationina beta-liasa MetC (EC 4.4.1.8),

v) polinucleótido sobre-expresado que codifica una homocisteína S-metiltransferasa MetE, independiente de B12 (EC 2.1.1.14),

w) polinucleótido sobre-expresado que codifica una homocisteína S-metiltransferasa MetH, independiente de B12 (EC 2.1.1.13),

x) polinucleótido sobre-expresado que codifica un tetrahidrofolato de metileno reductasa MetF (EC 1.5.1.20),

y) polinucleótido sobre-expresado que codifica uno o varios componentes del exportador de L-metionina BrnFE de Corynebacterium glutamicum,

z) polinucleótido sobre-expresado que codifica uno o varios componentes del exportador de valina YgaZH de Escherichia coli (b2682, b2683),

aa) polinucleótido sobre-expresado que codifica el supuesto transportador YjeH de Escherichia coli (b4141),

bb) polinucleótido sobre-expresado que codifica uno o varios componentes de la piridina nucleótido transhidrogenasa PntAB (EC 1.6.1.2),

cc) polinucleótido sobre-expresado que codifica una O-succinilhomoserina sulfhidrilasa MetZ (EC 2.5.1.48),

dd) polinucleótido sobre-expresado que codifica una fosfoenoilpiruvato carboxilasa Pyc (EC 4.1.1.31),

ee) polinucleótido sobre-expresado que codifica una tiosulfato-sulfotransferasa RDL2 (EC 2.8.1.1),

ff) polinucleótido sobre-expresado que codifica una tiosulfato-tiol sulfotransferasa (EC 2.8.1.3),

gg) polinucleótido sobre-expresado que codifica una tiosulfato-ditiol sulfotransferasa (EC 2.8.1.5),

hh) actividad incrementada de la homoserina O-succiniltransferasa MetA (EC 2.3.1.46),

ii) actividad incrementada de la serina acetiltransferasa CysE (EC 2.3.1.30),

jj) debilitamiento del gen metJ (b3938, ECK3930) que codifica el regulador de la transcripción de la biosíntesis de L- metionina (MetJ),

kk) debilitamiento del gen pgi (b4025, ECK4017) que codifica el regulador de la glucosa-6-fosfato-isomerasa (Pgi, EC N° 5.3.1.9),

ll) debilitamiento del gen thrB (b0003, ECK0003) que codifica la homoserinaquinasa (ThrB, EC 2.7.1.39),

mm) debilitamiento del gen metK (b2942, ECK2937) que codifica la S-adenosilmetionina sintasa (MetK, EC N° 2.5.1.6),

nn) debilitamiento del gen dapA (b2478, ECK2474) que codifica la dihidropicolinato sintasa (DapA, EC N° 4.2.1.52),

oo) debilitamiento del gen pck (b3403, ECK3390) que codifica la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (Pck, EC N° 4.1.1.49),

pp) debilitamiento del gen purU (b1232, ECK1227) que codifica la formiltetrahidrofolato hidrolasa (PurU, EC N° 3.5.1.10),

qq) debilitamiento del gen pykA (b1854, ECK1855) que codifica la piruvatoquinasa II (PykA, EC N° 2.7.1.40),

rr) debilitamiento del gen pykF (b1676, ECK1672) que codifica la piruvatoquinasa I (PykF, EC N° 2.7.1.40),

ss) debilitamiento del gen metQ (b0197, ECK0197) que codifica una subunidad del transportador de L-metionina (MetQNI),

5 tt) debilitamiento del gen metI (b0198, ECK0198) que codifica una subunidad del transportador de L-metionina (MetQNI),

uu) debilitamiento del gen metN (b0199, ECK0199) que codifica una subunidad del transportador de L-metionina (MetQNI),

vv) debilitamiento del gen dcd (b2065, ECK2059) que codifica la desoxicitidina 5'-trifosfato desaminasa (Dcd, EC N° 10 3.5.4.13),

ww) debilitamiento del gen yncA (b1448, ECK1442) que codifica la supuesta N-aciltransferasa (YncA, explorador metabólico documento WO 2010/020681),

xx) debilitamiento del gen rpoS (b2741, ECK2736) que codifica el factor Sigma RpoS,

yy) debilitamiento de la proteína reguladora MetJ,

15 zz) debilitamiento de la S-adenosilmetionina sintasa MetK;

entendiéndose por “debilitamiento” que la actividad o concentración de la proteína correspondiente fue reducida a 0 hasta 75 % de la actividad o concentración de la proteína en el microorganismo no recombinante para la correspondiente proteína, y en donde por “sobre-expresión”, “refuerzo” o “actividad incrementada” se ha de entender que la actividad de la correspondiente proteína está incrementada en un factor de al menos 2 con respecto a la cepa 20 de tipo salvaje.
16. Microorganismo según la reivindicación 15, caracterizado por que enriquece L-metionina en las células.
17. Microorganismo según la reivindicación 15, caracterizado por que enriquece L-metionina en el medio.
18. Microorganismo según una de las reivindicaciones 15 a 17, caracterizado por que el gen proP está desactivado.
19. Microorganismo según una de las reivindicaciones 15 a 18, caracterizado por que presenta una tolerancia a 25 metionina incrementada en comparación con el microorganismo sin gen proP debilitado, debiéndose entender por

tolerancia a metionina incrementada que los microorganismos están en condiciones de crecer todavía a una concentración de L-metionina de 50 gramos por litro.
20. Microorganismo según una de las reivindicaciones 15 a 19, caracterizado por que en el caso del microorganismo de la familia de las Enterobacteriaceae se trata de una bacteria de los géneros Escherichia, Erwinia, Providencia o

30 Serratia, en particular del género Escherichia, de manera particularmente preferida, se trata de Escherichai coli.
21. Microorganismo según una de las reivindicaciones 15 a 20, caracterizado por que en el caso del gen proP se trata de un gen con una identidad de la secuencia de al menos 80 %, preferiblemente de al menos 90 %, en particular de al menos 95 %, ante todo de al menos 98, 99 o 100 % en relación con las secuencias de polinucleótidos conforme a SEQ ID NO: 1, conforme a SEQ ID NO: 3, conforme a SEQ ID NO: 5 o conforme a SEQ

35 ID NO: 7, de manera particularmente preferida en relación con la secuencia de polinucleótidos conforme a SEQ ID NO: 1.
22. Microorganismo según una de las reivindicaciones 15 a 21, caracterizado por que en el caso del gen proP debilitado se trata de un polinucleótido que presenta una identidad de la secuencia de al menos 80 %, preferiblemente de al menos 90 %, en particular de al menos 95 %, ante todo de al menos 98, 99 o 100 % en

40 relación con la secuencia del polinucleótido conforme a SEQ ID NO: 1 y, además, con respecto al polinucleótido conforme a SEQ ID NO: 1 presenta obligatoriamente una o varias de las siguientes mutaciones:

a. intercambio del triplete que codifica L-arginina en la posición 324 conforme a SEQ ID NO: 2 o una posición equiparable de la secuencia de aminoácidos por un triplete que codifica un aminoácido elegido del grupo L-leucina, L-isoleucina y L-valina, preferiblemente L-leucina;

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10

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20

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b. intercambio del triplete que codifica L-tirosina en la posición 467 conforme a SEQ ID NO: 2 o una posición equiparable de la secuencia de aminoácidos por un triplete que codifica un aminoácido elegido del grupo L-lisina, L-arginina y L-histidina, preferiblemente L-histidina;

c. intercambio del triplete que codifica ácido L-glutámico en la posición 412 conforme a SEQ ID NO: 2 o una posición equiparable de la secuencia de aminoácidos por un triplete que codifica un

codón de parada;

d. deleción de la nucleobase adenina en la posición 854 del gen proP conforme a SEQ ID NO: 1;

e. deleción de una o varias de las nucleobases desde la posición 1173 a 1223, preferiblemente deleción de todas las nucleobases desde la posición 1173 a 1223 del gen proP conforme a SEQ ID NO: 1;

f. inserción de la nucleobase citosina en la posición 842 del gen proP conforme a SEQ ID NO: 1;

g. inserción de una o varias de las nucleobases en la posición 973, preferiblemente inserción de 19 nucleobases en la posición 973 del gen proP conforme a SEQ ID NO: 1;

h. inserción de una o varias de las nucleobases en la posición 183, preferiblemente inserción de 1359 nucleobases en la posición 183 del gen proP conforme a sEq ID NO: 1.
23. Polinucleótido con una identidad de la secuencia de al menos 80 %, preferiblemente de al menos 90 %, en particular de al menos 95 %, ante todo de al menos 98, 99 o 100 % en relación con el polinucleótido conforme a SEQ ID NO: 1, caracterizado por que el polinucleótido presenta obligatoriamente una o varias mutaciones con respecto al polinucleótido conforme a SEQ ID NO: 1, elegidas de

a. intercambio del triplete que codifica L-arginina en la posición 324 conforme a SEQ ID NO: 2 o una posición equiparable de la secuencia de aminoácidos por un triplete que codifica un aminoácido elegido del grupo L-leucina, L-isoleucina y L-valina, preferiblemente L-leucina;

b. intercambio del triplete que codifica L-tirosina en la posición 467 conforme a SEQ ID NO: 2 o una posición equiparable de la secuencia de aminoácidos por un triplete que codifica un aminoácido elegido del grupo L-lisina, L-arginina y L-histidina, preferiblemente L-histidina;

c. intercambio del triplete que codifica ácido L-glutámico en la posición 412 conforme a SEQ ID NO: 2 o una posición equiparable de la secuencia de aminoácidos por un triplete que codifica un

codón de parada;

d. deleción de la nucleobase adenina en la posición 854 del gen proP conforme a SEQ ID NO: 1;

e. deleción de una o varias de las nucleobases desde la posición 1173 a 1223, preferiblemente deleción de todas las nucleobases desde la posición 1173 a 1223 del gen proP conforme a SEQ ID NO: 1;

f. inserción de la nucleobase citosina en la posición 842 del gen proP conforme a SEQ ID NO: 1;

g. inserción de una o varias de las nucleobases en la posición 973, preferiblemente inserción de 19 nucleobases en la posición 973 del gen proP conforme a SEQ ID NO: 1;

h. inserción de una o varias de las nucleobases en la posición 183, preferiblemente inserción de 1359 nucleobases en la posición 183 del gen proP conforme a sEq ID NO: 1.
24. Polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 23, caracterizado por que se hibrida con uno o varios de los polinucleótidos elegidos del grupo polinucleótido complementario a SEQ ID NO: 1, polinucleótido complementario a SEQ ID NO: 3 y polinucleótido complementario a SEQ ID NO: 5, preferiblemente polinucleótido complementario a SEQ ID NO: 1.
25. Vector, que contiene un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 23 o 24.
26. Polipéptido con una identidad de al menos 80 %, preferiblemente al menos 90 %, en particular al menos 95 %, ante todo al menos 98, 99 o 100 % con relación a la secuencia conforme a SEQ ID NO: 2, caracterizado por que el

polipéptido presenta obligatoriamente una o varias mutaciones con respecto al polipéptido conforme a SEQ ID NO: 2, elegidas de:

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a. intercambio de la L-arginina en la posición 324 conforme a SEQ ID NO: 2 o una posición equiparable de la secuencia de aminoácidos por un aminoácido elegido del grupo L-leucina, L- isoleucina y L-valina, preferiblemente L-leucina;

b. intercambio de la L-tirosina en la posición 467 conforme a SEQ ID NO: 2 o una posición equiparable de la secuencia de aminoácidos por un aminoácido elegido del grupo L-lisina, L- arginina y L-histidina, preferiblemente L-histidina;

c. deleción de los 17 aminoácidos de la posición 392 a 408 conforme a SEQ ID NO: 2 o una posición equiparable de la secuencia de aminoácidos;

d. deleción de hasta 420 aminoácidos del extremo C en relación con la secuencia conforme a SEQ ID NO: 2, preferiblemente deleción de 88, 163, 202, 212 o 420 aminoácidos del extremo C de la secuencia de aminoácidos conforme a SEQ ID NO: 2.
27. Microorganismo recombinante, que contiene un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 23 o 24 y/o un vector de acuerdo con la reivindicación 25 y/o un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 26.

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