CN110951800A - 发酵生产l-赖氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种使用谷氨酸棒杆菌细菌发酵生产L‑赖氨酸的方法，所述细菌具有分泌L‑赖氨酸的能力并在其染色体中含有突变的NCgl2816多核苷酸。
Description
L-赖氨酸用于人类医学，制药工业，食品工业，特别是动物营养。
L-赖氨酸通过谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum，C.glutamicum)菌株的发酵产生。由于重大的经济重要性，在改进生产方法方面正在不断努力。改进可以涉及发酵技术如搅拌和供应氧气，或涉及营养培养基的组成，例如发酵过程中的糖浓度，或涉及将发酵液加工成合适的产品形式例如通过干燥和造粒发酵液或离子交换色谱，或可以涉及微生物本身的固有性能性质。
用于改善这些微生物的性能性质的方法是诱变、突变体的选择和筛选。以这种方式获得的菌株对抗代谢物具有抗性或对于具有调节重要性的代谢物是营养缺陷型并产生L-赖氨酸。重组DNA技术的方法同样已经用于改进产生L-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌菌株多年，通过修饰即增强或减弱参与L-赖氨酸生物合成的各个基因并研究对L-赖氨酸产生的作用(Sanchez等，The Journal of antibiotics(2018)71,26-36；2017年11月1日在线发表)。
各种细菌或谷氨酸棒杆菌菌株的染色体的核苷酸序列和它们的分析已经公开。该信息可在公共可访问的数据库获得并可用于菌株开发目的。一个这样的数据库是NCBI的GenBank数据库(National Center for Biotechnology Information，U.S.NationalLibrary of Medicine 8600 Rockville Pike，Bethesda MD，20894 USA)。
在生物体的测序染色体的注释过程中，鉴定出的结构如基因或编码序列由数据库的信息提供者提供称为locus_tag的唯一标识符。
Ikeda和Nakagawa(Applied Microbiology and Biotechnology 62,99-109(2003))和EP1108790描述了谷氨酸棒杆菌ATCC13032染色体的核苷酸序列及其分析。该信息可在NCBI获取，登记号为NC_003450。在以登录号NC_003450公开的染色体序列中，locus_tag NCgl2816鉴定编码整合膜转运蛋白的核苷酸序列。进一步注释该蛋白质类似于主要促进子超家族的通透酶。多肽的氨基酸序列可以标识符NP_602106.1获得，其中它被描述为整合膜转运蛋白并暂时作为推定的唾液酸转运蛋白。在EP1108790A2中，编码序列以序列3216公开。氨基酸序列在SEQ ID NO：6716公开。此外，EP1108790A2描述了大肠杆菌(Escherichia coli)中的同源基因是编码莽草酸转运蛋白的shiA基因(见EP1108790A2的表1)。
locus_tag NCgl2816的核苷酸序列和EP1108790的序列3216是相同的。
Kalinowski等(Journal of Biotechnology 104(1-3),5-25(2003))独立地描述了谷氨酸棒杆菌ATCC13032染色体的核苷酸序列及其分析。该信息可在NCBI以登录号NC_006958获得。Locus_tag CGTRNA_RS14420鉴定编码描述为MFS转运蛋白的基因产物的核苷酸序列。本领域中也使用old_locus_tag指定cg3226。多肽的氨基酸序列可在标识符WP_011015489下获得，其中临时描述为推定的唾液酸转运蛋白。
locus_tag NCgl2816和CGTRNA_RS14420的核苷酸序列是相同的。
术语“MFS”是“Major Facilitator Superfamily”的缩写。根据NCBI的保守结构域数据库(参见数据库条目cd06174)，该术语表示大量不同组的二级转运蛋白，包括单向转运蛋白，同向转运体和反向转运蛋白，它们促进多种底物跨越细胞质或内膜的转运，包括离子，糖磷酸盐，药物，神经递质，核苷，氨基酸和多肽。Pao等(Microbiology and MolecularBiology Reviews 62(1)，1-34(1998))提供了这组蛋白质的概述。
关于谷氨酸棒杆菌中转录信号的信息例如由old_locus_tag cg3226鉴定的基因的启动子的-10区域或转录起始位点(TSS)可以在Pfeifer-Sancar等(BMC Genomics 14：888(2013))，Albersmeier等(Journal of Biotechnology 257(2017)99-109)或Menz等(BMC Genomics 2013,14：714)中发现。根据这些教导，所述转录信号包含在序列表的SEQID NO：1的221至342位的序列中。
Stansen等(Applied and Environmental Microbiology 71(10)，5920-5928(2005))提供了实验指示，NCgl2816推定地编码乳酸通透酶或推定的转运蛋白，用于将L-乳酸从培养基摄取到细胞中。NCgl2816与编码醌依赖性L-乳酸脱氢酶的IldD基因一起形成NCgl2816-IldD操纵子。有关该操纵子及其表达调控的更多信息可见于Georgi等(Journalof Bacteriology 190(3)，963-971(2008))。
本发明的目的是提供通过谷氨酸棒杆菌细菌发酵生产L-赖氨酸的新措施。
为实现上述目的，本发明提供了一种利用谷氨酸棒杆菌细菌发酵生产L-赖氨酸的新方法，该细菌具有分泌L-赖氨酸的能力，在其染色体中含有编码包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，其中在所述多肽的氨基酸序列的第220位的氨基酸是不同于苯丙氨酸的任何蛋白质氨基酸。
因此，本发明提供了一种发酵生产L-赖氨酸的方法，包括以下步骤：
a)提供具有分泌L-赖氨酸的能力的谷氨酸棒杆菌细菌，在其染色体中含有编码包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，其中第220位的氨基酸苯丙氨酸被不同的蛋白质氨基酸取代，优选被半胱氨酸取代，
b)在合适的条件下在合适的培养基中培养所述细菌，和
c)在培养基中积累L-赖氨酸以形成含L-赖氨酸的发酵液。
SEQ ID NO：2的氨基酸序列，其中第220位的氨基酸苯丙氨酸被半胱氨酸取代，示于SEQ ID NO：4。
发现在本发明的方法中提供的经修饰的细菌在合适的发酵条件下，与未修饰的细菌相比将增加的L-赖氨酸分泌到合适的培养基中。
显然，较高的产物浓度有利于产品制造，例如纯化和分离。增加的产物产量减少了所需的原料量。增加的产物形成速率减少了发酵运行所需的时间，因此增加了给定发酵罐的可用性。
因此，本发明的方法有助于改进L-赖氨酸或含L-赖氨酸产物生产的技术和经济方面。
在一个优选的实施方案中，在本发明的方法中提供的细菌在其染色体中含有编码多肽的氨基酸序列的多核苷酸，所述多核苷酸包含SEQ ID NO：1的343至1641位的核苷酸序列，其中1000至1002位的核碱基是tgt或tgc，优选tgc。
特别优选的是SEQ ID NO：1的343至1641位的核苷酸序列，其中1001位的核碱基是鸟嘌呤(g)。
SEQ ID NO：1的343至1641位的核苷酸序列(1000至1002位核碱基为tgc)与SEQ IDNO：3的343至1641位的核苷酸序列相同。
在另一个优选的实施方案中，在本发明的方法中提供的细菌在其染色体中含有编码多肽的氨基酸序列的多核苷酸，所述多核苷酸包含SEQ ID NO：1的343至1644位的核苷酸序列，其中1000至1002位的核碱基是tgt或tgc，优选tgc。
特别优选的是SEQ ID NO：1的343至1644位的核苷酸序列，其中1001位的核碱基是鸟嘌呤(g)。
SEQ ID NO：1的343至1644位的核苷酸序列(1000至1002位的核碱基为tgc)与SEQID NO：3的343至1644位的核苷酸序列相同。
在另一个优选的实施方案中，在本发明的方法中提供的细菌在其染色体中含有编码多肽的氨基酸序列的多核苷酸，所述多核苷酸包含SEQ ID NO：1的221至1644位的核苷酸序列，其中1000至1002位的核碱基是tgt或tgc，优选tgc。
特别优选的是SEQ ID NO：1的221至1641位的核苷酸序列，其中1001位的核碱基是鸟嘌呤(g)。
SEQ ID NO：1的221至1644位的核苷酸序列(1000至1002位的核碱基为tgc)与SEQID NO：3的221至1644位的核苷酸序列相同。
本文提及的术语L-赖氨酸，特别是在产物形成的背景下，还包括它们的离子形式和盐，例如L-赖氨酸单盐酸盐或L-赖氨酸硫酸盐。
用于本发明方法的合适细菌是谷氨酸棒杆菌的L-赖氨酸分泌菌株，例如自菌株ATCC13032等通过一或几个菌株开发步骤获得并如本发明所述被修饰的L-赖氨酸分泌菌株。
菌株ATCC13032(也可作为DSM20300获得)是谷氨酸棒杆菌的分类学类型菌株。
谷氨酸棒杆菌的L-赖氨酸分泌菌株在本领域中是众所周知的并且可以如本发明所述被修饰。例如，US 7,338,790 B2描述了菌株DM1797。它根据布达佩斯条约以保藏号DSM16833保藏在DSMZ。DM1797是在N'-甲基-N-硝基-亚硝基胍诱变后获得的菌株ATCC13032的氨基乙基半胱氨酸抗性突变株。例如，Blombach等(Applied and EnvironmentalMicrobiology 75(2)，419-427,2009)描述了菌株DM1933(根据布达佩斯条约以保藏号DSM25442保藏)。通过几个菌株开发步骤从ATCC13032获得菌株DM1933。此外，可以使用根据布达佩斯条约以DSM32514保藏的分泌L-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌菌株DM2031。菌株DM2031是DM1933的进一步开发的衍生物，具有增强的L-赖氨酸分泌能力。其他分泌L-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌菌株例如描述于WO2008033001和EP0841395中。
分泌L-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌菌株通常含有编码反馈抗性天冬氨酸激酶多肽变体的多核苷酸。反馈抗性天冬氨酸激酶多肽变体是指天冬氨酸激酶，当与包含在野生型菌株如ATCC13032、ATCC14067和ATCC13869中的野生型酶相比时，其对L-赖氨酸和L-苏氨酸的混合物(例如各为10mM)或L-赖氨酸类似物S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸和L-苏氨酸的混合物(例如50mM S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸和10mM L-苏氨酸)的抑制作用较不敏感或脱敏。天冬氨酸激酶的EC编号为EC 2.7.2.4。编码反馈抗性天冬氨酸激酶多肽变体的谷氨酸棒杆菌的多核苷酸的描述例如在US5688671、US6844176和US6893848中给出。总结列表尤其可以在WO2009141330中找到。本领域中用于编码天冬氨酸激酶多肽的基因的符号是lysC。在基因编码反馈抗性多肽变体的情况下，本领域通常使用像lysCfbr的符号，其中fbr表示反馈抗性。
因此，如本发明所述被修饰的谷氨酸棒杆菌物种的所述L-赖氨酸分泌菌株优选含有编码反馈抗性天冬氨酸激酶多肽的多核苷酸的至少一个拷贝。
SEQ ID NO：5显示了菌株ATCC13032的天冬氨酸激酶多肽的编码序列的核苷酸序列，SEQ ID NO：6显示了编码多肽的氨基酸序列。本领域已知(参见US6893848)，SEQ ID NO：6的311位氨基酸Thr交换为Ile赋予所述酶对L-赖氨酸和L-苏氨酸混合物抑制的反馈抗性。
因此，优选所述反馈抗性天冬氨酸激酶多肽的氨基酸序列包含在311位含有异亮氨酸的SEQ ID NO：6的氨基酸序列。
该氨基酸交换可以通过将在SEQ ID NO：5的932位的核碱基胞嘧啶(c)交换为胸腺嘧啶(t)来实现。因此，苏氨酸的acc密码子被改变为异亮氨酸的atc密码子。
本领域进一步已知，用于天冬氨酸激酶多肽的编码序列的gtg起始密码子交换为atg增强了所述多肽的表达(参见例如EP2796555)。
因此，优选编码反馈抗性天冬氨酸激酶多肽的序列以atg起始密码子开始。
术语DSM表示位于德国Braunschweig的保藏机构Deutsche Sammlung fürMikroorganismen und Zellkulturen。术语ATCC表示位于美国佛吉尼亚州Manasass的保藏机构美国典型培养物保藏中心。
对于多核苷酸和多肽的序列分析，可以使用例如序列比对Clustal W程序(Larkin等：Clustal W and Clustal X version 2.0.In:Bioinformatics 23,2,947-2948(2007))或公共软件如CLC Genomics Workbench(Qiagen，Hilden，Germany)或由欧洲生物信息学研究所(EMBL-EBI，Hinxton，UK)提供的程序MUSCLE。
谷氨酸棒杆菌，特别是菌株ATCC13032和在菌株开发程序期间由其获得的L-赖氨酸分泌菌株，在其染色体中含有、特别是含有一个编码包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的基因。所述多肽的功能广泛地描述为本领域的MFS转运蛋白。编码序列显示在SEQ IDNO：1第343至1641位。编码序列可含有不改变所述多肽氨基酸序列的沉默突变。这在本领域也称为遗传密码的简并性。
在本发明的工作期间，发现通过将SEQ ID NO：2中所示多肽的编码氨基酸序列的第220位氨基酸苯丙氨酸交换为不同蛋白质氨基酸、优选半胱氨酸来修饰谷氨酸棒杆菌物种的L-赖氨酸分泌细菌，与未修饰的细菌相比，在发酵过程中增加了它们分泌L-赖氨酸的能力。
本领域技术人员知道许多如何在谷氨酸棒杆菌中实现所述修饰的诱变方法。
突变细菌可以使用诱变物质例如N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍或紫外光，通过用谷氨酸棒杆菌菌株的细胞群进行的经典体内诱变来获得。
可以使用选自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的引物通过PCR扩增包含基因内诱变位点的核苷酸序列。通过对PCR产物测序，鉴定出所需的突变体。关于该方法的细节尤其可以在US7754446中找到。与FRET杂交探针组合的实时PCR也可用于突变检测。术语FRET是荧光共振能量转移的缩写。Cyril D S Mamotte(The Clinical Biochemist Reviews 27,63-75(2006))综述了使用该方法鉴定单核苷酸取代。关于该方法的进一步总结可以在JocelynE.Krebs，Elliott S.Goldstein和Stephan T.Kilpatrick(Jones and BartlettPublishers，US，2018)的教科书Lewin's Genes XII中或本领域其他地方找到。
另一种突变谷氨酸棒杆菌基因的常用方法是
等(Gene 145,69-73(1994))描述的基因置换方法。
Peters-Wendisch等(Microbiology 144,915-927(1998))使用所述基因置换方法失活编码丙酮酸羧化酶的谷氨酸棒杆菌的pyc基因。在US7585650中，该方法应用于zwf基因以实现葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的Zwf亚基的氨基酸序列的321位的氨基酸交换。在US7754446中，该方法应用于rel基因以实现GTP-焦磷酸激酶多肽的氨基酸序列的38位的氨基酸交换。
在所述基因置换方法中，通过包含所研究基因的核苷酸序列或其含有突变的部分的分离的多核苷酸提供突变，例如至少一个核碱基的缺失、插入或取代。
在本发明的上下文中，所研究基因的核苷酸序列是由NCgl2816鉴定的基因。
在本发明的上下文中，突变是位于密码子中的至少一个核碱基的取代，所述密码子指定所述多肽的编码氨基酸序列(见SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)的第220位的氨基酸苯丙氨酸。
作为所述突变的结果，所述密码子指定了不同于苯丙氨酸的蛋白质氨基酸，优选半胱氨酸。指定半胱氨酸的密码子是tgt或tgc。优选密码子tgc。
220位氨基酸的密码子在SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3中具有1000至1002的位置。1000至1002位的核苷酸序列，特别是1001位的核苷酸，也可称为突变位点。
所研究基因的突变核苷酸序列或其含有突变的部分包含i)突变位点5'末端的核苷酸序列，其在本领域中也称为5'侧翼序列或上游序列，ii)突变位点3'末端的核苷酸序列，其在本领域中也称为3'-侧翼序列或下游序列，和iii)在i)和ii)之间的突变位点的核苷酸序列。
同源重组所需的这些5'-侧翼序列和3'-侧翼序列通常具有至少200bp、至少400bp、至少600bp或至少800bp的长度。最大长度通常为1000bp、1500bp或2000bp。
在本发明的上下文中包含突变核苷酸序列的多核苷酸的实例显示在SEQ ID NO：7中。SEQ ID NO：7的10至1610位的核苷酸序列对应于SEQ ID NO：3的201至1801位。SEQ IDNO：7中所示的多核苷酸在其5'和3'末端含有可用于克隆目的限制性内切核酸酶的识别位点。SEQ ID NO：7含有本发明中描述的NCgl2816多肽的变体的编码序列。5'-侧翼序列由SEQID NO：7的10至809位的核苷酸序列组成。3'-侧翼序列由SEQ ID NO：7的811至1610位的核苷酸序列组成。突变位点位于SEQ ID NO：7的810位。
将提供的突变的核苷酸序列克隆到质粒载体，例如由
等(Gene 145,69-73(1994))所述的pK18mobsacB，其不能在谷氨酸棒杆菌中自主复制。随后通过使用电穿孔或接合的转化将包含所述突变的核苷酸序列的该质粒载体转移到所需的谷氨酸棒杆菌菌株中。在两个同源重组事件(包括由质粒载体提供的5'-侧翼序列与谷氨酸棒杆菌染色体的同源序列的重组事件和由质粒载体提供的3'-侧翼序列和谷氨酸棒杆菌染色体的同源序列的重组事件)之后，一个影响整合和一个影响质粒载体的切除，所述突变被掺入谷氨酸棒杆菌染色体中。因此，包含在所述所需菌株染色体中的所研究基因的核苷酸序列被所述突变的核苷酸序列置换。
同源重组事件也可称为交叉。
优选地，为本发明方法提供的分泌L-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌菌株具有在合适条件下在合适培养基中分泌≥0.25g/l、优选≥0.5g/l、特别优选≥1.0g/l、非常特别优选≥2.0g/l的L-赖氨酸的能力。
在本发明的发酵方法中，根据本发明修饰并具有分泌L-赖氨酸能力的谷氨酸棒杆菌在合适条件下在合适培养基中培养。由于分泌L-赖氨酸的能力，在发酵过程中培养基中L-赖氨酸的浓度增加并积累，从而产生L-赖氨酸。
用于通过发酵方法生产L-赖氨酸的合适培养基含有碳源，氮源，磷源，无机离子和其他所需的有机化合物。
合适的碳源包括葡萄糖，果糖，蔗糖以及相应原料如淀粉水解产物，糖蜜或高果糖玉米糖浆。
作为氮源，可以使用有机含氮化合物如蛋白胨，肉提取物，大豆水解产物或尿素，或无机化合物如硫酸铵，氯化铵，磷酸铵，碳酸铵，硝酸铵，铵气或氨水。
作为磷源，可以使用磷酸，磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠盐。
无机离子如钾、钠、镁、钙、铁和其他微量元素等以硫酸、磷酸或盐酸的盐提供。
其他有机化合物指必需的生长因子如维生素，例如硫胺素或生物素或L-氨基酸例如L-高丝氨酸。
培养基组分可以以单批的形式加入培养物中，或者在培养过程中以合适方式补料。
在发酵过程中，可以通过以合适方式使用碱性化合物如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水或酸性化合物如磷酸或硫酸来控制培养物的pH。通常将pH调节至6.0至8.5，优选6.5至8.0。为控制发泡，可以使用消泡剂，例如脂肪酸聚乙二醇酯。为保持质粒的稳定性，可以向培养基中加入合适的选择性物质，例如抗生素。发酵过程优选在需氧条件下进行。为维持这些条件，将氧气或含氧气体混合物(例如空气)引入培养物中。在适当的情况下，在升高的压力下，例如在0.03-0.2MPa的高压下进行发酵过程。培养温度通常为25℃至40℃，优选30℃至37℃。在不连续方法中，继续培养直至形成足以回收的L-赖氨酸的量。然后完成培养。这个目标通常在10小时到160小时内完成。在连续方法中，可以延长培养时间。
因此，发酵过程产生含有所需L-赖氨酸的发酵液。
然后从发酵液中回收或制备液体或固体的含有L-赖氨酸的产物。“发酵液”是指其中本发明所述的谷氨酸棒杆菌在某些条件下已培养一定时间的培养基。
当发酵过程完成时，所得的发酵液相应地包含：
a)本发明的谷氨酸棒杆菌的生物量(细胞质量)，
所述生物量是由于所述谷氨酸棒杆菌细胞的繁殖而产生的
b)在发酵过程中积累的所需L-赖氨酸，
c)在发酵过程中积累的有机副产物，和
d)所使用的培养基在发酵过程未被消耗的成分。
有机副产物包括，除了产生L-赖氨酸之外，可以在发酵过程中由本发明的谷氨酸棒杆菌形成的化合物。
将发酵液从培养容器或发酵罐中取出，在适当时收集，并用于提供液体或固体形式的含有L-赖氨酸的产物。表述“回收含L-赖氨酸的产物”也用于此。在最简单的情况下，已从发酵罐中取出的含L-赖氨酸发酵液本身构成回收的产物。
随后可以对发酵液进行以下一个或多个处理步骤：
a)部分(>0％至<80％)至完全(100％)或几乎完全(≥80％，≥90％，≥95％，≥96％，≥97％，≥98％，≥99％)去除水，
b)部分(>0％至<80％)至完全(100％)或几乎完全(≥80％，≥90％，≥95％，≥96％，≥97％，≥98％，≥99％)去除生物量，后者任选在去除前被失活，
c)部分(>0％至<80％)至完全(100％)或几乎完全(≥80％，≥90％，≥95％，≥96％，≥97％，≥98％，≥99％，≥99.3％，≥99.7％)去除在发酵过程中形成的有机副产物，和
d)部分(>0％至<80％)至完全(100％)或几乎完全(≥80％，≥90％，≥95％，≥96％，≥97％，≥98％，≥99％，≥99.3％，≥99.7％)分别去除在发酵过程中未被消耗的所用培养基的残余组分或残留的输入材料。
除去水(措施a))尤其可以通过蒸发(使用例如降膜蒸发器)、通过反渗透或纳米过滤来实现。由此获得的浓缩物可以通过喷雾干燥或喷雾造粒进一步后处理。同样可以使用喷雾干燥或喷雾造粒直接干燥发酵液。
因此，本发明的方法包括从所述发酵液提取或基本上除去水。特别地，从发酵液提取至少40％(w/w)、优选至少90％(w/w)、更优选至少95％(w/w)的水。
除去生物质(措施b))尤其可以通过离心、过滤或倾析或其组合来实现。
去除有机副产物(措施c)或除去培养基的残余组分(措施d)尤其可以通过层析法例如离子交换层析、用活性炭处理或结晶来实现。如果有机副产物或培养基的残余组分作为固体存在于发酵液中，则可通过措施b)除去它们。
因此，本发明的L-赖氨酸产物的制备可以进一步包括纯化步骤，优选选自离子交换层析、用活性炭处理或结晶。
因此，可以获得例如含有L-赖氨酸×HCl、优选含有≥80％的L-赖氨酸×HCl、特别优选≥90％的L-赖氨酸×HCl或≥95％的L-赖氨酸×HCl的产物。
因此，实现了L-赖氨酸的浓缩或纯化并提供了具有所需L-赖氨酸含量的产物。
分析L-赖氨酸以确定其在发酵过程中的一或多个时间的浓度可以通过离子交换层析法、优选阳离子交换层析法分离L-赖氨酸，随后使用茚三酮进行柱后衍生化来进行，如Spackman等(Analytical Chemistry 30：1190-1206(1958))所述。也可以使用邻苯二甲醛而不是茚三酮进行柱后衍生化。关于离子交换层析的概述文章可以在Pickering(LC.GC(Magazine of Chromatographic Science 7(6)：484-487(1989))中找到。同样可以进行柱前衍生化，例如使用邻苯二甲醛或异硫氰酸苯酯，并通过反相层析法(RP)、优选以高效液相层析法(HPLC)的形式分级分离所得氨基酸衍生物。这种类型的方法描述于例如Lindroth等(Analytical Chemistry 51：1167-1174(1979))。通过光度法(吸收，荧光)进行检测。关于氨基酸分析的综述尤其可以在Lottspeich和Zorbas的教科书“Bioanalytik”(SpektrumAkademischer Verlag，Heidelberg，Germany 1998)中找到。
实验部分
A)材料和方法
本文简要描述了所用的分子生物学试剂盒，引物和化学品以及所应用方法的一些细节。
1.抗生素和化学品
a.卡那霉素：来自Sigma Aldrich的来自Streptomyces kanamyceticus的卡那霉素溶液(St.Louis，USA，目录号K0254)。
a.萘啶酸：来自Sigma Aldrich的萘啶酸钠盐(St.Louis，USA，目录号N4382)。
b.如果没有另外说明，所有化学品均是购自Merck(Darmstadt，Germany)，SigmaAldrich(St.Louis，USA)或Carl-Roth(Karlsruhe，Germany)的分析纯。
2.培养
如果没有另外说明，所有培养/温育程序如下进行：
c.来自Merck(Darmstadt，Germany；目录号110285)的LB肉汤(MILLER)用于在液体培养基中培养大肠杆菌菌株。将液体培养物(10ml液体培养基/100ml有3个挡板的Erlenmeyer烧瓶)在Infors GmbH(Einsbach，Germany)的Infors HT Multitron标准培养箱振荡器中于37℃和200rpm温育。
d.来自Merck(Darmstadt，Germany，目录号110283)的LB琼脂(MILLER)用于在琼脂平板上培养大肠杆菌菌株。将琼脂平板在37℃在来自VWR(Radnor，USA)的INCU-
小型培养箱中温育。
e.来自Merck(Darmstadt，Germany；目录号110493)的脑心脏输注肉汤(BHI)用于在液体培养基中培养谷氨酸棒杆菌菌株。将液体培养物(10ml液体培养基/100ml有3个挡板的Erlenmeyer烧瓶)在Infors GmbH(Einsbach，Germany)的Infors HT Multitron标准培养箱振荡器中于33℃和200rpm温育。
f.来自Merck(Darmstadt，Germany；目录号113825)的脑心琼脂(BHI-agar)用于在琼脂平板上培养谷氨酸棒杆菌菌株。将琼脂平板在33℃在来自Heraeus Instruments的具有
温度控制器(Hanau，Germany)的培养箱中温育。
3.确定光密度
a.使用来自Eppendorf AG(Hamburg，Germany)的BioPhotometer在600nm(OD600)测定摇瓶培养物中细菌悬浮液的光密度。
b.使用来自Tecan Group AG(
Switzerland)的GENiosTM读板仪在660nm(OD660)测定在Wouter Duetz(WDS)微发酵系统(24孔板)中产生的细菌悬浮液的光密度。
4.离心
a.台式离心机用于体积最多2ml的反应管
使用Eppendorf 5417R离心机(5分钟，13,000rpm)，使用1ml或2ml反应管(例如Eppendorf 
3810X)使最大体积为2ml的细菌悬浮液沉淀。
b.台式离心机用于体积最多50ml的试管
使用Eppendorf 5810R离心机，使用15ml或50ml离心管(例如FalconTM 50ml锥形离心管)在4000转/分钟离心10分钟使最大体积为50ml的细菌悬浮液沉淀。
5.使用FRET检测突变
通过实时PCR结合FRET杂交探针检测给定突变例如核碱基交换的存在。术语FRET是荧光共振能量转移的缩写。作为实时PCR仪器，使用来自Roche 
的Lightcycler(见下文)。
这种方法是例如由M.J.Lay和C.T.Wittwer(Clinical Chemistry 42(12)，2262-2267(1997))用于因子V Leiden的基因分型。Cyril DS Mamotte(The ClinicalBiochemist Reviews 27,63-75(2006)综述了使用这种方法进行单核苷酸取代的基因分型。有关这种方法的总结可以在教科书Jocelyn E.Krebs，Elliott S.Goldstein和StephanT.Kilpatrick的Lewin's Genes XII(Jones and Bartlett Publishers,US,2018)，W.Edward Highsmith的Molecular Diagnostics,12 Tests that changed everything(Humana Press,Springer,New York,2014)或本领域其他地方中找到。
FRET杂交供体探针用荧光染料荧光素标记，受体探针用荧光染料LC-Red640标记。实质上，检测方法包括三个步骤：菌落PCR，探针杂交和随后的解链曲线分析。该方法简称为实时PCR。
a.引物和探针
使用的寡核苷酸由eurofins genomics GmbH(Ebersberg，Germany)合成。
b.模板
作为PCR模板，使用菌落中含有的总DNA。它是通过将用牙签从琼脂平板上菌落取得细胞材料并将细胞材料直接放入PCR反应管中而制备的。将细胞材料用来自SEVERIN
GmbH(Sundern，Germany)的微波炉型Mikrowave&Grill以800W加热10秒，然后将PCR试剂加入到PCR反应管中的模板中。
b.反应混合物
来自Qiagen(Hilden，Germany，目录号206045)的Type-
Fast SNP探针PCR试剂盒(Type-it试剂盒)用于突变的实时检测。因此，将2.5μl的Qiagen Fast SNP Puffer(2x)与0.5μl的每种LC-PCR-引物[10μM]和0.5μl的每种1:500稀释的受体和供体探针[100pmol/μl]混合以获得实时PCR的反应混合物(mastermix)。
表1：使用
(步骤1-3)进行PCR的热循环条件和解链曲线分析(步骤4-6)。
c.PCR循环仪
反应在Roche Diagnostics(Rotkreuz，Switzerland)的
2.0仪器中进行并用
软件4.1分析。
6.大肠杆菌的化学转化
大肠杆菌K-12菌株S17-1用作供体，用于基于pK18mobsacB的质粒从大肠杆菌接合转移到谷氨酸棒杆菌。Simon，R等(Bio/Technology 1,784-794,1983)描述了菌株S17-1。它可从美国典型培养物保藏中心获得，保藏号为ATCC47055。
化学感受态大肠杆菌S17-1细胞如下制备：用100μl菌株S17-1的细菌悬浮液接种10ml LB培养基(10ml液体培养基/100ml含3个挡板的Erlenmeyer烧瓶)的预培养物，并将培养物在37℃和250rpm温育过夜约18h。用300μl预培养物接种主培养物(70ml LB/具有3个挡板的250ml Erlenmeyer烧瓶)并在37℃温育至OD600为0.5-0.8。将培养物在4℃和4000rpm离心6分钟，弃去上清。将细胞沉淀重悬于20ml无菌冰冷的50mM CaCl2溶液中并在冰上温育30分钟。在另一次离心步骤后，将沉淀重悬于5ml冰冷的50mM CaCl2溶液中并将悬浮液在兵上温育30分钟。然后将细胞悬浮液用85％(v/v)无菌冰冷甘油调节至终浓度为20％甘油(v/v)。将悬浮液分成50μl等分试样并储存在-80℃。
为转化S17-1细胞，使用热休克45秒的Tang等(Nucleic Acids Res.22(14),2857-2858,1994)的方案。
7.谷氨酸棒杆菌的接合
谷氨酸棒杆菌菌株的液体培养物在BHI培养基中于33℃进行。热休克在48.5℃进行9分钟。通过将接合批次铺板在补充有25mg/l卡那霉素和50mg/l萘啶酸的EM8琼脂(表2)上来选择转接合子。将EM8琼脂平板在33℃温育72小时。
表2：EM8琼脂的组成
使用无菌牙签将转接合子转移到BHI琼脂上，该琼脂补充有25mg/l卡那霉素和50mg/l萘啶酸。将琼脂平板在33℃温育20小时。然后将以这种方式产生的各个转接合子的培养物在33℃在含有具有3个挡板的100ml Erlenmeyer烧瓶中的10ml BHI培养基中进一步繁殖24小时。从适当稀释的液体培养物中取出等分试样并在BHI琼脂上铺板(通常100至200μl)，所述BHI琼脂补充有10％蔗糖。将琼脂平板在33℃温育48小时。然后检查在含有蔗糖的琼脂平板上生长的菌落的卡那霉素敏感性表型。为此，使用牙签从菌落中取出细胞材料并将其转移到含有25mg/l卡那霉素的BHI琼脂上并转移到含有10％蔗糖的BHI琼脂上。将琼脂平板在33℃温育60小时。通过实时PCR检测证明对卡那霉素敏感并对蔗糖具有抗性的克隆的所需DNA片段的整合。
8.大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌菌株的甘油储液
对于大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌菌株的长时间储存，制备甘油储液。将选择的大肠杆菌克隆在补充有2g/l葡萄糖的10ml LB培养基中培养。选择的谷氨酸棒杆菌克隆在补充有2g/l葡萄糖的两倍浓缩BHI培养基中培养。含有大肠杆菌菌株的质粒培养物补充50mg/l卡那霉素。含有谷氨酸棒杆菌菌株的质粒培养物补充25mg/l卡那霉素。将培养基装在含有3个挡板的100ml Erlenmeyer烧瓶中。用取自菌落的一环细胞接种并将培养物培养约18小时，在大肠杆菌的情况是在37℃和200rpm，在谷氨酸棒杆菌的情况是在33℃和200rpm。在所述温育期后，向培养物中加入1.2ml 85％(v/v)无菌甘油。然后将获得的含甘油的细胞悬浮液等分成2ml并储存在-80℃。
9.根据Wouter Duetz(WDS)的培养系统
根据Duetz(Trends Microbiol.2007；15(10)：469-75)的毫升级培养系统用于研究构建的谷氨酸棒杆菌菌株的性能。为此目的，使用来自EnzyScreen BV(Heemstede，Netherlands；目录号CR1424)的填充有2.5mL培养基的24孔深孔微平板(24孔WDS板)。
菌株的预培养在10ml两倍浓缩的BHI培养基中进行。将培养基装入带有3个挡板的100ml Erlenmeyer烧瓶中。用100μl甘油储液培养物接种并将培养物在33℃和200rpm温育24小时。
在所述温育期后，测定预培养物的光密度OD600。
通过用等份预培养物接种含有2.5ml培养基的24孔WDS-平板的孔制备主要培养物，得到光密度OD600为0.1。
使用Keilhauer等(J.Bacteriol.1993 Sep；175(17):5595-5603)描述的用于主要培养物CGXII培养基的培养基。为方便起见，CGXII培养基的组成示于表3。
表3：Keilhauer的CGXII培养基的组成。
| 成分 | 浓度(g/l) |
| MOPS(3-(N-吗啉)丙磺酸) | 42 |
| (NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub> | 20 |
| 尿素 | 5 |
| KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> | 1 |
| K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> | 1 |
| MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O | 0.25 |
| CaCl<sub>2</sub> | 0.01 |
| FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O | 0.01 |
| MnSO<sub>4</sub> H<sub>2</sub>O | 0.01 |
| ZnSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O | 0.001 |
| CuSO<sub>4</sub>·5H<sub>2</sub>O | 0.0002 |
| NiCl<sub>2</sub> 6H<sub>2</sub>O | 0.00002 |
| 生物素(无菌过滤的) | 0.0002 |
| 原儿茶酸(无菌过滤的) | 0.03 |
| 碳源(无菌过滤的) | 如所需 |
| 用NaOH调节pH至7 |
将这些主要培养物在33℃和300rpm在Infors GmbH(Bottmingen，Switzerland)的Infors HT Multitron标准培养箱振荡器中温育约45小时，直至完全消耗葡萄糖。
用LifeScan(Johnson&Johnson Medical GmbH，Neuss，Germany)的血糖仪OneTouch 
分析悬浮液中的葡萄糖浓度。
培养后，将培养悬浮液转移到深孔微量培养板中。适当稀释一部分培养悬浮液以测量OD600。将培养物的另一部分离心并在上清液中分析L-氨基酸、特别是L-赖氨酸和残余葡萄糖的浓度。
10.氨基酸分析仪
使用来自SYKAM Vertriebs GmbH(Fürstenfeldbruck，Germany)的SYKAM S433氨基酸分析仪通过离子交换层析法测定培养上清液中L-赖氨酸和其它L-氨基酸的浓度。作为固相，使用来自SYKAM的具有球形的聚苯乙烯基阳离子交换剂(Peek LCA N04/Na，尺寸150×4.6mm)的柱。取决于L-氨基酸，使用缓冲液A和B的混合物进行等度运行以进行洗脱或使用所述缓冲液通过梯度洗脱进行分离。作为缓冲液A，使用含有20l 263g柠檬酸三钠，120g柠檬酸，1100ml甲醇，100ml 37％HCl和2ml辛酸(最终pH3.5)的水溶液。作为缓冲液B，使用含有20l 392g柠檬酸三钠，100g硼酸和2ml辛酸(最终pH10.2)的水溶液。通过柱后衍生化用茚三酮对游离氨基酸着色并在570nm光度检测。
11.用连续流动系统(CFS)测定葡萄糖
使用来自SKALAR analytic GmbH(Erkelenz，Germany)的SANplus多通道连续流动分析仪测定上清液中葡萄糖的浓度。通过NADH形成用偶联酶测定(己糖激酶/葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶)检测葡萄糖。
B)实验结果
实施例1
谷氨酸棒杆菌菌株DM1933的NCgl2816基因的序列
菌株DM1933是Blombach等(Applied and Environmental Microbiology 75(2),419-427,2009)描述的L-赖氨酸生产菌。它根据布达佩斯条约以保藏号DSM25442保藏在DSMZ。
通过Illumina全基因组测序技术(Illumina Inc.,San Diego,CA,US)测定菌株DM1933染色体的核苷酸序列。发现包含其上游和下游核苷酸序列的菌株DM1933的NCgl2816编码序列的核苷酸序列与SEQ ID NO：1所示的ATCC13032的核苷酸序列相同。
DM1933在其染色体中含有编码反馈抗性天冬氨酸激酶多肽的天冬氨酸激酶基因的变体。所述反馈抗性天冬氨酸激酶多肽具有序列表SEQ ID NO：6的氨基酸序列，其中氨基酸序列第311位的氨基酸苏氨酸(Thr)被异亮氨酸(Ile)置换。在US 7,338,790中，缩写“lysC T311I”用于表示所述交换。Blombach等使用缩写“lysC(T311I)”。
实施例2
构建质粒pK18mobsacB_NCgl2816_F220C
构建质粒pK18mobsacB_NCgl2816_F220C以使得能够将导致氨基酸交换F220C的突变掺入菌株DM1933的NCgl2816编码序列的核苷酸序列中。该质粒基于
等(Gene145,69-73,1994)描述的可移动载体pK18mobsacB。为构建pK18mobsacB_NCgl2816_F220C，合成根据SEQ ID NO：7的NCgl2816_F220C序列并通过GeneArt(ThermoFisher Scientific(Waltham，USA))将其亚克隆到pK18mobsacB中。
为组装质粒pK18mobsacB_NCgl2816_F220C，将两个多核苷酸，即用XbaI切割的载体pK18mobsacB和合成的并用XbaI消化的多核苷酸NCgl2816_F220C连接并通过GeneArt(ThermoFisher Scientific(Waltham，USA))转化大肠杆菌。
实施例3
构建菌株DM1933_NCgl2816_F220C
使用实施例2中获得的质粒pK18mobsacB_NCgl2816_F220C将导致氨基酸交换F220C(参见SEQ ID NO：7的核苷酸位置810)的突变掺入L-赖氨酸生产菌DM1933的染色体中。
用pK18mobsacB_NCgl2816_F220C的质粒DNA转化大肠杆菌菌株S17-1的化学感受态细胞。材料和方法中所述的
等(Journal of Bacteriology 172,1663-1666,1990)的改良接合方法用于接合转移到菌株DM1933中并且通过它们的蔗糖抗性和卡那霉素敏感性表型选择转接合子克隆。
通过实时PCR分析转接合子克隆，使用Type-it试剂盒和引物LC-NCgl2818_1和LC-NCgl2816_2用于PCR扩增并使用NCgl2816_220_C作为受体探针和NCgl2816_220_A作为供体探针进行解链曲线分析(表4)。所述引物和探针也列于序列表的SEQ ID NO：9-12中。
表4：用于实时PCR的引物和探针列表。
1受体探针，在5'末端用LC-Red640标记并在3'末端磷酸化
2供体探针，在3'末端用荧光素标记
如此表征的一个转接合子克隆称为DM1933_NCgl2816_F220C。制备所述转接合子克隆的甘油储液培养物并用作进一步研究的起始材料。
因此，菌株DM1933的NCgl2816基因被突变，其中编码的NCgl2816多肽的氨基酸序列的第220位氨基酸苯丙氨酸被半胱氨酸置换。
实施例4
菌株DM1933_NCgl2816_F220C的L-赖氨酸生产
使用根据Wouter Duetz的培养系统，通过分批培养分析菌株DM1933(参考)和实施例3中获得的DM1933_NCgl2816_F220C从葡萄糖产生L-赖氨酸的能力。
使用含有20g/l葡萄糖作为碳源的培养基CGXII。将培养物温育45小时直至完全消耗葡萄糖，如通过使用血糖仪的葡萄糖分析所确认的，并测定L-赖氨酸的浓度和光密度OD660。实验结果如表5所示。
表5：菌株DM1933_NCgl2816_F220C的L-赖氨酸生产。
| 菌株 | L-赖氨酸<sup>1</sup>(g/l) | OD660 |
| DM1933 | 3.7 | 9.5 |
| DM1933_NCgl2816_F220C | 4.0 | 9.0 |
1为L-赖氨酸x HCl
该实验显示，与亲本菌株DM1933相比，菌株DM1933_NCgl2816_F220C中L-赖氨酸的产生增加。
序列表
<110> 赢创德固赛有限公司
<120> 发酵生产L-赖氨酸的方法
<130> file: 201800249
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2001
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032
<220>
<221> misc_feature
<222> (221)..(221)
<223> position 221
<220>
<221> CDS
<222> (343)..(1641)
<223> coding sequence of NCgl2816
<220>
<221> misc_feature
<222> (1000)..(1002)
<223> ttc codon for phenylalanine
<220>
<221> misc_feature
<222> (1001)..(1001)
<223> nucleobase thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (1642)..(1644)
<223> taa stop codon
<400> 1
gccaccaggg attgggccgt acgattcaac gctctcatgg ccattcacgg tcacctacat 60
attcctgccg aaacccgcgt tgatggggta agccacgtgg aggtttcttt gggttacccc 120
tttgaaaaac acccacctca catgaagcgt ccgtggccgt ttccggtcat gcagattaac 180
taactctgtt gcttaaatgg gggtaattgg attcgactgt tttccacacc ccattgacaa 240
ttaaaggtga cacgccttac attcttgtgg tctgaccatg aggttgggcc aatcggtttc 300
agcccgttta ctcccgccgt ccgtttcaga gaagaggtca cc atg aca acc gca 354
Met Thr Thr Ala
1
gta gat caa aac tca ccg ccc aag cag caa ctc aac aag cgc gtc ctg 402
Val Asp Gln Asn Ser Pro Pro Lys Gln Gln Leu Asn Lys Arg Val Leu
5 10 15 20
ctg ggc agc ttg agt ggc agc gtt atc gaa tgg ttc gac ttc ctg gtt 450
Leu Gly Ser Leu Ser Gly Ser Val Ile Glu Trp Phe Asp Phe Leu Val
25 30 35
tac gga acc gtc gcc gcg ctg gtc ttc aac aag atg tac ttc ccc agc 498
Tyr Gly Thr Val Ala Ala Leu Val Phe Asn Lys Met Tyr Phe Pro Ser
40 45 50
ggc aac gag ttc ctc tcc aca atc ctg gcg tac gca tcc ttc tcc ctg 546
Gly Asn Glu Phe Leu Ser Thr Ile Leu Ala Tyr Ala Ser Phe Ser Leu
55 60 65
acc ttc ttc ttc cgc ccc att ggt ggc gtc atc ttc gcc cac atc ggc 594
Thr Phe Phe Phe Arg Pro Ile Gly Gly Val Ile Phe Ala His Ile Gly
70 75 80
gac cgc att ggg cgt aag aag acc ctg ttc atc acc ttg atg ctc atg 642
Asp Arg Ile Gly Arg Lys Lys Thr Leu Phe Ile Thr Leu Met Leu Met
85 90 95 100
ggt ggc ggc acc gtc gcc att ggt ttg ctg ccc gac tac aac gcc atc 690
Gly Gly Gly Thr Val Ala Ile Gly Leu Leu Pro Asp Tyr Asn Ala Ile
105 110 115
ggc att tgg gca cca atc ctt ctg atg ttc ctc cgc att ttg cag ggc 738
Gly Ile Trp Ala Pro Ile Leu Leu Met Phe Leu Arg Ile Leu Gln Gly
120 125 130
atc gga att ggc ggc gaa tgg ggt ggc gca ctg ctc ctg gca tac gaa 786
Ile Gly Ile Gly Gly Glu Trp Gly Gly Ala Leu Leu Leu Ala Tyr Glu
135 140 145
tac gct cca aag aag cag cgt ggg ctc tac ggc gca gtt cct caa atg 834
Tyr Ala Pro Lys Lys Gln Arg Gly Leu Tyr Gly Ala Val Pro Gln Met
150 155 160
ggc att tcc ctg ggc atg ctg ctt gca gct ggc gtg atc tct ctg ctc 882
Gly Ile Ser Leu Gly Met Leu Leu Ala Ala Gly Val Ile Ser Leu Leu
165 170 175 180
acc ctc atg ccg gaa gat cag ttc ctc acc tgg ggc tgg cgc atc cca 930
Thr Leu Met Pro Glu Asp Gln Phe Leu Thr Trp Gly Trp Arg Ile Pro
185 190 195
ttc gtc gga tcc atc ctc cta gtg ttc atc ggc ctg ttc atc cga aac 978
Phe Val Gly Ser Ile Leu Leu Val Phe Ile Gly Leu Phe Ile Arg Asn
200 205 210
ggc ctt gat gaa acc ccc gag ttc aag cgt atc cgc gat tcc ggc cag 1026
Gly Leu Asp Glu Thr Pro Glu Phe Lys Arg Ile Arg Asp Ser Gly Gln
215 220 225
cag gta aag atg cct ctg aag gaa gtt ctg acc aag tac tgg cca gcc 1074
Gln Val Lys Met Pro Leu Lys Glu Val Leu Thr Lys Tyr Trp Pro Ala
230 235 240
gtt ctg gtc tcc atc ggc gca aaa gct gcc gag acc ggc ccc ttc tac 1122
Val Leu Val Ser Ile Gly Ala Lys Ala Ala Glu Thr Gly Pro Phe Tyr
245 250 255 260
atc ttc ggc acc tac atc gtt gct tac gca acc aac ttc ctg aac atc 1170
Ile Phe Gly Thr Tyr Ile Val Ala Tyr Ala Thr Asn Phe Leu Asn Ile
265 270 275
cgc gac aac att gtc ctt ctg gca gtt gct tgc gcc gcc ctc gtt gcc 1218
Arg Asp Asn Ile Val Leu Leu Ala Val Ala Cys Ala Ala Leu Val Ala
280 285 290
acc atc tgg atg cca ctg ttc gga tcc ttc tcc gac cgc gtc aac cgt 1266
Thr Ile Trp Met Pro Leu Phe Gly Ser Phe Ser Asp Arg Val Asn Arg
295 300 305
gca gtg ctc tac agg atc tgt gca tcc gca acc atc gtg ctg att gtc 1314
Ala Val Leu Tyr Arg Ile Cys Ala Ser Ala Thr Ile Val Leu Ile Val
310 315 320
cct tac tac ttg gtc ctc aac acc ggc gaa att tgg gca ctg ttt atc 1362
Pro Tyr Tyr Leu Val Leu Asn Thr Gly Glu Ile Trp Ala Leu Phe Ile
325 330 335 340
act acc gtg att ggc ttc ggc atc ctc tgg ggt agc gtc aac gca atc 1410
Thr Thr Val Ile Gly Phe Gly Ile Leu Trp Gly Ser Val Asn Ala Ile
345 350 355
ctc gga acc gtc atc gca gaa aac ttc gca cct gag gtc cgc tac acc 1458
Leu Gly Thr Val Ile Ala Glu Asn Phe Ala Pro Glu Val Arg Tyr Thr
360 365 370
ggc gct acc ctg ggt tac caa gtc gga gca gca ctc ttc ggc ggt acc 1506
Gly Ala Thr Leu Gly Tyr Gln Val Gly Ala Ala Leu Phe Gly Gly Thr
375 380 385
gca ccc att atc gca gca tgg ctg ttc gaa atc tcc ggc gga caa tgg 1554
Ala Pro Ile Ile Ala Ala Trp Leu Phe Glu Ile Ser Gly Gly Gln Trp
390 395 400
tgg cca atc gcc gtc tac gtc gct gca tgt tgc ctt ctc tct gtg atc 1602
Trp Pro Ile Ala Val Tyr Val Ala Ala Cys Cys Leu Leu Ser Val Ile
405 410 415 420
gcc tcg ttc ttc atc caa cgc gtc gcg cac caa gag aac taaaatctaa 1651
Ala Ser Phe Phe Ile Gln Arg Val Ala His Gln Glu Asn
425 430
gtaaaacccc tccgaaagga accacccatg gtgaaacgtc aactgcccaa ccccgcagaa 1711
ctactcgaac tcatgaagtt caaaaagcca gagctcaacg gcaagaaacg acgcctagac 1771
tccgcgctca ccatctacga cctgcgtaaa attgctaaac gacgcacccc agctgccgcg 1831
ttcgactaca ccgacggcgc agccgaggcc gaactctcaa tcacacgcgc acgtgaagca 1891
ttcgaaaaca tcgaattcca cccagacatc ctcaagcctg cagaacacgt agacaccacc 1951
acccaaatcc tgggcggaac ctcctccatg ccattcggca tcgcaccaac 2001
<210> 2
<211> 433
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032
<400> 2
Met Thr Thr Ala Val Asp Gln Asn Ser Pro Pro Lys Gln Gln Leu Asn
1 5 10 15
Lys Arg Val Leu Leu Gly Ser Leu Ser Gly Ser Val Ile Glu Trp Phe
20 25 30
Asp Phe Leu Val Tyr Gly Thr Val Ala Ala Leu Val Phe Asn Lys Met
35 40 45
Tyr Phe Pro Ser Gly Asn Glu Phe Leu Ser Thr Ile Leu Ala Tyr Ala
50 55 60
Ser Phe Ser Leu Thr Phe Phe Phe Arg Pro Ile Gly Gly Val Ile Phe
65 70 75 80
Ala His Ile Gly Asp Arg Ile Gly Arg Lys Lys Thr Leu Phe Ile Thr
85 90 95
Leu Met Leu Met Gly Gly Gly Thr Val Ala Ile Gly Leu Leu Pro Asp
100 105 110
Tyr Asn Ala Ile Gly Ile Trp Ala Pro Ile Leu Leu Met Phe Leu Arg
115 120 125
Ile Leu Gln Gly Ile Gly Ile Gly Gly Glu Trp Gly Gly Ala Leu Leu
130 135 140
Leu Ala Tyr Glu Tyr Ala Pro Lys Lys Gln Arg Gly Leu Tyr Gly Ala
145 150 155 160
Val Pro Gln Met Gly Ile Ser Leu Gly Met Leu Leu Ala Ala Gly Val
165 170 175
Ile Ser Leu Leu Thr Leu Met Pro Glu Asp Gln Phe Leu Thr Trp Gly
180 185 190
Trp Arg Ile Pro Phe Val Gly Ser Ile Leu Leu Val Phe Ile Gly Leu
195 200 205
Phe Ile Arg Asn Gly Leu Asp Glu Thr Pro Glu Phe Lys Arg Ile Arg
210 215 220
Asp Ser Gly Gln Gln Val Lys Met Pro Leu Lys Glu Val Leu Thr Lys
225 230 235 240
Tyr Trp Pro Ala Val Leu Val Ser Ile Gly Ala Lys Ala Ala Glu Thr
245 250 255
Gly Pro Phe Tyr Ile Phe Gly Thr Tyr Ile Val Ala Tyr Ala Thr Asn
260 265 270
Phe Leu Asn Ile Arg Asp Asn Ile Val Leu Leu Ala Val Ala Cys Ala
275 280 285
Ala Leu Val Ala Thr Ile Trp Met Pro Leu Phe Gly Ser Phe Ser Asp
290 295 300
Arg Val Asn Arg Ala Val Leu Tyr Arg Ile Cys Ala Ser Ala Thr Ile
305 310 315 320
Val Leu Ile Val Pro Tyr Tyr Leu Val Leu Asn Thr Gly Glu Ile Trp
325 330 335
Ala Leu Phe Ile Thr Thr Val Ile Gly Phe Gly Ile Leu Trp Gly Ser
340 345 350
Val Asn Ala Ile Leu Gly Thr Val Ile Ala Glu Asn Phe Ala Pro Glu
355 360 365
Val Arg Tyr Thr Gly Ala Thr Leu Gly Tyr Gln Val Gly Ala Ala Leu
370 375 380
Phe Gly Gly Thr Ala Pro Ile Ile Ala Ala Trp Leu Phe Glu Ile Ser
385 390 395 400
Gly Gly Gln Trp Trp Pro Ile Ala Val Tyr Val Ala Ala Cys Cys Leu
405 410 415
Leu Ser Val Ile Ala Ser Phe Phe Ile Gln Arg Val Ala His Gln Glu
420 425 430
Asn
<210> 3
<211> 2001
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<220>
<221> misc_feature
<222> (221)..(221)
<223> position 221
<220>
<221> CDS
<222> (343)..(1641)
<223> coding sequence of a variant of NCgl2816
<220>
<221> misc_feature
<222> (1000)..(1002)
<223> tgc codon for cysteine
<220>
<221> misc_feature
<222> (1001)..(1001)
<223> nucleobase guanine
<220>
<221> misc_feature
<222> (1642)..(1644)
<223> taa stop codon
<400> 3
gccaccaggg attgggccgt acgattcaac gctctcatgg ccattcacgg tcacctacat 60
attcctgccg aaacccgcgt tgatggggta agccacgtgg aggtttcttt gggttacccc 120
tttgaaaaac acccacctca catgaagcgt ccgtggccgt ttccggtcat gcagattaac 180
taactctgtt gcttaaatgg gggtaattgg attcgactgt tttccacacc ccattgacaa 240
ttaaaggtga cacgccttac attcttgtgg tctgaccatg aggttgggcc aatcggtttc 300
agcccgttta ctcccgccgt ccgtttcaga gaagaggtca cc atg aca acc gca 354
Met Thr Thr Ala
1
gta gat caa aac tca ccg ccc aag cag caa ctc aac aag cgc gtc ctg 402
Val Asp Gln Asn Ser Pro Pro Lys Gln Gln Leu Asn Lys Arg Val Leu
5 10 15 20
ctg ggc agc ttg agt ggc agc gtt atc gaa tgg ttc gac ttc ctg gtt 450
Leu Gly Ser Leu Ser Gly Ser Val Ile Glu Trp Phe Asp Phe Leu Val
25 30 35
tac gga acc gtc gcc gcg ctg gtc ttc aac aag atg tac ttc ccc agc 498
Tyr Gly Thr Val Ala Ala Leu Val Phe Asn Lys Met Tyr Phe Pro Ser
40 45 50
ggc aac gag ttc ctc tcc aca atc ctg gcg tac gca tcc ttc tcc ctg 546
Gly Asn Glu Phe Leu Ser Thr Ile Leu Ala Tyr Ala Ser Phe Ser Leu
55 60 65
acc ttc ttc ttc cgc ccc att ggt ggc gtc atc ttc gcc cac atc ggc 594
Thr Phe Phe Phe Arg Pro Ile Gly Gly Val Ile Phe Ala His Ile Gly
70 75 80
gac cgc att ggg cgt aag aag acc ctg ttc atc acc ttg atg ctc atg 642
Asp Arg Ile Gly Arg Lys Lys Thr Leu Phe Ile Thr Leu Met Leu Met
85 90 95 100
ggt ggc ggc acc gtc gcc att ggt ttg ctg ccc gac tac aac gcc atc 690
Gly Gly Gly Thr Val Ala Ile Gly Leu Leu Pro Asp Tyr Asn Ala Ile
105 110 115
ggc att tgg gca cca atc ctt ctg atg ttc ctc cgc att ttg cag ggc 738
Gly Ile Trp Ala Pro Ile Leu Leu Met Phe Leu Arg Ile Leu Gln Gly
120 125 130
atc gga att ggc ggc gaa tgg ggt ggc gca ctg ctc ctg gca tac gaa 786
Ile Gly Ile Gly Gly Glu Trp Gly Gly Ala Leu Leu Leu Ala Tyr Glu
135 140 145
tac gct cca aag aag cag cgt ggg ctc tac ggc gca gtt cct caa atg 834
Tyr Ala Pro Lys Lys Gln Arg Gly Leu Tyr Gly Ala Val Pro Gln Met
150 155 160
ggc att tcc ctg ggc atg ctg ctt gca gct ggc gtg atc tct ctg ctc 882
Gly Ile Ser Leu Gly Met Leu Leu Ala Ala Gly Val Ile Ser Leu Leu
165 170 175 180
acc ctc atg ccg gaa gat cag ttc ctc acc tgg ggc tgg cgc atc cca 930
Thr Leu Met Pro Glu Asp Gln Phe Leu Thr Trp Gly Trp Arg Ile Pro
185 190 195
ttc gtc gga tcc atc ctc cta gtg ttc atc ggc ctg ttc atc cga aac 978
Phe Val Gly Ser Ile Leu Leu Val Phe Ile Gly Leu Phe Ile Arg Asn
200 205 210
ggc ctt gat gaa acc ccc gag tgc aag cgt atc cgc gat tcc ggc cag 1026
Gly Leu Asp Glu Thr Pro Glu Cys Lys Arg Ile Arg Asp Ser Gly Gln
215 220 225
cag gta aag atg cct ctg aag gaa gtt ctg acc aag tac tgg cca gcc 1074
Gln Val Lys Met Pro Leu Lys Glu Val Leu Thr Lys Tyr Trp Pro Ala
230 235 240
gtt ctg gtc tcc atc ggc gca aaa gct gcc gag acc ggc ccc ttc tac 1122
Val Leu Val Ser Ile Gly Ala Lys Ala Ala Glu Thr Gly Pro Phe Tyr
245 250 255 260
atc ttc ggc acc tac atc gtt gct tac gca acc aac ttc ctg aac atc 1170
Ile Phe Gly Thr Tyr Ile Val Ala Tyr Ala Thr Asn Phe Leu Asn Ile
265 270 275
cgc gac aac att gtc ctt ctg gca gtt gct tgc gcc gcc ctc gtt gcc 1218
Arg Asp Asn Ile Val Leu Leu Ala Val Ala Cys Ala Ala Leu Val Ala
280 285 290
acc atc tgg atg cca ctg ttc gga tcc ttc tcc gac cgc gtc aac cgt 1266
Thr Ile Trp Met Pro Leu Phe Gly Ser Phe Ser Asp Arg Val Asn Arg
295 300 305
gca gtg ctc tac agg atc tgt gca tcc gca acc atc gtg ctg att gtc 1314
Ala Val Leu Tyr Arg Ile Cys Ala Ser Ala Thr Ile Val Leu Ile Val
310 315 320
cct tac tac ttg gtc ctc aac acc ggc gaa att tgg gca ctg ttt atc 1362
Pro Tyr Tyr Leu Val Leu Asn Thr Gly Glu Ile Trp Ala Leu Phe Ile
325 330 335 340
act acc gtg att ggc ttc ggc atc ctc tgg ggt agc gtc aac gca atc 1410
Thr Thr Val Ile Gly Phe Gly Ile Leu Trp Gly Ser Val Asn Ala Ile
345 350 355
ctc gga acc gtc atc gca gaa aac ttc gca cct gag gtc cgc tac acc 1458
Leu Gly Thr Val Ile Ala Glu Asn Phe Ala Pro Glu Val Arg Tyr Thr
360 365 370
ggc gct acc ctg ggt tac caa gtc gga gca gca ctc ttc ggc ggt acc 1506
Gly Ala Thr Leu Gly Tyr Gln Val Gly Ala Ala Leu Phe Gly Gly Thr
375 380 385
gca ccc att atc gca gca tgg ctg ttc gaa atc tcc ggc gga caa tgg 1554
Ala Pro Ile Ile Ala Ala Trp Leu Phe Glu Ile Ser Gly Gly Gln Trp
390 395 400
tgg cca atc gcc gtc tac gtc gct gca tgt tgc ctt ctc tct gtg atc 1602
Trp Pro Ile Ala Val Tyr Val Ala Ala Cys Cys Leu Leu Ser Val Ile
405 410 415 420
gcc tcg ttc ttc atc caa cgc gtc gcg cac caa gag aac taaaatctaa 1651
Ala Ser Phe Phe Ile Gln Arg Val Ala His Gln Glu Asn
425 430
gtaaaacccc tccgaaagga accacccatg gtgaaacgtc aactgcccaa ccccgcagaa 1711
ctactcgaac tcatgaagtt caaaaagcca gagctcaacg gcaagaaacg acgcctagac 1771
tccgcgctca ccatctacga cctgcgtaaa attgctaaac gacgcacccc agctgccgcg 1831
ttcgactaca ccgacggcgc agccgaggcc gaactctcaa tcacacgcgc acgtgaagca 1891
ttcgaaaaca tcgaattcca cccagacatc ctcaagcctg cagaacacgt agacaccacc 1951
acccaaatcc tgggcggaac ctcctccatg ccattcggca tcgcaccaac 2001
<210> 4
<211> 433
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 4
Met Thr Thr Ala Val Asp Gln Asn Ser Pro Pro Lys Gln Gln Leu Asn
1 5 10 15
Lys Arg Val Leu Leu Gly Ser Leu Ser Gly Ser Val Ile Glu Trp Phe
20 25 30
Asp Phe Leu Val Tyr Gly Thr Val Ala Ala Leu Val Phe Asn Lys Met
35 40 45
Tyr Phe Pro Ser Gly Asn Glu Phe Leu Ser Thr Ile Leu Ala Tyr Ala
50 55 60
Ser Phe Ser Leu Thr Phe Phe Phe Arg Pro Ile Gly Gly Val Ile Phe
65 70 75 80
Ala His Ile Gly Asp Arg Ile Gly Arg Lys Lys Thr Leu Phe Ile Thr
85 90 95
Leu Met Leu Met Gly Gly Gly Thr Val Ala Ile Gly Leu Leu Pro Asp
100 105 110
Tyr Asn Ala Ile Gly Ile Trp Ala Pro Ile Leu Leu Met Phe Leu Arg
115 120 125
Ile Leu Gln Gly Ile Gly Ile Gly Gly Glu Trp Gly Gly Ala Leu Leu
130 135 140
Leu Ala Tyr Glu Tyr Ala Pro Lys Lys Gln Arg Gly Leu Tyr Gly Ala
145 150 155 160
Val Pro Gln Met Gly Ile Ser Leu Gly Met Leu Leu Ala Ala Gly Val
165 170 175
Ile Ser Leu Leu Thr Leu Met Pro Glu Asp Gln Phe Leu Thr Trp Gly
180 185 190
Trp Arg Ile Pro Phe Val Gly Ser Ile Leu Leu Val Phe Ile Gly Leu
195 200 205
Phe Ile Arg Asn Gly Leu Asp Glu Thr Pro Glu Cys Lys Arg Ile Arg
210 215 220
Asp Ser Gly Gln Gln Val Lys Met Pro Leu Lys Glu Val Leu Thr Lys
225 230 235 240
Tyr Trp Pro Ala Val Leu Val Ser Ile Gly Ala Lys Ala Ala Glu Thr
245 250 255
Gly Pro Phe Tyr Ile Phe Gly Thr Tyr Ile Val Ala Tyr Ala Thr Asn
260 265 270
Phe Leu Asn Ile Arg Asp Asn Ile Val Leu Leu Ala Val Ala Cys Ala
275 280 285
Ala Leu Val Ala Thr Ile Trp Met Pro Leu Phe Gly Ser Phe Ser Asp
290 295 300
Arg Val Asn Arg Ala Val Leu Tyr Arg Ile Cys Ala Ser Ala Thr Ile
305 310 315 320
Val Leu Ile Val Pro Tyr Tyr Leu Val Leu Asn Thr Gly Glu Ile Trp
325 330 335
Ala Leu Phe Ile Thr Thr Val Ile Gly Phe Gly Ile Leu Trp Gly Ser
340 345 350
Val Asn Ala Ile Leu Gly Thr Val Ile Ala Glu Asn Phe Ala Pro Glu
355 360 365
Val Arg Tyr Thr Gly Ala Thr Leu Gly Tyr Gln Val Gly Ala Ala Leu
370 375 380
Phe Gly Gly Thr Ala Pro Ile Ile Ala Ala Trp Leu Phe Glu Ile Ser
385 390 395 400
Gly Gly Gln Trp Trp Pro Ile Ala Val Tyr Val Ala Ala Cys Cys Leu
405 410 415
Leu Ser Val Ile Ala Ser Phe Phe Ile Gln Arg Val Ala His Gln Glu
420 425 430
Asn
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<211> 1266
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1263)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1264)..(1266)
<223> taa stop codon
<400> 5
gtg gcc ctg gtc gta cag aaa tat ggc ggt tcc tcg ctt gag agt gcg 48
Met Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala
1 5 10 15
gaa cgc att aga aac gtc gct gaa cgg atc gtt gcc acc aag aag gct 96
Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala
20 25 30
gga aat gat gtc gtg gtt gtc tgc tcc gca atg gga gac acc acg gat 144
Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp
35 40 45
gaa ctt cta gaa ctt gca gcg gca gtg aat ccc gtt ccg cca gct cgt 192
Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg
50 55 60
gaa atg gat atg ctc ctg act gct ggt gag cgt att tct aac gct ctc 240
Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu
65 70 75 80
gtc gcc atg gct att gag tcc ctt ggc gca gaa gcc caa tct ttc acg 288
Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr
85 90 95
ggc tct cag gct ggt gtg ctc acc acc gag cgc cac gga aac gca cgc 336
Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg
100 105 110
att gtt gat gtc act cca ggt cgt gtg cgt gaa gca ctc gat gag ggc 384
Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly
115 120 125
aag atc tgc att gtt gct ggt ttc cag ggt gtt aat aaa gaa acc cgc 432
Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg
130 135 140
gat gtc acc acg ttg ggt cgt ggt ggt tct gac acc act gca gtt gcg 480
Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala
145 150 155 160
ttg gca gct gct ttg aac gct gat gtg tgt gag att tac tcg gac gtt 528
Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val
165 170 175
gac ggt gtg tat acc gct gac ccg cgc atc gtt cct aat gca cag aag 576
Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys
180 185 190
ctg gaa aag ctc agc ttc gaa gaa atg ctg gaa ctt gct gct gtt ggc 624
Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly
195 200 205
tcc aag att ttg gtg ctg cgc agt gtt gaa tac gct cgt gca ttc aat 672
Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn
210 215 220
gtg cca ctt cgc gta cgc tcg tct tat agt aat gat ccc ggc act ttg 720
Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu
225 230 235 240
att gcc ggc tct atg gag gat att cct gtg gaa gaa gca gtc ctt acc 768
Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr
245 250 255
ggt gtc gca acc gac aag tcc gaa gcc aaa gta acc gtt ctg ggt att 816
Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile
260 265 270
tcc gat aag cca ggc gag gct gcg aag gtt ttc cgt gcg ttg gct gat 864
Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp
275 280 285
gca gaa atc aac att gac atg gtt ctg cag aac gtc tct tct gta gaa 912
Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu
290 295 300
gac ggc acc acc gac atc acc ttc acc tgc cct cgt tcc gac ggc cgc 960
Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ser Asp Gly Arg
305 310 315 320
cgc gcg atg gag atc ttg aag aag ctt cag gtt cag ggc aac tgg acc 1008
Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr
325 330 335
aat gtg ctt tac gac gac cag gtc ggc aaa gtc tcc ctc gtg ggt gct 1056
Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala
340 345 350
ggc atg aag tct cac cca ggt gtt acc gca gag ttc atg gaa gct ctg 1104
Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu
355 360 365
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Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg
370 375 380
att tcc gtg ctg atc cgt gaa gat gat ctg gat gct gct gca cgt gca 1200
Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala
385 390 395 400
ttg cat gag cag ttc cag ctg ggc ggc gaa gac gaa gcc gtc gtt tat 1248
Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr
405 410 415
gca ggc acc gga cgc taa 1266
Ala Gly Thr Gly Arg
420
<210> 6
<211> 421
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Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala
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Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp
35 40 45
Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg
50 55 60
Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu
65 70 75 80
Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr
85 90 95
Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg
100 105 110
Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly
115 120 125
Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg
130 135 140
Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala
145 150 155 160
Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val
165 170 175
Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys
180 185 190
Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly
195 200 205
Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn
210 215 220
Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu
225 230 235 240
Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr
245 250 255
Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile
260 265 270
Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp
275 280 285
Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu
290 295 300
Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ser Asp Gly Arg
305 310 315 320
Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr
325 330 335
Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala
340 345 350
Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu
355 360 365
Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg
370 375 380
Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala
385 390 395 400
Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr
405 410 415
Ala Gly Thr Gly Arg
420
<210> 7
<211> 1619
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> polynucleotide comprising a mutated nucleotide sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(9)
<223> recognition site for restriction endonuclease XbaI
<220>
<221> CDS
<222> (152)..(1450)
<223> coding sequence of NCgl2816
<220>
<221> misc_feature
<222> (809)..(811)
<223> tgc codon for cysteine
<220>
<221> misc_feature
<222> (810)..(810)
<223> nucleobase guanine
<220>
<221> misc_feature
<222> (1451)..(1453)
<223> taa stop codon
<220>
<221> misc_feature
<222> (1611)..(1616)
<223> recognition site for restriction endonuclease XbaI
<400> 7
gcgtctagag ggtaattgga ttcgactgtt ttccacaccc cattgacaat taaaggtgac 60
acgccttaca ttcttgtggt ctgaccatga ggttgggcca atcggtttca gcccgtttac 120
tcccgccgtc cgtttcagag aagaggtcac c atg aca acc gca gta gat caa 172
Met Thr Thr Ala Val Asp Gln
1 5
aac tca ccg ccc aag cag caa ctc aac aag cgc gtc ctg ctg ggc agc 220
Asn Ser Pro Pro Lys Gln Gln Leu Asn Lys Arg Val Leu Leu Gly Ser
10 15 20
ttg agt ggc agc gtt atc gaa tgg ttc gac ttc ctg gtt tac gga acc 268
Leu Ser Gly Ser Val Ile Glu Trp Phe Asp Phe Leu Val Tyr Gly Thr
25 30 35
gtc gcc gcg ctg gtc ttc aac aag atg tac ttc ccc agc ggc aac gag 316
Val Ala Ala Leu Val Phe Asn Lys Met Tyr Phe Pro Ser Gly Asn Glu
40 45 50 55
ttc ctc tcc aca atc ctg gcg tac gca tcc ttc tcc ctg acc ttc ttc 364
Phe Leu Ser Thr Ile Leu Ala Tyr Ala Ser Phe Ser Leu Thr Phe Phe
60 65 70
ttc cgc ccc att ggt ggc gtc atc ttc gcc cac atc ggc gac cgc att 412
Phe Arg Pro Ile Gly Gly Val Ile Phe Ala His Ile Gly Asp Arg Ile
75 80 85
ggg cgt aag aag acc ctg ttc atc acc ttg atg ctc atg ggt ggc ggc 460
Gly Arg Lys Lys Thr Leu Phe Ile Thr Leu Met Leu Met Gly Gly Gly
90 95 100
acc gtc gcc att ggt ttg ctg ccc gac tac aac gcc atc ggc att tgg 508
Thr Val Ala Ile Gly Leu Leu Pro Asp Tyr Asn Ala Ile Gly Ile Trp
105 110 115
gca cca atc ctt ctg atg ttc ctc cgc att ttg cag ggc atc gga att 556
Ala Pro Ile Leu Leu Met Phe Leu Arg Ile Leu Gln Gly Ile Gly Ile
120 125 130 135
ggc ggc gaa tgg ggt ggc gca ctg ctc ctg gca tac gaa tac gct cca 604
Gly Gly Glu Trp Gly Gly Ala Leu Leu Leu Ala Tyr Glu Tyr Ala Pro
140 145 150
aag aag cag cgt ggg ctc tac ggc gca gtt cct caa atg ggc att tcc 652
Lys Lys Gln Arg Gly Leu Tyr Gly Ala Val Pro Gln Met Gly Ile Ser
155 160 165
ctg ggc atg ctg ctt gca gct ggc gtg atc tct ctg ctc acc ctc atg 700
Leu Gly Met Leu Leu Ala Ala Gly Val Ile Ser Leu Leu Thr Leu Met
170 175 180
ccg gaa gat cag ttc ctc acc tgg ggc tgg cgc atc cca ttc gtc gga 748
Pro Glu Asp Gln Phe Leu Thr Trp Gly Trp Arg Ile Pro Phe Val Gly
185 190 195
tcc atc ctc cta gtg ttc atc ggc ctg ttc atc cga aac ggc ctt gat 796
Ser Ile Leu Leu Val Phe Ile Gly Leu Phe Ile Arg Asn Gly Leu Asp
200 205 210 215
gaa acc ccc gag tgc aag cgt atc cgc gat tcc ggc cag cag gta aag 844
Glu Thr Pro Glu Cys Lys Arg Ile Arg Asp Ser Gly Gln Gln Val Lys
220 225 230
atg cct ctg aag gaa gtt ctg acc aag tac tgg cca gcc gtt ctg gtc 892
Met Pro Leu Lys Glu Val Leu Thr Lys Tyr Trp Pro Ala Val Leu Val
235 240 245
tcc atc ggc gca aaa gct gcc gag acc ggc ccc ttc tac atc ttc ggc 940
Ser Ile Gly Ala Lys Ala Ala Glu Thr Gly Pro Phe Tyr Ile Phe Gly
250 255 260
acc tac atc gtt gct tac gca acc aac ttc ctg aac atc cgc gac aac 988
Thr Tyr Ile Val Ala Tyr Ala Thr Asn Phe Leu Asn Ile Arg Asp Asn
265 270 275
att gtc ctt ctg gca gtt gct tgc gcc gcc ctc gtt gcc acc atc tgg 1036
Ile Val Leu Leu Ala Val Ala Cys Ala Ala Leu Val Ala Thr Ile Trp
280 285 290 295
atg cca ctg ttc gga tcc ttc tcc gac cgc gtc aac cgt gca gtg ctc 1084
Met Pro Leu Phe Gly Ser Phe Ser Asp Arg Val Asn Arg Ala Val Leu
300 305 310
tac agg atc tgt gca tcc gca acc atc gtg ctg att gtc cct tac tac 1132
Tyr Arg Ile Cys Ala Ser Ala Thr Ile Val Leu Ile Val Pro Tyr Tyr
315 320 325
ttg gtc ctc aac acc ggc gaa att tgg gca ctg ttt atc act acc gtg 1180
Leu Val Leu Asn Thr Gly Glu Ile Trp Ala Leu Phe Ile Thr Thr Val
330 335 340
att ggc ttc ggc atc ctc tgg ggt agc gtc aac gca atc ctc gga acc 1228
Ile Gly Phe Gly Ile Leu Trp Gly Ser Val Asn Ala Ile Leu Gly Thr
345 350 355
gtc atc gca gaa aac ttc gca cct gag gtc cgc tac acc ggc gct acc 1276
Val Ile Ala Glu Asn Phe Ala Pro Glu Val Arg Tyr Thr Gly Ala Thr
360 365 370 375
ctg ggt tac caa gtc gga gca gca ctc ttc ggc ggt acc gca ccc att 1324
Leu Gly Tyr Gln Val Gly Ala Ala Leu Phe Gly Gly Thr Ala Pro Ile
380 385 390
atc gca gca tgg ctg ttc gaa atc tcc ggc gga caa tgg tgg cca atc 1372
Ile Ala Ala Trp Leu Phe Glu Ile Ser Gly Gly Gln Trp Trp Pro Ile
395 400 405
gcc gtc tac gtc gct gca tgt tgc ctt ctc tct gtg atc gcc tcg ttc 1420
Ala Val Tyr Val Ala Ala Cys Cys Leu Leu Ser Val Ile Ala Ser Phe
410 415 420
ttc atc caa cgc gtc gcg cac caa gag aac taaaatctaa gtaaaacccc 1470
Phe Ile Gln Arg Val Ala His Gln Glu Asn
425 430
tccgaaagga accacccatg gtgaaacgtc aactgcccaa ccccgcagaa ctactcgaac 1530
tcatgaagtt caaaaagcca gagctcaacg gcaagaaacg acgcctagac tccgcgctca 1590
ccatctacga cctgcgtaaa tctagagcc 1619
<210> 8
<211> 433
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 8
Met Thr Thr Ala Val Asp Gln Asn Ser Pro Pro Lys Gln Gln Leu Asn
1 5 10 15
Lys Arg Val Leu Leu Gly Ser Leu Ser Gly Ser Val Ile Glu Trp Phe
20 25 30
Asp Phe Leu Val Tyr Gly Thr Val Ala Ala Leu Val Phe Asn Lys Met
35 40 45
Tyr Phe Pro Ser Gly Asn Glu Phe Leu Ser Thr Ile Leu Ala Tyr Ala
50 55 60
Ser Phe Ser Leu Thr Phe Phe Phe Arg Pro Ile Gly Gly Val Ile Phe
65 70 75 80
Ala His Ile Gly Asp Arg Ile Gly Arg Lys Lys Thr Leu Phe Ile Thr
85 90 95
Leu Met Leu Met Gly Gly Gly Thr Val Ala Ile Gly Leu Leu Pro Asp
100 105 110
Tyr Asn Ala Ile Gly Ile Trp Ala Pro Ile Leu Leu Met Phe Leu Arg
115 120 125
Ile Leu Gln Gly Ile Gly Ile Gly Gly Glu Trp Gly Gly Ala Leu Leu
130 135 140
Leu Ala Tyr Glu Tyr Ala Pro Lys Lys Gln Arg Gly Leu Tyr Gly Ala
145 150 155 160
Val Pro Gln Met Gly Ile Ser Leu Gly Met Leu Leu Ala Ala Gly Val
165 170 175
Ile Ser Leu Leu Thr Leu Met Pro Glu Asp Gln Phe Leu Thr Trp Gly
180 185 190
Trp Arg Ile Pro Phe Val Gly Ser Ile Leu Leu Val Phe Ile Gly Leu
195 200 205
Phe Ile Arg Asn Gly Leu Asp Glu Thr Pro Glu Cys Lys Arg Ile Arg
210 215 220
Asp Ser Gly Gln Gln Val Lys Met Pro Leu Lys Glu Val Leu Thr Lys
225 230 235 240
Tyr Trp Pro Ala Val Leu Val Ser Ile Gly Ala Lys Ala Ala Glu Thr
245 250 255
Gly Pro Phe Tyr Ile Phe Gly Thr Tyr Ile Val Ala Tyr Ala Thr Asn
260 265 270
Phe Leu Asn Ile Arg Asp Asn Ile Val Leu Leu Ala Val Ala Cys Ala
275 280 285
Ala Leu Val Ala Thr Ile Trp Met Pro Leu Phe Gly Ser Phe Ser Asp
290 295 300
Arg Val Asn Arg Ala Val Leu Tyr Arg Ile Cys Ala Ser Ala Thr Ile
305 310 315 320
Val Leu Ile Val Pro Tyr Tyr Leu Val Leu Asn Thr Gly Glu Ile Trp
325 330 335
Ala Leu Phe Ile Thr Thr Val Ile Gly Phe Gly Ile Leu Trp Gly Ser
340 345 350
Val Asn Ala Ile Leu Gly Thr Val Ile Ala Glu Asn Phe Ala Pro Glu
355 360 365
Val Arg Tyr Thr Gly Ala Thr Leu Gly Tyr Gln Val Gly Ala Ala Leu
370 375 380
Phe Gly Gly Thr Ala Pro Ile Ile Ala Ala Trp Leu Phe Glu Ile Ser
385 390 395 400
Gly Gly Gln Trp Trp Pro Ile Ala Val Tyr Val Ala Ala Cys Cys Leu
405 410 415
Leu Ser Val Ile Ala Ser Phe Phe Ile Gln Arg Val Ala His Gln Glu
420 425 430
Asn
Claims (11)
1.一种发酵生产L-赖氨酸的方法，包括以下步骤：
a)提供具有分泌L-赖氨酸的能力的物种谷氨酸棒杆菌的细菌，所述细菌在其染色体中含有编码包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，其中第220位的氨基酸苯丙氨酸被不同的蛋白质氨基酸取代，
b)在合适条件下在合适培养基中培养所述细菌，和
c)在培养基中积累所述L-赖氨酸以形成含L-赖氨酸的发酵液。
2.权利要求1的方法，其中，在所述细菌中，SEQ ID NO：2的氨基酸序列第220位的氨基酸是半胱氨酸。
3.权利要求2的方法，其中，在所述细菌中，编码所述氨基酸序列的多核苷酸包含SEQID NO：1的第343至1641位的核苷酸序列，其中第1000至1002位的核碱基是tgt或tgc。
4.权利要求3的方法，其中第1000至1002位的核碱基是tgc。
5.权利要求2的方法，其中，在所述细菌中，编码所述氨基酸序列的多核苷酸包含SEQID NO：1的第343至1644位的核苷酸序列，其中第1000至1002位的核碱基是tgt或tgc。
6.权利要求5的方法，其中第1002至1004位的核碱基是tgc。
7.权利要求2的方法，其中，在所述细菌中，编码所述氨基酸序列的多核苷酸包含SEQID NO：1的第221至1644位的核苷酸序列，其中第1000至1002位的核碱基是tgt或tgc。
8.权利要求7的方法，其中第1000至1002位的核碱基是tgc。
9.前述权利要求任一项的方法，还包括从发酵液制备含L-赖氨酸的产物。
10.前述权利要求任一项的方法，还包括从发酵液中提取或基本上除去水。
11.权利要求10的方法，其中所述制备包括纯化步骤。
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