BR102019020057A2

BR102019020057A2 - método para a produção fermentativa de l-lisina

Info

Publication number: BR102019020057A2
Application number: BR102019020057A
Authority: BR
Inventors: Schneider Frank; Thierbach Georg; Voss Kornelia; BEKEL Thomas
Original assignee: Evonik Degussa Gmbh; Evonik Operations Gmbh
Priority date: 2018-09-26
Filing date: 2019-09-25
Publication date: 2020-04-07
Also published as: EP3628742A1; US20200095622A1; RU2019128538A; US10689677B2; EP3628742B1; CN110951800A

Abstract

método para a produção fermentativa de l-lisina a presente invenção disponibiliza um método para a produção fermentativa de l-lisina usando bactérias da espécie corynebacterium glutamicum, que têm a habilidade de excretar l-lisina, e contendo no seu cromossomo um polinucleotídeo ncgl2816 mutado.

Description

“MÉTODO PARA A PRODUÇÃO FERMENTATIVA DE L-LISINA [0001] A L-lisina é usada em medicina humana, na indústria farmacêutica, na indústria alimentícia e particularmente em nutrição de animais.

[0002] A L-lisina é produzida por fermentação de cepas da espécie Corynebacterium glutamicum (C. glutamicum) . Devido à grande importância econômica, um trabalho está sendo desenvolvido continuamente para melhorar os métodos de produção. As melhorias podem estar relacionadas com a tecnologia de fermentação como, por exemplo, agitação e fornecimento de oxigênio, ou com a composição do meio de nutriente, por exemplo, a concentração de açúcar durante a fermentação, ou com o processamento do caldo de fermentação para uma forma de produto adequada, por exemplo, por secagem e granulação do caldo de fermentação ou cromatografia de troca iônica, ou pode se relacionar com as propriedades de desempenho intrínseco do próprio microrganismo.

[0003] Os métodos usados para melhorar as propriedades de desempenho desses microrganismos são os de mutagênese, seleção e triagem de mutantes. As cepas obtidas desse modo são resistentes a antimetabólitos ou são auxotróficas para metabólitos de importância regulatória e produzem L-lisina.

[0004] Métodos de tecnologia de DNA recombinante foram usados de modo similar por diversos anos para melhoramento de cepas produtoras de L-lisina da espécie Corynebacterium glutamicum, modificando-se, isto é, melhorando ou atenuando, genes individuais envolvidos na biossíntese de L-lisina e investigando-se o efeito na produção de L-lisina

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2/36 (Sanchez et al. The Journal of antibiotics (2018) 71, 2636; publicado online em 1 de novembro de 2017).

[0005] As sequências de nucleotídeos dos cromossomos de várias bactérias ou cepas, respectivamente, da espécie Corynebacterium glutamicum e sua análise foram reveladas. Essas informações estão disponíveis em bancos de dados publicamente acessíveis e podem ser usadas para propósitos de desenvolvimento de cepas. Um de tais bancos de dados é o banco de dados GenBank do NCBI (Centro Nacional de Informações Biotecnológicas [National Center for Biotechnology Information], U.S. National Library of Medicine 8600 Rockville Pike, Bethesda MD, 20894 EUA).

[0006] Durante o procedimento de anotação para um cromossomo sequenciado de um organismo, estruturas identificadas como, por exemplo, genes ou sequências de codificação, são dotadas de um identificador exclusivo denominado locus_tag pelo fornecedor das informações do banco de dados.

[0007] A sequência de nucleotídeos do cromossomo ATCC13032 de Corynebacterium glutamicum e sua análise foram descritas por Ikeda e Nakagawa (Applied Microbiology and Biotechnology 62, 99-109(2003)) e no documento EP1108790. As informações estão disponíveis no NCBI sob o número de acesso NC_003450. Na sequência de cromossomos revelada sob o número de acesso NC_003450, locus_tag NCgl2816 identifica uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de transporte de membrana integral. É ainda anotado que a proteína é similar às permeases da superfamília facilitadora principal. A sequência de aminoácidos do polipeptídeo está disponível sob o identificador

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NP_602106.1, onde é descrita como uma proteína de transporte de membrana integral e provisoriamente como um transportador putativo de ácido siálico. No documento EP1108790 A2, a sequência de codificação é revelada na sequência 3216. A sequência de aminoácidos é revelada sob o SEQ ID NO: 6716. Além disso, o documento EP1108790 A2 afirma que o gene homólogo em Escherichia coli é o gene shiA que codifica uma proteína de transporte de xiquimato (ver tabela 1 do documento EP1108790 A2).

[0008] As sequências de nucleotídeos de locus_tag NCgl2816 e sequência 3216 do documento EP1108790 são idênticas.

[0009] A sequência de nucleotídeos do cromossomo ATCC13032 de Corynebacterium glutamicum e sua análise foram independentemente descritas por Kalinowski et al. (Journal of Biotechnology 104 (1-3), 5-25 (2003)). As informações estão disponíveis no NCBI sob o número de acesso NC_006958. Locus_tag CGTRNA_RS14420 identifica uma sequência de nucleotídeo que codifica um produto de gene descrito como transportador MFS. A designação cg3226 de old_locus_tag também é usada na técnica. A sequência de aminoácidos do polipeptídeo está disponível sob o identificador WP_011015489, onde é descrita provisoriamente como um transportador putativo de ácido siálico.

[0010] As sequências de nucleotídeos de locus_tag NCgl2816 e CGTRNA_RS14420 são idênticas.

[0011] O termo MFS é a abreviatura de Superfamília de Facilitador Principal. De acordo com o banco de dados de domínios conservados no NCBI (consultar a entrada no banco de dados cd06174), o termo denota um grupo amplo e diverso

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4/36 de transportadores secundários que inclui uniportadores, simportadores e antiportadores que facilita o transporte por membranas citoplasmáticas ou internas de uma variedade de substratos, incluindo íons, fosfatos de açúcar, fármacos, neurotransmissores, nucleosídeos, aminoácidos e peptídeos. Pao et al. (Microbiology and Molecular Biology Reviews 62(1), 1 - 34 (1998)) apresenta um resumo deste grupo de proteínas.

[0012] Informações relativas aos sinais de transcrição em Corynebacterium glutamicum, por exemplo, a região -10 de um promotor, ou o sítio de iniciação da transcrição (TSS) do gene identificado por old_locus_tag cg3226 podem ser encontradas em Pfeifer-Sancar et al. (BMC Genomics 14:888 (2013)), Albersmeier et al. (Journal of Biotechnology 257 (2017) 99-109) ou Menz et al. (BMC Genomics 2013, 14:714) . De acordo com estes ensinamentos, os ditos sinais de transcrição estão contidos na sequência da posição 221 a 342 da SEQ ID NO: 1 da listagem de sequências.

[0013] Stansen et al. (Applied and Environmental Microbiology 71(10), 5920 - 5928 (2005)) fornecem indicações experimentais de que o NCgl2816 codifica putativamente uma lactato permease ou uma proteína de transporte putativa para a captação de L-lactato do meio para a célula resp. NCgl2816 juntamente com o gene lldD, que codifica uma L-lactato desidrogenase dependente de quinona, forma o operon NCgl2816-lldD. Mais informações sobre esse operon e a regulação de sua expressão podem ser encontradas por Georgi et al. (Journal of Bacteriology 190 (3), 963-971 (2008)).

[0014] O objetivo da presente invenção consiste em

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5/36 fornecer medidas inovadoras para a produção fermentativa de L-lisina por bactérias da espécie Corynebacterium glutamicum.

[0015] Para alcançar o objetivo definido acima, a presente invenção torna disponível um método para a produção fermentativa de L-lisina inovador usando a espécie Corynebacterium glutamicum, as quais têm a habilidade de excretar L-lisina, contêm em seu cromossomo um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2, em que o aminoácido na posição 220 da sequência de aminoácidos do polipeptídeo é qualquer aminoácido proteinogênico diferente de fenilalanina.

[0016] Consequentemente, a presente invenção fornece um método para a produção fermentativa de L-lisina compreendendo as etapas de

a) fornecer uma bactéria da espécie Corynebacterium glutamicum, que tem a habilidade de excretar L-lisina, contendo em seu cromossomo um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2, em que o aminoácido fenilalanina na posição 220 é substituído por um aminoácido proteinogênico diferente, de preferência, por cisteína,

b) cultivar a bactéria em um meio adequado sob condições adequadas e

c) acumular a L-lisina no meio para produzir um caldo de fermentação contendo L-lisina.

[0017] A sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2, em que o aminoácido fenilalanina na posição 220 é substituído por

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6/36 cisteína, é mostrada na SEQ ID NO:4.

[0018] Verificou-se que as bactérias modificadas, fornecidas no método de acordo com a invenção, excretaram L-lisina em um meio adequado sob condições de fermentação adequadas em um aumento em comparação com a bactéria não modificada.

[0019] É evidente que uma maior concentração de produto facilita a fabricação de produto, por exemplo, purificação e isolamento. Um rendimento de produto aumentado reduz a quantidade de matéria-prima necessária. Uma taxa de formação de produto aumentada reduz o tempo necessário para um ciclo de fermentação, aumentando, desse modo, a disponibilidade de um dado fermentador.

[0020] O método de acordo com a invenção contribui, dessa forma, para a melhoria de aspectos técnicos e econômicos da fabricação de L-lisina ou de produtos contendo L-lisina.

[0021] Em uma modalidade preferida, a bactéria fornecida no método de acordo com a invenção contém no seu cromossomo um polinucleotídeo que codifica uma sequência de aminoácidos de um polipeptídeo compreendendo a sequência de nucleotídeo das posições 343 a 1641 da SEQ ID NO:1 com as nucleobases da posição 1000 a 1002 sendo tgt ou tgc, de preferência, tgc.

[0022] A sequência de nucleotídeos das posições 343 a 1641 da SEQ ID NO:1 com a nucleobase na posição 1001 sendo guanina (g) é particularmente preferida.

[0023] A sequência de nucleotídeos das posições 343 a 1641 da SEQ ID NO: 1 com as nucleobases das posições 1000 a 1002 sendo tgc é idêntica à sequência de nucleotídeo das

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7/36 posições 343 a 1641 da SEQ ID NO:3.

[0024] Em uma outra modalidade preferida, a bactéria fornecida no método de acordo com a invenção contém no seu cromossomo um polinucleotídeo que codifica uma sequência de aminoácidos de um polipeptídeo compreendendo a sequência de nucleotídeo das posições 343 a 1644 da SEQ ID NO:1 com as nucleobases da posição 1000 a 1002 sendo tgt ou tgc, de preferência, tgc.

[0025] A sequência de nucleotídeos das posições 343 a 1644 da SEQ ID NO:1 com a nucleobase na posição 1001 sendo guanina (g) é particularmente preferida.

[0026] A sequência de nucleotídeos das posições 343 a 1644 da SEQ ID NO: 1 com as nucleobases das posições 1000 a 1002 sendo tgc é idêntica à sequência de nucleotídeo das posições 343 a 1644 da SEQ ID NO:3.

[0027] Em uma outra modalidade preferida, a bactéria fornecida no método de acordo com a invenção contém no seu cromossomo um polinucleotídeo que codifica uma sequência de aminoácidos de um polipeptídeo compreendendo a sequência de nucleotídeo das posições 221 a 1644 da SEQ ID NO:1 com as nucleobases da posição 1000 a 1002 sendo tgt ou tgc, de preferência, tgc.

[0028] A sequência de nucleotídeo das posições 221 a 1641 da SEQ ID NO:1 com a nucleobase na posição 1001 sendo guanina (g) é particularmente preferida.

[0029] A sequência de nucleotídeos das posições 221 a 1644 da SEQ ID NO: 1 com as nucleobases das posições 1000 a 1002 sendo tgc é idêntica à sequência de nucleotídeos das posições 221 a 1644 da SEQ ID NO:3.

[0030] O termo L-lisina, quando mencionado no presente

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8/36 documento, em particular, no contexto de formação de produto, também compreende suas formas iônicas e sais, por exemplo, monocloridrato de L-lisina ou sulfato de L-lisina. [0031] Bactérias adequadas para o método desta invenção são cepas excretoras de L-lisina de Corynebacterium glutamicum, por exemplo, cepas excretoras de L-lisina obtidas por uma ou diversas etapas de desenvolvimento de cepa da cepa ATCC13032 e similares e modificadas como descrito nesta invenção.

[0032] A cepa ATCC13032 (também disponível como DSM20300) é a cepa do tipo taxonômico da espécie Corynebacterium glutamicum.

[0033] As cepas excretoras de L-lisina da espécie Corynebacterium glutamicum são amplamente conhecidas na técnica e podem ser modificadas como descrito na presente invenção. Por exemplo, o documento US 7.338.790 B2 descreve a cepa DM1797. É depositada de acordo com o tratado de Budapeste no DSMZ sob o número de acesso DSM16833. DM1797 é um mutante resistente à aminoetilcisteína da cepa ATCC13032 obtida após a mutagênese da N'-metil-N-nitronitrosoguanidina. Por exemplo, Blombach et al. (Applied and Environmental Microbiology 75(2), 419-427, 2009) descrevem uma cepa DM1933 (depositada sob o número de acesso DSM25442 de acordo com o tratado de Budapeste. A cepa DM1933 foi obtida a partir de ATCC13032 por diversas etapas de desenvolvimento de cepa. Além disso, a cepa DM2031 de Corynebacterium glutamicum que excreta de L-lisina, depositada de acordo com o Tratado de Budapeste como DSM32514, pode ser usada. A cepa DM2031 é um derivado desenvolvido posteriormente a partir de DM1933 que tem

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9/36 habilidade melhorada de excreção de L-lisina. Outras cepas de Corynebacterium glutamicum que excretam L-lisina são descritas, por exemplo, nos documentos WO2008033001 e EP0841395.

[0034] As cepas que excretam L-lisina da espécie Corynebacterium glutamicum contêm tipicamente um polinucleotídeo que codifica uma variante de polipeptídeo de aspartoquinase resistente à realimentação. Uma variante de polipeptídeo de aspartoquinase resistente à realimentação significa uma aspartoquinase que é menos sensível, ou dessensibilizada, respectivamente, à inibição por misturas de L-lisina e L-treonina, por exemplo, 10 mM cada, ou misturas do análogo de L-lisina S-(2-aminoetil)-Lcisteína e L-treonina, por exemplo, S-(2-aminoetil)-Lcisteína 50 mM e L-treonina 10 mM, em comparação à forma selvagem da enzima, que está contida em cepas selvagens como, por exemplo, ATCC13032, ATCC14067 e ATCC13869. O número EC para aspartoquinase é EC 2.7.2.4. Descrições de polinucleotídeos de Corynebacterium glutamicum que codificam uma variante de polipeptídeo de aspartoquinase resistente à realimentação são dadas, por exemplo, nos documentos US5688671, US6844176 e US6893848. Uma lista resumida pode ser encontrada, entre outros, no documento WO2009141330. O símbolo usado na técnica para um gene que codifica um polipeptídeo de aspartoquinase é lysC. Caso o gene codifique uma variante de polipeptídeo resistente a realimentação, a técnica usa tipicamente símbolos como lysC^fbr com fbr indicando resistência a realimentação.

[0035] Consequentemente, as ditas cepas que excretam Llisina da espécie Corynebacterium glutamicum, modificadas

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10/36 como descrito na presente invenção, contêm, de preferência, pelo menos uma cópia de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de aspartoquinase resistente à realimentação. [0036] A SEQ ID NO:5 mostra a sequência de nucleotídeos da sequência de codificação do polipeptídeo de aspartoquinase da cepa ATCC13032 e a SEQ ID NO:6 mostra a sequência de aminoácidos do polipeptídeo codificado. Sabese, na técnica (consultar documento US6893848), que a troca do aminoácido Thr na posição 311 da SEQ ID NO:6 por Ile confere à enzima resistência à realimentação para inibição por misturas de L-lisina e L-treonina.

[0037] Consequentemente, é preferido que a sequência de aminoácidos do dito polipeptídeo de aspartoquinase resistente à realimentação compreenda a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:6 contendo isoleucina na posição 311.

[0038] Esta troca de aminoácidos pode ser alcançada ao trocar a nucleobase citosina (c) na posição 932 da SEQ ID NO:5 para produzir timina (t). O códon acc para treonina é, então, alterado para o códon atc para isoleucina.

[0039] Sabe-se, ainda, na técnica que a troca do códon de início gtg da sequência de codificação para o polipeptídeo de aspartoquinase por atg melhora a expressão do polipeptídeo (consultar, por exemplo, documento EP2796555).

[0040] Consequentemente, é preferível que a sequência que codifica um polipeptídeo de aspartoquinase resistente à realimentação seja iniciada com um códon de iniciação atg.

[0041] O termo DSM denota o depositório Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen localizado em

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Braunschweig, Alemanha. O termo ATCC denota o depositório American Type Culture Collection localizado em Manasass, Virginia, EUA.

[0042] Para análise de sequência de polinucleotídeos e polipeptídeos, por exemplo, alinhamentos de sequência, o programa Clustal W (Larkin et al.: Clustal W e Clustal X versão 2.0. Em: Bioinformatics 23, 2947-2948 (2007)) ou o software público, como o CLC Genomics Workbench (Qiagen, Hilden, Alemanha) ou o programa MUSCLE fornecido pela Instituto Europeu de Bioinformática (EMBL-EBI, Hinxton, Reino Unido) pode ser usado.

[0043] Corynebacterium glutamicum, em particular, cepa ATCC13032 e cepas excretoras de L-lisina obtidas a partir da mesma durante um programa de desenvolvimento de cepa, contém em seu cromossomo um, em particular um, gene que codifica um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2. A função do polipeptídeo é amplamente descrita como um transportador MFS na técnica. A sequência de codificação é mostrada na SEQ ID NO:1, posições 343 a 1641. A sequência de codificação pode conter mutações silenciosas que não alteram a sequência de aminoácidos do polipeptídeo. Esse contexto também é conhecido como degeneração do código genético na técnica.

[0044] Durante o trabalho para a presente invenção, constatou-se que modificar bactérias excretoras de L-lisina da espécie Corynebacterium glutamicum ao trocar o aminoácido fenilalanina na posição 220 da sequência de aminoácidos codificada do polipeptídeo mostrado na SEQ ID NO:2 por um aminoácido proteinogênico diferente, de preferência cisteína, aumentou sua habilidade de excretar

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L-lisina em um processo fermentativo em comparação à bactéria não modificada.

[0045] A pessoa versada na técnica está ciente de diversos métodos de mutagênese para alcançar a dita modificação na Corynebacterium glutamicum.

[0046] Uma bactéria mutante pode ser obtida por mutagênese in vivo clássica, realizada com populações celulares de cepas de Corynebacterium glutamicum com o uso de substâncias mutagênicas, por exemplo, N-metil-N'-nitroN-nitrosoguanidina, ou luz ultravioleta.

[0047] A sequência de nucleotídeos que compreende o sítio de mutagênese no gene pode ser amplificada por PCR com o uso de iniciadores selecionados a partir da SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:3. Sequenciando-se o produto de PCR, os mutantes desejados são identificados. Detalhes referentes a essa abordagem podem ser encontrados, entre outros, no documento US7754446. A PCR em tempo real em combinação com sondas de hibridização de FRET também pode ser usada para detecção de mutação. O termo FRET é a abreviatura de transferência de energia de ressonância de fluorescência. Cyril D S Mamotte (The Clinical Biochemist Reviews 27, 6375 (2006) revisa a identificação de substituições de nucleotídeo único com o uso desse método. Resumos adicionais referentes a esse método podem ser encontrados no livro Lewin's Genes XII de Jocelyn E. Krebs, Elliott S. Goldstein e Stephan T. Kilpatrick (Jones and Bartlett Publishers, EUA, 2018) ou em outros documentos da técnica. [0048] Outro método comum de realizar mutação de genes de Corynebacterium glutamicum é o método de substituição de gene descrito por Schãfer et al. (Gene 145, 69-73 (1994)).

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13/36 [0049] Peters-Wendisch et al. (Microbiology 144, 915-927 (1998)) usaram o método de substituição de gene para inativar o gene pyc de Corynebacterium glutamicum que codifica piruvato carboxilase. No documento US7585650, o método foi aplicado ao gene zwf para realizar uma troca de aminoácido na posição 321 da sequência de aminoácidos da subunidade Zwf da glicose 6-fosfato desidrogenase. No documento US7754446, o método foi aplicado ao gene rel para realizar uma troca de aminoácido na posição 38 da sequência de aminoácidos do polipeptídeo de GTP-pirofosfato quinase.

[0050] No método de substituição de gene, uma mutação, por exemplo, uma deleção, inserção ou substituição de pelo menos uma nucleobase, é fornecida por um polinucleotídeo isolado que compreende a sequência de nucleotídeos do gene em questão ou uma parte do mesmo que contém a mutação.

[0051] No contexto da presente invenção, a sequência de nucleotídeos do gene em questão é o gene identificado por NCgl2816.

[0052] No contexto da presente invenção, a mutação é uma substituição de pelo menos uma nucleobase localizada no códon que especifica o aminoácido fenilalanina na posição 220 da sequência de aminoácidos codificada (consultar SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2) do polipeptídeo.

[0053] Como consequência da dita mutação, o códon especifica um aminoácido proteinogênico diferente de fenilalanina, de preferência, cisteína. Os códons que especificam a cisteína são tgt ou tgc. O códon tgc é preferencial.

[0054] O códon para o aminoácido na posição 220 tem a posição de 1000 a 1002 na SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:3. A

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14/36 sequência de nucleotídeos da posição 1000 a 1002, em particular, o nucleotídeo na posição 1001, também pode ser denominada sítio de mutação.

[0055] A sequência de nucleotídeos que sofreu mutação do gene em questão ou uma parte do mesmo que contém a mutação compreende i) uma sequência de nucleotídeos na extremidade 5' do sítio de mutação, a qual também é denominada sequência flanqueadora 5' ou sequência a montante na técnica, ii) uma sequência de nucleotídeos na extremidade 3' do sítio de mutação, a qual também é denominada sequência flanqueadora 3' ou sequência a jusante na técnica, e iii) a sequência de nucleotídeos do sítio de mutação entre i) e ii).

[0056] Estas sequência flanqueadora 5' e a sequência flanqueadora 3' necessárias para recombinação homóloga têm tipicamente um comprimento de pelo menos 200 pb, pelo menos 400 pb, pelo menos 600 pb ou pelo menos 800 pb. O comprimento máximo é tipicamente 1000 pb, 1500 pb ou 2000 pb.

[0057] Um exemplo de um polinucleotídeo que compreende uma sequência de nucleotídeo mutada no contexto da presente invenção é mostrado na SEQ ID NO:7. A sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO:7 das posições 10 a 1610 corresponde à SEQ ID NO:3 das posições 201 a 1801. O polinucleotídeo mostrado na SEQ ID NO: 7 contém nos seus sítio de reconhecimento de extremidade 5' e 3' para endonuclease de restrição úteis para fins de clonagem. A SEQ ID NO: 7 contém a sequência de codificação de uma variante do polipeptídeo NCgl2816 descrito nesta invenção. A sequência flanqueadora 5' consiste na sequência de

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15/36 nucleotídeos das posições 10 a 809 da SEQ ID NO:7. A sequência flanqueadora 3' consiste na sequência de nucleotídeos das posições 811 a 1610 da SEQ ID NO:7. O sítio de mutação está na posição 810 da SEQ ID NO:7.

[0058] A sequência de nucleotídeos que sofreu mutação fornecida é clonada em um vetor plasmidial, por exemplo, pK18mobsacB descrito por Schâfer et al. (Gene 145, 69-73 (1994)), que não é capaz de replicação autônoma em Corynebacterium glutamicum. Este vetor de plasmídeo que compreende a sequência de nucleotídeos que sofreu mutação é subsequentemente transferido para a cepa desejada de Corynebacterium glutamicum por transformação com o uso de eletroporação ou conjugação. Após dois eventos de recombinação homóloga que compreendem um evento de recombinação dentro da sequência flanqueadora 5' fornecido pelo vetor de plasmídeo com a sequência homóloga do cromossomo de Corynebacterium glutamicum e um evento de recombinação dentro da sequência flanqueadora 3' fornecida pelo vetor de plasmídeo com a sequência homóloga do cromossomo de Corynebacterium glutamicum, um realizando a integração e o outro realizando a excisão do vetor de plasmídeo, a mutação é incorporada no cromossomo de Corynebacterium glutamicum. Desse modo, a sequência de nucleotídeos do gene em questão contida no cromossomo da dita cepa desejada é substituída pela sequência de nucleotídeos que sofreu mutação.

[0059] Um evento de recombinação homóloga também pode ser denominado permutação.

[0060] É preferencial que as cepas de Corynebacterium glutamicum excretoras de L-lisina fornecidas para o método

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16/36 da presente invenção tenham a habilidade de excretar b 0,25 g/l, preferencialmente b 0,5 g/l, particularmente preferencial b 1,0 g/l, de modo muito particularmente preferencial b 2,0 g/l de L-lisina em um meio adequado sob condições adequadas.

[0061] Em um processo fermentativo de acordo com a invenção, uma Corynebacterium glutamicum modificada de acordo com a presente invenção e que tem a habilidade de excretar L-lisina é cultivada em um meio adequado sob condições adequadas. Devido à habilidade de excretar a Llisina, a concentração de L-lisina aumenta e se acumula no meio durante o processo fermentativo e a L-lisina é, então, produzida.

[0062] Um meio adequado usado para a produção de Llisina por um processo fermentativo contém uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, uma fonte de fósforo, íons inorgânicos e outros compostos orgânicos, conforme necessário.

[0063] As fontes de carbono adequadas incluem glicose, frutose, sacarose, bem como as matérias-primas correspondentes, como hidrolisado de amido, melaços ou xarope de milho com alto teor de frutose.

[0064] Como fonte de nitrogênio, compostos contendo nitrogênio orgânico, como peptonas, extrato de carne, hidrolisados de soja ou ureia, ou compostos inorgânicos, como sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio, nitrato de amônio, gás de amônio ou amônia aquosa, podem ser usados.

[0065] Como fonte de fósforo, ácido fosfórico, dihidrogenofosfato de potássio ou hidrogenofosfato de

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17/36 dipotássio ou os sais contendo sódio correspondentes podem ser usados.

[0066] Íons inorgânicos, como potássio, sódio, magnésio, cálcio, ferro e demais elementos-traço etc. são fornecidos como sais de ácido sulfúrico, ácido fosfórico ou ácido clorídrico.

[0067] Outros compostos orgânicos representam fatores de crescimento essenciais, como vitaminas, por exemplo, tiamina ou biotina ou L-aminoácidos, por exemplo, Lhomosserina.

[0068] Os componentes de meio podem ser adicionados à cultura na forma de uma única batelada ou podem ser alimentados durante o cultivo de uma maneira adequada.

[0069] Durante o processo fermentativo, o pH da cultura pode ser controlado empregando-se compostos básicos, como hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, amônia ou amônia aquosa, ou compostos ácidos, como ácido fosfórico ou ácido sulfúrico de uma maneira adequada. O pH é geralmente ajustado a um valor de 6,0 a 8,5, preferencialmente 6,5 a 8,0. Para controlar a formação de espuma, é possível empregar agentes antiespumantes, como, por exemplo, poliglicol ésteres de ácido graxo. Para manter a estabilidade de plasmídeos, é possível adicionar ao meio substâncias seletivas adequadas, como, por exemplo, antibióticos. O processo fermentativo é preferencialmente realizado sob condições aeróbicas. A fim de manter essas condições, oxigênio ou misturas de gás contendo oxigênio, como, por exemplo, ar, são introduzidos na cultura. O processo fermentativo é realizado, quando adequado, a uma pressão elevada, por exemplo, a uma pressão elevada de 0,03

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18/36 a 0,2 MPa. A temperatura da cultura é normalmente de 25 °C a 40 °C, preferencialmente de 30 °C a 37 °C. Em um processo descontínuo, o cultivo é continuado até que uma quantidade da L-lisina suficiente para ser recuperada tenha sido formada. O cultivo é, então, concluído. Esse objetivo é normalmente alcançado em 10 horas a 160 horas. Em processos contínuos, períodos mais longos de cultivo são possíveis. [0070] Então, o processo fermentativo resulta em um caldo de fermentação que contém a L-lisina desejada.

[0071] Um produto contendo a L-lisina é, então, recuperado ou fabricado em líquido ou sólido do caldo de fermentação. Um caldo de fermentação significa um meio em que um Corynebacterium glutamicum descrito na invenção foi cultivado por um certo tempo e sob certas condições.

[0072] Quando o processo fermentativo é concluído, o caldo de fermentação resultante compreende consequentemente:

a) a biomassa (massa celular) da Corynebacterium glutamicum da invenção, em que a dita biomassa foi produzida devido à propagação das células da dita Corynebacterium glutamicum,

b) a L-lisina desejada acumulada durante o processo fermentativo,

c) os subprodutos orgânicos acumulados durante o processo fermentativo e

d) os componentes do meio empregado que não foram consumidos no processo fermentativo.

[0073] Os subprodutos orgânicos incluem compostos que podem ser formados pela Corynebacterium da invenção durante o processo fermentativo além da produção da L-lisina.

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19/36 [0074] O caldo de fermentação é removido do vaso de cultura ou tanque de fermentação, coletado em lugar adequado e usado para fornecer um produto contendo a Llisina, em forma líquida ou sólida. A expressão recuperar o produto contendo L-lisina também é usada para tanto. No caso mais simples, o próprio caldo de fermentação contendo L-lisina, o qual foi removido do tanque de fermentação, constitui o produto recuperado.

[0075] O caldo de fermentação pode ser subsequentemente submetido a uma ou mais das seguintes etapas de processo:

a) remoção parcial (>0	% a <	80	%)	a completa	(100 %)	ou
quase completa ( > 80 %	, > 90	o, %,	>	95 %, > 96 %,	> 97 %,	>
98 %, > 99 %) da água,
b) remoção parcial (>0	% a <	80	%)	a completa	(100 %)	ou
quase completa (> 80 %,	> 90	o, %,	>	95 %, > 96 %,	> 97 %,	>
98 %, > 99 %) da biomassa,	sendo que a	última	é
opcionalmente inativada	antes	da	remoção,
c) remoção parcial (>0	% a <	80	%)	a completa	(100 %)	ou
quase completa (> 80 %,	> 90	o, %,	>	95 %, > 96 %,	> 97 %,	>
98 %, > 99 %, > 99,3 %,	> 99,7	%)	dos subprodutos	orgânicos

formados durante o processo fermentativo e

d) remoção parcial (>0 a 80 %) a completa (100 %) ou quase completa (> 80 %, > 90 %, > 95 %, > 96 %, > 97 %, > 98 %, > 99 %, > 99,3 %, > 99,7 %) dos componentes residuais do meio empregado ou dos materiais de entrada residuais resp., os quais não foram consumidos no processo fermentativo.

[0076] A remoção de água (medida a)) pode ser alcançada, entre outros, por evaporação, com o uso, por exemplo, de um evaporador de filme descendente, por osmose reversa ou nanofiltração. Os concentrados assim obtidos podem ser

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20/36 adicionalmente finalizados por secagem por pulverização ou granulação por pulverização. Do mesmo modo, é possível secar o caldo de fermentação diretamente com o uso de secagem por pulverização ou granulação por pulverização. [0077] Consequentemente, um método de acordo com a invenção compreende extrair ou, substancialmente, eliminar a água do dito caldo de fermentação. Em particular, pelo menos 40 % (p/p) , de preferência, pelo menos 90 % (p/p) , mais de preferência pelo menos 95 % (p/p) de água são extraídos do caldo de fermentação.

[0078] A remoção da biomassa (medida b)) pode ser alcançada, entre outros, por centrifugação, filtração ou decantação ou uma combinação desses.

[0079] A remoção dos subprodutos orgânicos (medida c) ou remoção de componentes residuais do meio (medida d) pode ser alcançada, entre outros, por cromatografia, por exemplo, cromatografia de troca iônica, tratamento com carvão ativado ou cristalização. Caso os subprodutos orgânicos ou componentes residuais do meio estejam presentes no caldo de fermentação como sólidos, podem ser removidos pela medida b).

[0080] Consequentemente, a fabricação de um produto de L-lisina de acordo com a invenção pode compreender ainda uma etapa de purificação, de preferência, selecionada do grupo que consiste em cromatografia de troca iônica, tratamento com carvão ativado ou cristalização.

[0081] Assim, por exemplo, um produto que contém LLisina x HCl, de preferência, contendo > 80 % de L-Lisina x HCl, particularmente de preferência > 90 % de L-Lisina x HCl ou > 95 % de L-Lisina x HCl pode ser obtido.

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21/36 [0082] Então, uma concentração ou purificação da Llisina é alcançada e um produto que tem o teor desejado da dita L-lisina é fornecido.

[0083] A análise de L-lisina para determinar sua concentração em um ou mais períodos durante a fermentação pode ocorrer separando-se a L-lisina por meio de cromatografia por troca de íons, preferencialmente cromatografia por troca de cátions, com derivatização póscoluna subsequente com o uso de ninidrina, como descrito em Spackman et al. (Analytical Chemistry 30: 1190-1206 (1958)). Também é possível empregar orto-ftalaldeído em vez de ninidrina para a derivatização pós-coluna. Um artigo de visão geral sobre cromatografia de troca iônica pode ser encontrado em Pickering (LC.GC (Magazine of Chromatographic Science 7(6):484-487 (1989)). É possível, do mesmo modo, realizar uma derivatização pré-coluna, por exemplo, com o uso de orto-ftalaldeído ou isotiocianato de fenila, e fracionar os derivados de aminoácido resultantes por cromatografia de fase reversa (RP), preferencialmente na forma de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Um método desse tipo é descrito, por exemplo, em Lindroth et al. (Analytical Chemistry 51:1167-1174 (1979)). A detecção é realizada fotometricamente (absorção, fluorescência). Uma resenha referente à análise de aminoácido pode ser encontrada, entre outros, no livro Bioanalytik por Lottspeich e Zorbas (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Alemanha 1998).

SEÇÃO EXPERIMENTAL

A) MATERIAIS e MÉTODOS [0084] Os kits, iniciadores e produtos químicos de

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22/36 biologia molecular usados e alguns detalhes dos métodos aplicados são brevemente descritos no presente documento.

1. Antibióticos e produtos químicos

a. Canamicina: Solução de canamicina de Streptomyces kanamyceticus adquirida junto à Sigma Aldrich (St. Louis, EUA, n° de Cat. K0254).

b. Ácido nalidíxico: Sal de sódio de ácido nalidíxico disponível junto à Sigma Aldrich (St. Louis, EUA, n° de Cat. N4382) .

c. Se não for declarado de outro modo, todos os produtos químicos foram adquiridos analiticamente puros junto à Merck (Darmstadt, Alemanha), Sigma Aldrich (St. Louis, EUA) ou Carl-Roth (Karlsruhe, Alemanha).

2. Cultivo [0085] Se não for declarado de outro modo, todos os procedimentos de cultivo/incubação foram realizados como a seguir:

a. Caldo LB (MILLER) da Merck (Darmstadt, Alemanha; n° de Cat. 110285) foi usado para cultivo de cepas de E. coli em meio líquido. As culturas líquidas (10 ml de meio líquido por frasco Erlenmeyer de 100 ml com 3 defletores) foram incubadas no agitador de incubadora padrão Infors HT

Multitron da Infors GmbH (Einsbach, Alemanha) a 37 °C e 200 rpm.

b. Ágar de LB (MILLER) da Merck (Darmstadt, Alemanha; n° de Cat. 110283) foi usado para em placas de ágar. As placas 37 °C em uma mini-incubadora EUA).

c. Caldo infusão de cérebro cultivo de cepas de E. coli de ágar foram incubadas a INCU-Line® da VWR (Radnor, e coração (BHI) da Merck

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23/36 (Darmstadt, Alemanha; n° de Cat. 110493) foi usado para cultivar cepas de C. glutamicum em meio líquido. As culturas líquidas (10 ml de meio líquido por frasco Erlenmeyer de 100 ml com 3 defletores) foram incubadas no agitador de incubadora padrão Infors HT Multitron da Infors GmbH (Einsbach, Alemanha) a 33 °C e 200 rpm.

d. Ágar cérebro e coração (BHI-ágar) da Merck (Darmstadt, Alemanha; n° de Cat. 113825) foi usado para cultivo de cepas de C. glutamicum em placas de ágar. As placas de ágar foram incubadas a 33 °C em uma incubadora da Heraeus Instruments com controlador de temperatura Kelvitron® (Hanau, Alemanha).

3. Determinação de densidade óptica

a. A densidade óptica de suspensões bacterianas em culturas de frasco de agitação foi determinada a 600 nm (OD600) com o uso do BioPhotometer da Eppendorf AG (Hamburgo, Alemanha).

b. A densidade óptica de suspensões bacterianas produzidas no sistema de microfermentação Wouter Duetz (WDS) (Placas de 24 poços) foi determinada a 660 nm (OD660) com o leitor de placa GENios™ da Tecan Group AG (Mânnedorf, Suíça).

4. Centrifugação

a. Centrífuga de bancada para tubos de reação com um volume de até 2 ml [0086] As suspensões bacterianas com um volume máximo de 2 ml foram levadas à sedimentação com o uso de tubos de reação de 1 ml ou 2 ml (por exemplo, Eppendorf Tubes^®3810X) com o uso de uma centrífuga Eppendorf 5417 R (5 min a 13.000 rpm).

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b. Centrífuga de bancada para tubos com um volume de até 50 ml [0087] As suspensões bacterianas com um volume máximo de 50 ml foram levadas à sedimentação com o uso de tubos de centrífuga de 15 ml ou 50 ml (por exemplo, Tubos de Centrífuga Cônica de 50 ml Falcon^TM) com o uso de uma centrífuga Eppendorf 5810 R por 10 min a 4.000 rpm.

5. Detecção de mutações com o uso de FRET [0088] A presença de uma dada mutação, por exemplo, uma troca de nucleobase, foi detectada por PCR em tempo real em combinação com sondas de hibridização de FRET. O termo FRET é a abreviatura de transferência de energia de ressonância de fluorescência. Como o instrumento de PCR em tempo real, um Lightcycler da Roche Diagnostics^® foi usado (consultar abaixo).

[0089] Esse método foi, por exemplo, usado por M. J. Lay e C. T. Wittwer (Clinical Chemistry 42 (12), 2262-2267 (1997)) para a genotipagem de fator V de Leiden. Cyril DS Mamotte (The Clinical Biochemist Reviews 27, 63-75 (2006) revisa a genotipagem de substituições de nucleotídeo único com o uso desse método. Resumos referentes a esse método podem ser encontrados nos livros Lewin's Genes XII de Jocelyn E. Krebs, Elliott S. Goldstein e Stephan T. Kilpatrick (Jones e Bartlett Publishers, EUA, 2018), Molecular Diagnostics, 12 Tests that changed everything de W. Edward Highsmith (Humana Press, Springer, Nova York, 2014) ou em outras publicações da técnica.

[0090] A sonda doadora de hibridização de FRET foi identificada com o corante fluorescente fluoresceína e a sonda receptora com o corante fluorescente LC-Red640. Em

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25/36 essência, o método de detecção compreendia três etapas: PCR de colônia, hibridização por sonda e análise de curva de fusão subsequente. O método é simplesmente denominado PCR em tempo real no presente documento.

a. Iniciadores e Sondas [0091] Os oligonucleotídeos usados foram sintetizados por Eurofins Genomics GmbH (Ebersberg, Alemanha).

b. Modelo [0092] Como modelo de PCR, o DNA total contido em uma colônia foi usado. Foi preparado obtendo-se material celular com um palito de uma colônia em uma placa de ágar e colocando-se o material celular diretamente no tubo de reação de PCR. O material celular foi aquecido por 10 s com 800 W em um forno de micro-ondas do tipo Mikrowave & Grill da SEVERIN Elektrogerãte GmbH (Sundern, Alemanha) e, então, os reagentes de PCR foram adicionados ao modelo no tubo de reação de PCR.

b. Mistura de Reação [0093] O kit de PCR de sonda Fast SNP Type-it® (Kit

Type-it) da Qiagen (Hilden, Alemanha, n° de Cat. 206045) foi usado para detecção em tempo real das mutações. Portanto, 2,5 pl do Qiagen Fast SNP Puffer (2x) foram misturados com 0,5 pl de cada um dos Iniciadores de LC-PCR [10 pM] e 0,5 pl de cada uma das sondas receptora e doadora diluídas a 1:500 [100 pmol/pl] para obter a mistura principal para a PCR em tempo real.

[0094] Tabela 1: Condições de termociclização para PCR com o LightCycler® (etapas 1-3) e análise de curva de fusão (etapas 4-6).

Programa PCR

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Etapa	Tempo [s]	T [°C]	Descrição
1	15	95	Etapa de desnaturação (e Ativação de DNA polimerase HotStarTaq^TM)
2	05	55	Etapa de anelamento
3	30	72	Etapa de alongamento
			Repetição das etapas 1 a 3: 50 x
4	10	95	Etapa de desnaturação
5	30	40	Hibridização por sonda
6		40- 80	Análise de curva de fusão
7		80- 40	Resfriamento

c. Ciclador PCR [0095] As reações foram realizadas em um Instrumento LightCycler® 2.0 e analisadas com o Software 4.1 LightCycler® da Roche Diagnostics (Rotkreuz, Suíça).

6. Transformação química de E. coli [0096] A cepa S17-1 de E. coli K-12 foi usada como doadora para transferência conjugacional de plasmídeos baseados em pk18mobsacB de E. coli para C. glutamicum. A cepa S17-1 é descrita por Simon, R. et al. (Bio/Technology 1, 784-794, 1983). Está disponível junto à Coleção Americana de Culturas Celulares sob o número de acesso ATCC47055.

[0097] As células de E. coli S17-1 quimicamente competentes foram feitas como a seguir: Uma pré-cultura de 10 ml de meio de LB (10 ml de meio líquido por frasco Erlenmeyer de 100 ml com 3 defletores) foi inoculada com 100 pl suspensão bacteriana da cepa S17-1 e a cultura foi

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27/36 incubada de um dia para o outro por cerca de 18 h a 37 °C e 250 rpm. A cultura principal (70 ml de LB contidos em um frasco Erlenmeyer de 250 ml com 3 defletores) foi inoculada com 300 pl da pré-cultura e incubada até um OD600 de 0,50,8 a 37 °C. A cultura foi centrifugada por 6 min a 4 °C e 4000 rpm e o sobrenadante foi descartado. O pélete celular foi ressuspenso em 20 ml de solução estéril gelada de CaCl2 50 mM e incubado no gelo por 3 0 min. Após outra etapa de centrifugação, o pélete foi ressuspenso em 5 ml de solução gelada de CaCl2 50 mM e a suspensão foi incubada no gelo por 30 min. A suspensão celular foi, então, ajustada a uma concentração final de glicerol a 20 % (v/v) com glicerol estéril gelado a 85 %. A suspensão foi dividida em alíquotas de 50 pl e armazenada a -80 °C.

[0098] Para transformar células S17-1, o protocolo de acordo com Tang et al. (Nucleic Acids Res. 22(14), 28572858, 1994) com um choque térmico de 45 s foi usado.

7. Conjugação de C. glutamicum [0099] O sistema de plasmídeo pK18mobsacB descrito por Schãfer et al. (Gene 145, 69 - 73, 1994) foi usado para integrar fragmentos de DNA desejado no cromossomo de C. glutamicum. Um método de conjugação modificada de Schãfer et al. (Journal of Bacteriology 172, 1663 - 1666, 1990) foi usado para a transferência do respectivo plasmídeo para a cepa recipiente de C. glutamicum desejada.

[0100] As culturas líquidas das cepas de C. glutamicum foram realizadas em meio de BHI a 33 °C. O choque térmico foi realizado a 48,5 °C por 9 min. Transconjugantes foram selecionados plaqueando-se a batelada de conjugação em ágar de EM8 (Tabela 2), a qual foi suplementada com 25 mg/l de

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28/36 canamicina e 50 mg/l de ácido nalidíxico. As placas de ágar de EM8 foram incubadas por 72 h a 33 °C.

[0101] Tabela 2: Composição do ágar de EM8

Componentes	Concentração (g/l)
Glicose (estéril-filtrada)	23
CSL (milhocina; Roquette; teor de sólidos 48±2 % p/p)	30
Peptona de farinha de soja (Merck, Alemanha)	40
(NHJ2SO4	8
Ureia	3
KH2PO4	4
MgSO4 · 7 H2O	0,5
FeSO4 · 7 H2O	0,01
CuSO4 · 5 H2O	0,001
ZnSO4 · 7 H2O	0,01
Pantotenato de cálcio, D(+)	0,01
Tiamina	0,001
Inositol	0,1
Ácido nicotínico	0,001
Biotina (estéril-filtrada)	0,005
CaCO3 (autoclavado separadamente)	1,6
Ágar-Ágar (Merck, Alemanha)	14

[0102] Palitos estéreis foram usados para a transferência dos transconjugantes para ágar de BHI, o qual foi suplementado com 25 mg/l de canamicina e 50 mg/l de ácido nalidíxico. As placas de ágar foram incubadas por 20 h a 33 °C. As culturas dos respectivos transconjugantes

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29/36 produzidos dessa maneira foram, então, propagadas adicionalmente por 24 h a 33 °C em 10 ml de meio de BHI contido em frascos Erlenmeyer de 100 ml com 3 defletores. Uma alíquota foi obtida da cultura líquida, adequadamente diluída e plaqueada (tipicamente 100 a 200 pl) em ágar de BHI que foi suplementado com sacarose a 10 %. As placas de ágar foram incubadas por 48 h a 33 °C. As colônias em crescimento nas placas de ágar contendo sacarose foram, então, examinadas para o fenótipo de sensibilidade à canamicina. Para fazê-lo, um palito foi usado para remover material celular da colônia e transferi-lo para ágar de BHI contendo 25 mg/l de canamicina e para ágar de BHI contendo sacarose a 10 %. As placas de ágar foram incubadas por 60 h a 33 °C. Clones que se provaram sensíveis à canamicina e resistentes à sacarose foram examinados para integração do fragmento de DNA desejado por meio de PCR.

8. Estoques de glicerol de cepas de E.coli e C. glutamicum [0103] Para um armazenamento de longo período de cepas de E.coli e C. glutamicum, estoque de glicerol foram preparados. Os clones de E. coli selecionados foram cultivados em 10 ml de meio de LB suplementado com 2 g/l de glicose. Os clones de C. glutamicum selecionados foram cultivados em meio de BHI concentrado duas vezes suplementado com 2 g/l de glicose. Culturas de cepas de E. coli contendo plasmídeo foram suplementadas com 50 mg/l de canamicina. Culturas de cepas de C. glutamicum contendo plasmídeo foram suplementadas com 25 mg/l de canamicina. O meio estava contido em frascos Erlenmeyer de 100 ml com 3 defletores. Foi inoculado com um laço de células obtido a

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30/36 partir de uma colônia e a cultura foi incubada por cerca de 18 h a 37 °C e 200 rpm no caso de E. coli e 33 °C e 200 rpm no caso de C. glutamicum. Após o dito período de incubação, 1,2 ml de glicerol estéril a 85 % (v/v) foram adicionados à cultura. A suspensão celular contendo glicerol obtida foi, então, dividida em alíquotas em porções de 2 ml e armazenada a -80 °C.

9. Sistema de cultivo de acordo com Wouter Duetz (WDS) [0104] O sistema de cultivo de escala em mililitros de acordo com Duetz (Trends Microbiol. 2007; 15(10):469-75) foi usado para investigar o desempenho das cepas de C. glutamicum construídas. Para esse propósito, foram usadas microplacas de 24 poços profundas (placas WDS de 24 poços) da EnzyScreen BV (Heemstede, Holanda; n° de Cat. CR1424) preenchidas com 2,5 ml de meio.

[0105] Pré-culturas das cepas foram feitas em 10 ml de meio de BHI concentrado duas vezes. O meio estava contido em um frasco Erlenmeyer de 100 ml com 3 defletores. Foi inoculado com 100 pl de uma cultura de estoque de glicerol e a cultura foi incubada por 24 h a 33 °C e 200 rpm.

[0106] Após o dito período de incubação, as densidades ópticas OD600 das pré-culturas foram determinadas.

[0107] As culturas principais foram feitas inoculando-se os poços contendo 2,5 ml de meio da Placa de WDS de 24 poços com uma alíquota da pré-cultura para produzir uma densidade óptica OD600 de 0,1.

[0108]	Como	meio	para	a cultura	principal, o meio de
CGXII	descrito	por	Keilhauer	et al	. (J.	Bacteriol. 1993
Sep;	175(17):	5595-	5603)	foi	usado.	Por	conveniência, a

composição do meio de CGXII é mostrada na tabela 3.

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31/36 [0109] Tabela 3: Composição do meio de CGXII de

Keilhauer.

Componentes	Concentração (g/l)
MOPS (ácido 3-(N- morfolino)propanossulfônico)	42
(NHJ2SO4	20
Ureia	5
KH2PO4	1
K2HPO4	1
MgSO4 · 7 H2O	0,25
CaCl2	0,01
FeSO4 · 7 H2O	0,01
MnSO4 H2O	0,01
ZnSO4 · 7 H2O	0,001
CuSO4 · 5 H2O	0,0002
NiCl2 6 H2O	0,00002
Biotina (estéril-filtrada)	0,0002
Ácido protocatecuico (estérilfiltrado)	0,03
Fonte de carbono (estérilfiltrado)	conforme necessário
ajustar o pH a 7 com NaOH

[0110] Essas culturas principais foram incubadas por aproximadamente 45 h a 33 °C e 300 rpm em um agitador de incubadora padrão Infors HT Multitron da Infors GmbH (Bottmingen, Suíça) até o consumo completo de glicose.

[0111] A concentração de glicose na suspensão foi analisada com o medidor de glicose no sangue OneTouch Vita® da LifeScan (Johnson & Johnson Medical GmbH, Neuss,

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Alemanha).

[0112] Após o cultivo, as suspensões de cultura foram transferidas para uma microplaca de poço profundo. Uma parte da suspensão de cultura foi adequadamente diluída para medir o OD600. Outra parte da cultura foi centrifugada e a concentração de L-aminoácidos, em particular, L-lisina, e glicose residual foi analisada no sobrenadante.

Analisador de Aminoácidos [0113] A concentração de L-lisina e outros Laminoácidos, nos sobrenadantes de cultura foi determinada por cromatografia de troca iônica com o uso de um analisador de aminoácidos SYKAM S433 da SYKAM Vertriebs GmbH (Fürstenfeldbruck, Alemanha). Como fase sólida, uma coluna com trocador de cátion esférico à base de poliestireno (Peek LCA N04/Na, dimensão 150 x 4,6 mm) da SYKAM foi usada. Dependendo do L-aminoácido, a separação ocorre em um ciclo isocrático com o uso de uma mistura de tampões A e B para eluição ou por eluição de gradiente com o uso dos ditos tampões. Como tampão A, uma solução aquosa contendo, em 20 l, 263 g de citrato de trissódio, 120 g de ácido cítrico, 1100 ml de metanol, 100 ml de HCl a 37 % e 2 ml de ácido octanoico (pH final 3,5) foi usada. Como tampão B, uma solução aquosa contendo, em 2 0 l, 3 92 g de citrato de trissódio, 100 g de ácido bórico e 2 ml de ácido octanoico (pH final 10,2) foi usada. Esses aminoácidos livres foram coloridos com ninidrina através de derivatização pós-coluna e detectados fotometricamente a 570 nm.

11. Determinação de glicose com sistema de fluxo contínuo (CFS)

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33/36 [0114] Um analisador de fluxo contínuo multicanal SANplus da SKALAR Analytic GmbH (Erkelenz, Alemanha) foi usado para determinar a concentração de glicose no sobrenadante. A glicose foi detectada com um ensaio acoplado de enzima (Hexoquinase/ Glicose-6-FosfatoDesidrogenase) por formação de NADH.

B) RESULTADOS EXPERIMENTAIS

Exemplo 1 [0115] Sequência do gene NCgl2816 da cepa DM1933 de C. glutamicum A cepa DM1933 é uma produtora de L-lisina descrita por Blombach et al. (Applied and Environmental Microbiology 75(2), 419-427, 2009). É depositada de acordo com o tratado de Budapeste no DSMZ sob o número de acesso DSM25442.

[0116] A sequência de nucleotídeos do cromossomo da cepa DM1933 foi determinada por tecnologia de sequenciamento de genoma completo Illumina (Illumina Inc., San Diego, CA, EUA). Constatou-se que a sequência de nucleotídeos da sequência de codificação de Ncgl2816 da cepa DM1933, incluindo a sequência de nucleotídeos a montante e a jusante da mesma, é idêntica àquela de ATCC13032 mostrada na SEQ ID NO:1.

[0117] DM1933 contém em seu cromossomo uma variante do gene de aspartoquinase que codifica um polipeptídeo de aspartoquinase resistente à realimentação. O dito polipeptídeo de aspartoquinase resistente à realimentação tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6 da listagem de sequências, em que o aminoácido treonina (Thr) na posição 311 da sequência de aminoácidos é substituído por isoleucina (Ile). No documento US 7.338.790, a abreviatura

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34/36 lysC T311I” é usada para indicar a dita troca. Blombach et al. usam a abreviatura lysC(T311I)”.

Exemplo 2

Construção do plasmídeo pK18mobsacB_NCgl2816_F220C [0118] O plasmídeo pK18mobsacB_NCgl2816_F220C foi construído para possibilitar a incorporação da mutação que causa a troca de aminoácido F220C para a sequência de nucleotídeos da sequência codificadora NCGl2816 da cepa DM1933. O plasmídeo é baseado no vetor móvel pK18mobsacB descrito por Schãfer et al. (Gene 145, 69-73, 1994). Para a construção do pK18mobsacB_NCgl2816_F220C a sequência NCgl2816_F220C de acordo com a SEQ ID NO:7 foi sintetizada e sub-clonada em pK18mobsacB por GeneArt (ThermoFisher Scientific (Waltham, EUA)).

[0119] Para montar o plasmídeo pK18mobsacB_NCgl2816_F220C os dois polinucleotídeos, ou seja, o vetor pK18mobsacB cortado com Xbal e o polinucleotídeo NCgl2816_F220C digerido com Xbal e sintetizado foram ligados e transformados em E. coli por GeneArt (ThermoFisher Scientific (Waltham, EUA)).

Exemplo 3

Construção da cepa DM1933_NCgl2816_F220C [0120] O plasmídeo pK18mobsacB_NCgl2816_F220C obtido no exemplo 2 foi usado para incorporar as mutações que levaram às trocas de aminoácido F220C (consultar as posições de nucleotídeos 810 da SEQ ID NO:7) no cromossomo da DM1933 produtora de L-lisina.

[0121] Células quimicamente competentes da cepa S17-1 de E. coli foram transformadas com DNA plasmidial de pK18mobsacB_NCgl2816_F220C. O método de conjugação

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35/36 modificado de Schafer et al. (Journal of Bacteriology 172, 1663 - 1666, 1990), como descrito em materiais e métodos, foi usado para transferência conjugada para a cepa DM1933 e para seleção de clones de transconjugantes em virtude de sua resistência à sacarose e fenótipo de sensibilidade à canamicina.

[0122] Os clones transconjugantes foram analisados por PCR em tempo real com o uso do Kit Type-it e os iniciadores LC-NCgl2818_1 e LC-NCgl2816_2 para amplificação de PCR e NCgl2816_220_C como sonda de aceptor e NCgl2816_220_A como sonda de doador para análise de curva de fusão (tabela 4). Os ditos iniciadores e sondas também são listados sob as SEQ ID NO's 9 a 12 da listagem de sequências.

[0123] Tabela 4: Lista de iniciadores e sondas usadas para PCR em tempo real.

nome	sequência
LC-NCgl2818_1	CTTGCAGCTGGCGTGATCTC
LC-NCgl2816_2	TGGTTGCGTAAGCAACGATG
NCgl2816_220_C¹	GATACGCTTGCACTCGGGGG
NCgl2816_220_A²	CCTTCAGAGGCATCTTTACCTGCTGGCCGGAATCG

¹ sonda receptora identificada com LC-Red640 na extremidade 5' e fosforilada na extremidade 3' ² sonda doadora identificada com fluoresceína na extremidade 3' [0124] Um dos clones de transconjugante então caracterizado foi denominado DM1933_NCgl2816_F220C. A cultura de estoque de glicerol do clone de transconjugante foi preparada e usada como material de partida para investigações adicionais.

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36/36 [0125] Então, o gene NCgl2816 da cepa DM1933 foi submetido à mutação com o efeito de que o aminoácido fenilalanina na posição 220 da sequência de aminoácidos do polipeptídeo NCgl2816 codificado foi substituído por cisteína.

Exemplo 4

Produção de L-lisina pela cepa DM1933_NCgl2816_F220C [0126] As cepas DM1933 (referência) e DM1933_NCgl2816_F220C obtidas no exemplo 3 foram analisadas quanto à sua habilidade de produzir L-lisina de glicose por cultivo de batelada com o uso de sistema de cultivo de acordo com Wouter Duetz.

[0127] Como meio, CGXII contendo 20 g/l de glicose como fonte de carbono foi usado. As culturas foram incubadas por cerca de 45 h até o consumo completo de glicose como confirmado por análise de glicose com o uso de medidor de glicose no sangue e as concentrações de L-lisina e a densidade óptica OD660 foram determinadas. O resultado do experimento é apresentado na tabela 5.

[0128] Tabela 5: Produção de L-lisina pela cepa DM1933_NCgl2816_F220C.

cepa	L-lisina¹ (g/l)	OD6 6 0
DM1933	3,7	9,5
DM1933_NCgl2816_F220C	4,0	9,0

¹ como L-lisina x HCl

O experimento mostra que a produção de L-lisina foi aumentada na cepa DM1933_NCgl2816_F220C em comparação à cepa principal DM1933.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para a produção fermentativa de L-lisina caracterizado por compreender as etapas de

a) fornecer uma bactéria da espécie Corynebacterium glutamicum, que tem a habilidade de excretar Llisina, contendo em seu cromossomo um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2, em que o aminoácido fenilalanina na posição 220 é substituído por um aminoácido proteinogênico diferente,

b) cultivar a bactéria em um meio adequado sob condições adequadas e

c) acumular a dita L-lisina no meio para formar um caldo de fermentação contendo L-lisina. 2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que, na bactéria, o aminoácido na posição 220 da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2 é cisteína. 3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que, na bactéria, o polinucleotídeo que codifica a dita sequência de

aminoácidos compreende a sequência de nucleotídeos das posições 343 a 1641 da SEQ ID NO:1 com as nucleobases nas posições 1000 a 1002 sendo tgt ou tgc.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que as nucleases nas posições 1000 a 1002 são tgc.

5. Método, de acordo com a reivindicação 2,

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2/2 caracterizado pelo fato de que, na bactéria, o polinucleotídeo que codifica a dita sequência de aminoácidos compreende a sequência de nucleotídeos das

posições 343 a 1644 da SEQ ID NO :1 com as nucleobases nas posições 1000 a 1002 sendo tgt ou tgc. 6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que as nucleases nas posições 1002 a 1004 são tgc. 7. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que, na bactéria, o polinucleotídeo que codifica a dita sequência de

aminoácidos compreende a sequência de nucleotídeos das posições 221 a 1644 da SEQ ID NO:1 com as nucleobases nas posições 1000 a 1002 sendo tgt ou tgc.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que as nucleases nas posições 1000 a 1002 são tgc.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por compreender adicionalmente a fabricação de um produto contendo LLisina a partir do caldo de fermentação.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por compreender adicionalmente extrair ou eliminar substancialmente a água a partir do caldo de fermentação.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a dita fabricação compreende uma etapa de purificação.