BR102018068936A2 - Método para a produção fermentativa de l-aminoácidos - Google Patents

Abstract

"método para a produção fermentativa de l-aminoácidos" a presente invenção fornece uma bactéria do gênero corynebacterium, em particular da espécie corynebacterium glutamicum, que tem a habilidade de excretar um laminoácido selecionado a partir de l-aminoácidos proteinogênicos e l-ornitina e novas medidas para a produção fermentativa de l-aminoácidos proteinogênicos e lornitina por tais bactérias.

Description

MÉTODO PARA A PRODUÇÃO FERMENTATIVA DE L-AMINOÁCIDOS [0001] A presente invenção fornece uma bactéria do gênero Corynebacterium, em particular da espécie Corynebacterium glutamicum, que tem a habilidade de excretar um L-aminoácido selecionado a partir de Laminoácidos proteinogênicos e L-ornitina e novas medidas para a produção fermentativa de L-aminoácidos proteinogênicos e L-ornitina por tais bactérias.

[0002] Os L-aminoácidos são usados em medicina humana, na indústria farmacêutica, na indústria alimentícia e particularmente em nutrição de animais.

[0003] Os L-aminoácidos como, por exemplo, L-lisina, são produzidos por fermentação de cepas do gênero Corynebacterium, em particular Corynebacterium glutamicum. Devido à grande importância econômica, tem-se trabalhado continuamente para melhorar os métodos de produção. As melhorias podem se referir à tecnologia de fermentação, como, por exemplo, agitar e fornecer oxigênio, ou à composição dos meios de nutriente, por exemplo, a concentração de açúcar durante a fermentação, ou ao processamento do caldo de fermentação em uma forma de produto adequada ao, por exemplo, secar e granular o caldo de fermentação ou cromatografia ou podem se referir às propriedades intrínsecas de desempenho do próprio microrganismo.

[0004] Os métodos usados para melhorar as propriedades de desempenho desses microrganismos são aqueles de mutagênese, seleção e triagem de mutantes. As cepas obtidas desse modo são resistentes a antimetabólitos ou são auxotróficas para metabólitos de importância regulatória e

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2/59 produzem L-aminoácidos. Um antimetabólito conhecido é o análogo de L-lisina S-(2-aminoetil)-L-cisteína (consultar, por exemplo, Tosaka et al.: Agricultural and Biological Chemistry 42(4), 745-752, (1978)).

[0005] Métodos de tecnologia de DNA recombinante foram usados de modo similar por diversos anos para melhoramento de cepa de cepas produtoras de L-aminoácido do gênero Corynebacterium ao modificar, isto é, melhorar ou atenuar, genes de biossíntese de L-aminoácido individuais e investigar o efeito na produção de L-aminoácido. Wendisch et al. fornecem uma resenha sobre produção de aminoácidos em C. glutamicum (World J Microbiol Biotechnol (2016) 32:105, 1-10) .

[0006] Lee et al. ensinam que a inativação de um gene que codifica uma proteína secretora resulta em um aumento de produção de L-lisina em C. glutamicum (documento EP 3 141 597 A1) . O documento EP 3 144 383 A1 revela que a inativação de uma oxaloacetato descarboxilase intrínseca melhora a produção de L-lisina em C. glutamicum. Mockel et al. revelam que a atenuação do gene poxB em C. glutamicum aumenta a produção de L-lisina (documento EP 1 096 013 A2).

[0007] Ochrombel et al. ensinam que a introdução de um sistema de clivagem de glicina em C. glutamicum aumenta a produção de L-aminoácidos (documento EP 2 940 039 A1).

[0008] As sequências de nucleotídeos dos cromossomas de várias bactérias ou cepas resp. do gênero Corynebacterium e da espécie Corynebacterium glutamicum e sua análise foram reveladas. Essas informações estão disponíveis em bancos de dados publicamente acessíveis e podem ser usadas para propósitos de desenvolvimento de cepas. Um de tais bancos

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3/59 de dados é o banco de dados GenBank do NCBI (Centro Nacional de Informações Biotecnológicas [National Center for Biotechnology Information], U.S. National Library of Medicine 8600 Rockville Pike, Bethesda MD, 20894 EUA) .

[0009] Durante o procedimento de anotação e submissão para um cromossoma sequenciado identificado, estruturas, como, por exemplo, genes ou sequências de codificação são dotadas de um identificador exclusivo denominado locus_tag pelo fornecedor das informações do banco de dados.

[0010] Corynebacterium glutamicum contém um gene em seu cromossoma que tem uma atividade de conferir resistência a diferentes fármacos em Escherichia coli.

[0011] Jãger et al. (Journal of Bacteriology, 179(7), 2449 - 2451 (1997)) identificaram um gene denominado cmr (resistência a múltiplos fármacos corinebacterianos) no cromossoma de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 que media a resistência a diversos antibióticos estruturalmente não relacionados, como eritromicina, tetraciclina, puromicina e bleomicina em Escherichia coli. Esse gene cmr confere um fenótipo de resistência apenas a Escherichia coli, porém não a Corynebacterium glutamicum. Com base em análise de sequência de aminoácidos, Jãger et al. concluíram que o gene codifica uma proteína hidrofóbica com 12 potenciais segmentos em α-hélice transmembranares que mostram similaridade a antiportadores fármaco-H+. Jãger et al. declararam, ainda, que a proteína tem uma estrutura comum para transportar proteínas que pertencem à família de facilitador principal. No entanto, a função da atividade dessa proteína em Corynebacterium glutamicum ainda é desconhecida. A sequência de nucleotídeos do gene cmr e a

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4/59 sequência de aminoácidos do polipeptídeo codificado estão disponíveis sob o número de acesso GenBank U43535. A sequência de aminoácidos do polipeptídeo codificado também é mostrado sob a SEQ ID NO:1 da listagem de sequências.

[0012] A sequência de nucleotídeos do cromossoma de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 e sua análise foram descritos por Ikeda e Nakagawa (Applied Microbiology and Biotechnology 62, 99-109(2003)) e no documento EP 1 108 790 A2. Está disponível no NCBI sob o número de acesso NC_003450. Locus_tag NCgl2680 identifica uma sequência que

codifica	uma	proteína	de	resistência	a múltiplos
fármacos.	O	documento EP	1	108 790 A2	também	revela
sequências	de	nucleotídeos	que	codificam fragmentos	dessa

proteína de resistência a múltiplos fármacos.

[0013] Nakagawa revela sob o número de acesso GenBank NP_601971 a sequência de aminoácidos codificada de um polipeptídeo definido como proteína de resistência a múltiplos fármacos de Corynebacterium glutamicum de ATCC13032. Também é mostrada sob a SEQ ID NO:2 da listagem de sequências.

[0014] O documento WO 2001/000804 A2 revela vários genes que codificam proteínas de estresse, resistência e tolerância (proteínas SRT) de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 e seu uso para a modulação de produção de produtos químicos finos. Sob o código de identificação RXA01666 (página 59) e a SEQ ID NO:233 e SEQ ID NO:234, uma sequência de nucleotídeos e a sequência de aminoácidos da proteína codificada que tem a função de uma proteína de resistência a múltiplos fármacos são reveladas. Essas sequências também são reveladas sob o número de acesso

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GenBank AX066329. Declarou-se que proteínas SRT podem ser superexpressas (p37) ou rompidas (p44). No entanto, uma aplicação específica da dita sequência de nucleotídeos para a produção de um produto químico fino específico não é revelada.

[0015] As sequências de aminoácidos de entradas U43535 e NP_601971 foram comparadas e determinadas como idênticas ao longo de todo o comprimento. As ditas duas sequências de aminoácidos também foram determinadas como idênticas à sequência de aminoácidos da proteína de resistência a múltiplos fármacos de ATCC13032 como revelado na SEQ ID NO:234 do documento WO 2001/000804 A2 (consultar também o número de acesso GenBank AX066329).

[0016] Nishio et al. revelam sob o número de acesso GenBank BAV24403, a sequência de aminoácidos codificada de uma proteína definida como “permeases da superfamília de facilitador principal” de uma cepa de Corynebacterium glutamicum ssp. lactofermentum denominada AJ1511. Também é mostrada sob a SEQ ID NO:3 da listagem de sequências.

[0017] A sequência de nucleotídeos do cromossoma de Corynebacterium glutamicum ATCC13869, uma cepa anteriormente denominada Brevibacterium lactofermentum, e sua análise foram reveladas por Chen et al. no NCBI sob o número de acesso NZ_CP016335. Locus_tag BBD29_RS13550 identifica uma sequência que codifica um transportador MFS. Chen et al. revelam sob o número de acesso GenBank ANU34683 a sequência de aminoácidos codificada de uma proteína definida como “transportador de múltiplos fármacos” de Corynebacterium glutamicum ATCC13869 (anteriormente denominada Brevibacterium lactofermentum).

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Também é mostrada sob a SEQ ID NO:4 da listagem de sequências.

[0018] As sequências de aminoácidos de entradas BAV24403 e ANU34683 foram comparadas e determinadas como idênticas ao longo de todo o comprimento. Quando comparada à sequência de aminoácidos do polipeptídeo correspondente de ATCC13032, a identidade foi determinada como de 99,3 %.

[0019] A sequência de nucleotídeos do cromossoma de Corynebacterium glutamicum R e sua análise foram descritas por Yukawa et al. (Microbiology 153(4):1042-1058 (2007)). Está disponível no NCBI sob o número de acesso AP009044. Locus_tag cgR_2674 identifica uma sequência que codifica uma proteína hipotética que compreende uma região denominada MFS. MFS é a abreviação de Superfamília de Facilitador Principal”. Yukawa et al. revelam sob o número de acesso GenBank BAF55689 a sequência de aminoácidos codificada de uma proteína de Corynebacterium glutamicum R que tem uma região denominada MFS”. Também é mostrada sob a SEQ ID NO:5 da listagem de sequências. Sua identidade à sequência de aminoácidos correspondente de ATCC13032 foi determinada como de 98,9 %.

[0020] O termo MFS” é a abreviação para Superfamília de Facilitador Principal”. De acordo com o banco de dados de domínios conservados no NCBI (consultar a entrada no banco de dados cd06174), o termo denota um grupo amplo e diverso de transportadores secundários que inclui uniportadores, simportadores e antiportadores que facilita o transporte por membranas citoplasmáticas ou internas de uma variedade de substratos, incluindo íons, fosfatos de açúcar, fármacos, neurotransmissores, nucleosídeos,

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7/59 aminoácidos e peptídeos.

[0021] Lv et al. (Journal of Bacteriology 194(3), 742743 (2012)) descrevem o sequenciamento e a análise do cromossoma de Corynebacterium glutamicum ATCC14067, uma cepa anteriormente denominada Brevibacterium flavum. Está disponível no NCBI sob o número de acesso AGQQ02000001 e AGQQ02000002. Locus_tag KIQ_001800 identifica uma sequência que codifica um transportador de múltiplos fármacos. Lv et al. revelam sob o número de acesso GenBank KEI24322 a sequência de aminoácidos codificada de uma proteína de Corynebacterium glutamicum ATCC14067 (anteriormente denominada Brevibacterium flavum) definida como um “transportador de múltiplos fármacos” que tem uma região denominada “MFS”. Também é mostrada sob a SEQ ID NO:6 da listagem de sequências. Sua identidade à sequência de aminoácidos correspondente de ATCC13032 foi determinada como de 99,6 %.

[0022] Um resumo das descobertas é mostrado na tabela 1.

Cepa de Corynebacterium glutamicum	Número de Acesso	Comprimento (número de resíduos de aminoácido)	Aminoácido s idênticos	% de Identidade	Sequência
(SEQ NO:	ID )
ATCC13032	U43535	459	459	100, 0	SEQ NO : 1	ID
AJ1511	BAV24403	459	456	99,3	SEQ NO : 3	ID
ATCC13869	ANU34683	459	456	99,3	SEQ NO : 4	ID
R	BAF55689	459	454	98,9	SEQ NO : 5	ID
ATCC14067	KEI24322	459	457	99, 6	SEQ NO: 6	ID

Tabela 1: A comparação das sequências de aminoácidos codificadas de polipeptídeos de Cmr de várias cepas de Corynebacterium glutamicum à sequência de aminoácidos

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8/59 codificada do polipeptídeo de Cmr de ATCC13032 (número de acesso GenBank NP_601971; consultar também SEQ ID NO:2) por alinhamento de sequência com o uso do programa de software Clustal W (Larkin et al.: Clustal W e Clustal X versão 2.0. Em: Bioinformatics 23, 2947-2948 (2007)).

[0023] A sequência de aminoácidos do polipeptídeo de Cmr codificado de ATCC 13032 mostrado na SEQ ID NO: 2 também é mostrado na SEQ ID NO:8.

[0024] O objetivo da presente invenção é fornecer novas medidas para a produção fermentativa de L-aminoácidos proteinogênicos e L-ornitina por bactérias do gênero Corynebacterium, de preferência, da espécie Corynebacterium glutamicum.

[0025] Constatou-se que a produção de L-aminoácidos proteinogênicos e/ou L-ornitina por bactérias do gênero Corynebacterium em que a atividade do polipeptídeo de Cmr, cuja função ainda é desconhecida em Corynebacterium glutamicum, é eliminada, por exemplo, modificando-se o polinucleotídeo que codifica o dito polipeptídeo de Cmr e que são cultivadas em um meio adequado sob condições de fermentação adequadas é melhorada em relação à quantidade de produto formada e/ou à taxa de produção de produto em comparação à bactéria não modificada.

[0026] Portanto, a presente invenção fornece uma bactéria do gênero Corynebacterium que tem a habilidade de excretar um L-aminoácido selecionado a partir de Laminoácidos proteinogênicos e L-ornitina, em que, dentro do cromossoma da dita bactéria, um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo, que é pelo menos 90 % idêntico à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:8 e que confere à

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Escherichia coli uma resistência a pelo menos um

antibiótico,	selecionado	a	partir	de	eritromicina,
tetraciclina,	puromicina	e	bleomicina,	é modificado
deletando-se	pelo menos	uma	parte	da	sequência de

codificação para o polipeptídeo de Cmr correspondente aos aminoácidos das posições 149 a 251, 41 a 344 ou 14 a 435 da sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO:8 ou deletando-se pelo menos a sequência de nucleotídeos completa que codifica o ditopolipeptídeo, de preferência, deletando-se a sequência de codificação completa e o códon de parada adjacente.

[0027] O polipeptídeo, que confere à Escherichia coli uma resistência a pelo menos um antibiótico, selecionado a partir de eritromicina, tetraciclina, puromicina e bleomicina, também é denominado polipeptídeo de Cmr (polipeptídeo de resistência a múltiplos fármacos corinebacterianos) no presente documento. Os ensinamentos para medir fenótipos de resistência/sensibilidade podem ser encontrados nos livros de microbiologia médica, como o livro de H. Brandis, W. Kohler, H.J. Eggers e G. Pulverer (Lehrbuch der Medizinischen Mikrobiologie, 7a edição, Gustav Fischer Verlag, 1994) e por Jãger et al. (Journal of Bacteriology, 179(7), 2449 - 2451 (1997)).

[0028] A eritromicina é um antibiótico macrólido produzido por Saccharopolyspora erythraea. O número de registro CAS (Serviço de Resumos Químicos) é 114-07-8.

[0029] A tetraciclina é um antibiótico policétido produzido pela espécie Streptomyces. O número de registro CAS é 60-54-8. O número de registro CAS do sal de HCl correspondente é 64-75-5.

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10/59 [0030] A puromicina é um antibiótico de nucleosídeo produzido por Streptomyces alboniger. O número de registro CAS é 53-79-2. O número de registro CAS do sal de dicloridrato correspondente é 58-58-2.

[0031] A bleomicina é um antibiótico antitumor de glicopeptídeo produzido por Streptomyces verticillus. O número de registro CAS é 11056-06-7. O número de registro CAS do sal de H2SO4 correspondente é 9041-93-4.

[0032] Resumos referentes a antibióticos podem ser encontrados, entre outros, no livro de Jason C. Gallagher e Conan MacDougall (Antibiotics Simplified, 2^a edição, Jones & Bartlett Learning, 2012).

[0033] O polipeptídeo cuja atividade é eliminada modificando-se o polinucleotídeo que codifica o dito polipeptídeo na Corynebacterium de acordo com a presente invenção confere à Escherichia coli uma resistência, de preferência, aos antibióticos eritromicina e/ou tetraciclina.

[0034] Os L-aminoácidos proteinogênicos devem ser compreendidos como os L-aminoácidos presentes em proteínas naturais, ou seja, proteínas de microrganismos, plantas, animais e seres humanos. Os L-aminoácidos proteinogênicos compreendem ácido L-aspártico, L-asparagina, L-treonina, Lserina, ácido L-glutâmico, L-glutamina, L-glicina, Lalanina, L-cisteína, L-valina, L-metionina, L-isoleucina, L-leucina, L-tirosina, L-fenilalanina, L-histidina, Llisina, L-triptofano, L-arginina, L-prolina e, em alguns casos, L-selenocisteína e L-pirrolisina.

[0035] O termo L-aminoácidos, quando mencionado no presente documento, em particular no contexto de formação

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11/59 de produto, também compreende suas formas iônicas e sais, por exemplo, monocloridrato de L-lisina ou sulfato de Llisina no caso da L-lisina de L-aminoácido.

[0036] A sequência de aminoácidos do dito polipeptídeo de Cmr codificado cuja atividade é eliminada modificando-se o polinucleotídeo que codifica o dito polipeptídeo na Corynebacterium de acordo com a presente invenção compreende 459 resíduos de aminoácido antes da modificação do polinucleotídeo. Sabe-se, na técnica, que o aminoácido N-terminal metionina de um polipeptídeo codificado pode ser removido por uma aminopeptidase durante ou após tradução (Jocelyn E. Krebs, Elliott S. Goldstein e Stephan T. Kilpatrick: Lewin's Genes X, Jones e Bartlett Publishers, EUA, 2011).

[0037] A sequência de aminoácidos do polipeptídeo de Cmr codificado de ATCC13032 mostrado na SEQ ID NO:2 também é

mostrada	na	SEQ ID NO: 8. A sequência de	nucleotídeos que
codifica	o	dito polipeptídeo é	mostrada	na	SEQ ID NO:7
posições	100	1 a 2377.
[0038]	Na	Corynebacterium de	acordo	com	a presente
invenção	o	polipeptídeo cuja	atividade	é eliminada

modificando-se o polinucleotídeo que codifica o dito polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:8 ou SEQ ID NO:10 ou SEQ ID NO:12, de preferência, o dito polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:8 antes da modificação do polinucleotídeo.

[0039] Durante o trabalho para a presente invenção, a sequência de codificação para o polipeptídeo de Cmr da cepa DSM13994 (depositada em DSMZ, Braunschweig, Alemanha em 16 de janeiro de 2001) descrita no documento EP 1 239 040 A2

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12/59 foi analisada. A dita sequência de codificação da cepa DSM13994 foi determinada como idêntica àquela da cepa ATCC13032, com exceção da posição 1341. A posição 1341 da sequência de codificação corresponde à posição 2341 da SEQ ID NO:7. A posição 1341 da sequência de codificação em DSM13994 contém a nucleobase timina (t), resultando em um códon gct. A posição 1341 da sequência de codificação em ATCC13032 contém citosina (c), resultando em um códon gcc. Ambos os códons codificam L-alanina.

[0040] A sequência de aminoácidos do polipeptídeo de Cmr codificado de ATCC13869 mostrado na SEQ ID NO:4 também é mostrada na SEQ ID NO: 10. A sequência de nucleotídeos que codifica o dito polipeptídeo é mostrada na SEQ ID NO:9 posições 1001 a 2377.

[0041] A sequência de aminoácidos do polipeptídeo de Cmr codificado de ATCC14067 mostrado na SEQ ID NO:6 também é mostrada na SEQ ID NO: 12. A sequência de nucleotídeos que codifica o dito polipeptídeo é mostrada na SEQ ID NO:11 posições 1001 a 2377.

[0042] Antes da modificação do polinucleotídeo, a sequência de nucleotídeos que codifica o dito polipeptídeo de Cmr é, de preferência, selecionada a partir de SEQ ID NO:7 posições 1001 a 2377, SEQ ID NO:7 posições 1001 a 2377, em que na posição 2341 timina (t) está contida, SEQ ID NO:9 posições 1001 a 2377 e SEQ ID NO:11 posições 1001 a 2377, com SEQ ID NO:7 posições 1001 a 2377 e SEQ ID NO:7 posições 1001 a 2377, em que na posição 2341 timina (t) está contida, sendo particularmente preferencial.

[0043] Na Corynebacterium, o polinucleotídeo que é modificado de acordo com a presente invenção e que codifica

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13/59 o dito polipeptídeo de Cmr compreende as posições 1001 a 2377 da sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO:7 ou as posições 1001 a 2377 da SEQ ID NO:7, em que na posição 2341 citosina (c) é substituída por timina (t).

[0044] Os ensinamentos e as informações quanto ao manuseio e trabalho experimental com polinucleotídeos podem ser encontrados, entre outros, no livro de J. Sambrook et al (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), o livro de C. R. Newton e A. Graham (PCR, Spektrum Akademischer Verlag, 1994) e o livro de D. Rickwood e B. D. Hames (Gel electrophoresis of nucleic acids, a practical approach, IRL Press, 1982).

[0045] Para análise de sequência de polinucleotídeos e polipeptídeos, por exemplo, alinhamentos de sequência, o software público como o CLC Genomics Workbench (Qiagen, Hilden, Alemanha) ou o programa MUSCLE fornecido pelo Instituto Europeu de Bioinformática [European Bioinformatics Institute] (EMBL-EBI, Hinxton, Reino Unido) também pode ser usado.

[0046] Durante o trabalho para a presente invenção, constatou-se que modificar L-aminoácido que excretam bactérias do gênero Corynebacterium, de preferência, da espécie Corynebacterium glutamicum, eliminando-se a atividade de polipeptídeo de Cmr modificando-se o polinucleotídeo que codifica o dito polipeptídeo aumentou sua habilidade de excretar L-aminoácidos em comparação à bactéria não modificada.

[0047] A pessoa versada na técnica está ciente que diversos métodos de mutagênese para alcançar a dita eliminação, ou inativação resp., do dito polipeptídeo de

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Cmr na Corynebacterium.

[0048] Como consequência da dita eliminação por deleção, novos pontos de junção, ou sítios de junção resp., são criados no cromossoma da Corynebacterium, de preferência, Corynebacterium glutamicum.

[0049] Se, por exemplo, a sequência de codificação completa, incluindo o códon de parada adjacente for deletado, um novo ponto de junção é criado no cromossoma da Corynebacterium glutamicum que liga a primeira nucleobase após o códon de parada da sequência de codificação, por exemplo, a nucleobase na posição 2381 da SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:7 contendo timina (t) na posição 2341, SEQ ID NO:9 ou SEQ ID NO:11, sendo que a primeira nucleobase precedente ao códon de início da sequência de codificação, por exemplo, a nucleobase na posição 1000 da SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9 ou SEQ ID NO:11.

[0050] Em uma modalidade específica da presente invenção, a sequência de nucleotídeos das posições 1001 a 2380 da SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:7 contendo timina (t) na posição 2341, SEQ ID NO:9 ou SEQ ID NO:11, de preferência, SEQ ID NO:7 ou SEQ ID NO:7 contendo timina (t) na posição 2341, que compreende a sequência de codificação do polipeptídeo de Cmr, incluindo o códon de parada adjacente, é deletada e a sequência de nucleotídeos gatatc, que é o sítio de reconhecimento para a endonuclease de restrição EcoRV inserida no sítio de deleção. Então, a modificação da sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo de Cmr dentro do cromossoma da Corynebacterium resulta em uma inserção de um sítio de reconhecimento para a enzima de restrição EcoRV.

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15/59 [0051] Consequentemente, um novo sítio de junção é criado no presente documento no cromossoma da Corynebacterium caracterizado por a ponte de sequência de nucleotídeos gatatc entre a nucleobase c na posição 1000 e a nucleobase g na posição 2381 da SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:7 contendo timina (t) na posição 2341, SEQ ID NO:9 ou SEQ ID NO:11, de preferência, SEQ ID NO:7 ou SEQ ID NO:7 contendo timina (t) na posição 2341.

[0052] A sequência de nucleotídeos do novo sítio de junção criado, incluindo as sequências de nucleotídeos a montante e a jusante da mesma é mostrada na SEQ ID NO:13 e nas tabelas 2 e 3.

linhagem	sequência de nucleotídeos	comprimento*
a	SEQ ID NO:13 posições 796 a 807	12
b	SEQ ID NO:13 posições 795 a 807	13
c	SEQ ID NO:13 posições 794 a 807	14
d	SEQ ID NO:13 posições 793 a 807	15
e	SEQ ID NO:13 posições 792 a 807	16
f	SEQ ID NO:13 posições 791 a 807	17

Tabela 2: Listagem de sequências de nucleotídeos indicando uma deleção da sequência de codificação completa para o polipeptídeo de Cmr e o códon de parada adjacente associado à inserção do sítio de reconhecimento para a enzima de restrição EcoRV em cepas da espécie Corynebacterium glutamicum de acordo com a presente invenção. A sequência de nucleotídeos do sítio de reconhecimento para a endonuclease de restrição EcoRV se estende da posição 801 a 806 na SEQ ID NO:13.

*comprimento em nucleobases ou pares de bases resp.

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linhagem	sequência de nucleotídeos	comprimento*
a	SEQ ID NO:13 posições 798 a 808	11
b	SEQ ID NO:13 posições 797 a 808	12
c	SEQ ID NO:13 posições 796 a 808	13
d	SEQ ID NO:13 posições 795 a 808	14
e	SEQ ID NO:13 posições 794 a 808	15
f	SEQ ID NO:13 posições 793 a 808	16

Tabela 3: Listagem de sequências de nucleotídeos indicando uma deleção da sequência de codificação completa para o polipeptídeo de Cmr e o códon de parada adjacente associado à inserção do sítio de reconhecimento para a enzima de restrição EcoRV em cepas da espécie Corynebacterium glutamicum de acordo com a presente invenção. A sequência de nucleotídeos do sítio de reconhecimento para a endonuclease de restrição EcoRV se estende da posição 801 a 806 na SEQ ID NO:13.

*comprimento em nucleobases ou pares de bases resp.

[0053] Consequentemente, em uma modalidade mais específica da presente invenção, uma deleção da sequência de codificação completa para o polipeptídeo de Cmr e o códon de parada adjacente associado à inserção do sítio de reconhecimento para a enzima de restrição EcoRV no cromossoma de uma Corynebacterium, em particular de uma Corynebacterium glutamicum, de preferência, ATCC13032, ATCC13869, ATCC14067 e cepas que excretam L-aminoácido obtidas dessas cepas é identificada por uma das sequências de nucleotídeos mostradas nas tabelas 2 e 3.

[0054] Um método comum para incorporar mutações em genes cromossômicos de Corynebacterium glutamicum é o método de

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17/59 substituição de gene descrito por Schwarzer e Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991)) e adicionalmente elaborado por Schafer et al. (Gene 145, 69-73 (1994) ) . PetersWendisch et al. (Microbiology 144, 915-927 (1998)) usaram o método de substituição de gene para inativar o gene pyc de Corynebacterium glutamicum que codifica piruvato carboxilase. Schafer et al. usaram o método para incorporar uma deleção na região de gene hom-thrB de Corynebacterium glutamicum. No documento EP1094111, o método foi usado para incorporar uma deleção no gene pck de Corynebacterium glutamicum que codifica fosfoenol piruvato carboxiquinase. [0055] No método de substituição de gene, uma mutação, como, por exemplo, uma deleção, inserção ou substituição de pelo menos uma nucleobase, é construída in vitro na sequência de nucleotídeos do gene em questão.

[0056] No contexto da presente invenção, o gene em questão é o gene cmr. A sequência de nucleotídeos do gene cmr contém uma sequência de codificação para um polipeptídeo que tem uma atividade de conferir à Escherichia coli resistência a pelo menos um antibiótico, selecionado a partir de eritromicina, tetraciclina, puromicina e bleomicina, como especificado nesta invenção. Exemplos de tais sequências de nucleotídeos são SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:7 contendo timina (t) na posição 2341, SEQ ID NO:9 e SEQ ID NO:11 da listagem de sequências. No contexto da presente invenção, a mutação é, de preferência, uma deleção localizada na sequência de codificação do dito gene cmr.

[0057] A sequência de nucleotídeos que sofreu mutação do gene em questão compreende i) uma sequência de nucleotídeos

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18/59 na extremidade 5' do sítio de mutação, a qual também é denominada sequência flanqueadora 5' ou sequência a montante na técnica, ii) uma sequência de nucleotídeos na extremidade 3' do sítio de mutação, a qual também é denominada sequência flanqueadora 3' ou sequência a jusante na técnica, e iii) a sequência de nucleotídeos do sítio de mutação entre i) e ii). O sítio de mutação é caracterizado no contexto da presente invenção pela falta de uma sequência específica, a saber, uma deleção em ou da sequência de codificação para o polipeptídeo de Cmr, e consequentemente também caracterizado pelas sequências que flanqueiam o sítio de mutação (sequências flanqueadoras).

[0058] Para algumas aplicações, pode ser conveniente incorporar adicionalmente um polinucleotídeo adequado no dito sítio de mutação. O dito polinucleotídeo adequado pode conter, entre outros, a sequência de codificação para uma enzima da via biossintética de um L-aminoácido, por exemplo, a sequência de codificação para a enzima aspartoquinase, a qual é uma enzima da via biossintética de L-lisina, ou a sequência de nucleotídeos do sítio de reconhecimento para uma enzima de restrição útil para melhora adicional da cepa.

[0059] Um exemplo de uma sequência de nucleotídeos que sofreu mutação no contexto da presente invenção é mostrado na SEQ ID NO:13. A sequência flanqueadora 5' consiste na sequência de nucleotídeos das posições 201 a 1000 da SEQ ID NO:7. A sequência flanqueadora 3' consiste na sequência de nucleotídeos das posições 2381 a 3180 da SEQ ID NO:7. A sequência de nucleotídeos das posições 1001 a 2380 da SEQ ID NO:7 que compreendem a sequência de codificação para o

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19/59 polipeptídeo de Cmr e o códon de parada adjacente foi removida e a sequência de nucleotídeos do sítio de reconhecimento da endonuclease de restrição EcoRV foi incorporada como mostrado das posições 801 a 806 da SEQ ID NO:13.

[0060] A sequência de nucleotídeos que sofreu mutação construída é clonada em um vetor de plasmídeo adequado que não é capaz de replicação autônoma em Corynebacterium, de preferência, Corynebacterium glutamicum. Os vetores de plasmídeo adequados, de preferência, vetores de plasmídeo que permitem a substituição de gene, são pK*mob e pK*mobsacB, é particularmente preferencial pK18mobsacB, descrito por Schãfer et al. (Gene 145, 69 - 73, 1994) . Esses vetores de plasmídeo são capazes de replicação autônoma em Escherichia coli, porém não em Corynebacterium. No entanto, devido à sua natureza móvel, podem ser transferidos de Escherichia coli para Corynebacterium por conjugação. Devido à presença do sistema de seleção de gene sacB, conferir sensibilidade à sacarose a seu hospedeiro, o vetor de plasmídeo pK18mobsacB fornece o meio para selecionar eventos de recombinação dupla após recombinação homóloga. Permite, desse modo, o isolamento de cepas que portam a mutação desejada no gene de interesse. Vetores de plasmídeo similares são descritos, por exemplo, nos documentos WO2002070685 A2 e WO2003014362 A2.

[0061] Esse vetor de plasmídeo contendo a sequência de nucleotídeos que sofreu mutação é subsequentemente transferido para a cepa desejada de Corynebacterium, por exemplo, cepa DM1933 de Corynebacterium glutamicum (isto é, DSM25442; Blombach et al., Applied and Environmental

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Microbiology 75(2), 419-427, 2009), por transformação ou conjugação. Após dois eventos de recombinação homóloga que compreendem um evento de recombinação dentro da sequência flanqueadora 5' fornecido pelo vetor de plasmídeo com a sequência homóloga do cromossoma de Corynebacterium glutamicum e um evento de recombinação dentro da sequência flanqueadora 3' fornecida pelo vetor de plasmídeo com a sequência homóloga do cromossoma de Corynebacterium glutamicum, um realizando a integração e o outro realizando a excisão do dito vetor de plasmídeo, a mutação é incorporada no cromossoma de Corynebacterium glutamicum. Desse modo, a sequência de nucleotídeos do gene em questão contida no cromossoma da dita cepa desejada é substituída pela sequência de nucleotídeos que sofreu mutação. Um evento de recombinação homóloga também pode ser denominado permutação (crossing over).

[0062] Para praticar a presente invenção, bactérias do gênero Corynebacterium são usadas. Uma descrição do gênero Corynebacterium e a espécie compreendida nesse gênero pode ser encontrada no artigo “Corynebacterium” por K. A. Bernard e G. Funke em Bergey's Manual of Systematics of Archaea and Bacteria (Bergey's Manual Trust, 2012). A bactéria do gênero Corynebacterium de acordo com a presente invenção pertence, de preferência, à espécie Corynebacterium glutamicum.

[0063] A Corynebacterium de acordo com a presente invenção tem a habilidade de excretar L-aminoácidos proteinogênicos, selecionados a partir de L-lisina, Lvalina, L-treonina, L-isoleucina, L-histidina e L-prolina, e L-ornitina.

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21/59 [0064] As cepas adequadas de Corynebacterium glutamicum são cepas selvagens dessa espécie, por exemplo, cepas ATCC13032, ATCC14067 e ATCC13869, e cepas que excretam Laminoácido obtida a partir dessas cepas selvagens, de preferência, cepas que excretam L-aminoácido obtidas a partir dessas cepas selvagens.

[0065] A cepa ATCC13032 (também disponível como DSM20300) é a cepa do tipo taxonômico da espécie Corynebacterium glutamicum. A cepa ATCC14067 (também disponível como DSM20411) também é conhecida sob a designação desatualizada Brevibacterium flavum. A cepa ATCC13869 (também disponível como DSM1412) também é conhecida sob a designação desatualizada Brevibacterium lactofermentum. Um estudo taxonômico desse grupo de bactérias baseado em hibridização de DNA-DNA foi feito por Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology 41(2), 255-260, 1991) . Uma análise comparativa de várias cepas da espécie Corynebacterium glutamicum baseada em análise de sequência foi fornecido por Yang e Yang (BMC Genomics 18(1):940).

[0066] Uma multitude de cepas que excretam L-aminoácido do gênero Corynebacterium, em particular da espécie Corynebacterium glutamicum, foi obtida na técnica durante as últimas décadas, tendo início em cepas como ATCC13032, ATCC14067, ATCC13869 e similares. Foram obtidas como resultado de programas de desenvolvimento que tinham como alvo o L-aminoácido (ou L-aminoácidos) desejado de cepa com o uso, entre outros, de métodos como mutagênese clássica, seleção para resistência antimetabólito, bem como amplificação e modificação de promotor de genes da via

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22/59 biossintética do L-aminoácido em questão por métodos de engenharia genética. Resumos podem ser encontrados em L. Eggeling e M. Bott (Handbook of Corynebacterium glutamicum, CRC Press, 2005) ou H. Yukawa e M. Inui (Corynebacterium glutamicum Biology and Biotechnolgy, Springer Verlag, 2013).

[0067] As cepas que excretam L-lisina da espécie Corynebacterium glutamicum são amplamente conhecidas na técnica e podem ser usadas para o propósito da presente invenção. Por exemplo, Blombach et al. (Applied and Environmental Microbiology 75(2), 419-427, 2009) descrevem uma cepa DM1933 de Corynebacterium glutamicum que foi depositada sob número de acesso DSM25442 de acordo com o tratado de Budapeste. Além disso, a cepa DM2031 de Corynebacterium glutamicum que excreta L-lisina, depositada de acordo com o Tratado de Budapeste como DSM32514, pode ser usada. A cepa DM2031 é um derivado desenvolvida adicionalmente de DM1933 que tem habilidade melhorada de excreção de L-lisina. Outras cepas Corynebacterium glutamicum que excretam L-lisina são descritas, por exemplo, nos documentos W02008033001 Al e EP0841395 Al.

[0068] As cepas que excretam L-lisina da espécie Corynebacterium glutamicum contêm tipicamente um polinucleotídeo que codifica uma variante de polipeptídeo de aspartoquinase resistente à realimentação. Uma variante de polipeptídeo de aspartoquinase resistente à realimentação significa uma aspartoquinase que é menos sensível, ou dessensibilizada resp., à inibição por misturas de L-lisina e L-treonina, por exemplo, 10 mM cada, ou misturas do análogo de L-lisina S-(2-aminoetil)-L

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23/59 cisteína e L-treonina, por exemplo, S-(2-aminoetil)-Lcisteína 50 mM e L-treonina 10 mM, em comparação à forma selvagem da enzima, que está contida em cepas selvagens como, por exemplo, ATCC13032, ATCC14067 e ATCC13869. O número EC para aspartoquinase é EC 2.7.2.4. Descrições de polinucleotídeos de Corynebacterium glutamicum que codificam uma variante de polipeptídeo de aspartoquinase resistente à realimentação são dadas, por exemplo, nos documentos US5688671, US6844176 e US6893848. Uma lista resumida pode ser encontrada, entre outros, no documento WO2009141330 A1.

[0069] Consequentemente, as ditas cepas que excretam Llisina da espécie Corynebacterium glutamicum usadas para as medidas da presente invenção contêm, de preferência, pelo menos uma cópia de um polinucleotídeo que codifica uma aspartoquinase resistente à realimentação.

[0070] A SEQ ID NO:14 mostra a sequência de nucleotídeos da sequência de codificação do polipeptídeo de aspartoquinase da cepa ATCC13032 e a SEQ ID NO:15 mostra a sequência de aminoácidos do polipeptídeo codificado. Sabese, na técnica (consultar documento US6893848), que a troca do aminoácido Thr na posição 311 da SEQ ID NO: 15 por Ile confere à enzima resistência à realimentação para inibição por misturas de L-lisina e L-treonina.

[0071] Consequentemente, é preferencial que a sequência de aminoácidos da dita aspartoquinase resistente à realimentação polipeptídeo compreenda a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:15 contendo Isoleucina na posição 311.

[0072] A dita troca de amino pode ser alcançada ao

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24/59 trocar a nucleobase citosina (c) na posição 932 da SEQ ID NO:14 para produzir timina (t) . O códon acc para treonina é, então, alterado para o códon atc para isoleucina.

[0073] Sabe-se, ainda, na técnica que a troca do códon de início gtg da sequência de codificação para o polipeptídeo de aspartoquinase por atg melhora a expressão do polipeptídeo (consultar, por exemplo, documento EP2796555).

[0074] Consequentemente, é preferencial que a sequência que codifica um polipeptídeo de aspartoquinase resistente à realimentação seja iniciada com um códon de início atg.

[0075] Resumos referentes ao melhoramento de cepas que excretam L-lisina de Corynebacterium glutamicum podem ser encontrados, entre outros, em L. Eggeling e M. Bott (Handbook of Corynebacterium glutamicum, CRC Press, 2005),

V. F. Wendisch (Amino Acid Biosynthesis - Pathways, Regulation and Metabolic Engineering, Springer Verlag, 2007), H. Yukawa e M. Inui (Corynebacterium glutamicum Biology and Biotechnolgy, Springer Verlag, 2013), e Eggeling e Bott (Applied Microbiology and Biotechnology 99 (9), 3387-3394, 2015).

[0076] As cepas que excretam L-treonina da espécie Corynebacterium glutamicum são conhecidas na técnica e podem ser usadas para o propósito da presente invenção. Por exemplo, o documento EP0385940 A1 descreve a cepa DSM5399.

[0077] As cepas que excretam L-valina da espécie Corynebacterium glutamicum são conhecidas na técnica e podem ser usadas para o propósito da presente invenção. Por exemplo, o documento US5188948 descreve a cepa AJ12341, a qual está depositada sob FERM BP-1763 e o documento

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EP2811028 A1 descreve a cepa ATCC14067_PprpD2-ilvBN.

[0078] As cepas que excretam L-isoleucina da espécie Corynebacterium glutamicum são conhecidas na técnica e podem ser usadas para o propósito da presente invenção. Por exemplo, o documento US4656135 descreve a cepa AJ12152, a qual está depositada sob Ferm BP-760.

[0079] As cepas que excretam L-histidina da espécie Corynebacterium glutamicum são conhecidas na técnica, por exemplo, no documento US4495283, e podem ser usadas para o propósito da presente invenção.

[0080] As cepas que excretam L-prolina da espécie Corynebacterium glutamicum são conhecidas na técnica e podem ser usadas para o propósito da presente invenção. Por exemplo, o documento EP1828384 A1 descreve uma cepa de Corynebacterium glutamicum que excreta L-prolina que compreende um polipeptídeo que tem atividade de γ-glutamil quinase que contém, na posição 149 da sequência de aminoácidos codificada, ácido L-aspártico.

[0081] As cepas que excretam L-ornitina da espécie Corynebacterium glutamicum são conhecidas na técnica e podem ser usadas para o propósito da presente invenção. Por exemplo, o documento EP2553113 A2 descreve a cepa ATCC13032_Delta_argFRGH de Corynebacterium glutamicum que excreta L-ornitina e transformantes derivados da cepa.

[0082] Ca so uma cepa selvagem, por exemplo, ATCC13032, ATCC13869 ou ATCC14067, seja, em uma primeira etapa, submetida às medidas da presente invenção, a cepa resultante é submetida, em uma segunda etapa, a um programa de desenvolvimento de cepa alvejada no L-aminoácido desejado para obter uma bactéria de acordo com a presente

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26/59 invenção .

[0083] As cepas que excretam L-aminoácido de Corynebacterium, de preferência, Corynebacterium glutamicum, da presente invenção têm a habilidade de excretar h 0,1 g/l, de preferência, h 0,25 g/l, de modo particularmente preferencial h 0,5 g/l do L-aminoácido desejado em um meio adequado sob condições adequadas.

[0084]	De preferência, o	L-aminoácido	secretado	de
acordo	com a presente invenção	é L-lisina.
[0085]	A invenção fornece,	ainda, um	método para	a
produção fermentativa de um	L-aminoácido,	selecionado	a
partir	de L-aminoácidos proteinogênicos, de	preferência,	L-
lisina,	L-valina, L-treonina,	L-isoleucina,	L-histidina	e
L-prolina, e L-ornitina, de	preferência,	L-lisina, e	L-

ornitina, que compreende as etapas de

a) cultivar a bactéria do gênero Corynebacterium, de preferência, Corynebacterium glutamicum, de acordo com a presente invenção em um meio adequado sob condições adequadas,

b) acumular o dito L-aminoácido no meio para formar um caldo de fermentação contendo L-aminoácido.

[0086] O método de acordo com a presente invenção pode compreender, ainda, a concentração do caldo de fermentação contendo L-aminoácido. O caldo de fermentação contendo L-

aminoácido	ou	o dito	concentrado	obtido por um método	de
acordo com a	presente invenção	é opcionalmente seco	de
novo. Em	uma	etapa	adicional,	o L-aminoácido pode	ser
purificado	do	dito	caldo de	fermentação contendo	L-
aminoácido	ou	do dito	concentrado	ou concentrado seco.

[0087]

Em um processo fermentativo de acordo com a

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27/59 invenção, uma Corynebacterium, de preferência, Corynebacterium glutamicum, modificada de acordo com a presente invenção e que tem a habilidade de excretar um Lamino é cultivada em um meio adequado sob condições adequadas. Devido à sua habilidade de excretar o dito Laminoácido, a concentração do L-aminoácido aumenta e se acumula no meio durante o processo fermentativo e o Laminoácido é, então, produzido.

[0088] O processo fermentativo pode ser um processo descontínuo, como um processo de batelada ou um processo de batelada alimentada, ou um processo contínuo. Um resumo referente à natureza geral de processos de fermentação está disponível no livro por H. Chmiel (Bioprozesstechnik, Spektrum Akademischer Verlag, 2011), no livro de C. Ratledge e B. Kristiansen (Basic Biotechnology, Cambridge University Press, 2006) ou no livro de V.C. Hass e R. Portner (Praxis der Bioprozesstechnik Spektrum Akademischer Verlag, 2011).

[0089] Um meio adequado usado para a produção de um Laminoácido por um processo fermentativo contém uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, uma fonte de fósforo, íons inorgânicos e outros compostos orgânicos, conforme necessário.

[0090] As fontes de carbono adequadas incluem glicose, frutose, sacarose, bem como os matérias-primas correspondentes, como hidrolisado de amido, melaços ou xarope de milho com alto teor de frutose.

[0091] Como fonte de nitrogênio, compostos contendo nitrogênio orgânico, como peptonas, extrato de carne, hidrolisados de soja ou ureia, ou compostos inorgânicos,

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28/59 como sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio, nitrato de amônio, gás de amônio ou amônia aquosa, podem ser usados.

[0092] Como fonte de fósforo, ácido fosfórico, dihidrogenofosfato de potássio ou hidrogenofosfato de dipotássio ou os sais contendo sódio correspondentes podem ser usados. Íons inorgânicos, como potássio, sódio, magnésio, cálcio, ferro e demais elementos-traço etc. são fornecidos como sais de ácido sulfúrico, ácido fosfórico ou ácido clorídrico. Outros compostos orgânicos representam fatores de crescimento essenciais, como vitaminas, por exemplo, tiamina ou biotina ou L-aminoácidos, por exemplo, L-homoserina.

[0093] Os componentes de meio podem ser adicionados à cultura na forma de uma única batelada ou podem ser alimentados durante o cultivo de uma maneira adequada.

[0094] Durante o processo fermentativo, o pH da cultura pode ser controlado empregando-se compostos básicos, como hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, amônia ou amônia aquosa, ou compostos ácidos, como ácido fosfórico ou ácido sulfúrico de uma maneira adequada. O pH é geralmente ajustado a um valor de 6,0 a 8,5, preferencialmente 6,5 a 8,0. Para controlar a formação de espuma, é possível empregar agentes antiespumantes, como, por exemplo, poliglicol ésteres de ácido graxo. Para manter a estabilidade de plasmídeos, é possível adicionar ao meio substâncias seletivas adequadas, como, por exemplo, antibióticos. O processo fermentativo é preferencialmente realizado sob condições aeróbicas. A fim de manter essas condições, oxigênio ou misturas de gás contendo oxigênio,

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29/59 como, por exemplo, ar, são introduzidos na cultura. O processo fermentativo é realizado, quando adequado, a uma pressão elevada, por exemplo, a uma pressão elevada de 0,03 a 0,2 MPa. A temperatura da cultura é normalmente de 25 °C a 40 °C, preferencialmente de 30 °C a 37 °C. Em um processo descontínuo, o cultivo é continuado até que uma quantidade do L-aminoácido desejado suficiente para ser recuperado tenha sido formada. O cultivo é, então, concluído. Esse objetivo é normalmente alcançado em 10 horas a 160 horas. Em processos contínuos, períodos mais longos de cultivo são possíveis. Exemplos de meios e condições de cultura adequados podem ser encontrados, entre outros, em L. Eggeling e M. Bott (Handbook of Corynebacterium glutamicum, CRC Press, 2005) e nos documentos de patente US5770409, US5990350, US 5275940, US5763230 e US6025169.

[0095] Então, o processo fermentativo resulta em um caldo de fermentação que contém o L-aminoácido desejado.

[0096] No método de acordo com a presente invenção, o Laminoácido produzido é selecionado a partir dos Laminoácidos proteinogênicos L-lisina, L-valina, L-treonina, L-isoleucina, L-histidina e L-prolina, e L-ornitina. De preferência, o L-aminoácido produzido é L-lisina.

[0097] Um produto contendo o L-aminoácido é, então, recuperado em líquido ou sólido do caldo de fermentação.

[0098] Um caldo de fermentação significa um meio em que um Corynebacterium da invenção foi cultivado por um certo tempo e sob certas condições.

[0099] Quando o processo fermentativo é concluído, o caldo de fermentação resultante compreende consequentemente:

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a) a biomassa (massa celular) da Corynebacterium da invenção, sendo que a dita biomassa foi produzida devido à propagação das células da dita Corynebacterium,

b) o L-aminoácido desejado acumulado durante o processo fermentativo,

c) os subprodutos orgânicos acumulados durante o processo fermentativo, e

d) os componentes do meio empregado que não foram consumidos no processo fermentativo.

[0100] Os subprodutos orgânicos incluem compostos que podem ser formados pelo Corynebacterium da invenção durante o processo fermentativo além da produção do L-aminoácido desej ado.

[0101] O caldo de fermentação é removido do vaso de cultura ou tanque de fermentação, coletado quando adequado e usado para fornecer um produto contendo o produto químico fino, preferencialmente um produto contendo L-aminoácido, em forma líquida ou sólida. A expressão recuperar o produto contendo produto químico fino também é usada para tanto. No caso mais simples, o próprio caldo de fermentação contendo L-aminoácido, o qual foi removido do tanque de fermentação, constitui o produto recuperado.

[0102] O caldo de fermentação pode ser subsequentemente submetido a uma ou mais das medições selecionadas a partir do grupo que consiste em:

a) remoção parcial (>0 % a <80 %) a completa (100 %) ou quase completa ( > 80 %, > 90 %, > 95 %, > 96 %, > 97 %, > 98 %, > 99 %) da água,

b) remoção parcial (>0 % a <80 %) a completa (100 %) ou

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quase	completa (> 80 %,	> 90 %,	> 95 %, > 96 %,	> 97 %,	>
98 %,	> 99 %) da	biomassa,	sendo que a	última	é
opcionalmente inativada	antes da	remoção,
c) remoção parcial (>0	% a <8 0	%) a completa (	100 %)	ou
quase	completa (> 80 %,	> 90 %,	> 95 %, > 96 %,	> 97 %,	>
98 %,	> 99 %, > 99,3 %,	> 99,7 %)	dos subprodutos	orgânicos

formados durante o processo fermentativo, e

d) remoção parcial (>0 %) a completa (100 %) ou quase completa (> 80 %, > 90 %, > 95 %, > 96 %, > 97 %, > 98 %, > 99 %, > 99,3 %, > 99,7 %) dos componentes residuais do meio empregado ou dos materiais de entrada residuais resp., os quais não foram consumidos no processo fermentativo.

[0103] Uma grande quantidade de instruções técnicas para medições a), b), c) e d) está disponível na técnica.

[0104] A remoção de água (medição a)) pode ser alcançada, entre outros, por evaporação, com o uso, por exemplo, de um evaporador de filme descendente, por osmose reversa ou nanofiltração. Os concentrados então obtidos podem ser adicionalmente finalizados por secagem por aspersão ou granulação por aspersão. Do mesmo modo, é possível secar o caldo de fermentação diretamente com o uso de secagem por aspersão ou granulação por aspersão.

[0105] A remoção da biomassa (medição b)) pode ser alcançada, entre outros, por centrifugação, filtração ou decantação ou uma combinação desses.

[0106] A remoção dos subprodutos orgânicos (medição c) ) ou remoção de componentes residuais do meio (medição d) pode ser alcançada, entre outros, por cromatografia, por exemplo, cromatografia por troca de íons, tratamento com carbono ativado ou cristalização. Caso os subprodutos

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32/59 orgânicos ou componentes residuais do meio estejam presentes no caldo de fermentação como sólidos, podem ser removidos pela medição b).

[0107] Instruções gerais sobre métodos de separação, purificação e granulação podem ser encontradas, entre outros, no livro de R. Ghosh “Principles of Bioseperation Engineering” (World Scientific Publishing, 2006), o livro de F. J. Dechow “Seperation and Purification Techniques in Biotechnology” (Noyes Publications, 1989), o artigo “Bioseparation” de Shaeiwitz et al (Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Wiley-VCH, 2012) e o livro de P. Serno et al “Granulieren” (Editio Cantor Verlag, 2007).

[0108] Um esquema de processamento a jusante para produtos de L-lisina pode ser encontrado no artigo “Llysine Production” de R. Kelle et al. (L. Eggeling e M. Bott (Handbook of Corynebacterium glutamicum, CRC Press, 2005)). O documento US5279744 ensina a fabricação de um produto de L-lisina purificado por cromatografia por troca de íons. O documento US4956471 ensina a fabricação de um produto de L-valina purificado por cromatografia por troca de íons. O documento US5431933 ensina a fabricação de produtos de L-aminoácido secos, por exemplo, um produto de L-lisina ou um produto de L-valina, contendo a maioria dos constituintes do caldo de fermentação.

[0109] Então, uma concentração ou purificação do Laminoácido desejado é alcançada e um produto que tem o teor desejado do dito L-aminoácido é fornecido.

[0110] A análise de L-aminoácidos para determinar a concentração em um ou mais períodos durante a fermentação pode ocorrer separando-se os L-aminoácidos por meio de

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33/59 cromatografia por troca de íons, preferencialmente cromatografia por troca de cátions, com derivatização póscoluna subsequente com o uso de ninhidrina, como descrito em Spackman et al. (Analytical Chemistry 30: 1190-1206 (1958)). Também é possível empregar orto-ftalaldeído em vez de ninhidrina para a derivatização pós-coluna. Um artigo de visão geral sobre cromatografia por troca de íons pode ser encontrado em Pickering (LC.GC (Magazine of Chromatographic Science 7 (6) :484-487 (1989) ) . É possível, do mesmo modo, realizar uma derivatização pré-coluna, por exemplo, com o uso de orto-ftalaldeído ou isotiocianato de fenila, e fracionar os derivados de aminoácido resultantes por cromatografia de fase reversa (RP), preferencialmente na forma de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Um método desse tipo é descrito, por exemplo, em Lindroth et al. (Analytical Chemistry 51:1167-1174 (1979)). A detecção é realizada fotometricamente (absorção, fluorescência). Uma resenha referente à análise de aminoácido pode ser encontrada, entre outros, no livro Bioanalytik por Lottspeich e Zorbas (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Alemanha 1998).

[0111] O termo DSMZ denota o depositório Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen localizado em Braunschweig, Alemanha. O termo ATCC denota o depositório American Type Culture Collection localizado em Manasass, Virginia, EUA. O termo FERM denota o depositório National Institute of Technology and Evaluation (NITE) localizado em Tóquio, Japão. Dois outros depositórios bem conhecidos são KCCM e NRRL. O termo KCCM denota o depositório Korean Culture Center of Microorganisms localizada em Seoul,

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Coreia. O termo NRRL denota o depositório Agricultural Research Service Culture Collection localizado em Peoria, Illinois, EUA.

[0112] Os detalhes referentes à bioquímica e à estrutura química de polinucleotídeos e polipeptídeos, como presente em seres vivos, como bactérias como Corynebacterium ou Escherichia, por exemplo, podem ser encontrados, entre outros, no livro Biochemie por Berg et al (Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, Berlim, Alemanha, 2003; ISBN 3-8274-1303-6).

[0113] Os polinucleotídeos que consistem em monômeros de desoxirribonucleotídeo contendo as nucleobases ou bases resp. adenina (a), guanina (g), citosina (c) e timina (t) são denominados desoxirribopolinucleotídeos ou ácido desoxirribonucleico (DNA). Os polinucleotídeos que consistem em monômeros de ribonucleotídeo contendo as nucleobases ou bases resp. adenina (a), guanina (g), citosina (c) e uracila (u) são denominados ribopolinucleotídeos ou ácido ribonucleico (RNA). Os monômeros nos ditos polinucleotídeos são covalentemente ligados entre si por uma ligação de 3',5'-fosfodiéster. Por convenção, polinucleotídeos de filamento único são escritos da direção 5' a 3'. Consequentemente, um polinucleotídeo tem uma extremidade 5' e uma extremidade 3'. A ordem dos monômeros de nucleotídeo no polinucleotídeo é comumente denominada sequência de nucleotídeos. Consequentemente, um polinucleotídeo é caracterizado por sua sequência de nucleotídeos. Para o propósito desta invenção, desoxirribopolinucleotídeos são preferenciais. Em bactérias, por exemplo, Corynebacterium ou Escherichia, o

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DNA está tipicamente presente em forma de fita dupla. Consequentemente, o comprimento de uma molécula de DNA é tipicamente dado em pares de bases (bp) . A sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo específico é denominada sequência de codificação (cds).

[0114] Um gene de um ponto de vista químico é um polinucleotídeo, de preferência, um desoxirribopolinucleotídeo.

[0115] O termo gene se refere a um polinucleotídeo que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo específico (sequência de codificação) e o códon de parada adjacente. Em um sentido mais amplo, o termo inclui sequências reguladoras precedentes e subsequentes à sequência de codificação. A sequência precedente é localizada na extremidade 5' da sequência de codificação e também é denominada sequência a montante. Um promotor é um exemplo de uma sequência reguladora localizada em 5' em relação à sequência de codificação. A sequência após a sequência de codificação está localizada em sua extremidade 3' e também é denominada sequência a jusante. Um terminador transcricional é um exemplo de uma sequência reguladora localizada em 3' em relação à sequência de codificação.

[0116] Os polipeptídeos consistem em monômeros de Laminoácido unidos por ligações peptídicas. Para a abreviação de L-aminoácidos, o código de uma letra e o código de três letras da IUPAC (União Internacional de Química Pura e Aplicada) é usado. Devido à natureza da biossíntese de polipeptídeo, os polipeptídeos têm uma extremidade amino terminal e uma extremidade carboxil

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36/59 terminal também denominadas extremidade N-terminal e extremidade C-terminal. A ordem dos L-aminoácidos ou resíduos de L-aminoácido resp. no polipeptídeo é comumente denominada sequência de aminoácidos. Os polipeptídeos também são denominados proteínas.

[0117] Além disso, sabe-se na técnica que o códon de início ou códon de iniciação resp. gtg de uma sequência de codificação, bem como atg, codifica o aminoácido metionina. SEÇÃO EXPERIMENTAL

A) MATERIAIS e MÉTODOS [0118] Os kits, iniciadores e produtos químicos de biologia molecular usados e alguns detalhes dos métodos aplicados são brevemente descritos no presente documento.

1. Produtos químicos

a. Solução de canamicina de Streptomyces kanamyceticus foi adquirida junto à Sigma Aldrich (St. Louis, EUA, Cat. n° K0254).

b. Sal de sódio de ácido nalidíxico foi adquirido junto à Sigma Aldrich (St. Louis, EUA, Cat. n° N4382).

c. Se não for declarado de outro modo, todos os outros produtos químicos foram adquiridos analiticamente puros junto à Merck (Darmstadt, Alemanha), Sigma Aldrich (St. Louis, EUA) ou Carl-Roth (Karlsruhe, Alemanha).

2. Cultivo [0119] Se não for declarado de outro modo, todos os procedimentos de cultivo / incubação foram realizados como descrito a seguir:

a. Caldo de LB (MILLER) da Merck (Darmstadt, Alemanha; Cat. n° 110285) foi usado para cultivar cepas de E. coli em meio líquido. As culturas líquidas (10 ml de meio líquido

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37/59 por frasco Erlenmeyer de 100 ml com 3 defletores) foram incubada no agitador de incubadora padrão Infors HT Multitron da Infors GmbH (Bottmingen, Suíça) a 37 °C e 200 rpm.

b. Ágar de LB (MILLER) da Merck (Darmstadt, Alemanha Cat. n° 110283) foi usado para cultivo de cepas de E. coli em placas de ágar. As placas de ágar foram incubadas a 37 °C em uma mini-incubadora INCU-Line® da VWR (Radnor, EUA).

c. Caldo de infusão cérebro-coração (BHI) da Merck (Darmstadt, Alemanha; Cat. n° 110493) foi usado para cultivar cepas de C. glutamicum em meio líquido. As culturas líquidas (10 ml de meio líquido por frasco Erlenmeyer de 100 ml com 3 defletores) foram incubada no agitador de incubadora padrão Infors HT Multitron da Infors GmbH (Bottmingen, Suíça) a 33°C e 200 rpm.

d. Ágar cérebro-coração (ágar BHI) da Merck (Darmstadt, Alemanha; Cat. n° 113825) foi usado para cultivo de cepas de C. glutamicum em placas de ágar. As placas de ágar foram incubadas a 33 °C em uma incubadora da Heraeus Instruments com controlador de temperatura Kelvitron® (Hanau, Alemanha).

3. Determinação de densidade óptica

a. A densidade óptica de suspensões bacterianas em culturas de frasco de agitação foi determinada a 600 nm (OD600) com o uso do BioPhotometer da Eppendorf AG (Hamburg, Alemanha).

b. A densidade óptica de suspensões bacterianas produzidas no sistema de microfermentação Wouter Duetz (WDS) (Placas de 24 cavidades) foi determinada a 660 nm (OD660) com o leitor de placa GENios™ da Tecan Group AG

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38/59 (Mãnnedorf, Suíça).

4. Centrifugação

a. Centrífuga de bancada para tubos de reação com um volume de até 2 ml

As suspensões bacterianas com um volume máximo de 2 ml foram levadas à sedimentação com o uso de tubos de reação de 1 ml ou 2 ml (por exemplo, Eppendorf Tubes® 3810X) com o uso de uma centrífuga Eppendorf 5417 R (5 min a 13000 rpm) .

b. Centrífuga de bancada para tubos com um volume de até 50 ml

As suspensões bacterianas com um volume máximo de 50 ml foram levadas à sedimentação com o uso de tubos de centrífuga de 15 ml ou 50 ml (por exemplo, Tubos de Centrífuga Cônica de 50 ml FalconTM) com o uso de uma centrífuga Eppendorf 5810 R por 10 min a 4000 rpm.

5. Isolamento de DNA

a. O DNA plasmidial foi isolado de células de E. coli com o uso do Kit QIAprep Spin Miniprep da Qiagen (Hilden, Alemanha, Cat. n° 27106).

b. O DNA total de C. glutamicum foi isolado com o uso do método de Eikmanns et al. (Microbiology 140, 1817-1828, 1994).

6. Reação em cadeia de polimerase (PCR) [0120] A PCR com uma polimerase de correção de leitura (alta fidelidade) foi usada para amplificar um segmento de DNA desejado antes da Montagem de Gibson ou sequenciamento de Sanger.

[0121] Kits de polimerase que não são de correção de leitura foram usados para determinar a presença ou ausência de um fragmento de DNA desejado diretamente de colônias de

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E. coli ou C. glutamicum.

a. O Kit de DNA Polimerase de Alta Fidelidade Phusion® (Phusion Kit) de New England BioLabs Inc. (Ipswich, EUA, Cat. n° M0530) foi usado para amplificação de correção de modelo de regiões de DNA selecionadas de acordo com as instruções do fabricante (consultar tabela 4) .

Tabela 4: Condições de termociclagem para PCR com Kit de DNA Polimerase de Alta Fidelidade Phusion® de NEB Inc.

Programa PCR
Etapa	Tempo [min:s]	T [°C]	Descrição
1	00:30	98	Etapa de desnaturação inicial
2	00:05	98	Etapa de desnaturação
3	00:30	60	Etapa de recozimento
4	00:xx	72	Etapa de alongamento 1 min por kb de DNA
			Repetir etapa 2 a 4: 35 x
5	05:00	72	Etapa de alongamento final
6	Aguardar	4	Etapa de resfriamento

b. Kit Taq PCR Core (Kit Taq) da Qiagen (Hilden, Alemanha; Cat. n° 201203) foi usado para amplificar um segmento desejado de DNA a fim de confirmar sua presença. O kit foi usado de acordo com as instruções do fabricante (consultar tabela 5).

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Tabela 5: Condições de termociclagem para PCR com Kit Taq

PCR Core (Kit Taq) da Qiagen.

Programa PCR
Etapa	Tempo [min:s]	T [°C]	Descrição
1	05:00	94	Etapa de desnaturação inicial
2	00:30	94	Etapa de desnaturação
3	00:30	52	Etapa de recozimento
4	01:20	72	Etapa de alongamento 1 min por kb de DNA
			Repetir etapa 2 a 4: 35 x
5	04:00	72	Etapa de alongamento final
6	Aguardar	4	Etapa de resfriamento

c. SapphireAmp® Fast PCR Master Mix (Sapphire Mix) da Takara Bio Inc (Takara Bio Europe S.A.S.; Saint-Germain-enLaye, França; Cat. n° RR350A/B) foi usado como uma alternativa para confirmar a presença de um segmento desejado de DNA em células obtidas de colônias de E. coli ou C. glutamicum de acordo com as instruções do fabricante (consultar tabela 6).

Tabela 6: Condições de termociclagem para PCR com SapphireAmp® Fast PCR Master Mix (Sapphire Mix) da Takara Bio Inc.

Programa PCR
Etapa	Tempo [min:s]	T [°C]	Descrição
1	01:00	94	Etapa de desnaturação inicial
2	00:05	98	Etapa de desnaturação
3	00: 05	55	Etapa de recozimento

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Programa PCR
Etapa	Tempo [min:s]	T [°C]	Descrição
4	00: 05	72	Etapa de alongamento
			Repetir etapa 2 a 4: 30 x
5	04:00	72	Etapa de alongamento final
6	Aguardar	4	Etapa de resfriamento

d. Iniciador [0122] Os oligonucleotídeos usados foram sintetizadas por Eurofins Genomics GmbH (Ebersberg, Alemanha) com o uso do método de fosforamidita descrito por McBride e Caruthers (Tetrahedron Lett. 24, 245-248, 1983).

e. Modelo [0123] Como modelo de PCR, uma solução adequadamente diluída de DNA plamidial isolado ou de DNA total isolado de uma cultura líquida de C. glutamicum ou o DNA total contido em uma colônia foi usada (PCR de colônia). Para a dita PCR de colônia, o modelo foi preparado obtendo-se material celular com um palito de uma colônia em uma placa de ágar e colocando-se o material celular diretamente no tubo de reação de PCR. O material celular foi aquecido por 10 s com 800 W em um forno de micro-ondas do tipo Mikrowave & Grill da SEVERIN Elektrogerãte GmbH (Sundern, Alemanha) e, então, os reagentes de PCR foram adicionados ao modelo no tubo de reação de PCR.

f. Ciclizador de PCR [0124] Os experimentos de PCR foram realizados em

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42/59 ciclizadores de PCR do tipo Mastercycler ou Mastercycler nexus gradient da Eppendorf AG (Hamburgo, Alemanha).

. Digestão de enzima de restrição de DNA [0125] As endonucleases de restrição FastDigest (FD) e o tampão associado da ThermoFisher Scientific (Waltham, EUA, Cat. n° FD0684) foram usadas para digestão de restrição do DNA plasmidial. As reações foram realizadas de acordo com as instruções do manual do fabricante.

8. Determinação do tamanho de fragmentos de DNA [0126] O tamanho de fragmentos de DNA foi determinado por eletroforese capilar automatizada com o uso do QIAxcel da Qiagen (Hilden, Alemanha).

9. Purificação de amplificados de PCR e fragmentos de DNA de restrição [0127] Os amplificados de PCR e fragmentos de restrição foram limpos com o uso do QIAquick PCR Purification Kit da Qiagen (Hilden, Alemanha; Cat. n° 28106), acordo com as instruções do fabricante.

10. Determinação de concentração de DNA [0128] A concentração de DNA foi medida com o uso do Espectrofotômetro NanoDrop ND-1000 da PEQLAB Biotechnologie GmbH, desde 2015 com a marca VWR (Erlangen, Alemanha).

11. Montagem de Gibson [0129] Os vetores de expressão e vetores que permitem a integração da mutação desejada no cromossoma foram feitos com o uso do método de Gibson et al. (Science 319, 1215—20, 2008) . O Kit de Montagem de Gibson da New England BioLabs Inc. (Ipswich, EUA; Cat. n° E2611) foi usado para esse propósito. A mistura de reação, contendo o vetor restrito e pelo menos um inserto de DNA, foi incubada a 50 °C por 60

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43/59 min. 0,5 μΐ da mistura de Montagem foram usados para um experimento de transformação.

12. Transformação química de E. coli

a. Células Stellar™ de E. coli quimicamente competentes foram adquiridas junto à Clontech Laboratories Inc. (Mountain View, EUA; Cat. n° 636763) e transformadas de acordo com o protocolo do fabricante (PT5055-2).

[0130] Es sas células foram usadas como hospedeiros de transformação para misturas de reação obtidas por Montagem de Gibson. As bateladas de transformação foram cultivadas de um dia para o outro por aproximadamente 18 h a 37 °C e os transformantes contendo plasmídeos foram selecionados em ágar de LB suplementado com 50 mg/l de canamicina.

b. A cepa S17-1 de E. coli K-12 foi usada como doadora para transferência conjugacional de plasmídeos com base em pK18mobsacB de E. coli para C. glutamicum. A cepa S17-1 é descrita por Simon, R. et al. (Bio/Technology 1, 784-794, 1983). Está disponível junto à American Type Culture Collection sob o número de acesso ATCC47055.

[0131] As células de E. coli S17-1 quimicamente competentes foram feitas como a seguir: Uma pré-cultura de 10 ml de meio de LB (10 ml de meio líquido por frasco de Erlenmeyer de 100 ml com 3 defletores) foi inoculada com 100 pl suspensão bacteriana de cepa S17-1 e a cultura foi incubada de um dia para o outro por cerca de 18 h a 37 °C e 250 rpm. A cultura principal (70 ml de LB contidos em um frasco de Erlenmeyer de 250 ml com 3 defletores) foi inoculada com 300 μl da pré-cultura e incubada até um OD600 de 0,5-0,8 a 37 °C. A cultura foi centrifugada por 6 min a 4 °C e 4000 rpm e o sobrenadante foi descartado. O pélete

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44/59 celular foi ressuspenso em 20 ml de solução estéril gelada de CaCl2 50 mM e incubado no gelo por 30 min. Após outra etapa de centrifugação, o pélete foi ressuspenso em 5 ml de solução gelada de CaCl2 50 mM e a suspensão foi incubada no gelo por 30 min. A suspensão celular foi, então, ajustada a uma concentração final de glicerol a 20 % (v/v) com glicerol estéril gelado a 85 %. A suspensão foi dividida em alíquotas de 50 pl e armazenada a -80 °C.

[0132] Para transformar células S17-1, o protocolo de acordo com Tang et al. (Nucleic Acids Res. 22(14), 28572858, 1994) com um choque térmico de 45 s foi usado.

13. Conjugação de C. glutamicum [0133] O sistema de plasmídeo pK18mobsacB descrito por Schãfer et al. (Gene 145, 69 - 73, 1994) foi usado para integrar fragmentos de DNA desejado no cromossoma de C. glutamicum. Um método de conjugação modificada de Schãfer et al. (Journal of Bacteriology 172, 1663 - 1666, 1990) foi usado para a transferência do respectivo plasmídeo para a cepa recipiente de C. glutamicum desejada.

[0134] As culturas líquidas das cepas de C. glutamicum foram realizadas em meio de BHI a 33 °C. O choque térmico foi realizado a 48,5 °C por 9 min. Transconjugantes resultantes de um primeiro evento de recombinação foram selecionados plaqueando-se a batelada de conjugação em ágar de EM8 (Tabela 7), a qual foi suplementada com 25 mg/l de canamicina e 50 mg/l de ácido nalidíxico. As placas de ágar de EM8 foram incubadas por 72 h a 33 °C.

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Tabela 7: Composição do ágar de EM8.

Componentes	Concentração (g/l)
Glicose (estéril-filtrada)	23
CSL (milhocina)	30
Peptona de farinha de soja (Merck, Alemanha)	40
(NH4)2SO4	8
Ureia	3
KH2PO4	4
MgSO4 · 7 H2O	0,5
FeSO4 · 7 H2O	0, 01
CuSO4 · 5 H2O	0, 001
ZnSO4 · 7 H2O	0, 01
Pantotenato de cálcio, D(+)	0, 01
Tiamina	0, 001
Inositol	0,1
Ácido nicotínico	0, 001
Biotina (estéril-filtrada)	0, 005
CaCO3 (autoclavada separadamente)	1, 6
Ágar-Ágar (Merck, Alemanha)	14

[0135] Palitos estéreis foram usados para a transferência dos transconjugantes para ágar de BHI, o qual foi suplementado com 25 mg/l de canamicina e 50 mg/l de ácido nalidíxico. As placas de ágar foram incubadas por 20 h a 33 °C. As culturas dos respectivos transconjugantes produzidos dessa maneira foram, então, propagadas adicionalmente por 24 h a 33 °C em 10 ml de meio de BHI contido em frascos Erlenmeyer de 100 ml com 3 defletores. Para isolar clones que encontraram um segundo evento de

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46/59 recombinação, uma alíquota foi obtida da cultura líquida, adequadamente diluída e plaqueada (tipicamente 100 a 200 μΐ) em ágar de BHI que foi suplementado com sacarose a 10 %. As placas de ágar foram incubadas por 48 h a 33 °C. As colônias em crescimento nas placas de ágar contendo sacarose foram, então, examinadas para a fenótipo de sensibilidade à canamicina. Para fazê-lo, um palito foi usado para remover material celular da colônia e transferilo para ágar de BHI contendo 25 mg/l de canamicina e para ágar de BHI contendo sacarose a 10 %. As placas de ágar foram incubadas por 60 h a 33 °C. Clones de transconjugante que se provaram sensíveis à canamicina e resistentes à sacarose foram examinados para integração do recurso genético desejado no cromossoma por meio de PCR.

14. Determinação de sequências de nucleotídeos [0136] Sequências de nucleotídeos de moléculas de DNA foram determinadas por Eurofins Genomics GmbH (Ebersberg, Alemanha) por sequenciamento de ciclo, com o uso do método de terminação de cadeia de didesoxi de Sanger et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences EUA 74, 5463 - 5467, 1977), em Analisadores de DNA 3730xl da Applied Biosystems® (Carlsbad, CA, EUA) . O software Clonemanager Professional 9 da Scientific & Educational

Software (Denver,	EUA) foi usado	para	visualizar e avaliar
as sequências.
15. Estoques de	glicerol	de	cepas	de E.coli	e C.
glutamicum
[0137] Para um	armazenamento	de longo período de	cepas
de E. coli e C.	glutamicum,	estoque	de glicerol	foram
preparados. Os	clones de	E.	coli	selecionados	foram

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47/59 cultivados em 10 ml de meio de LB suplementado com 2 g/l de glicose. Os clones de C. glutamicum selecionados foram cultivados em meio de BHI concentrado duas vezes suplementado com 2 g/l de glicose. Culturas de cepas de E. coli contendo plasmídeo foram suplementadas com 50 mg/l de canamicina. Culturas de cepas de C. glutamicum contendo plasmídeo foram suplementadas com 25 mg/l de canamicina. O meio estava contido em frascos Erlenmeyer de 100 ml com 3 defletores. Foi inoculado com um laço de células obtidas de uma colônia. A cultura foi, então, incubada por cerca de 18 h a 37 °C e 200 rpm no caso de E. coli e 33 °C e 200 rpm no caso de C. glutamicum. Após o dito período de incubação, 1,2 ml de glicerol estéril a 85 % (v/v) foram adicionados à cultura. A suspensão celular contendo glicerol obtida foi, então, dividida em alíquotas em porções de 2 ml e armazenada a -80 °C.

16. Sistema de cultivo de acordo com Wouter Duetz [0138] O sistema de cultivo de escala em mililitros de acordo com Duetz (Trends Microbiol. 2007; 15(10):469-75) foi usado para investigar o desempenho das cepas de C. glutamicum construídas. Para esse propósito, microplacas de 24 cavidades profundas (placas WDS de 24 cavidades) da EnzyScreen BV (Heemstede, Holanda; Cat. n° CR1424) preenchidas com 2,5 ml de meio foram usadas.

[0139] Pré-culturas das cepas foram feitas em 10 ml de meio de BHI concentrado duas vezes. O meio estava contido em um frasco Erlenmeyer de 100 ml com 3 defletores. Foi inoculado com 100 pl de uma cultura de estoque de glicerol e a cultura foi incubada por 24 h a 33 °C e 200 rpm.

[0140] Após o dito período de incubação, as densidades

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48/59 ópticas OD600 das pré-culturas foram determinadas.

[0141] As culturas principais foram feitas inoculando-se as cavidades contendo 2,5 ml de meio da Placa de WDS de 24 cavidades com uma alíquota da pré-cultura para produzir uma densidade óptica OD600 de 0,1.

[0142] Como meio para a cultura principal, o meio de CGXII descrito por Keilhauer et al. (J. Bacteriol. 1993 Sep; 175(17): 5595-5603) foi usado. Por conveniência, a composição do meio de CGXII é mostrada na tabela 8.

Tabela 8: Composição do meio de CGXII de Keilhauer.

Componentes	Concentração (g/l)
MOPS (ácido 3-(N-morfolino)propanossulfônico)	42
(NH4) 2SO4	20
Ureia	5
KH2PO4	1
K2HPO4	1
MgSO4 · 7 H2O	0,25
CaCl2	0, 01
FeSO4 · 7 H2O	0, 01
MnSO4 H2O	0, 01
ZnSO4 · 7 H2O	0, 001
CuSO4 · 5 H2O	0,0002
NiCl2 6 H2O	0,00002
Biotina (estéril-filtrada)	0,0002
Ácido protocatecuico (estéril-filtrado)	0, 03
Fonte de carbono (estéril-filtrado)	conforme necessário
ajustar o pH a 7 com NaOH

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49/59 [0143] Es sas culturas principais foram incubadas por aproximadamente 45 h a 33 °C e 300 rpm em um agitador de incubadora padrão Infors HT Multitron da Infors GmbH (Bottmingen, Suíça) até o consumo completo de glicose.

[0144] A concentração de glicose na suspensão foi analisada com o medidor de glicose no sangue OneTouch Vita® da LifeScan (Johnson & Johnson Medical GmbH, Neuss, Alemanha).

[0145] Após o cultivo, as suspensões de cultura foram transferidas para uma microplaca de cavidade profunda. Uma parte da suspensão de cultura foi adequadamente diluída para medir o OD600. Outra parte da cultura foi centrifugada e a concentração de L-aminoácidos, em particular L-lisina, e glicose residual foram analisadas no sobrenadante.

17. Analisador de aminoácido [0146] A concentração de L-aminoácidos, em particular Llisina, nos sobrenadantes de cultura foi determinado por cromatografia com o uso do analisador de aminoácido SYKAM S433 da SYKAM Vertriebs GmbH (Fürstenfeldbruck, Alemanha) . Como fase sólida, uma coluna com trocador de cátion esférico à base de poliestireno (Peek LCA N04/Na, dimensão 150 x 4,6 mm) da SYKAM foi usada. Dependendo do Laminoácido, a separação ocorre em um ciclo isocrático com o uso de uma mistura de tampões A e B para eluição ou por eluição de gradiente com o uso dos ditos tampões. Como tampão A, uma solução aquosa contendo, em 20 l, 263 g de citrato de trissódio, 120 g de ácido cítrico, 1100 ml de metanol, 100 ml de HCl a 37 % e 2 ml de ácido octanoico (pH final 3,5) foi usada. Como tampão B, uma solução aquosa contendo, em 20 l, 392 g de citrato de trissódio, 100 g de

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50/59 ácido bórico e 2 ml de ácido octanoico (pH final 10,2) foi usada. Esses aminoácidos livres foram coloridos com ninhidrina através de derivatização pós-coluna e detectados fotometricamente a 570 nm.

B) RESULTADOS EXPERIMENTAIS

Exemplo 1 [0147] Sequência do gene cmr de cepa DM1933 e DM1797 de C. glutamicum [0148] A cepa DM1933 é um produtor de L-lisina descrito por Blombach et al. (Applied and Environmental Microbiology 75(2), 419-427, 2009). É depositada de acordo com o tratado de Budapeste no DSMZ sob o número de acesso DSM25442.

[0149] A sequência de nucleotídeos do cromossoma da cepa DM1933 foi determinada por tecnologia de sequenciamento de genoma completo Illumina (Illumina Inc., San Diego, CA, EUA). Consultar, por exemplo, Benjak et al. (2015) WholeGenome Sequencing for Comparative Genomics and De Novo Genome Assembly. Em: Parish T., Roberts D. (eds) Mycobacteria Protocols. Methods in Molecular Biology, Vol 1285. Humana Press, NY, US) e Bennet, S. (Pharmacogenomics 5(4), 433-438, 2004) .

[0150] Constatou-se que a sequência de nucleotídeos da sequência de codificação de cmr, incluindo a sequência de nucleotídeos a montante e a jusante da mesma, é idêntica àquela de ATCC13032, como mostrado na SEQ ID NO:7.

[0151] A cepa DM1797 é um produtor de L-lisina descrito no documento US 7.338.790 B2 (consultar a coluna 30). É depositada de acordo com o tratado de Budapeste no DSMZ sob o número de acesso DSM16833. DM1797 é um mutante resistente a aminoetilcisteína da cepa ATCC13032 obtida após

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51/59 mutagênese de N'-metil-N-nitro-nitrosoguanidina.

[0152] A sequência de nucleotídeos da sequência de codificação de cmr de DM1797, incluindo a sequência de nucleotídeos a montante e a jusante da mesma, é idêntica àquela de ATCC13032 mostrada na SEQ ID NO:7.

[0153] DM1797 contém em seu cromossoma uma variante do gene de aspartoquinase que codifica um polipeptídeo de aspartoquinase resistente à realimentação. O dito polipeptídeo de aspartoquinase resistente à realimentação tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:15 da listagem de sequências, em que o aminoácido L-treonina (Thr) na posição 311 da sequência de aminoácidos é substituído por L-isoleucina (Ile). No documento US 7.338.790, a abreviação “lysC T311I” é usada para indicar a dita troca.

[0154] A cepa DM1933 também contém a dita variante do gene de aspartoquinase. É abrevida como “lysC(T311I)” por Blombach et al. (consultar tabela 1 de Blombach et al.) Exemplo 2

Construção do plasmídeo pK18mobsacB_Dcmr [0155] O plasmídeo pK18mobsacB_Dcmr foi construído para permitir a incorporação de uma deleção, que compreende a sequência de codificação de cmr e o códon de parada adjacente associado à inserção do sítio de reconhecimento para a endonuclease de restrição EcoRV, no cromossoma de uma cepa de C. glutamicum desejada. O plasmídeo é baseado no vetor móvel pK18mobsacB descrito por Schãfer et al.

(Gene 145, 69-73, 1994). Para a construção de pK18mobsacB_Dcmr, o método de Montagem de Gibson foi usado.

[0156] Para esse propósito, três polinucleotídeos ou moléculas de DNA resp. foram gerados: Um polinucleotídeo

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52/59 denominado cmr_up que compreende a sequência a montante (sequência flanqueadora 5') e um segundo polinucleotídeo denominado cmr_down que compreende a sequência a jusante (sequência flanqueadora 3') da sequência de codificação de cmr. O terceiro polinucleotídeo era o pK18mobsacB plasmidial linearizado por tratamento com endonuclease de restrição XbaI. Os polinucleotídeos cmr_up e cmr_down foram fundidos durante o processo de Montagem de Gibson para produzir o polinucleotídeo Dcmr que compreende a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO:13 contida pK18mobsacB_Dcmr. [0157] Polinucleotídeos cmr_up e cmr_down foram sintetizados por PCR com o uso de DNA total isolado de uma cultura de C. glutamicum ATCC13032 como modelo. Para a PCR, o Kit Phusion foi usado com uma etapa de alongamento (consultar tabela 4, etapa 4) de 15 s. Para a amplificação da sequência a montante (polinucleotídeo cmr_up), os iniciadores 1f-Dcmr e 1r-Dcmr e, para a amplificação da sequência a jusante (polinucleotídeo cmr_down), os iniciadores 2f-Dcmr e 2r-Dcmr foram usados (tabela 9). Os iniciadores também são mostrados na SEQ ID NO:16 a SEQ ID NO:19 da listagem de sequências.

Tabela 9: Lista de iniciadores usados e tamanho de amplificados durante PCR com Kit Phusion.

Síntese de amplificado	nome	sequência	tamanho [bp]
cmr_up	1f- Dcmr	AGCTCGGTACCCGGGGATCCTGTGCCACAAAATTTAGCCTGTC	847
1r- Dcmr	CAAACAACGGTCTAGAGCACGATATCGGGGTGTCTCCTAAAGATGG

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Síntese de amplificado	nome	sequência	tamanho [bp]
cmr down	2f- Dcmr	CCATCTTTAGGAGACACCCCGATATCGTGCTCTAGACCGTTGTTTG	846
	2r- Dcmr	TGCATGCCTGCAGGTCGACTCTTGCCGAAGGCTACTACCTG

[0158] A sequência de nucleotídeos do amplificado cmr_up é mostrada na SEQ ID NO:20. A sequência de nucleotídeos do amplificado cmr_down é mostrada na SEQ ID NO:21.

[0159] O amplificado cmr_up contém uma sequência de 800 nucleotídeos da região a montante da sequência de codificação de cmr de ATCC13032. Em sua extremidade 5', é equipado com uma sequência que se sobrepõe a uma sequência do corte de pK18mobsacB com XbaI. Em sua extremidade 3', é equipado com uma sequência que se sobrepõe a uma sequência do amplificado cmr_down. A dita sequência na extremidade 3' contém o sítio de reconhecimento para a endonuclease de restrição EcoRV.

[0160] O amplificado cmr_down contém uma sequência de 800 nucleotídeos da região a jusante da sequência de codificação de cmr de ATCC13032. Em sua extremidade 5', é equipado com uma sequência que se sobrepõe a uma sequência do amplificado cmr_up. A dita sequência na extremidade 5' contém o sítio de reconhecimento para a endonuclease de restrição EcoRV. Em sua extremidade 3', é equipado com uma sequência que se sobrepõe a uma sequência de pK18mobsacB cortado com XbaI. As sequências em sobreposição são necessárias para a técnica de montagem de Gibson.

[0161] O pK18mobsacB plasmidial foi linearizado com a

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54/59 endonuclease de restrição XbaI. A mistura de digestão foi controlada por eletroforese capilar, purificada e a concentração de DNA quantificada.

[0162] Para a montagem de pK18mobsacB_Dcmr plamidial, os três polinucleotídeos, isto é, o vetor pK18mobsacB cortado com XbaI, o amplificado cmr_up e o amplificado cmr_down foram misturados com o uso do Kit de Montagem de Gibson. A mistura de montagem então obtida foi usada para transformar células Stellar™ de E. coli quimicamente competentes.

[0163] Cinquenta transformantes resistentes à canamicina foram analisados por PCR de colônia com o uso do Kit Taq e os iniciadores pCV22_1.p e pCV22_2.p de acordo com o protocolo mostrado na tabela 5. Os iniciadores são mostrados na tabela 10 e sob SEQ ID NO:22 e SEQ ID NO:23 da listagem de sequências. O tamanho dos amplificados foi controlado por eletroforese capilar.

Tabela 10: Lista de iniciadores usados para PCR de colônia e tamanho de amplificado durante a PCR com Kit Taq.

indicação para a presença de	nome	sequência	tamanho [bp]
Dcmr	pCV22_1.p	AGGTTTCCCGACTGGAAAGC	1893
pCV22_2.p	TGCAAGGCGATTAAGTTGGG

[0164] Um dos transformantes então caracterizados contendo um plasmídeo do tamanho desejado foi denominado Stellar/pK18mobsacB_Dcmr e armazenado como um estoque de glicerol.

[0165] O DNA do plasmídeo pK18mobsacB_Dcmr foi isolado do dito transformante e o polinucleotídeo Dcmr criado em

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55/59 pK18mobsacB durante a montagem de Gibson foi analisado por sequenciamento de Sanger com o uso dos iniciadores pVW_1.p e M13For mostrados na tabela 11. Os ditos iniciadores também são mostrados sob SEQ ID NO:24 e SEQ ID NO:25 da listagem de sequências.

Tabela 11: Lista de iniciadores usados para sequenciamento de Sanger.

detecção de	nome	sequência
Dcmr	pVW_1.p	G T GAG C G GATAACAAT T T CACAC
M13For	GTAAAACGACGGCCAG

[0166] A análise da sequência de nucleotídeos então obtida mostrou que o polinucleotídeo Dcmr contido em pK18mobsacB_Dcmr tem a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO:13.

[0167] Exemplo 3 [0168] Construção da cepa DM1933_Acmr::EcoRV [0169] O plasmídeo pK18mobsacB_Dcmr foi usado para incorporar a deleção da sequência de codificação de cmr completa e o códon de parada adjacente associado à inserção do sítio de reconhecimento para a enzima de restrição EcoRV no cromossoma do produtor de L-lisina DM1933.

[0170] A dita deleção da sequência de codificação de cmr completa e do códon de parada adjacente associado à inserção do sítio de reconhecimento para a enzima de restrição EcoRV é abreviada como Acmr::EcoRV ou deltacmr::EcoRV quando adequado.

[0171] Células quimicamente competentes de cepa S17-1 de E. coli foram transformadas com DNA plasmidial de

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56/59 pK18mobsacB_Dcmr obtido no exemplo 2. O método de conjugação modificado de Schafer et al. (Journal of Bacteriology 172, 1663 - 1666, 1990) como descrito em materiais e métodos foi usado para transferência conjugada para a cepa DM1933 e para seleção de clones de transconjugante em virtude de sua resistência à sacarose e fenótipo de sensibilidade à canamicina.

[0172] Clones de transconjugante foram analisados por PCR de colônia com o uso dos iniciadores NCgl2679_fw e NCgl2679_rev listados na tabela 12, sucedidos pela determinação de tamanho dos amplificados por eletroforese capilar. Os iniciadores também são mostrados na SEQ ID NO:26 e SEQ ID NO:27 da listagem de sequências. Para PCR, a Sapphire Mix (consultar tabela 6) foi usada.

Tabela 12: Lista de iniciadores usados para PCR de colônia e tamanho de amplificado durante PCR com Sapphire Mix.

amplificação/detecção de	nome	sequência	tamanho [bp]
Acmr::EcoRV	NCgl2679_fw	CTGGAGATGCGAGTGGGTTG	309
NCgl2679_rev	TGCTGCTTCTTTGGGTGTAG

[0173] Um dos clones de transconjugante então caracterizado foi denominado DM1933_Acmr::EcoRV. A cultura de estoque de glicerol do clone de transconjugante foi preparada e usada como material de partida para investigações adicionais.

[0174] A sequência de nucleotídeos da região cromossomal da cepa DM1933_Acmr::EcoRV contendo a sequência de nucleotídeos que sofreu mutação, isto é, falta (deleção) da sequência de codificação de cmr e do códon de parada

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57/59 adjacente associado à inserção do sítio de reconhecimento para a endonuclease de restrição EcoRV, foi analisada por sequenciamento de Sanger.

[0175] Para esse propósito, um amplificado de PCR foi produzido estendendo o sítio de mutação. Um PCR de colônia foi feito com o uso dos iniciadores NCgl2679_fwd1 e NCgl2681_rev1 (consultar tabela 13) e o Kit Phusion (consultar tabela 4) com um tempo de alongamento de 45 s (etapa 4 da tabela 4) . O amplificado obtido foi, então, sequenciado com o uso dos iniciadores NCgl2679_fwd2 e NCgl2 681_rev2 (consultar tabela 13) . As sequências de nucleotídeos dos iniciadores usados nesse contexto também são mostradas na SEQ ID NO:28 a 31.

Tabela 13: Lista de iniciadores usados para PCR de colônia e sequenciamento de Sanger.

amplificação/ detecção de	nome	sequência	tamanho [bp]
Acmr::EcoRV	NCgl2679_fwd1	TAGCCTGTCCTGGGTGTAAC	1525
NCgl2681_rev1	CGTGCGGGCACATCATGTTG
Acmr::EcoRV	NCgl2679_fwd2	TCGAGATCGTGGGCAGGTTC
Acmr::EcoRV	NCgl2681_rev2	CGTGGAAGCTCCCATGTCAG

[0176] A sequência de nucleotídeos obtida é mostrada na SEQ ID NO:32. Contém as sequências de nucleotídeos identificadas na tabela 2 e na tabela 3. O resultado mostrou que a cepa DM1933_Acmr::EcoRV continha a mutação desejada, ou a sequência de nucleotídeos que sofreu mutação desejada resp., em seu cromossoma. Então, o gene de cmr da cepa DM1933 foi substituído pela mutação de

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Acmr::EcoRV.

Exemplo 4 [0177] Produção de L-lisina pela cepa DM1933_Acmr::EcoRV [0178] As cepas DM1933 (referência) e DM1933_Acmr::EcoRV foram analisadas quanto à sua habilidade de produzir Llisina de glicose por cultivo de batelada com o uso de sistema de cultivo de acordo com Wouter Duetz.

[0179] Como meio, CGXII contendo 20 g/l de glicose como fonte de carbono foi usado. As culturas foram incubadas por cerca de 45 h até o consumo completo de glicose como confirmado por análise de glicose com o uso de medidor de glicose no sangue e as concentrações de L-lisina e a densidade óptica OD660 foram determinadas. O resultado do experimento é apresentado na tabela 14.

Tabela 14: Produção de L-lisina pela cepa

DM1933 Acmr::EcoRV.

cepa	L-lisina1) (g/l)	OD660
DM1933	6, 3	5, 1
DM1933_Acmr::EcoRV	6, 9	4,9

1) como L-lisina x HCl [0180] O experimento mostra que a produção de L-lisina foi aumentada na cepa DM1933Acmr::EcoRV em comparação à cepa principal.

Exemplo 5 [0181] Construção das cepas ATCC13032_Acmr::EcoRV e DM1797_Acmr::EcoRV [0182] As cepas ATCC13032_Acmr::EcoRV e

DM1797_Acmr::EcoRV foram construídas a partir de ATCC13032

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59/59 e DM1797 e analisadas como descrito no exemplo 3.

Exemplo 6 [0183] Produção de L-lisina por cepas

ATCC13032_Acmr::EcoRV e DM1797_Acmr::EcoRV [0184] O teste de produção foi feito como descrito no exemplo 4. O resultado é mostrado na tabela 15.

Tabela 15: Produção de L-lisina por cepas

ATCC13032 Acmr::EcoRV e DM1797 Acmr::EcoRV

cepa	L-lisina1) (g/l)	OD660
ATCC13032	nd2)	3,4
ATCC13032_Acmr::EcoRV	nd2)	3,2
DM1797	3,4	4,5
DM1797_Acmr::EcoRV	3, 9	3, 9

1) como L-lisina x HCl

2) não detectável [0185] O teste mostrou que a mutação Acmr::EcoRV não converte a cepa tipo ATCC13032 em um produtor de L-lisina. O teste mostrou adicionalmente que, em uma cepa que porta uma aspartoquinase resistente à realimentação, a dita mutação melhora a formação de L-lisina.

Claims (12)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Bactéria do gênero Corynebacterium caracterizada por ter a habilidade de excretar um L-aminoácido selecionado a partir de L-aminoácidos proteinogênicos e Lornitina, em que dentro do cromossoma da dita bactéria um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo, o qual é pelo menos 90 % idêntico à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:8 e que confere à Escherichia coli uma resistência a pelo menos um antibiótico, selecionado a partir de eritromicina, tetraciclina, puromicina e bleomicina, é modificado deletando-se pelo menos a parte da sequência de nucleotídeos que codifica o dito polipeptídeo que corresponde aos aminoácidos das posições 149 a 251, 41 a 344, ou 14 a 435 da sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO:8 ou deletando-se pelo menos a sequência de nucleotídeos completa que codifica o dito polipeptídeo.
2. 2. Bactéria, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo é modificado deletando-se pelo menos a sequência de nucleotídeos completa que codifica o dito polipeptídeo e o códon de parada adjacente.
3. 3. Bactéria, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a modificação do dito polinucleotídeo dentro do cromossoma da dita bactéria resulta em uma inserção de um sítio de reconhecimento para a enzima de restrição EcoRV.
4. 4. Bactéria, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, sendo que a dita bactéria é caracterizada por pertencer à espécie Corynebacterium

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   2/3 glutamicum.
5. 5. Bactéria, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o dito L-aminoácido é selecionado a partir dos L-aminoácidos proteinogênicos L-lisina, L-valina, L-treonina, Lisoleucina, L-histidina e L-prolina.

   6. Bactéria, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o dito L-aminoácido é L- lisina. 7. Bactéria, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que a

   sequência de aminoácidos do polipeptídeo compreende 459 aminoácidos antes da modificação do polinucleotídeo.
6. 8. Bactéria, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:8 ou SEQ ID NO:10 ou SEQ ID NO:12 antes da modificação do polinucleotídeo.
7. 9. Bactéria, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o dito polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:8 antes da modificação do polinucleotídeo.
8. 10. Bactéria, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que, antes da modificação do polinucleotídeo, a sequência de nucleotídeos que codifica o dito polipeptídeo compreende as posições 1001 a 2377 da sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO:7 ou as posições 1001 a 2377 da SEQ ID NO:7, em que na posição 2341 a citosina (c) é substituída por timina (t).
9. 11. Método caracterizado por ser para a produção fermentativa de um L-aminoácido, selecionado a partir de L

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   3/3 aminoácidos proteinogênicos e L-ornitina, que compreende as etapas de

   a) cultivar uma bactéria, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em um meio adequado sob condições adequadas,

   b) acumular o dito L-aminoácido no meio para formar um caldo de fermentação contendo L-aminoácido.
10. 12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o dito L-aminoácido é selecionado a partir dos L-aminoácidos proteinogênicos Llisina, L-valina, L-treonina, L-isoleucina, L-histidina e L-prolina.

    13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o dito L-aminoácido é L-

    lisina.

    14. Método, de acordo com qualquer uma das

    reivindicações 11 a 13, caracterizado por compreender adicionalmente a concentração do caldo de fermentação contendo L-aminoácido.
11. 15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 14, caracterizado por compreender adicionalmente uma etapa de secar o caldo de fermentação contendo L-aminoácido.
12. 16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 14, caracterizado por compreender adicionalmente a etapa de purificar o L-aminoácido do dito caldo de fermentação contendo L-aminoácido.