BR102015019296A2 - Microrganismo e método para a produção de aminoácidos por fermentação - Google Patents

Abstract

microrganismo e método para a produção de aminoácidos por fermentação a invenção refere-se a um microrganismo que produz e/ou secreta um composto químico orgânico, em que o microrganismo tem uma expressão aumentada, em comparação com a respectiva cepa de partida, de um polipeptídeo lpda com a atividade de um transidrogenase; e um processo para produzir um composto químico orgânico utilizando o microrganismo de acordo com a invenção.

Description

MICRORGANISMO E MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE AMINOÁCIDOS POR FERMENTAÇÃO [0001] A invenção refere-se a um microrganismo que produz e/ou secreta um composto químico orgânico, em que o microrganismo tem uma atividade aumentada de uma transidrogenase (proteína LpdA, produto do gene do gene

lpdA); e	; um processo	para produzir um composto	químico
orgânico	utilizando o	microrganismo de	acordo	com	a
invenção
Γ 0002 ]	A presente	invenção surgiu no	âmbito	de	um
projeto	promovido pelo	Ministério Federal	de Educação	e

Pesquisa (BMBF) (número de concessão 0313917A).

TÉCNICA ANTERIOR [0003] Compostos químicos orgânicos, incluindo, em particular, aminoácidos, ácidos orgânicos, vitaminas, nucleotídeos e nucleotídeos, encontram aplicação em medicina humana, na indústria farmacêutica, na indústria de alimentos e muito especialmente na alimentação de animais.

[0004]

Um grande número destes compostos, por exemplo,

L-lisina, é produzido por fermentação por cepas de bactérias corineformes, em especial de Corynebacterium glutamicwn, ou por cepas da família Enterobacteriaceae, especialmente Escherichia coli. Devido à importância econômica considerável, há esforço constante para melhorar os processos de produção. As melhorias de processo podem se relacionar com medidas técnicas na fermentação, por exemplo, agitação e fornecimento de oxigênio, ou para a composição dos meios nutrientes, por exemplo, concentração de açúcar durante a fermentação, ou para trabalhar-se à forma do produto, por exemplo, por

2/66 cromatografia de troca iônica ou para as propriedades intrínsecas do desempenho do próprio microrganismo.

[0005] Em cepas do tipo selvagem, vias de biossintese de aminoácidos estão sujeitas a um controle metabólico rigoroso, o que garante que os aminoácidos são produzidos apenas no nível necessário para necessidades próprias da célula. Um requisito importante para os processos de produção mais eficientes é, por conseguinte, para os microrganismos adequados para estar disponível, o qual, em contraste com organismos do tipo selvagem tem capacidade para produzir o aminoácido desejado que é dramaticamente aumentada para além dos seus próprios requisitos (superprodução).

[0006]

A melhoria das propriedades de desempenho desses microrganismos emprega métodos de mutagênese, seleção e colheita de mutantes.

Desta forma, são obtidas cepas que são resistentes a antimetabólitos ou são auxotróficas para metabólitos de importância regulatória e que produzem L-aminoácidos. Um antimetabólito conhecido é o análogo de lisina S-(2-aminoetil)-L-cisteina (AEC).

[0007] Durante alguns anos, os métodos da tecnologia do DNA recombinante também foram usados para melhorar as cepas produtoras de L-aminoácido do gênero Corynebacterium, em especial de Corynebacterium glutamicum, ou do gênero Escherichia, em especial Escherichia coli, através da modificação ou enfraquecimento ou reforço os genes da biossintese de aminoácidos individuais e investigar o efeito sobre a produção de aminoácidos.

[0008] As sequências de nucleotídeos dos cromossomas de numerosas bactérias são conhecidas.

3/66 [0009] A sequência de nucleotídeos do genoma de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 é descrito em Ikeda e Nakagawa (Applied Microbiology and Biotechnology 62, 99-109 (2003)), na EP 1 108 790 e em Kalinowski et al. (Journal of Biotechnology 104 (1-3), (2003)).

[0010] A sequência de nucleotídeos do genoma de Corynebacterium glutamicum R é descrita em Yukawa et al. (Microbiology 153 (4): 1042-1058 (2007)).

[0011] A sequência de nucleotídeos do genoma de Corynebacterium efficiens é descrito em Nishio et al. (Genome Research. 13 (7), 1572-1579 (2003)).

[0012] A sequência de nucleotídeos do genoma de Corynebacterium diphtheriae NCTC 13129 foi descrito por Cerdeno-Tarraga et al. (Nucleic Acids Research 31 (22), 6516-6523 (2003)).

[0013]

A sequência de nucleotídeos do genoma de

Corynebacterium jeikeium foi descrito por

Tauch et al.

(Journal of Bacteriology

187 (13), 4671-4682 (2005)).

[0014]

As sequências de nucleotídeos do genoma de

Corynebacterium glutamicum também estão disponíveis no banco de dados do

National Center for

Biotechnology

Information (NCBI) do

National Library of Medicine (Bethesda, MD, EUA), no

Banco de Dados de

DNA do Japão (DDBJ, Mishima, Japão) ou na base de dados da sequência de nucleotídeos dos Laboratórios de Biologia

Molecular Europeu (EMBL, Heidelberg, Alemanha ou Cambridge,

Reino Unido).

[0015]

Vários aspectos da produção de L-aminoácidos por fermentação estão resumidos em R. Faurie e J. Thommel, Advances in Biochemical Engineering Biotechnology, Vol. 79 (Springer-Verlag, Berlim, Heidelberg (Alemanha) 2003).

4/66 [0016] Na produção dos compostos químicos orgânicos acima mencionados utilizando microrganismos, cada um destes compostos é produzido em uma via de biossíntese na célula de um microrganismo. Uma das coenzimas importantes que são essenciais para a função de enzimas importantes no sistema de biossíntese é fosfato de dinucleotídeo de nicotinamidaadenina reduzida (daqui em diante chamado de NADPH).

[0017] Ά relação entre NADPH e a produção de compostos químicos orgânicos que utilizam microrganismos é explicado, por exemplo, na EP0733712B.

[0018] Transidrogenase dinucleotídeo de nicotinamida (chamada simplesmente daqui em diante transidrogenase) é conhecida por ser uma das enzimas responsáveis pela produção de NADPH. É sabido que esta enzima está presente em vários organismos, incluindo em microrganismos do gênero Escheríchia. No caso da Escheríchia coli, um microrganismo típico do gênero Escheríchia, purificação de transidrogenase (David M. Clarke e Philip D. Bragg, Eur. J. Biochem., 149, 517-523 (1985)), clonagem de um gene que a codifica (David M. Clarke e Philip D. Bragg, J. Bacteriology., 162, 367-373 (1985)) e determinação da sequência de nucleotídeos do gene (David M. Clarke, Ponta W. Loo, Shirley Gillam, e Philip D. Bragg, Eur. J. Biochem. 158, 647-653 (1986)) foram realizadas, e foi demonstrada a presença da enzima. No entanto, a função fisiológica da enzima é pouco conhecida. Isto é tipicamente demonstrado pelo fato que variantes a que falta a enzima não apresentam qualquer expressão fenotípica.

[0019] Makoto Ishimoto Metabolic Maps, 25 de julho de 1971 (Kyoritsu Suppan Co., Ltd.), páginas 30-32, revela

5/66 que a atividade redutora de NADH ou NADPH é necessária para a biossintese de vários aminoácidos. Este documento, no entanto, não revela a conversão de NADH em NADPH para a biossintese de uma substância alvo.

[0020] Bunji Maruo, Nobuo Tamiya (autores) Manual de Enzimas, 01 de março de 1983 (01.03.83), Asakura Shoten, p. 132-133 e Arch. Biochem. Biophys. Vol. 176, N° 1, 1976, Wermuth B. et al. Nucleotídeo de transidrogenase piridina de purificação de Pseudomonas aeruginosa por cromatografia de afinidade e propriedades fisico-quimicas, p. 136-143, em cada caso, revela uma enzima que é capaz de converter NADH em NADPH e vice-versa. Nenhum desses documentos diz respeito à produção de uma substância alvo ou um aumento da produtividade para NADPH, que poderia ser utilizado para a produção de uma substância alvo.

[0021] E. coli contém tanto um nucleotídeo de piridina transidrogenase ligada à membrana e solúvel. O nucleotídeo de piridina transidrogenase solúvel é o produto do gene Stha (Sth, UdhA); o seu papel fisiológico principal parece ser reoxidação de NADPH. O próton de nucleotídeo de piridina transidrogenase ligada à membrana é o produto de gene PntAB; PntAB é uma importante fonte de NADPH (Sauer et al., The Journal of Biological Chemistry 279 (8) (2004)).

[0022] Anderlund et al. (Applied and Environmental Microbiology 56(6) (1999)) investigaram o efeito fisiológico da expressão de transidrogenase ligado à membrana (genes de pntA e pntB) a partir de Escherichia coli em Saccharomyces cerevisiae recombinante.

[0023] Neste contexto, o problema a ser resolvido pela presente invenção é proporcionar um microrganismo que é

6/66 melhorado em relação a microrganismos descritos na técnica anterior, métodos de produção de microrganismo e métodos utilizando o referido microrganismo para a sobreprodução de compostos químicos orgânicos, em que o aperfeiçoamento se refere a fatores tais como a concentração do composto sobreproduzido atingido intracelularmente, o rendimento do composto sobreproduzido após o processamento da cultura, as propriedades de crescimento do microrganismo, bem como o tempo e número de etapas do processo necessários para superprodução e o processamento do composto e a exigência do meio do processo, por exemplo, com respeito ao tempo, a energia e quantidade de cepas e adutos utilizados.

[0024] Estes e outros problemas são resolvidos pelo matéria do presente pedido de patente e especialmente pela matéria das reivindicações independentes, em que formas de realização surgem a partir das reivindicações dependentes. [0025] Num primeiro aspecto, o problema a ser resolvido pelo pedido de patente é resolvido por um processo para a produção de um composto químico orgânico por fermentação usando um microrganismo que contém as etapas de:

a. fermentação de um microrganismo que produz um composto químico orgânico;

em que, no microrganismo, um polinucleotídeo que é sobre-expresso que codifica um polipeptídeo cuja sequência de aminoácidos é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2;

7/66 e em que a fermentação se realiza num meio de fermentação adequado com formação de um caldo de fermentação; e

b. enriquecimento (acumulação) do composto químico orgânico no caldo de fermentação a partir de a).

[0026] No contexto da presente invenção, um microrganismo que produz um composto químico orgânico significa um microrganismo que produz o composto químico orgânico além do que é necessário para manter a viabilidade do microrganismo.

[0027] No contexto da presente invenção, o enriquecimento, ou acumulação, do composto químico orgânico no caldo de fermentação significa que tanto o enriquecimento/acumulação dos compostos químicos orgânicos nas células do microrganismo e a secreção do composto químico orgânico no meio nutriente em torno do microrganismo, isto é, no caldo de fermentação.

[0028] Num outro aspecto, o problema a ser resolvido pelo pedido de patente é resolvido com um microrganismo que produz um composto químico orgânico, em que um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo cuja sequência de aminoácidos é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, é sobre-expresso no microrganismo.

[0029] Numa forma de realização do processo de acordo com a invenção, para a produção de um composto químico orgânico, ou o microrganismo de acordo com a invenção, o polipeptídeo codificado, cuja sequência de aminoácidos é pelo menos 80%, em menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos

8/66

95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, tem a atividade de uma transidrogenase.

[0030] A atividade de uma transidrogenase é detectada pelo teste de enzima de acordo com Argyrou et al. (2004) . Neste teste, transidrogenase purificada é investigada em relação à redução dependente de NAD(P)H de 5-HNQ, um aceitador de elétron artificial.

[0031] Os microrganismos ou cepas (cepas de partida) utilizadas para as medidas para a sobre-expressão do polipeptídeo divulgado nas reivindicações de preferência já possuem a capacidade para enriquecer o composto químico orgânico desejado na célula ou para secretar no meio nutriente circundante e acumulando ali.

[0032] A vantagem da presente invenção é que o rendimento do produto em processos de produção biotecnológica, por exemplo, produção de aminoácidos, é ainda mais aumentada. Com o processo de acordo com a invenção, ou utilizando os microrganismos de acordo com a invenção, a produção microbiana dos compostos químicos orgânicos pode ser ainda mais aumentada.

[0033] Portanto, o processo de acordo com a invenção para a produção de um composto químico orgânico é também caracterizado pelo fato de que a produção do composto químico orgânico é aumentada em pelo menos 0,5%, pelo menos 1%, pelo menos 1,5% ou, pelo menos, 2% em relação à da fermentação de um microrganismo em que o polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo cuja sequência de aminoácidos é pelo menos 80% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, não é sobre-expressa. Surpreendentemente, uma

9/66 transidrogenase em C. glutamicum foi identificada a partir de uma elevada identidade de sequência de uma proteína com a atividade de um transidrogenase (proteína LpdA) em Mycobacterium tuberculosis. 0 aumento em expressão da transidrogenase levou a um aumento da produção de um composto químico orgânico quando utilizando uma cepa de produção correspondente.

[0034] Numa forma de realização preferida do processo de acordo com a invenção/do microrganismo de acordo com a invenção, o polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo cuja sequência de aminoácido é de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 é derivado a partir de Corynebacterium glutamicum. Especialmente de preferência, este polipeptídeo codificado tem a atividade de uma transidrogenase.

[0035] O microrganismo de acordo com a invenção tem, em comparação com a respectiva cepa de partida, expressão aumentada de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo com uma sequência de aminoácido exibindo identidade de 80% ou mais para a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2.

[0036] As formas de realização preferidas incluem variantes que são pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idênticas à sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2, ou seja, em que pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelos menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% das posições de aminoácidos são idênticas as da sequência

10/66 de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2. A percentagem de identidade é de um modo preferido calculada ao longo de todo o comprimento do aminoácido ou região de ácido nucleico.

[0037] Numa forma de realização preferida, o microrganismo tem, em comparação com a respectiva cepa de partida, expressão aumentada de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 2.

[0038] No que são necessários equivalentes de redução sob a forma de NADPH para a biossíntese de compostos químicos orgânicos, a melhoria da disposição com equivalentes de redução é vantajosa.

[0039] Um composto químico orgânico significa, para as medidas da invenção, uma vitamina, por exemplo, tiamina (vitamina Bl) , riboflavina (vitamina B2) , cianocobalamina (vitamina B12), ácido fólico (vitamina H), tocoferol (vitamina

E) ou ácido nicotínico/nicotinamida, um nucleosídeo ou nucleotídeo, por exemplo,

Sadenosilmetionina, inosina ácido

5'-monofosfórico e guanosina ácido 5'-monofosfórico,

L-aminoácidos, ácidos orgânicos ou também uma amina, por exemplo cadaverina. Laminoácidos e produtos que os contêm são preferencialmente produzidos.

[0040] O composto químico orgânico que é produzido e/ou secretado pelo microrganismo de acordo com a invenção é de preferência selecionado a partir do grupo que compreende vitamina, nucleosídeo ou nucleotídeo, L aminoácidos, ácidos orgânicos e amina.

11/66 [0041] O termo L-aminoácidos compreende os aminoácidos proteinogênicos, além de L-ornitina e L-homoserina. Laminoácidos proteinogênicos devem ser entendidos como os Laminoácidos que se realizam em proteínas naturais, ou seja, em proteínas de microrganismos, plantas, animais e seres humanos. Os aminoácidos proteinogênicos incluem o ácido Laspártico, L-asparagina, L-treonina, L-serina, ácido Lglutâmico, L-glutamina, L-glicina, L-alanina, L-cisteína, L-valina, L-metionina, L-isoleucina, L-leucina, L-tirosina, L-fenilalanina, L-histidina, L-lisina, L-triptofano, Larginina, L-prolina e opcionalmente L-selenocisteína e Lpirrolisina.

[0042] 0 termo ácido orgânico inclui α-ceto ácidos, especialmente um ácido α-ceto ácido selecionado a partir do grupo α-cetoisocaproico, ácido α-cetovalérico e ácido aceto-p-metilvalérico.

[0043] Especialmente de preferência, o composto químico orgânico é selecionado a partir do grupo proteinogênico de ácido L-aminoácido, L-ornitina e L-homoserina, bem como ácido α-cetoisocaproico-, ácido acetovalérico e ácido-a-ceto-pmetilvalérico. Especialmente de preferência, o L-aminoácido proteinogênico é selecionado a partir do grupo de L-treonina, L-lisina, L-metionina, Lvalina, L-prolina, L-glutamato, L-leucina e L-isoleucina, especialmente L-lisina, L-metionina e L-valina, muito especialmente L-lisina e L-metionina.

[0044] Se os aminoácidos ou L-aminoácidos são mencionados a seguir, o termo também compreende os sais dos mesmos, por exemplo, monocloridrato de lisina ou sulfato de lisina no caso de o aminoácido de L-lisina. Da mesma forma,

12/66 o termo ácido α-ceto também inclui os seus sais, tais como no caso de ácido α-cetoisocaproico (CCI) : CCI de cálcio, CCI de potássio ou CCI de sódio.

[0045] 0 microrganismo é preferencialmente selecionado a partir do grupo de bactérias, leveduras e fungos, entre as bactérias, especialmente de preferência a partir da família Corynebacteriaceae ou da família Enterobacteriaceae, em que o gênero Corynebacterium ou o gênero Escherichia é quase muito especialmente preferido a partir dos gêneros declarados, a espécie Corynebacterium glutamicum ou as espécies de Escherichia coli é especialmente preferida.

[0046] Numa outra forma de realização preferida, a expressão do polinucleotídeo que codifica para um polipeptídeo cuja sequência de aminoácidos é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e, de preferência, com a atividade de uma transidrogenase é aumentada de uma ou mais medidas selecionadas do seguinte grupo:

a) expressão do gene está sob o controle de um promotor, que no microrganismo utilizado para o processo é mais forte do que o nativo, ou o promotor original do gene; exemplos de promotores de modo preferido utilizável de acordo com a invenção em Corynebacterium glutamicum são descritos, por exemplo, na Figura 1 do artigo de revisão por Patek et al. (Journal of Biotechnology 104 (1-3), 311323 (2003)) . As variantes do promotor dapA descrito por Vasicova et al. (Journal of Bacteriology 181, 6188-6191 (1999)), por exemplo, o promotor A25, pode ser utilizado no

13/66 mesmo caminho. Além disso, o promotor GAP de Corynebacterium glutamicum (EP 06007373) pode ser usado. Finalmente, é possível utilizar adequadamente promotores conhecidos T3, T7, SP6, M13, lac, tac e trc descritos por Amann et ai. (Gene 69 (2), 301-315 (1988)) e Amann e Brosius (Gene 40 (2-3), 183-190 (1985));

b) aumentar o número de cópias do gene que codifica um polipeptídeo com a atividade de uma transidrogenase; preferencialmente, inserindo o gene de plasmídeos com o aumento do número de cópias e/ou por meio da integração do gene no cromossoma do microrganismo em pelo menos uma cópia;

c) expressão do gene é se realiza utilizando um local de ligação ao ribossomo, que no microrganismo usado para o processo é mais forte do que o local de ligação ao ribossomo inicial do gene;

d) expressão do gene se realiza com otimização da utilização do códon do microrganismo utilizado para o processo;

e) expressão do gene se realiza com redução de estruturas secundárias de mRNA no mRNA transcrito pelo gene;

f) expressão do gene se realiza com eliminação de terminadores de RNA polimerase do mRNA transcrito pelo gene;

g) expressão do gene se realiza usando sequências de estabilização de mRNA no mRNA transcrito pelo gene.

[0047] As medidas indicadas para o aumento da expressão podem ser adequadamente combinadas. De preferência, a expressão do polinucleotídeo que codifica um

14/66 polipeptídeo com a atividade de uma transidrogenase é aumentada através da combinação de pelo menos duas das medidas selecionados de entre o grupo a), b) e c) , especialmente de preferência uma combinação de medidas a) e b) .

[0048] Como mencionado acima, a presente invenção compreende um microrganismo e um processo para produzir um composto químico orgânico por fermentação contendo as etapas:

a) cultura do microrganismo de acordo com a presente invenção descrita acima, num meio adequado, obtendo-se um caldo de fermentação; e

b) enriquecimento do composto químico orgânico no caldo de fermentação a partir de a).

[0049] De preferência, um produto sob a forma líquida ou sólida é produzido a partir do caldo de fermentação.

[0050] Como mencionado acima, o termo microrganismo compreende bactérias, leveduras e fungos. Entre as bactérias, o gênero Corynebacterium e o gênero Escherichia podem ser mencionados em particular.

[0051] Dentro do gênero Corynebacterium, cepas que são preferidas são baseadas nas seguintes espécies:

Efficiens Corynebacterium, por exemplo, a cepa do tipo DSM44549,

Corynebacterium glutamicum, por exemplo, a cepa do tipo ATCC13032 ou a cepa R; e

Corynebacterium ammoniagenes, por exemplo, a cepa do tipo ATCC6871;

em que as cepas das espécies Corynebacterium glutamicum são muito especialmente preferidos.

15/66 [0052] Algumas das cepas das espécies de Corynebacterium glutamicum são também conhecidas na técnica anterior sob outras designações. Estas incluem, por exemplo:

cepa	ATCC13870,	que	foi	designada	Corynebacterium
acetoacidophilum;
cepa	DSM20137,	que	foi	designada	Corynebacterium
lilium;
cepa	ATCC17965,	que	foi	designada	Corynebacterium

melassecola;

cepa	ATCC14067,	que	foi	designada	Brevibacterium
flavum;
cepa	ATCC13869,	que	foi	designada	Brevibacterium
lactofermentum; e
cepa	ATCC14020,	que	foi	designada	Brevibacterium

diva ricatum.

[0053] termo Micrococcus glutamicus também foi utilizado para Corynebacterium glutamicum.

[0054]

Algumas cepas da espécie

Corynebacterium efficiens também foram designadas

Corynebacterium thermoaminogenes na técnica

FERM BP-1539.

[0055] Os representantes da Enterobacteriaceae são preferencialmente selecionados de entre os gêneros Escherichia, Erwinia, Providencia e Serratia. O gênero Escherichia e Serratia são especialmente preferidos. No caso do gênero Escherichia, em particular a espécie Escherichia coli pode ser mencionada, e, no caso do gênero Serratia, em particular as espécies Serratia marcescens pode ser mencionadas.

16/66 [0056] Os microrganismos ou cepas (cepas de partida) utilizados para as medidas para a sobre-expressão do polipeptídeo descrito nas reivindicações de preferência já possuem a capacidade para enriquecer o composto químico orgânico desejado ou compostos na célula ou para secretar ele ou eles no meio nutriente circundante e acumulando ele ou eles lá. No que se segue, a expressão produzido também é utilizado para isto. Em particular, as cepas utilizadas para as medidas de sobre-expressão possuem a capacidade para enriquecer ou acumular £ (pelo menos) 0,10 g/l, 0,25 g/l, > 0,5 g/l, 1,0 g/l, 1,5 g/l, 2,0 g/l, 2 4 g/l ou 2 10 g/l do composto desejado em (max.) 120 horas, £ 96 horas, 48 horas, 36 horas, 24 horas ou 12 horas na célula ou no meio nutriente, respectivamente. As cepas de partida são as cepas de preferência que foram produzidas por mutagênese e seleção, por técnicas de ADN recombinante ou por uma combinação de ambos os métodos.

[0057] Um perito na técnica compreenderá que um microrganismo adequado para as medidas da invenção também pode ser obtido por uma primeira sobre-expressando uma transidrogenase numa cepa selvagem, por exemplo, na cepa do tipo Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 ou na cepa ATCC 14067, e, em seguida, fazendo com que o microrganismo, por outras medidas genéticas descritas na técnica anterior, para produzir o L-aminoácido (s) desejado. A simples transformação do tipo selvagem com o polinucleotídeo indicado não é uma medida de acordo com a invenção.

[0058] Cepas secretoras ou produtoras de L-Lisina da espécie Corynebacterium glutamicum que pode servir como

17/66 cepa de partida para os microrganismos sobre-expressando transidrogenase de acordo com a invenção são, por exemplo: Corynebacterium glutamicum DSM13994 descrita na US 6.783.967, e Corynebacterium glutamicum DM1933 descrita no Blombach et ai. (Appl Environ Microbiol 2009 Jan; 75 (2):419-27).

[0059] Uma cepa de L-lisina de secreção ou produção das espécies de Corynebacterium efficiens é por exemplo: Corynebacterium thermoaminogenes AJ12521 (= FERM BP-3304) descrita na US 5.250.423.

[0060] Microrganismos que produzem L-Lisina tipicamente possuem uma aspartato quinase dessensibilizada ou resistente a retroação. Aspartato quinases resistente à retroação devem ser entendidas como aspartato quinases (LysC) que tem, em comparação com a forma selvagem (tipo selvagem), uma menor sensibilidade à inibição por misturas de lisina e treonina ou misturas de AEC (aminoetil cisteína) e treonina ou lisina sozinha ou AEC sozinha. Os genes ou alelos que codificam para estas aspartatos quinases que são dessensibilizadas em comparação com o tipo selvagem são também designadas como alelos lysC^tBR. No caso das aspartatos quinases da espécie Corynebacterium glutamicum, a cepa ATCC13032 é o tipo selvagem apropriado. No técnica anterior, numerosos alelos lysC^FBR são descritos que codificam para variantes da aspartato quinase, que possuem trocas de aminoácidos em comparação com a proteína do tipo selvagem. No caso de bactérias do gênero Corynebacterium, o gene LysC também é designado como o ask. gene. No caso de Enterobacteriaceae, a aspartato quinase

18/66 codificada pelo gene LysC também é designada como aspartoquinase III.

[0061] Uma lista detalhada afirmando trocas de amino ácidos na proteína aspartato quinase de Corynebacterium glutamicum levam a dessensibilização é dada em WO2009141330 entre outras. Variantes de aspartato quinase que levam a seguintes trocas de aminoácidos são preferidas, selecionado a partir do grupo: na posição 380 da sequência de aminoácidos de L-isoleucina em vez de L-treonina e opcionalmente na posição 381 da L-fenilalanina em vez de Lserina, na posição 311 de L-isoleucina em vez de L-treonina na posição 279 de L-treonina em vez de L-alanina.

[0062] Uma cepa secretora ou produtora de L-metionina da espécie Corynebacterium glutamicum que pode servir como cepa de partida para os microrganismos que sobre-expressam transidrogenase de acordo com a invenção é, por exemplo, Corynebacterium glutamicum DSM 17322 descrito no documento WO 2007/011939.

[0063] Representantes conhecidos de cepas secretoras ou produtoras de L-triptofano de bactérias corineformes que podem servir como cepa de partida para os microrganismos

que sobre-expressam	transidrogenase de	acordo	com a
invenção são, por exemplo:
Corynebacterium	glutamicum	K76 ( =	FERM	BP-1847)
descrita na US 5.563.	052;
Corynebacterium	glutamicum	BPS13 (=	FERM	BP-1777)

descrita em US 5.605.818; e

Corynebacterium glutamicum FERM BP-3055 descrita na US

5.235.940.

19/66 [0064] Representantes conhecidos de cepas secretoras ou produtoras de L-valina de bactérias corineformes que podem servir como cepa de partida para os microrganismos que sobre-expressam transidrogenase de acordo com a invenção são, por exemplo:

Brevibacterium lactofermentum FERM BP-1763 descrita na OS 5.188.948;

Brevibacterium lactofermentum FERM BP-3007 descrita na US 5.521.074;

Corynebacterium glutamicum FERM BP-3006 descrita na US 5.521.074; e

Corynebacterium glutamicum FERM BP-1764 descrita na US 5.188.948.

[0065] Representantes conhecidos de cepas secretoras ou produtoras de L-isoleucina de bactérias corineformes que podem servir como cepa de partida para os microrganismos

que sobre-expressa)	m transidrogenase de	acordo	com	a
invenção são, por exemplo,: Brevibacterium flavum FERM BP-760	descrita	na	US
4.656.135;
Brevibacterium	flavum FERM BP-2215	descrita	na	US
5.294.547; e
Corynebacterium	glutamicum FERM BP-758 descrita	na	US

4.656.135.

[0066] Representantes conhecidos de cepas secretoras ou produtoras de L-homo-serina de bactérias corineformes que podem servir como cepa de partida para os microrganismos sobre-expressam transidrogenase de acordo com a invenção são, por exemplo:

20/66

Micrococcus	glutamicus	ATCC	14296	descrita na	US
3.189.526; e
Micrococcus	glutamicus	ATCC	14297	descrita na	US
3.189.526.

[0067] Microrganismos que produzem ou que segregam cadaverina são por exemplo descritos no documento WO 2007/113127.

[0068] Representantes conhecidos de cepas secretoras ou produtoras de L-treonina do gênero Escherichia, especialmente da espécie Escherichia coli que podem servir como cepa de partida para os microrganismos que sobreexpressam transidrogenase de acordo com a invenção são, por exemplo:

- H4581 Escherichia coli (EP 0 301 572);

- Escherichia coli KY10935 (Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61 (11): 1877-1882 (1997));

- Escherichia coli MG442 VNIIgenetika (US-A-4.278.765);

- Escherichia coli VNIIgenetika Ml (US-A-4.321.325);

Escherichia coli VNIIgenetika 472T23 (US-A5.631.157);

- Escherichia coli BKIIM B-3996 (US-A-5.175.107);

- Escherichia coli kat 13 (WO 98/04715);

- Escherichia coli KCCM-10132 (WO 00/09660).

[0069] Representantes conhecidos de cepas secretoras ou produtoras de L-treonina do gênero Serratia, especialmente da espécie Serratia marcescens que podem servir como cepa de partida para os microrganismos que sobre-expressam transidrogenase de acordo com a invenção são, por exemplo:

21/66

- Serratia marcescens HNr21 (Applied and Environmental Microbiology 38(6): 1045-1051 (1979));

- Serratia marcescens TLrl56 (Gene 57 (2-3): 151-158 (1987)) ;

- Serratia marcescens T-2000 (Applied Biochemistry and Biotechnology 37(3): 255-265 (1992)).

[0070] Representantes conhecidos de cepas secretoras ou produtoras de L-triptofano do gênero Escherichia, especialmente das espécie Escherichia coli que podem servir como cepa de partida para os microrganismos que sobreexpressam transidrogenase de acordo com a invenção são por exemplo:

- Escherichia coli JP4735/pMU3028 (US 5.756.345);

- Escherichia coli JP6015/pMU91 (US 5.756.345);

- Escherichia coli SV164 (pGH5) (WO 94/08031);

- E. coli AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263) (US 4.371.614);

E. coli AGX6 (pGX50)aroP (NRRL B-12264) (US 4.371.614);

Escherichia coli AGX17/pGX50, pACKG4-pps (WO 97/08333);

- Escherichia coli ATCC 31743 (CA 1182409);

- E. coli C534/PD2310, pDM136 (ATCC 39795) (WO 87/01130);

- JB102 Escherichia coii/p5LRPS2 (US 5.939.295).

[0071] Um representante conhecido de cepas secretoras ou produtoras de L-homo-serina do gênero Escherichia, especialmente da espécie Escherichia coli, que podem servir como cepa de partida para os microrganismos que sobreexpressam transidrogenase de acordo com a invenção é, por exemplo:

22/66

Escherichia coli NZ10rhtA23/pAL4 (US 6.960.455).

[0072] Representantes conhecidos de cepas secretoras ou produtoras de L-lisina do gênero Escherichia, especialmente da espécie Escherichia coli que pode servir como cepa de partida para os microrganismos que sobreexpressam transidrogenase de acordo com a invenção são por exemplo:

• Escherichia coli pDAl/TOC21R (= CNCM 1-167) (FR-A2.511.032);

• Escherichia coli NRRL B-12199 (US 4.346.170);

• Escherichia coli NRRL B-12185 (US 4.346.170).

[0073] Uma lista detalhada indicando que aminoácidos mudam na proteína de aspartato quinase III de Escherichia coli levam a dessensibilização para inibição por L-lisina é dada, inter alia, no documento EP 0 834 559 Al, na página 3 (linhas 29-41). Uma variante de aspartato quinase é preferida que contenha L-ácido aspártico em vez de glicina na posição 323 da sequência de aminoácidos e/ou Lisoleucina em vez de L-metionina na posição 318.

[0074] Um representante conhecido de cepas secretoras ou produtoras de L-valina do gênero Escherichia, especialmente da espécie Escherichia coli, que pode servir como cepa de partida para os microrganismos que sobreexpressam transidrogenase de acordo com a invenção é, por exemplo:

• AJ11502 Escherichia coli (NRRL B-12288) (US-A4.391.907).

[0075] Polipeptídeo com a atividade de uma transidrogenase significa uma enzima que é capaz de converter NADH em NADPH e vice-versa, isto é, no contexto

23/66 do presente invenção, o termo transidrogenase significa um dinucleotideo de nicotinamida transidrogenase.

[0076] Transidrogenases dos organismos mais variados encontram-se descritos nas bases de dados públicas, por exemplo, o banco de dados UniProtKB (Universal Protein Resource Knowledgebase). 0 banco de dados UniProtKB é mantido pelo Consórcio UniProt, para que o Instituto Europeu de Bioinformática (EBI, Wellcome Trust, Hinxton,

Cambridge,

Reino Unido), o Instituto Suíço de

Bioinformática (SIB,

Centro Médico Universitário, Genebra,

Suíça) e Recursos de Informação de Proteína (PIR,

Universidade de Georgetown, Washington, DC, EUA) pertencem. [0077] Os genes para uma transidrogenase podem ser isolados a partir dos organismos por meio da reação em cadeia da polimerase (PCR) utilizando os iniciadores adequados. As instruções são dadas, entre outras, no manual de laboratório PCR de Newton e Graham (Spektrum

Akademischer Verlag, Heidelberg, Alemanha, 1994) e no documento WO 2006/100211, páginas 14 a 17.

[0078] Para as medidas da invenção, que codificam genes a partir de Corynebacteria são preferencialmente utilizadas para a transidrogenase. Especialmente de preferência, genes são usados que codificam para polipeptídeos com atividade de uma transidrogenase, cuja sequência de aminoácidos é 2 (pelo menos) 2 80%, 2 90%, 2 92%, 2. 94%, 96%, 2 97%, 2 98%, 2 99%, idêntica à sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 2. Durante a investigação que conduziu a presente invenção, o polinucleotídeo que codifica transidrogenase a partir de Corynebacterium glutamicum foi identificado.

24/66

[0079]	A sequência do gene	é depositado	sob SEQ	ID
No. 1.
[0080]	Do ponto de vista	químico, um	gene é	um
polinucleotídeo. Um polinucleotídeo que codifica	uma

proteína/polipeptídeos é usada aqui como sinônimo do termo gene.

[0081] Numa forma de realização preferida do processo de acordo com a invenção, ou do microrganismo de acordo com a invenção, este último sobre-expressa um gene que codifica um polipeptídeo selecionado a partir dos seguintes i) a vi) :

i) um polipeptídeo que consiste de, ou que contém a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2;

ii) um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica a sequência aminoácidos de i), ou seja, em que pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% das posições de aminoácidos são idênticas às da SEQ ID NO: 2;

iii) um polipeptídeo tal como descrito em i) ou ii), em que o polipeptídeo possui a atividade de uma transidrogenase;

iv) um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos contendo uma deleção, substituição, inserção

e/ou adição de 1 a 90,	1	a 45, 1 a 23, 1	a 12, 1 a	6
resíduos de aminoácidos	em relação à	sequência	de
aminoácidos mostrada em	SEQ	ID NO: 2;
v) um polipeptídeo,	tal	como descrito em	iv) , em que	o

polipeptídeo possui a atividade de uma transidrogenase;

25/66 vi) um polipeptídeo tal como descrito em V), em que o polipeptídeo possui a atividade de uma transidrogenase e a deleção, substituição, inserção e/ou adição de resíduos de aminoácidos que não afetam essencialmente a atividade.

[0082] A percentagem de identidade é calculada de um modo preferido ao longo de todo o comprimento da região de aminoácidos ou de ácido nucleico. Um número de programas, que são baseados em um grande número de algoritmos, estão disponíveis para um perito na técnica para comparação de sequências. A este respeito, os algoritmos de Needleman e Wunsch ou Smith e Waterman dão resultados particularmente fiáveis. A seguir estão disponíveis para alinhamento de sequências: o programa PileUp (J. Mol. Evolution., 25, 351360, 1987, de Higgins et al., CABIOS, 5 1989: 151-153) ou os programas Gap e BestFit [Needleman e Wunsch (J. Mol Biol. 48; 443-453 (1970)) e Smith e Waterman (Adv. Appl. Math. 2; 482-489 (1981))], que são parte do pacote de software GCG [Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, EUA 53711 (1991)]. As percentagens dadas acima para a identidade de sequência são de preferência calculadas com o programa GAP sobre a totalidade da região da sequência.

[0083] Opcionalmente, são preferidas as trocas de aminoácidos conservativas. No caso dos aminoácidos aromáticos, o termo trocas conservativas é usado quando a fenilalanina, triptofano e tirosina são trocados um pelo outro. No caso de aminoácidos hidrofóbicos, o termo trocas conservativas é usado quando a leucina, isoleucina e valina, são trocadas uma pelo outra. No caso de aminoácidos polares, o termo trocas conservativas é usado quando a

26/66 glutamina e a asparagina são trocadas uma pelo outra. No caso de ácidos aminados básicos, o termo trocas conservativas é usada quando a arginina, lisina e histidina são trocadas uma pela outra. No caso de aminoácidos ácidos, o termo trocas conservativas é usado, quando o ácido aspártico e ácido glutâmico são trocados um pelo outro. No caso de aminoácidos que contenham grupos hidroxila, o termo trocas conservativas é usado quando a serina e a treonina são trocadas uma pela outra.

[0084] Configurações especialmente preferidas do processo de acordo com a invenção, portanto, refere-se a produção de L-lisina ou L-metionina por fermentação utilizando um microrganismo do gênero Corynebacterium ou Escherichia, caracterizado em que as seguintes etapas são realizadas

a) fermentação de um microrganismo que produz um composto químico orgânico, em que um polinucleotídeo é sobre-expresso no microrganismo, em que o polinucleotídeo codifica para um polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO: 2, incluindo 1 a 12, 1 a 6 deleções, substituições, inserções e/ou adições, e em que a fermentação se realiza num meio de fermentação, com formação de um caldo de fermentação;

b) enriquecimento do composto químico orgânico no caldo de fermentação a partir de a).

[0085] Configurações especialmente preferidas do processo de acordo com a invenção também se relacionam com a produção de L-lisina ou L-metionina por fermentação, utilizando um microrganismo do gênero Corynebacterium ou Escherichia, caracterizado em que as seguintes etapas são realizadas:

27/66

a) fermentação de um microrganismo que produz um composto químico orgânico, em que um polinucleotídeo é sobre-expresso no microrganismo, em que o polinucleotídeo codifica para um polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO: 2, incluindo 1 a 12, 1 a 6 deleções, substituições, inserções e/ou adições, em que o polipeptídeo possui a atividade de uma transidrogenase e em que a fermentação se realiza num meio de fermentação, com formação de um caldo de fermentação;

b) enriquecimento do composto químico orgânico no caldo de fermentação a partir de a).

[0086] Além disso, os polinucleotídeos podem ser utilizados que hibridizam para a sequência de nucleotídeos complementar a SEQ ID NO: 1, de preferência a região de codificação de SEQ ID NO: 1, sob condições rigorosas e codificam para um polipeptídeo que tem a atividade de uma transidrogenase.

[0087] Um perito na técnica pode encontrar instruções para a hibridização de ácidos nucleicos ou polinucleotídeos, entre outros, no manual O guia de usuários do sistema DIG de hibridização de filtro da empresa Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Alemanha, 1993) e em Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255-260 (1991)). A hibridização se realiza sob condições rigorosas, isto é, apenas os híbridos são formados para a qual a sonda, ou seja, um polinucleotídeo que compreende as sequências de nucleotídeos complementares à SEQ ID NO: 1, de preferência para a região de codificação de SEQ ID NO: 1, e a sequência alvo, ou seja, os polinucleotídeos tratados ou identificados com a sonda,

28/66 são pelo menos 80% idênticos. É sabido que o rigor da hibridização, incluindo as etapas de lavagem é influenciada ou determinada variando a composição tampão, a temperatura e a concentração do sal. A reação de hibridização é geralmente realizada a relativamente baixa severidade em comparação com as etapas de lavagem (Guia de hibridação Hybaid, Hybaid Limites, Teddington, Reino Unido, 1996).

[0088] Por exemplo, um tampão correspondente a 5x tampão SSC a uma temperatura de aprox. 50°C-68°C pode ser usado para a reação de hibridização. Além disso, as sondas também podem hibridizar com os pclinucleotídeos que possuem menos de 70% de identidade com a sequência de nucleotídeo da sonda utilizada. Esses híbridos são menos estáveis e são removidos por lavagem sob condições rigorosas. Isto pode, por exemplo, ser conseguido através da redução da concentração de sal para 2x SSC ou lx SSC e, em seguida, opcionalmente, 0,5x SSC (O Guia do Usuário do Sistema DIG de Hibridação de Filtro, Boehringer Mannheim, Mannheim,

Alemanha,

1995), definindo uma temperatura de aproximadamente

50°C - 68°C, aproximadamente

52°C - 68°C, aproximadamente

54°C - 68°C, aproximadamente

56°C - 68°C, aproximadamente

58°C - 68°C, aproximadamente

60°C - 68°C, aproximadamente

62°C - 68°C, aproximadamente

64°C - 68°C, aproximadamente

66°C

68°C. Faixas de temperatura de aproximadamente

64°C - 68°C ou aproximadamente 66°C - 68°C são os preferidos. Opcionalmente, é possível diminuir a concentração de sal para uma concentração correspondente a

0,2 x SSC ou 0,1 x SSC. Opcionalmente, o tampão SSC contém dodecil sulfato de sódio (SDS) a uma concentração de 0,1%. Aumentando gradualmente a temperatura de hibridização em

29/66 etapas de aproximadamente 1-2°C a partir de 50°C a 68°C, os fragmentos de polinucleotideos podem ser isolados que tem pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos

94%, pelo menos 96%, pelo menos

97%, pelo menos menos 99%, opcionalmente 100% de identidade com a sequência ou sequência complementar da sonda utilizada e codificar para um polipeptídeo que possui a atividade de uma transidrogenase. Mais informações sobre a hibridização estão comercialmente disponíveis sob a forma dos chamados kits (por exemplo

DIG Easy

Hyb pela empresa Roche

Diagnostics

GmbH,

Mannheim,

Alemanha,

Catálogo

No.

1.603.558) .

[0089]

Para as medidas da invenção, um gene que codifica uma transidrogenase é sobre-expresso num microrganismo ou numa cepa mãe ou de partida produzindo o aminoácido (s) desej ado.

[0090] sobre-expressão é geralmente entendida como um aumento na concentração intracelular ou atividade de um ácido ribonucleico, de uma proteína (polipeptídeo) ou de uma enzima em comparação com a cepa de partida (cepa-mãe)

ou cepa do	tipo	selvagem, quando a	última é a cepa	de
partida. A	cepa	de	partida (cepa-mãe)	é entendida como a
cepa sobre	qual	a	medida que leva a	sobre-expressão	foi
realizada.
[0091]	Para	a	sobre-expressão,	são preferidos	os

métodos de sobre-expressão recombinante. Este abrange todos os métodos em que um microrganismo é produzido utilizando uma molécula de DNA que é preparada in vitro.

DNA deste tipo compreendem, por exemplo, cassetes de expressão, genes, alelos,

Moléculas de promotores, regiões de

30/66 codificação, etc. Estes são transferidos para o microrganismo desejado através de métodos de transformação,

conj ugação,	transdução ou métodos semelhantes.
[0092]	Através das medidas de sobre-expressão, a

atividade (atividade total na célula) ou concentração do polipeptídeo correspondente é geralmente aumentada em pelo

menos 10%,

25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% ou

500%, de preferência no máximo até 1000%, 2,000%, 4,000%, 10,000% ou 20,000% relativamente à atividade ou concentração do polipeptídeo na cepa antes da medida levando a sobre-expressão.

[0093]

Um grande número de métodos estão disponíveis

na técnica anterior para alcançar sobre-expressão. Estes

incluem o	aumento do número de cópias e modificar as
sequências	de nucleotídeos que regulam ou controlam a

expressão do gene. A transcrição de um gene é controlada,

inter alia,

pelo promotor e, opcionalmente, por proteínas

que reprimem a transcrição (proteínas repressoras) ou promovem a transcrição (proteínas ativadoras). A translação do RNA formado é controlada inter alia o sítio de ligação ao ribossomo e o códon de iniciação. Os polinucleotídeos ou moléculas de DNA que compreendem um promotor e um sítio de ligação ao ribossomo e um opcionalmente um códon de iniciação também são chamados um cassete de expressão.

[0094]	0 número de cópias pode ser aumentado por
plasmídeos,	que se replicam no citoplasma do microrganismo.
Por isso,	toda uma série de plasmídeos para as mais
diferentes	grupos de microrganismos são descritos na

técnica anterior, com o qual o desejado aumento no número de cópias do gene pode ser trazido. Plasmídeos adequados

31/66 para o gênero Escherichia são descritos, por exemplo, no manual de Biologia Molecular, Labfax (Ed.: T.A. Brown, Bios Scientific, Oxford, Reino Unido, 1991). Plasmídeos adequados para o gênero Corynebacterium são descritos por exemplo em Tauch et al. (Journal of Biotechnology 104 (13), 27-40, (2003)), ou em Stansen et al. (Applied Environmental Microbiology 71, 5920-5928 (2005)).

[0095] Além disso, o número de cópias pode ser aumentado em pelo menos uma (1) cópia através da inserção de cópias adicionais para o cromossoma do microrganismo. Os métodos adequados para o gênero Corynebacterium são descritos, por exemplo nos documentos de patente WO 03/014330, WO 03/040373 e WO 04/069996. Os métodos adequados para o gênero Escherichia são, por exemplo, a incorporação de uma cópia do gene no att-local do fago (Yu e Court, Gene 223, 77-81 (1998)), amplificação cromossômica pelo fago Mu, tal como descrito na EP 0 332 448, ou os métodos de troca de genes por meio de condicionalmente replicante de plasmídeos descritos por Hamilton et al.

(Journal of Bacteriology 174, 4617-4622 (1989)) ou Link et al. (Journal of Bacteriology 179, 6228-6237(1997)).

[0096] 0 aumento na expressão do gene pode, além disso, ser conseguido através de um promotor forte, que está ligado funcionalmente com o gene a ser expresso. De preferência é usado um promotor que é mais forte do que o promotor natural, ou seja, que está presente na cepa-mãe ou na cepa do tipo selvagem. Toda uma faixa de métodos está disponível para isto na técnica anterior.

32/66 [0097] Ligação funcional significa, neste contexto, o arranjo sequencial de um promotor a um gene, que conduz a expressão do gene e o seu controle.

[0098] Promotores adequados para o gênero Corynebacterium podem ser encontrados, inter alia, em Morinaga et al. (Journal of Biotechnology 5, 305-312, (1987)), nos documentos de patente EP 0 629 699 A2, US 2007/0259408 Al, WO 2006/069711, EP 1 881 076 Al e EP 1 918 378 Al e em contas sinópticas tais como o Manual de Corynebacterium glutamicum (Eds.: Lothar Eggeling e Michael Bott, CRC Press, Boca Raton, Estados Unidos (2005)) ou o livro Corynebacteria, Genômica e Biologia Molecular (Ed .: Andreas Burkovski, Caister Academic Press, Norfolk,

Reino Unido (2008)). Os promotores que podem ser utilizados são igualmente descritos na Figura 1 do artigo de revisão por Patek et al. (Journal of Biotechnology 104 (1-3), 311323 (2003) ) . Do mesmo modo, as variantes do promotor dapA descritas por Vasicova et al. (Journal of Bacteriology 181, 6188-6191 (1999)), por exemplo, o promotor A25, pode ser utilizado. Além disso, o promotor GAP de Corynebacterium glutamicum (EP 06007373, EP 2386650) ou variantes do promotor GAP (documento WO 2013000827) podem ser usados. Finalmente, é possível utilizar adequadamente os promotores

conhecidos	T3,	T7,	SP6,	M13, lac, tac e trc	descrito	por
Amann et	al.	(Gene	69	(2), 301-315 (1988))	e Amann e
Brosius (Gene	40	(2-3)	, 183-190 (1985)) .	Exemplos	de
promotores	que	permitem	expressão controladas, isto	é,
indução ou	de	repressão,	são descritas, por	exemplo,	em
Tsuchiya e	Morinaga	(Bio/Technology 6, 428-430	(1988)).

33/66 [0099] Tais promotores ou cassetes de expressão são tipicamente inseridos a uma distância de 1 a 1000, de preferência de 1 a 500, nucleotídeos a montante do primeiro nucleotídeo do códon de iniciação da região de codificação do gene.

[0100] É igualmente possível posicionar várias promotores antes de o gene desejado ou ligá-los funcionalmente com o gene a ser expresso e deste modo obter um aumento da expressão. Exemplos disto são descritos no documento de patente WO 2006/069711.

[0101] A estrutura de promotores de Escheríchia coli é bem conhecida. Por conseguinte, é possível aumentar a força de um promotor, modificando a sua sequência por meio de uma ou mais troca (s) e/ou uma ou mais inserção (ões) e/ou um ou mais deleção (ões) de nucleotídeos. Exemplos disso podem ser verificados inter alia em Lexikon der Herder Biologie [dicionário Herder de biologia] (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Alemanha (1994)).

[0102] Exemplos da alteração de promotores para aumentar a expressão em bactérias corineformes podem ser encontrados na US 6.962.805 B2 e no trabalho de Vasicová et al. (Bacteriol outubro 1999; 181 (19): 6188-91). O fortalecimento de um gene alvo através da adição ou substituição de um promotor homólogo pode ser encontrado, por exemplo, no EP 1 697 526 Bl.

[0103] A estrutura do local de ligação ao ribossomo de Corynebacterium glutamicum também é bem conhecida e é descrita, por exemplo, em Amador (Microbiology 145, 915-924 (1999)) e em manuais de genética e livros didáticos, por exemplo Genes e Clones (Winnacker, Verlag Chemie,

34/66

Weinheim, Alemanha (1990)) ou Genética molecular de bactérias (Dale and Park, Wiley and Sons Ltd., Chichester, Reino Unido (2004)).

[0104] Para alcançar sobre-expressão é também possível aumentar a expressão de proteínas ativadoras ou para reduzir ou desligar a expressão de proteínas repressoras.

[0105] As medidas acima referidas para a sobreexpressão podem ser adequadamente combinadas. Por exemplo, a utilização de um cassete de expressão adequado pode ser combinada com o aumento do número de cópias, e de preferência a utilização de um promotor adequado pode ser combinada com o aumento do número de cópias.

[0106] Instruções para a manipulação de DNA, digestão e ligação de DNA, transformação e seleção de transformantes podem ser encontrados, inter alia, no manual bem conhecido de Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

[0107] A extensão da expressão ou sobre-expressão pode ser encontrada por medição da quantidade de mRNA transcrito pelo gene, por determinação da quantidade do polipeptídeo e por determinação da atividade da enzima.

[0108] Para a determinação da quantidade de mRNA, é possível utilizar, entre outros, o método de Northern blotting e RT-PCR quantitativo. Em RT-PCR quantitativo, a reação em cadeia de polimerase é precedida por transcrição reversa. Para isso, é possível usar o sistema LightCycler™ da empresa Roche Diagnostics (Boehringer Mannheim GmbH, Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemanha),

35/66 descrito, por exemplo, em Jungwirth et al. (FEMS Microbiology Letters 281, 190-197 (2008)). A concentração da proteína pode ser determinada no gel por separação em gel de proteínas 1 e 2 dimensional, seguido por identificação óptica da concentração de proteína com software avaliação correspondente. Um método usual para a preparação de géis de proteína no caso de bactérias corineformes e para a identificação das proteínas é o procedimento descrito por Hermann et al. (Eletroforese, 22: 1712-1723 (2001)). A concentração de proteína pode também ser determinada por hibridização Western-blot com um anticorpo especifico para a proteína a ser detectado (Sambrook et al., Molecular Cloning:. A Laboratory Manual 2^a Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989) seguido de avaliação óptica com software apropriado para a determinação da concentração (Lohaus e Meyer (1998) Biospektrum 5: 32-39; Lottspeich, Angewandte Chemie 321: 2630-2647 (1999)).

[0109] O processo de acordo com a invenção, e/ou os microrganismos de acordo com a invenção podem ser realizados/cultivados continuamente - como descrito, por exemplo, em WO 05/021772 - ou descontinuamente no processo em lotes (ou cultura em lotes) ou em descontínuo alimentado (fed-batch) repetido ou processo descontínuo alimentado para a finalidade de produzir o composto químico orgânico desejado. Um resumo de natureza geral dos métodos de cultura conhecidos pode ser encontrado em livro didático de Chmiel (Tecnologia de Bioprocessos 1. Introdução à Tecnologia de Bioprocessos (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) ou no livro didático por Storhas

36/66 (Biorreactores e dispositivos periféricos (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)).

[0110] O meio de cultura ou meio de fermentação para ser utilizado adequadamente deve satisfazer os requisitos das respectivas cepas. Descrições de meios de cultura para vários microrganismos são dadas no Manual de Métodos de

Bacteriologia

Geral da Sociedade

Americana de

Bacteriologia (Washington D.C.,

EUA, 1981). Os termos meio de cultura e meio de fermentação ou meio são intercambiáveis.

[0111] Um meio especial não é necessário para realizar a presente invenção.

[0112] Açúcares e carboidratos, por exemplo, glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, melaço, soluções contendo sacarose a partir do processamento de açúcar de beterraba ou de cana de açúcar, amido, amido hidrolisado e celulose, óleos e gorduras, por exemplo, óleo de soja, óleo de girassol, óleo de amendoim e óleo de coco, ácidos graxos, por exemplo, ácido palmitico, ácido esteárico e ácido linoleico, álcoois, tais como, por exemplo, glicerol, metanol e etanol e ácidos orgânicos, por exemplo, ácido acético ou ácido lático, podem ser utilizados como fonte de carbono.

[0113] Compostos contendo nitrogênio orgânico tais como peptonas, extrato de levedura, extrato de carne, extrato de malte, licor de infusão de milho, farinha de soja e ureia ou compostos inorgânicos, tais como sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio e nitrato de amônio, podem ser usados como fonte de

37/66 nitrogênio. As fontes de nitrogênio podem ser utilizadas individualmente ou como uma mistura.

[0114]

Ácido fosfórico, di-hidrogenofosfato de potássio ou hidrogeno fosfato de dipotássio ou os correspondentes sais contendo sódio podem ser utilizados como fonte de fósforo.

[0115] meio de cultura deve, também, conter sais, por exemplo, sob a forma de cloretos ou sulfatos de metais tais como, por exemplo, sódio, potássio, magnésio, cálcio e do ferro, por exemplo sulfato de magnésio ou sulfato de ferro, que são necessários para o crescimento.

Finalmente, as substâncias essenciais de crescimento, tais como aminoácidos, por exemplo, homoserina, e vitaminas, por exemplo, tiamina, biotina ou ácido pantotênico, podem ser utilizados além das substâncias acima mencionadas.

[0116]

Os materiais de alimentação atrás referidos podem ser adicionados à cultura sob a forma de uma única preparação ou podem ser adicionados de maneira adequada durante a cultura.

[0117]

Para o controle de pH da cultura, compostos básicos tais como hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, amoníaco ou amoníaco aquoso ou compostos de ácidos, tais como ácido fosfórico ou ácido sulfúrico são utilizados de um modo adequado.

O pH é geralmente ajustado para um valor de 6,0

8,5, de preferência 6,5 a 8. Para controlar a formação de espuma, agentes antiesponjamento, por exemplo, ésteres de ácidos graxos de poliglicol podem ser usados.

Para manter a estabilidade do plasmídeo, as substâncias adequadas com ação seletiva, por exemplo, antibióticos, podem ser adicionados ao meio.

A fermentação

38/66 é preferivelmente realizada sob condições aeróbicas. Para manter estas condições, o oxigênio ou misturas de gases contendo oxigênio, por exemplo ar, são alimentadas para dentro da cultura. É também possível a utilização de líquidos que são enriquecidas com peróxido de hidrogênio. Opcionalmente, a fermentação é realizada a uma sobre pressão, por exemplo, a uma sobre pressão de 0,03 a 0,2 MPa. A temperatura da cultura é normalmente de 20°C a 45°C e de preferência 25°C a 40°C, especialmente de preferência de 30° a 37°C. Em processos descontínuos, a cultura é preferivelmente continuada até que uma quantidade formada que é suficiente para que a medida para a obtenção do composto químico orgânico desejado. Este objetivo é normalmente alcançado dentro de 10 horas a 160 horas. Nos processos contínuos, tempos de cultura mais longos são possíveis. Através da atividade dos microrganismos, há enriquecimento (acumulação) do composto químico orgânico no meio de fermentação e/ou nas células dos microrganismos.

[0118] Exemplos de meios de fermentação adequados pode ser encontrados inter alia nos documentos de patente US 5.770.409, US 5.990.350, US 5.275.940, WO 2007/012078, US 5.827.698, WO 2009/043803, US 5.756.345 ou US 7.138.266.

[0119] A análise de L-aminoácidos para determinação da concentração em um ou mais ponto (s) de tempo no decurso da fermentação pode ser realizada por separação dos Laminoácidos por meio de cromatografia de troca iônica, de preferência cromatografia de troca catiônica, com subsequente derivação pós-coluna utilizando ninidrina, como descrito em Spackman et al. (Analytical Chemistry 30: 11901206 (1958)). Em vez de ninidrina, orto-ftadialdeído também

39/66 pode ser usado para a derivação pós-coluna. Um artigo de revisão em cromatografia de troca iônica pode ser encontrado em Pickering (LC -GC (Magazine of Chromatographic Science) 7(6), 484-487 (1989)).

[0120] Também é possível proceder a uma derivação précoluna, por exemplo, utilizando orto-ftalaldeído ou isotiocianato de fenila e separar os derivados de aminoácido resultantes por de cromatografia de fase reversa (RP) de preferência sob a forma de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Um tal método é descrito por exemplo em Lindroth et al. (Analytical Chemistry 51: 11671174 (1979)).

[0121] Detecção é fotométrica (absorção, fluorescência).

[0122] Uma conta sinóptica de análise de aminoácidos pode ser encontrada inter alia no livro de texto Bioanalytik por Lottspeich e Zorbas (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Alemanha, 1998).

[0123] A análise de α-ceto ácidos tal como KIC para a determinação da concentração em um ou mais ponto (s) de tempo, no decurso da fermentação pode ser realizada por separação dos ceto-ácidos e outros produtos secretados por meio de cromatografia de troca iônica, de preferência de cromatografia de troca catiônica numa coluna de polímero de estireno-divinilbenzeno sulfonado na forma H+, por exemplo, utilizando ácido sulfúrico 0,025 N, com detecção UV subsequente a 215 nm (em alternativa também a 230 ou 275 nm) . De um modo preferido, uma coluna REZEX RFQ - fruta rápida H + (Phenomenex) pode ser utilizada, outros fornecedores são possíveis para a fase de separação (por

40/66 exemplo, Aminex a partir de BioRad). Separações similares são descritas nos exemplos de aplicação correspondente dados pelos fornecedores.

[0124] O desempenho dos métodos ou processos de fermentação de acordo com a invenção com respeito a uma ou mais dos parâmetros selecionados a partir do grupo de concentração (composto formado por volume), rendimento (composto formado por fonte de carbono consumido), formação (composto formado por volume e tempo) e formação específica (composto formado por matéria seca celular ou biomatéria seca e tempo, ou composto formado por proteína celular e tempo) ou também outros parâmetros de processo e suas combinações, é aumentado em pelo menos 0,5%, pelo menos 1%, pelo menos 1,5% ou, pelo menos, 2%, em relação a métodos ou processos de fermentação com microrganismos, em que há um aumento da atividade de uma transidrogenase.

[0125] Através das medidas de fermentação, um caldo de fermentação é obtido que contém o composto químico orgânico desejado, de um modo preferido L-aminoácido.

[0126] Isto é seguido pelo fornecimento ou produção ou obtenção de um produto na forma líquida ou sólida contendo o composto químico orgânico.

[0127] Um caldo de fermentação é para ser entendido como um meio de fermentação ou em meio nutriente em que um microrganismo foi cultivado durante um certo tempo e a uma determinada temperatura. 0 meio de fermentação ou os meios usados durante a fermentação contém/contêm todas as substâncias ou componentes que assegurem a produção do composto desejado e tipicamente multiplicação ou viabilidade.

41/66 [0128] Após a conclusão da fermentação, o caldo de fermentação resultante assim contém:

a) a biomassa (massa celular) do microrganismo resultante da multiplicação das células do microrganismo;

b) o composto químico orgânico desejado formado no decurso da fermentação;

c) os subprodutos orgânicos formados no decurso da fermentação; e

d) os constituintes do meio de fermentação utilizados ou os materiais de alimentação, por exemplo, vitaminas, tais como biotina ou os seus sais tais como o sulfato de magnésio, não consumido pela fermentação.

[0129] Os subprodutos orgânicos incluem substâncias que são produzidas e opcionalmente são secretadas pelos microrganismos utilizados na fermentação, além do respectivo composto desejado. Isto também inclui açúcares, por exemplo, trealose.

[0130] O caldo de fermentação é tomado a partir do vaso de cultura ou o tanque de fermentação, opcionalmente coletado e usado para preparação de um produto contendo o composto químico orgânico, de preferência um produto contendo L-aminoácido, na forma líquida ou sólida. A expressão obtenção do produto contendo L-aminoácido também é utilizada para isto. No caso mais simples, o caldo de fermentação contendo L-aminoácido retirado do tanque de fermentação é em si o produto obtido.

[0131] Através de uma ou mais das medidas selecionadas a partir do grupo de:

42/66

a)	remoção,	parcial	(>	0% a	<	80%) para	completar
(100%)	ou quase	completar	P	80%,		90%, > 95%,	S 96%, £
97%, >	98%, 99%) da água	r
b)	remoção,	parcial	(>	0% a	<	80%) para	completar
(100%)	ou quase	completar	(^	80%,	>	90%, 95%,	> 96%,
97%, >	98%, 99%) da biomassa, em	que esta é opcionalmente
inativada antes	da remoção	f
c)	remoção,	parcial	(>	0% a	<	80%) para	completar
(100%)	ou quase	completar	(^	80%,	£	90%, £ 95%,	> 96%,
97%,	98%, >	99%, 99,3%, >	99	,7%) dos subprodutos

orgânicos formados no decurso da fermentação; e

d) remoção, parcial (> 0%) para completar (100%) ou quase completar (^ 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, > 98%,

99%, S 99,3%, è 99,7%) dos componentes do meio de fermentação utilizados dos materiais de alimentação não consumido pela fermentação;

a partir do caldo de fermentação, a concentração ou purificação do composto químico orgânico desejado é alcançado. Deste modo, os produtos são isolados que têm um teor desejado do composto.

[0132] Ά remoção, parcial (> 0% a < 80%) para completar (100%) ou quase completar (2 80% a <100%) da água (medida a)) é também denominada secagem.

[0133] Numa variante do processo, por remoção completa ou quase completa da água, da biomassa, dos subprodutos orgânicos e dos constituintes não consumidos do meio de fermentação utilizado, produto puro (^ 80% em peso, 90% em peso) ou de alta pureza (^ 95% em peso, 97% em peso, 99% em peso%) forma o composto químico orgânico desejado, de um modo preferido L-aminoácidos, são obtidos. Para as

43/66 medidas de acordo com a), b) , c) ou d), toda uma série de instruções técnicas estão disponíveis na técnica anterior. [0134] No caso dos processos para a produção de ácidos orgânicos ou L-valina, L-leucina e L-isoleucina utilizando bactérias do gênero Corynebacterium, esses processos são preferidos em que produtos são obtidos que não contêm quaisquer constituintes do caldo de fermentação. Estes são utilizados em particular em medicina humana, na indústria farmacêutica e na indústria alimentar.

[0135] No caso do aminoácido L-lisina, essencialmente quatro diferentes formas de produto são conhecidas na técnica anterior.

[0136] Um grupo de produtos contendo L-lisina compreende soluções alcalinas aquosas, concentradas, de Llisina purificada (EP-B-0.534.865). Outro grupo, tal como descrito, por exemplo, na US 6.340.486 e US 6.465.025, compreende concentrados contendo biomassa, aquosos, ácidos, de caldos de fermentação contendo L-lisina. 0 grupo mais conhecido de produtos sólidos compreende formas pulverulentas ou cristalinas de L-lisina purificada ou pura, que normalmente está sob a forma de um sal, por exemplo, monocloridrato de L-lisina. Outro grupo de formas de produtos sólidos é descrito, por exemplo, na EP-B0.533.039. A forma do produto descrita contém, juntamente com L-lisina, a maior parte dos materiais de alimentação utilizada e não consumida durante a produção por fermentação e, opcionalmente, a biomassa do microrganismo utilizado com uma proporção de > 0% a 100%.

[0137] Correspondendo às várias formas do produto, os mais variados processos são conhecidos, em que o produto

44/66 contendo L-lisina ou a L-lisina purificada é preparada a partir do caldo de fermentação.

[0138] Para a preparação de L-lisina sólida, pura, essencialmente os métodos de cromatografia de troca iônica são aplicados, opcionalmente, utilizando técnicas de cristalização e carvão ativado. Desta forma, a base correspondente é obtida ou um sal correspondente, por exemplo, o monocloridrato de (Lys-HCl) ou sulfato de lisina (Lys2-H₂SO₄) .

[0139] Um processo para a produção de soluções contendo L-lisina básica, aquosa, a partir de caldos de fermentação está descrito na EP-B- 0534865. No processo descrito, a biomassa é separada a partir do caldo de fermentação e descartada. O pH é ajustado entre 9 e 11 por meio de uma base, por exemplo, de sódio, de potássio ou de hidróxido de amônio. Depois de concentração e resfriamento, os constituintes minerais (sais inorgânicos) são separados a partir do caldo por cristalização ou utilizados como fertilizante ou descartado.

[0140] No caso de processos para a produção de lisina por meio de bactérias do gênero Corynebacterium, esses processos são preferidos em que os produtos são obtidos que contêm constituintes do caldo de fermentação. Estes são utilizados em especial como aditivos para alimentação animal.

[0141] Dependendo dos requisitos, a biomassa pode ser removida completamente ou parcialmente a partir do caldo de fermentação por técnicas de separação, por exemplo, centrifugação, filtração, decantação ou uma combinação dos mesmos, ou pode ser deixada no mesmo completamente.

45/66

Opcionalmente, a biomassa ou o caldo de fermentação contendo biomassa é inativado durante uma etapa de processo adequada, por exemplo, por tratamento térmico (aquecimento) ou por adição de ácido.

[0142] Em um procedimento, a biomassa é removida completamente ou quase completamente, de modo que nenhum (0%) ou, no máximo 30%, no máximo 20%, no máximo 10%, no máximo, 5%, no máximo, 1% ou, no máximo, 0,1% de biomassa permanece no produto resultante. Num outro procedimento, a biomassa não é removida ou só é removida em pequenas proporções, de modo que toda (100%) ou mais do que 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou 99,9% da biomassa permanece no produto resultante. Num processo de acordo com a invenção, por conseguinte, a biomassa é removida em proporções de 0% a < 100%.

[0143] Finalmente, o caldo de fermentação obtido após a fermentação pode ser ajustado com um ácido inorgânico, por exemplo, ácido clorídrico, ácido sulfúrico ou ácido fosfórico ou um ácido orgânico, por exemplo, ácido propiônico, a um pH ácido, antes ou após a remoção completa ou parcial da biomassa (GB 1.439.728 ou EP 1 331 220). É também possível acidificar o caldo de fermentação com a biomassa completamente contida. Finalmente, o caldo também pode ser estabilizado por adição de bissulfito de sódio (NaHSO₃, GB 1.439.728) ou algum outro sal, por exemplo, de amônio, sal de metal alcalino ou alcalino-terroso de ácido sulfuroso.

[0144] Durante a separação da biomassa, os sólidos orgânicos ou inorgânicos opcionalmente contidos no caldo de fermentação são removidos, parcial ou completamente. Os

46/66 subprodutos orgânicos dissolvidos no caldo de fermentação e os constituintes dissolvidos, não consumidos do meio de fermentação (materiais de alimentação) permanecem no produto, pelo menos parcialmente (> 0%), de preferência a pelo menos 25%, especialmente de preferência de pelo menos 50% e muito especialmente de preferência a pelo menos 75%. Opcionalmente estes também permanecem completamente (100%) ou quase completamente, isto é,> 95% ou > 98% ou superior a 99%, no produto. Se um produto contém neste sentido, pelo menos, uma proporção dos constituintes do caldo de fermentação, que também é descrito com o termo produto à base de caldo de fermentação.

[0145] Em seguida, o caldo é desidratado usando métodos conhecidos, por exemplo, utilizando um evaporador rotativo, evaporador de película fina, evaporador de película descendente, por osmose reversa ou por nanofiltração, ou espessado ou concentrado. Este caldo de fermentação concentrado pode então ser processado por métodos de liofilizaçâo, secagem por pulverização, granulação por pulverização ou por outros métodos, por exemplo, no leito fluidizado circulante descrito de acordo com PCT/EP2004/006655, a produtos de escoamento livre, especialmente a um pó finamente dividido ou grânulos de preferência de granulação grossa. Opcionalmente, um produto desejado é isolado a partir dos grânulos obtidos por peneiraçâo ou separação de poeira.

[0146] É também possível secar o caldo de fermentação diretamente, ou seja, sem concentração prévia por secagem por pulverização ou granulação por pulverização.

47/66

[0147]	Escoamento	livre refere-se ao:	3 pós que, a
partir de	uma série de	vasos de	vidro de	descarga	com
aberturas	de saída de	diferentes	tamanhos	, escoam	sem
obstáculos	pelo menos, a	partir do vaso com a	abertura	de 5
milímetros	(mm) (Klein:	Seifen, Õle	, Fette,	Wachse 94	, 12
(1968)) .
[0148]	Finamente	dividido	signifi	ca um	Pó

principalmente (> 50%) com um tamanho de grão de 20 a 200 pm de diâmetro.

[0149] Granulação grossa significa um produto principalmente (> 50%) com um tamanho de grão de 20 a 200 pm de diâmetro.

[0150] Um tamanho do grão pode ser determinado por métodos de espectrometria de difração a laser. Os métodos correspondentes são descritos no livro de texto em Teilchengrõssenmessung in der Laborpraxis ”[Medição de tamanho de partícula em prática de laboratório] por R.H. Müller e R. Schuhmann, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft Stuttgart (1996) ou no livro de texto Introdução à Tecnologia de Partículas por M. Rhodes, Publ. Wiley & Sons (1998).

[0151] 0 pó de fluxo livre, finamente dividido pode além disso ser convertido por meio de técnicas de granulação ou compactação adequadas para um produto de granulação grossa, de fluxo livre, armazenável e em grande parte isento de poeira.

[0152] 0 termo livre de poeira significa que o produto contém apenas pequenas proporções (< 5%) de tamanhos de grão inferior a 100 pm de diâmetro.

48/66 [0153]

Armazenável, no sentido da presente invenção, significa um produto que pode ser armazenado num local fresco e seco por pelo menos um mais, de preferência pelo menos 1,5 anos ou mais, especia1 mente de preferência, por dois (2) anos ou mais, sem qualquer perda substancial (max.

5%) do respectivo aminoácido.

[0154]

A invenção refere-se ainda a um processo que é descrito em linhas gerais em WO

2007/042363

Al. Para isto, usando o caldo de fermentação obtido de acordo com a invenção, a partir do qual a biomassa foi separada, opcionalmente completamente ou parcialmente, um processo é realizado que compreende as seguintes etapas:

reduzido por adição de ácido sulfúrico para

4,0 a 5,2, especialmente

4,9 a 5,1, e uma razão molar de sulfato/L-lisina de 0,85 a 1,2, de preferência 0,9 a 1,0, com especial preferência > 0, 9 e < 0,95, é estabelecida no caldo, opcionalmente adicionando outro ou vários composto (s) contendo sulfato; e

b) a mistura resultante é concentrada por desidratação e opcionalmente granulada;

em que opcionalmente antes da etapa a) , um ou ambas das seguintes medidas é/são realizadas:

c) medir a razão molar de sulfato/lisina-L para determinar a quantidade necessária de composto (s) contendo sulfato;

d) adição de um composto contendo sulfato selecionado a partir do grupo de sulfato de amônio, sulfato hidrogeno de amônio e ácido sulfúrico em proporções correspondentes. [0155] Opcionalmente, além disso, antes da etapa b) , um sal de ácido sulfuroso, de preferência sulfito de

49/66 hidrogênio de metal alcalino, especialmente de preferência sulfito hidrogeno de sódio é adicionado numa concentração de 0,01 a 0,5% em peso, de preferência 0,1 a 0,3% em peso, especialmente de preferência 0,1 a 0,2% em peso em relação ao caldo de fermentação.

[0156] Como compostos preferidos contendo sulfato no sentido das etapas do processo acima mencionado, pode ser mencionado em especial o sulfato de amônio e/ou sulfato hidrogeno de amônio ou misturas correspondentes de amônia e ácido sulfúrico e ácido sulfúrico em si.

[0157] A razão molar V de sulfato/L-lisina é calculada a partir da fórmula: V = 2 x [SO₄ ^2-] / [L-lisina] . Esta fórmula leva em conta que o ânion SO4²', ou ácido sulfúrico é divalente. A razão V = 1 significa que uma Lys2~H₂SO₄ de composição estequiométrica está presente, enquanto que a uma razão de V = 0,9 a 10% um déficit de sulfato é verificado, e em uma razão de V = 1,1 a 10% um excesso de sulfato é verificado.

[0158] Durante a granulação ou compactação é vantajoso usar auxiliares orgânicos ou inorgânicos usuais, ou veículos, tais como amido, gelatina, derivados de celulose ou substâncias semelhantes, tal como geralmente encontram aplicação no processamento de alimentos ou no processamento de rações, tais como aglutinantes, gelificação, ou agentes espessantes, ou outras substâncias, por exemplo, ácidos silicicos, silicatos (EP0743016A) e estearatos.

[0159] Além disso, é vantajoso tratar a superfície dos grânulos obtidos com óleos ou gorduras, tal como descrito em WO 04/054381. Os óleos que podem ser utilizados são óleos minerais, óleos vegetais ou misturas de óleos

50/66 vegetais. Exemplos de tais óleos são o óleo de soja, azeite, misturas de óleo de soja/lecitina. Da mesma forma, os óleos de silicone, polietileno glicóis ou hidroxietil celulose, também são adequados. Tratando as superfícies com os óleos acima mencionados proporcionam maior resistência à abrasão do produto e uma redução na proporção de poeira. 0 teor de óleo no produto é de 0,02 a 2,0% em peso, preferivelmente 0,02 a 1,0% em peso, e muito especialmente de preferência de 0,2 a 1,0% em peso em relação à quantidade total do aditivo alimentar.

[0160] Os produtos são preferidos que têm uma proporção de > 97% em peso de um tamanho de grão a partir de 100 a 1800 pm ou uma proporção de 95% em peso de um tamanho de grão a partir de 300 a 1800 pm de diâmetro. A proporção de poeira, isto é, partículas com um tamanho de grão < 100 pm, é de preferência > 0 a 1% em peso, especialmente de preferência, no máximo 0,5% em peso.

[0161] Em alternativa, no entanto, o produto pode também ser aplicado em um veículo orgânico ou inorgânico que é conhecido e usual no processamento de rações, por exemplo, ácidos silícicos, silicatos, grão para moer, farelo, farinhas, amidos, açúcares ou outros e/ou misturados e estabilizados com espessantes usuais ou ligantes. Exemplos práticos e processos para isso são descritos na literatura (Die Mühle + Mischfuttertechnik 132 (1995) 49, página 817).

[0162] Finalmente, o revestimento com agentes formadores de película, por exemplo, carbonatos de metal, ácidos silícicos, silicatos, alginatos, estearatos, amidos, gomas e éteres de celulose, como descrito no documento DE

51/66

C-4100920, o produto também pode ser levado a um estado em que ele é estável contra a digestão no estômago dos animais, especialmente o estômago dos ruminantes.

[0163] Para estabelecer uma concentração de L-lisina desejada no produto, dependendo dos requisitos, a L-lisina pode ser adicionada durante o processo sob a forma de um concentrado ou, opcionalmente, uma substância substancialmente pura ou um seu sal, em forma líquida ou sólida. Estes podem ser adicionados individualmente ou como misturas para o caldo de fermentação obtido ou concentrado, ou também durante o processo de secagem ou granulação.

[0164] A invenção refere-se ainda a um processo para a produção de um produto sólido contendo lisina, o qual é descrito em linhas gerais no documento US 20050220933. Neste caso, usando o caldo de fermentação obtido de acordo com a invenção, um processo é realizado que compreende as seguintes etapas:

a) filtração do caldo de fermentação, de preferência com um filtro de membrana, de modo que uma lama contendo biomassa e um filtrado são obtidos;

b) concentração do filtrado, de preferência, de modo que um teor de sólidos de 48 a 52% em peso é obtido;

c) granular o concentrado obtido na etapa b) , de um modo preferido a uma temperatura desde 50°C a 62°C; e

d) revestimento dos grânulos obtidos em c) com um ou mais do agente (s) de revestimento.

[0165] A concentração do filtrado na etapa b) pode também ser realizada de tal maneira que um teor de sólidos de 52 a 55% em peso, de 55 a 58% em peso ou 58 a 61% em peso é obtido.

52/66

[0166]	Para o revestimento na	etapa	d) ,	de	um	modo
preferido	agentes de revestimento	que	são	usados	são
selecionados do grupo consistindo de:
dl) a	biomassa obtida na etapa a)	f
d2)	um composto que contém L	-lisina,	de	um	modo

preferido selecionado a partir do grupo de cloridrato de Llisina ou sulfato de L-lisina;

d3) uma substância Livre essencialmente de L-lisina com um teor de L-lisina < 1% em peso, de preferência < 0,5% em peso, de um modo preferido selecionado a partir do grupo do amido, carragenina, agar, ácidos silicicos, silicatos, grãos para moer, farelo e farinha; e d4) uma substância repelente a água, de preferência selecionada a partir de óleos do grupo, polietilenoglicóis e parafinas líquidas.

[0167] Com as medidas correspondentes as etapas dl) a d4), especialmente dl) a d3), o teor de L-lisina é ajustado para um valor desejado.

[0168] Na produção de produtos que contém L-lisina, a razão dos íons é, de preferência, ajustada de modo que a razão molar dos ions de acordo com a seguinte fórmula 2x[SO₄ ²’] + [C1‘] - [NH₄ ⁺ ] - [Na⁺] - [K⁺]-2x [Mg²⁺]-2x [Ca²⁺] / [L-Lis] Chega de 0,68 a 0,95, de preferência 0,68 a 0,90, especialmente de preferência 0,68 a 0,86, tal como descrito por Kushiki et al. Na US 20030152633.

[0169] No caso da L-lisina, o produto sólido preparado desta maneira, com base em caldo de fermentação tem um teor de lisina (como base de lisina) a partir de 10% em peso a 70% em peso ou 20% em peso a 70% em peso, preferencialmente 30% em peso a 70% em peso e muito

53/66 especialmente de preferência a partir de 40% em peso a 70% em peso em relação à matéria seca do produto. Os teores máximos de base de lisina de 71% em peso, 72% em peso, 73% em peso, são também possíveis.

[0170]

0 teor de água do produto sólido que contém L-

lisina é de até 5% em peso, de preferência até 4% em peso, e especialmente de preferência inferior a 3% em peso.

[0171]	Cepa DM1547 foi depositada em 16 de janeiro de
2001 na	Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und

Zellkulturen [Coleção Alemã de Microrganismos e Culturas

Celulares]	com o número de acesso DSM13994. DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0172]	Figura 1 mostra o plasmídeo pK18msb_Pg3 lpdA.
[0173]	Figura 2 mostra o plasmídeo pZ8-l::lpdA. EXEMPLOS

Exemplo 1

[0174]

0 produto do gene do gene lpdA (cg07 90) a

partir de Corynebacterium glutamicum foi, tal como no caso da proteína LpdA de Mycobacterium tuberculosis (Argyrou et al., 2004), classificada em uma anotação de genoma predominantemente automática como possível dihidrolipoamida desidrogenase pertencente a família flavoproteína dissulfeto redutase (FDR), cujos membros têm, apesar de sua multiplicidade de reações redox catalisadas, uma homologia geralmente elevada com uma outra em sequência e nível de estrutura. A homologia da presente proteína para a já caracterizada LpdA de Mycobacterium tuberculosis e outra flavoproteína dissulfeto redutase de C. glutamicum e vários outros organismos foi determinada por análise bioinformática de C. glutamicum LpdA por meio da função

54/66 blast do programa BLAST (Ferramenta de pesquisa de alinhamento local básico).

Exemplo 2

Construção do vector de troca pK18msb Pg3 lpdA [0175] A sequência de nucleotídeos do genoma de

Corynebacterium glutamicum ATCC13032 é descrita em Ikeda e Nakagawa (Applied Microbiology and Biotechnology 62, 99-109 (2003)), na EP 1 108 790 e em Kalinowski et al. (Journal of Biotechnology 104 (1-3), (2003)).

[0176] A sequência de nucleotídeos do genoma de

Corynebacterium glutamicum também está disponível na base de dados do Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (NCBI) da National Library of Medicine (Bethesda, MD, EUA) , no Banco de dados de DNA do Japão (DDBJ, Mishima, Japão) ou na base de dados da sequência de nucleotídeos do European Molecular Biology Laboratories (EMBL, Heidelberg, Alemanha ou Cambridge, Reino Unido).

[0177] A partir da sequência do qenoma de

Corynebacterium glutamicum ATCC13032, uma aproximação do fragmento de DNA de 1,7 kb foi sintetizado na empresa GeneArt (Regensburg, Alemanha) (SEQ ID NO: 3), que além do promotor Pgap3 (DE102011118019.6) carrega as sequências de flanqueamento para uma inserção do promotor antes do gene lpdA nativo. O fragmento foi cortado através dos sítios de divagem de terminal inseridos Xmal e Xbal por Xmal e Xbal de divagem e, em seguida, clonado no vetor mobilizável pK18mobsacB, também cortado com Xmal/Xbal, descrito por Scháfer et al. (Gene, 145, 69-73 (1994)). 0 plasmídeo tem a designação pK18msb_Pg3_lpdA e é mostrado na Figura 1.

Exemplo 3

55/66

Construção do vetor de pZ8-l lpdA [0178] O gene IpdA de C. glutamicum (cg0790) foi amplificado utilizando dois iniciadores, pelo qual o gene foi fornecido a montante com um local de divagem EcoRI e a jusante com um local de divagem Sall. Com base na sequência do gene lpdA conhecido para C. glutamicum, os seguintes oligonucleotideos foram utilizados como iniciadores:

lpdA_pZ8-l-l (SEQ ID NO: 4):

5' GGTGGTGAATTCAAAGGAGGACAACCATGGCAAAGAGGATCGTAAT 3 ' lpdA_pZ8-l-2 (SEQ ID NO: 5):

5' GGTGGTGTCGACTTAGCCTAGATCATCATGTT 3' [0179] Os iniciadores apresentados foram sintetizados pela empresa MWG Biotech (Ebersberg, Alemanha).

[0180] Eles possibilitam a amplificação de um segmento de DNA de 1448 pb de comprimento de acordo com a SEQ ID NO: 6.

[0181] O produto de PCR foi purificado com o kit de

NucleoSpin® Extracto II. O fragmento foi cortado através dos sítios de divagem EcoRI terminalmente inseridos e Sall por divagem com EcoRI e Sall e, em seguida, clonado com o auxílio da ligase de DNA de T4 no vetor pZ8-l, também cortado por EcoRI/SalI (DE3841454A1; E.coli DH5/pZ8-l foi depositada sob o número DSM 4939 na Coleção Alemão para Microrganismos). O plasmídeo tem a designação pZ8-l::lpdA e é mostrado na Fig. 2.

Exemplo 4

Produção da cepa DM1547 Pg3 lpdA [0182] A mutação Pg3_lpdA foi para ser introduzida na cepa de Corynebacterium glutamicum DM1547. A cepa DM1547 é

56/66 um mutante resistente de aminoetil cisteina ATCC13032 de Corynebacterium glutamicum. Ele foi depositado sob a designação DSM13994 em 16.01.2001 na Coleção Alemã de Microrganismos e Culturas Celulares (DSMZ, Braunschweig, Alemanha).

[0183] 0 vetor pK18msb_Pg3_lpdA descrito no exemplo 2 foi eletroporado usando a técnica de eletroporação de Liebl et al. (FEMS Microbiological Letters, 53: 299-303 (1989)) em Corynebacterium glutamicum DM1547. Seleção de células portadoras de plasmideos foi realizada por plaqueamento da preparação de eletroporação em agar LB (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2^a Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989), que foi suplementado com 25 mg/1 de canamicina. O vetor não pode replicar de forma independente em DM1547 e só é retido na célula quando esta se encontra integrada no cromossomo como resultado de um evento de recombinação. A seleção de transconjugantes, ou seja, de clones com pK18msb_Pg3_lpdA integrados, foi realizada por plaqueamento para a preparação da conjugação em placas de agar LB que foram suplementadas com 25 mg/1 de canamicina e 50 mg/1 de ácido nalidixico. Transconjugantes resistentes à canamicina foram então riscadas em placas de agar LB suplementado com canamicina (25 mg/1) e incubadas a 33°C durante 24 horas. Para selecionar os mutantes em que a excisão do plasmídeo tomou lugar como um resultado de um segundo evento de recombinação, os clones foram cultivados durante 30 horas em forma não seletiva em meio liquido, então riscados em agar LB que foi suplementado com 10% de sacarose e incubados a 33°C durante 24 horas.

57/66 [0184] O plasmídeo pKl8msb_Pg3_lpdA contém, assim como o plasmídeo de partida pK18mobsacB, em adição ao gene de resistência a canamicina, uma cópia do gene que codifica sacB para levansucrase de Bacillus subtilis. A expressão indutível de sacarose do gene sacB leva à formação de levanossacarase, que catalisa a síntese do produto levan, que é tóxico para C. glutamicum.

[0185] Por conseguinte, apenas os clones em que o pK18msb_Pg3_lpdA integrado foi excisado como um resultado de um segundo evento de recombinação cresce em LB agar suplementado com sacarose. Dependendo da posição do segundo evento de recombinação em relação ao local da mutação, durante a excisão de troca de alelos ou incorporação da

mutação s	e realiza ou a cópia original	permanece	no
cromossomo	do hospedeiro.
[0186]	Em seguida, em cada caso,	um clone	foi
procurado	na qual a troca desejada, isto é,	a incorporação
da mutação	Pg3 lpdA se realizou.
[0187]	Por isso, em cada caso, 20	clones com	o

fenótipo crescimento na presença de sacarose e nãocrescimento na presença de canamicina foram verificados para a integração da mutação Pg3_lpdA utilizando a reação em cadeia da polimerase (PCR).

[0188] Os seguintes oligonucleotídeos sintéticos (iniciadores) foram usados para isto:

lpdA_l. p (SEQ ID NO: 8):

'AACACGTCCCAGGATCAATG 3' lpdA_2.p (SEQ ID NO: 9):

5' TTTCGCAAGGTCCTTCACAC 3'

58/66 [0189] Os iniciadores mostrados foram sintetizados pela empresa MWG Biotech (Ebersberg, Alemanha). As reações de PCR foram realizadas com o Kit Taq PCR Core da Qiagen (Hilden, Alemanha), contendo a polimerase de DNA de Taq a partir de Thermus aquaticus, em um Mastercycler da empresa Eppendorf (Hamburgo, Alemanha). As condições na mistura de reação foram definidas de acordo com informações do fabricante. A preparação de PCR foi submetida primeiro a desnaturação preliminar a 94°C durante 2 minutos. Isto foi seguido por repetição de 35x de uma etapa de desnaturação a 94°C durante 30 segundos, uma etapa para a ligação do iniciador ao DNA a 57 °C durante 30 segundos e a etapa de extensão para o alongamento do iniciador a 72°C durante 60 segundos.

[0190] Após a etapa de extensão final de 5 min a 72°C, a preparação de PCR foi submetida a eletroforese em gel de agarose (0,8% de agarose). Identificação de um fragmento de DNA com comprimento de 1080 bp indica neste caso a integração do promotor Pg3 antes lpdA, enquanto que um fragmento de DNA com um comprimento de 591 bp indica o estado do tipo selvagem da cepa de partida.

[0191] Deste modo, os mutantes foram identificados em que a mutação Pg3_lpdA está presente sob a forma de integração, em que uma das estirpes de C. glutamicum obtidas foi designada DM1547_Pg3_lpdA.

Exemplo 5

Produção das cepas DM1547 / pZ8-l, DM1547 / pZ8-l::lpdA, DM1933 / pZ8-l e DM1933 / pZ8-l::lpdA [0192] Os plasmideos pZ8-l e pZ8-l::lpdA (exemplo 3) foram eletroporadas com a técnica de eletroporação de Liebl

59/66 et al. (FEMS Microbiological Letters, 53: 299-303 (1989)) em Corynebacterium glutamicum DM1547 e DM1933. Células portadoras de plasmídeos foram selecionadas por plaqueamento para a preparação de eletroporação em agar LB (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2^a Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989), que foram suplementadas com 25 mg/l de canamicina. O DNA do plasmídeo foi isolado a partir de um transformante em cada caso pelos métodos habituais (Peters-Wendisch et al., 1998, Microbiology, 144, 915-927) e verificado por meio de divagem de restrição seguido por eletroforese em gel de agarose.

[0193] As cepas obtidas foram designadas DM1547 / pZ81 e DM1547 / pZ8-l::lpdA e DM1933 / pZ8-l e DM1933 / pZ8-l ::lpdA.

Exemplo 6

Produção de L-lisina com as cepas DM1547 Pg3 lpdA e DM1547 [0194] A cepa de C. glutamicum DM1547_Pg3_lpdA obtida no Exemplo 4 e a cepa de partida DM1547 foram cultivadas num meio nutriente adequado para a produção de lisina e o teor de lisina no sobrenadante da cultura foi determinado. [0195] Para isso, os clones foram multiplicados primeiro em placas de agar de cérebro e coração (Merck, Darmstadt, Alemanha) durante 24 horas a 33°C. A partir destas culturas em placas de agar, uma pré-cultura foi inoculada em cada caso (meio de 10 ml num frasco Erlenmeyer de 100 ml). O meio MM foi usado como meio de pré-cultura. A pré-cultura foi incubada durante 24 horas a 33°C e 240 rpm num agitador. Desta pré-cultura, uma cultura principal foi inoculada, de modo que o OD inicial (660 nm) da cultura

60/66 principal foi de 0,1 OD. Meio MM também foi utilizado para a cultura principal.

[0196] A Tabela 1 apresenta uma sinopse da composição do meio de cultura utilizado.

TABELA 1: MEIO MM

CSL (licor de infusão de milho)	5 g/1
MOPS (ácido
morfolinopropanosulfônico)	20 g/1
Glicose (autoclavada separadamente)	50 g/1
Sais:
(NH4)2SO4	25 g/1
kh2po4	0,1 g/1
MgSO4 * 7 H2O	1,0 g/1
CaCl2 * 2 H2O	10 mg/1
FeSO4 * 7 H20	10 mg/1
MnS04 * H2O	5,0 mg/1
Biotina (estéril-filtrada)	0,3 mg/1
Tiamina * HC1 (estéril-filtrada)	0,2 mg/1
CaCÜ3	25 g/1

[0197] CSL (licor de infusão de milho), MOPS (ácido morfolinopropanosulfônico) e a solução salina foram ajustados para pH 7 com água de amoníaco e autoclavados. Em seguida, o substrato estéril e soluções de vitamina e CaCC>3 seco autoclavado foram adicionados.

[0198] A cultura foi realizada em volumes de 10 ml, os quais estavam contidos em frascos de Erlenmeyer de 100 ml

61/66 com chicanas. A temperatura era de 33°C, a velocidade de rotação foi de 250 rpm e a umidade do ar de 80%.

[0199] Após 40 horas, a densidade óptica (OD) foi determinada a uma medição do comprimento de onda de 660 nm com o Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, Munique). A quantidade de lisina formada foi determinada com um analisador de aminoácidos a partir da empresa EppendorfBiotronik (Hamburgo, Alemanha) , mediante cromatografia de troca iônica e derivação pós-coluna com detecção de ninidrina.

[0200] O resultado do teste é mostrado na Tabela 2.

TABELA 2: PRODUÇÃO DE L-LISINA

Cepa	L-lisina HC1 (g/1)	OD (660 nm)
DM1547	19, 0	12,3
DM1547 Pg3 lpdA	20, 8	12,2

[0201] Todos os valores são valores médios de 3 experimentos independentes com as cepas indicadas.

[0202] 0 resultado mostra que o rendimento do produto desejado (L-lisina) aumentou claramente.

Exemplo 7

Produção de L-lisina com as cepas DM1547 / pZ8- 1::lpdA,

DM1547 / pZ8-l, DM1933 / pZ8-l e DM1933 / pZ8-l::lpdA [0203] As cepas de C. glutamicum DM1547 / pZ8-l::lpdA e DM1933 / pZ8-l::lpdA obtidas no exemplo 5 e as cepas de controle DM1547 / pZ8-l e DM1933 / pZ8-l foram cultivadas num meio nutriente adequado para a produção de lisina e o teor de lisina no sobrenadante da cultura foi determinada.

[0204] Para isso, em primeiro lugar as cepas foram incubadas em uma placa de agar com o antibiótico (agar de cérebro e coração com canamicina (25 mg/1)) correspondente

62/66 a 33°C durante 24 horas. A partir destas culturas em placas de agar, uma pré-cultura foi inoculada em cada caso (meio de 10 ml num frasco Erlenmeyer de 100 ml). Meio MM (Tabela 1 do Exemplo 6) foi usado como meio de pré-cultura, a qual a canamicina (25 mg/l) foi adicionada. A pré-cultura foi incubada durante 24 horas a 33°C e 240 rpm num agitador. A partir desta pré-cultura, uma cultura principal foi inoculada, de modo que a OD inicial (660 nm) para a cultura principal foi de 0,1 OD. Meio MM também foi utilizado para a cultura principal.

[0205] A cultura foi realizada em volumes de 10 ml, os quais estavam contidos em frascos Erlenmeyer de 100 ml com chicanas. A temperatura era de 33°C, a velocidade de rotação foi de 250 rpm e a umidade do ar de 80%.

[0206] Depois de 40 horas, a densidade óptica (OD) foi determinada a uma medição do comprimento de onda de 660 nm com o Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, Munique). A quantidade de lisina formada foi determinada com um analisador de aminoácidos da empresa Eppendorf Biotronik(Hamburgo, Alemanha) por cromatografia de troca iônica e derivação pós-coluna com detecção com ninidrina.

[0207] O resultado do teste é mostrado na Tabela 3.

TABELA 3: PRODUÇÃO DE L-LISINA

Cepa	L-lisina HC1 (g/1)	OD (660nm)
DM1933 / pZ8-l	12,2	13, 1
DM1933 / pZ8-l::lpdA	14,5	13, 0
DM1547 / pZ8-l	18,5	12,5
DM1547 / pZ8-l::lpdA	21,0	12,3

63/66 [0208] Todos os valores são valores médios de 3 experimentos independentes com as cepas indicadas.

[0209] O resultado mostra que o rendimento do produto desejado (L-lisina) foi claramente aumentado.

Exemplo 8

Transformação da cepa ECM3 com os plasmideos pZ8-l e pZ81 lpdA [0210] A cepa de E. coli produzindo L-metionina ECM3 é baseada na cepa MG1655 tipo selvagem K12. A cepa ECM3 carrega, como descrito nas EP2205754A2, EP2326724A1 e EP12156052.8, um alelo metA resistente a retroação, uma deleção dos genes metJ, yncA, Pyka, pykF e purU, uma variante do gene spoT, e em cada caso promotor reforçando antes os genes metH, metF, gcvT, cysP e cysJ.

[0211] A cepa ECM3 foi transformada com os plasmideos pZ8-l e pZ8-l_lpdA do Exemplo 3 e transformantes foram selecionados os com 20 mg/l de canamicina. As cepas resultantes foram designadas ECM3/pZ8-l e ECM3/pZ8-l_lpdA.

Exemplo 9

Produção de L-metionina com as cepas ECM3 e ECM3/pZ8-l lpdA [0212] 0 desempenho das cepas de E. coli de produção de L-metionina ECM3 e ECM3/pZ8-l_lpdA foi avaliado por testes de produção em frascos Erlenmeyer de 100 ml. Como pré-culturas, em cada caso, 10 ml do meio de pré-cultura (10% de meio LB com 2,5 g/l de glicose e 90% meio mínimo PC1 (Tabela 4)) foi inoculado com 100 pl de cultura de células e cultivadas por 10 horas a 37°C. Em seguida, em cada caso, 10 ml de meio mínimo PC1 foi inoculado com esta para um OD 600 nm de 0,2 (Bio-fotômetro Eppendorf; Eppendorf AG, Hamburg, Alemanha) e cultivada durante 24

64/66 horas a 37 °C. A concentração de L- metionina extracelular foi determinada com um analisador de aminoácido (SYKAM GmbH, Eresing, Alemanha) por cromatografia de troca iônica e derivação pós-coluna com detecção com ninidrina. A concentração de glicose extracelular foi determinada com um Analisador selecionado de Glicose YSI 2700 (YSI Ciências

Biológicas, Yellow Springs, Ohio, EUA) . Os resultados são mostrados na Tabela 5. Após 48 horas, a glicose em ambas as culturas foi completamente consumida.

TABELA 4: MEIO MÍNIMO PC1

Substância	Concentração
ZnSO4 * 7 H2O	4 mg/l
CuC12 * 2 H2O	2 mg/l
MnSO4 * H2O	20 mg/l
H3BO3	1 mg/l
Na2Mo04 * 2 H2O	0,4 mg/l
MgSO4 * 7 H2O	1 g/1
Ácido cítrico * 1 H2O	6,56 g/1
CaCl2 * 2 H2O	40 mg/l
k2hpo4	8,02 g/1
Na2HPO4	2 g/1
(NH4) 2hpo4	8 g/1
nh4ci	0,13 g/1
(NH4)2SO3	5,6 g/1
MO PS	5 g/1
NaOH 10M	ajustado para pH 6,8
FeSO4 * 7 H2O	40 mg/l
Cloridrato de tiamina	10 mg/l

65/66

Vitamina B12	10 mg/l
Glicose	10 g/1
Canamicina	50 mg/l

TABELA 5: CONCENTRAÇÕES DE L-METIONINA NOS CALDOS DE

FERMENTAÇÃO DAS CEPAS DE E. COLI INVESTIGADAS

Cepa	OD(600nm)	L-metionina (g/1)
ECM3/pZ8-l	3, 38	0, 40
ECM3/pZ8-l_lpdA	3, 17	0,57

Todos os valores são valores médios de 3 [0213] experimentos independentes com as cepas indicadas.

[0214]	0 resultado mostra que o rendimento do produto
desejado	(L-metionina) aumentou claramente.
[0215]	Figura 1: Mapa do plasmídeo pK18msb Pg3 lpdA
[0216]	As abreviaturas e denominações utilizadas têm

os seguintes significados. Os números de pares de bases indicados são valores aproximados, que são obtidos na faixa de medição de reprodutibilidade.

KanR:	Gene de resistência à canamicina
Xmal	Local de divagem da enzima de restrição Xmal
EcoRI	Local de divagem da enzima de restrição EcoRI
Xbal	Local de divagem da enzima de restrição Xbal
sacB:	Gene sacB
oriV:	Origem de replicação V

[0217] Figura 2: Mapa do plasmídeo pZ8-l::lpdA [0218] As abreviaturas e designações utilizadas têm os seguintes significados.

Os números de pares de bases

66/66 indicados são valores aproximados, que são obtidos na faixa de medição de reprodutibilidade.

Km	Gene de resistência à canamicina
EcoRI	Local de divagem da enzima de restrição EcoRI
SalII	Local de divagem da enzima de restrição Sall
Ptac	Promotor tac
rep	Origem de replicação da Escherichia coli
TrrnB	Terminador rrnB

Claims (16)

1. Processo para a produção de um composto químico orgânico por fermentação usando um microrganismo, caracterizado pelo fato de que as seguintes etapas são realizadas:

a) fermentação de um microrganismo que produz um composto químico orgânico, em que um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo cuja sequência de aminoácido é pelo menos 80% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 é sobre-expressa no microrganismo e em que a fermentação se realiza num meio de fermentação, com formação de um caldo de fermentação;

b) enriquecimento do composto químico orgânico no caldo de fermentação a partir de a).

2. Processo para a produção de um composto químico orgânico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo cuja sequência de aminoácido é pelo menos 95% idêntica a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2 é sobreexpressa no microrganismo.

3. Processo para a produção de um composto químico orgânico de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo codificado tem a atividade de uma transidrogenase.

4. Processo para a produção de um composto químico orgânico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo codificado compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2.

5. Processo para a produção de um composto químico orgânico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado

2/4 pelo fato de que a produção do composto químico orgânico é aumentada em pelo menos 0,5% em relação a da fermentação de um microrganismo em que o polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo cuja sequência de aminoácido é pelo menos 80% idêntica à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2 não é sobre-expressa.

6. Processo para a produção de um composto químico orgânico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a sobre-expressão é conseguida através de uma ou mais das medidas selecionadas a partir do grupo:

a) expressão do gene está sob o controle de um promotor, que é mais forte no microrganismo utilizado para o processo do que o promotor nativo do gene;

b) aumento do número de cópias do gene que codifica um polipeptídeo com a atividade de uma transidrogenase; preferencialmente, inserindo o gene de plasmídeos com o aumento do número de cópias e/ou por meio da integração do gene no cromossoma do microrganismo em pelo menos uma cópia;

c) expressão do gene se realiza utilizando um local de ligação ao ribossomo, que é mais forte no microrganismo utilizado para o processo do que o local de ligação ao ribossoma original do gene;

d) expressão do gene se realiza com otimização da utilização do códon do microrganismo utilizado para o processo;

e) expressão do gene se realiza com redução de estruturas de mRNA secundárias no mRNA transcrito pelo gene;

3/4

f) expressão do gene se realiza com eliminação de terminadores de RNA polimerase no mRNA transcrito pelo gene;

g) a expressão do gene se realiza utilizando sequências de estabilização de mRNA no mRNA transcrito pelo gene.

7. Processo para a produção de um composto químico orgânico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

6, caracterizado pelo fato de que o composto químico orgânico é um L-aminoácido selecionado a partir do grupo Ltreonina, L-isoleucina, L-lisina, L-metionina, L-ornitina, L-prolina, L-valina, L-leucina e L-triptofano.

8. Processo para a produção de um composto químico orgânico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

7, caracterizado pelo fato de que é um microrganismo secretor de composto químico orgânico do gênero Corynebacterium ou Escherichia.

9. Processo para a produção de um composto químico orgânico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

8, caracterizado pelo fato de que é um microrganismo secretor de composto químico orgânico da espécie Corynebacterium glutamicum ou da espécie Escherichia coli.

10. Processo para a produção de um composto químico orgânico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que é um processo selecionado a partir do grupo: processo em lote, processo em lote alimentado, processo em lote alimentado repetido e processo contínuo.

11. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o composto químico orgânico ou um produto contendo composto químico orgânico líquido ou

4/4 sólido é obtido a partir do caldo de fermentação contendo composto químico orgânico.

12. Microrganismo que produz um composto químico orgânico, caracterizado pelo fato de que um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo cuja sequência de aminoácidos é 2 a 80% idêntica à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2 é sobre-expresso.

13. Microrganismo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácido do polipeptídeo codificado é 2 a 95% idêntica à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2.

14. Microrganismo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo codificado compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2.

15. Microrganismo de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, caracterizado pelo fato de que é selecionado a partir do grupo do gênero Corynebacterium e a bactéria da família Enterobacteriaceae, em que a espécie Corynebacterium glutamicum é preferida.

16. Microrganismo de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 15, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo sobre-expresso tem a atividade de uma transidrogenase.