KR102109440B1 - 엔테로박테리아세아에 과의 개선된 균주를 사용하는 l-아미노산의 발효적 생산 방법 - Google Patents

엔테로박테리아세아에 과의 개선된 균주를 사용하는 l-아미노산의 발효적 생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 감쇠된 proP 유전자를 함유하는 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae) 과의 미생물을 사용하는 L-아미노산의 발효적 생산을 위한 방법 (L-아미노산은 적합한 미생물의 생산을 코딩함) 뿐만 아니라 수송체 ProP의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.

Description

엔테로박테리아세아에 과의 개선된 균주를 사용하는 L-아미노산의 발효적 생산 방법 {METHOD FOR THE FERMENTATIVE PRODUCTION OF L-AMINO ACIDS USING IMPROVED STRAINS OF THE ENTEROBACTERIACEAE FAMILY}
본 발명은 감쇠된 proP 유전자를 보유하는 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae) 과의 미생물을 사용하는 L-아미노산의 발효적 생산 방법, 상기 생산에 적합한 미생물, 및 ProP 수송체의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
유기 화학적 화합물, 보다 구체적으로 황-함유 L-아미노산은 매우 경제적으로 중요하다. L-시스테인은 식품 보충제로서, 약리학적 활성 화합물에 대한 출발 물질 (예를 들어 N-아세틸시스테인)로서, 및 화장품에 사용된다. 아미노산 L-메티오닌은 동물 영양에서 우세한 역할을 수행하고, 척추동물의 대사에서 생합성에 의해 생산될 수 없는 필수 아미노산 중 하나이다. 동물 사육에서 결과적으로 충분한 양의 특정한 아미노산이 사료로 섭취되는 것이 보장되어야 한다. 그러나, L-메티오닌은 예를 들어 종종 특히 돼지 및 가금류의 경우에 최적의 동물 영양을 보장하기에는 너무 낮은 양으로 종래의 사료 식물 (예컨대 대두 또는 곡류)에 존재하기 때문에, 동물 사료에 첨가제로서의 메티오닌을 혼합하는 것은 유리하다. 척추동물은 D-메티오닌을 생물학적 활성 L-메티오닌으로 전환시킬 수 있다. 따라서 D- 및 L-메티오닌의 라세미체는 통상적으로 동물 사료에 첨가된다. 동물은 L-호모시스테인을 메틸기전이에 의해 L-메티오닌으로 전환시킬 수 있고, 따라서 전자가 후자를 대체할 수 있다.
하기 언급되는 유기 화학적 화합물은 L-아미노산, 바람직하게는 황-함유 L-아미노산, 특히 L-메티오닌, L-시스테인, L-시스틴, L-호모시스테인 및 L-호모시스틴의 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 의미한다. L-메티오닌이 바람직하다.
선행 기술에서, 아미노산, 예컨대 메티오닌은 화학적 합성에 의해 제조된다. 이는 처음에 아크롤레인 및 메틸 메르캅탄과 반응하여 3-(메틸티오)프로피온알데히드를 제공하고, 이는 다시 시아나이드, 암모니아 및 일산화탄소와 반응하여 히단토인을 생산하는 것을 포함한다. 최종적으로, 후자는 2종의 입체이성질체, D- 및 L-메티오닌의 등몰 혼합물인 라세미체로 가수분해된다. 분자의 생물학적 활성 형태는 단지 L 형태에 의해 나타내어지기 때문에, 사료에 존재하는 D 형태는 우선 대사적으로 탈아미노화 및 아미노교환에 의해 활성 L 형태로 전환되어야 한다.
메티오닌과 달리, 대부분의 다른 천연 단백질생성 아미노산, 예컨대 L-트레오닌은 예를 들어 주로 미생물의 발효에 의해 제조된다. 이는 미생물이 천연 아미노산의 합성에 적절한 생합성 경로를 갖는다는 사실을 이용한다. 또한, 다수의 발효 공정은 저렴한 반응물, 예컨대 글루코스 및 무기 염을 이용함으로써 매우 유리한 생산 비용을 달성하고, 또한 특정한 아미노산의 생물학적 활성 L 형태를 전달한다.
유기 화학적 화합물이 엔테로박테리아세아에, 특히 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) (이. 콜라이) 및 세라티아 마르세스센스(Serratia marcescens)의 균주의 발효에 의해 생산될 수 있는 것으로 알려져 있다. 그의 큰 중요성으로 인해, 제조 공정을 개선하기 위한 노력이 지속적으로 이루어지고 있다. 공정에 대한 개선은 발효 공학, 예를 들어 교반 및 산소 공급과 관련된 측정, 또는 영양 배지의 조성, 예컨대 예를 들어 사용되는 당의 선택 또는 발효 동안의 당 농도, 또는 예를 들어 이온 교환 크로마토그래피에 의한 제품 형태에 대한 후처리, 또는 미생물 자체의 고유한 성능 특성에 대한 것일 수 있다.
야생형 균주에서 아미노산의 생합성 경로는 아미노산이 오직 세포의 본질적인 필요를 위해 생산되는 것을 보장하는 엄격한 신진 제어가 적용된다. 따라서, 효율적인 생산 공정에 중요한 전제조건은 야생형 유기체와 달리 바람직한 아미노산의 제조를 위해 본질적인 필요를 초과하여 (과다생산) 현저하게 증가된 생산 산출량을 갖는 적합한 미생물의 이용가능성이다.
이러한 아미노산-과다생산 미생물은 전형적인 돌연변이/선택 과정 및/또는 최근의 특정 재조합 기술 ("대사 공학")에 의해 생성될 수 있다. 후자는 첫번째로 그의 변형, 활성화 또는 불활성화로 인한 아미노산 과다생산에 영향을 미치는 유전자 또는 대립유전자를 확인하는 것을 포함한다. 이어서, 이들 유전자/대립유전자는 미생물의 균주로 도입되거나 또는 분자 생물학 기술을 이용하여 불활성화되어 최적의 과다생산을 달성한다. 그러나, 종종 단지 다수의 상이한 측정을 조합하는 것이 확실하게 효율적인 생산으로 이어진다.
L-메티오닌은 리신 및 트레오닌과 함께 아스파르테이트로부터 유래된다. 황은 L-시스테인의 형태에서 (중간체로서의 시스타티오닌을 통해) 트랜스황화에 의해 L-메티오닌으로 도입된다. L-메티오닌의 CH3 기는 C1 대사로부터 기원하고, MetE 또는 MetH 메티오닌 신타제에 의해 L-호모시스테인으로 전달된다 (검토: Greene RC (1996) in Neidhardt FC et al. (eds.) "Escherichia coli and Salmonella", 2nd edition, pp. 542-560). L-메티오닌의 발효적 생산을 위한 균주 및 방법은 예를 들어 이. 콜라이에 대해 WO2006/001616 또는 WO2009/043803에 기재되어 있다.
ProP는 이. 콜라이 양성자/호환가능한 용질 공수송체이며, 따라서 고삼투압 조건 하에 활성인 이. 콜라이의 수송체 중 하나이다 (Grothe et al., Journal of Bacteriology 166, 253-259 (1986); Racher et al., Biochemistry 38, 1676-1684 (1999); Wood, Methods in Enzymology 428, 77-107 (2007)). 세포 주변 매질의 오스몰랄농도가 증가하면, 매질의 수분 포텐셜이 감소하고, 물 분자는 삼투압 구배를 따라 세포 외부로 확산된다. 세포의 팽압이 감소하고, 이에 따라 세포질 단백질은 그의 기능적으로 관련된 수화 쉘을 상실한다. 이러한 탈수의 결과로서, 세포 대사 및 세포 분열이 멈추게 된다. 이를 방지하기 위해, 미생물은 진화 과정에서 예를 들어 호환가능한 용질로서 알려진 것의 합성 및/또는 흡수를 통해 상이한 전략을 발생시켰다. 이러한 자연 발생 보호제, 예를 들어 프롤린 또는 글리신 베타인이 외부에서 이용가능한 경우에, 보다 빠르고 또한 에너지적으로 보다 유리한 흡수가 미생물의 자가 합성에 바람직하다 (Wood, Microbiology and Molecular Biology Reviews 63, 230-262 (1999)). ProP 공수송체는 MFS 패밀리 (주요 촉진인자 슈퍼패밀리)에 속하며, 프롤린, 글리신 베타인, 프롤린 베타인, 엑토인, 및 다른 구조적으로 유사한 기질이 양성자와의 공수송으로 고삼투압 조건 하에 세포로 흡수되는 것을 촉매한다. ProP는 삼투압감지 및 삼투압조절 특성이 재구성된 시스템에서 검출된 첫번째 수송체였다. C-말단 도메인은 코일트 코일 모티프를 형성할 수 있다. 이러한 도메인의 형성은 삼투압조절에 중요하며, 아마도 삼투압 자극의 감지에 중요할 것이다 (Culham et al., Journal of Molecular Recognition 13, 309-322 (2000)). ProP는 칼륨 이온 농도의 내부 증가에 의해 및 상이한 쇄 길이의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 사용에 의해 프로테오리포솜에서 제한되는 거대분자 밀집에 의해 활성화된다 (Racher et al., Biochemistry 40, 7324-7333 (2001); Culham et al., Biochemistry 42, 410-420 (2003)). 그러나, ProP가 추가의 인자없이 삽투 스트레스 상황을 감지할 수 있더라도, 생체내에서 캐리어의 완전한 활성은 세포질 ProQ 단백질의 존재를 필요로 한다 (Kunte et al., Journal of Bacteriology 181, 1537-43 (1999)).
따라서, 이. 콜라이 ProP 수송체는 삼투압조절에서의 그의 기능에 대해 어느 정도 알려져 있다.
놀랍게도, 본 발명자들은 이제 본 발명에 따라 엔테로박테리아세아에 과의 미생물에 의한 L-아미노산의 생산이 proP 유전자를 감쇠시킴으로써 증가될 수 있다는 것을 밝혀내었다.
본 발명의 목적은 황-함유 아미노산, 보다 구체적으로 L-메티오닌의 과다생산을 증가시킬 수 있는 방법 및 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 제1 대상은 proP 유전자가 감쇠된 미생물을 사용하는 것을 특징으로 하는, 엔테로박테리아세아에 과의 미생물의 발효에 의해 L-아미노산 또는 L-아미노산을 함유하는 사료 첨가제를 생산하는 방법이다.
상기 미생물은 L-아미노산을 생산하고, 이를 바람직하게는 주위 배지로 분비한다.
미생물은 또한 L-아미노산을 바람직하게는 배지에 및/또는 세포 내부 (축적)로 축적시키며, 배지에 축적시키는 것이 특히 바람직하다.
따라서 본 발명의 또 다른 대상은 또한 L-아미노산을 생산하여 이를 바람직하게는 배지로 분비하고, 바람직하게는 L-아미노산을 배지에 및/또는 세포 내부로, 바람직하게는 배지에 축적시키는 것을 특징으로 하는, 감쇠된 proP 유전자를 보유하는 엔테로박테리아세아에 과의 미생물이다.
미생물은 본원에서 바람직하게는 감쇠된 proP 유전자 없이 사용된 출발 균주 또는 모 균주와 비교하여 발효 공정에서 바람직한 L-아미노산 증가된 생산 및 바람직하게는 배출을 보여준다.
"감쇠된"은 본 발명에 따르면 proP 유전자가 낮은 수준으로 발현되거나 또는 완전하게 작동하지 않는 것을 의미한다.
이와 관련하여, 용어 "감쇠"는 본 발명에 따르면 상응하는 DNA에 의해, 보다 구체적으로 본원에서 proP 유전자에 의해 코딩되는 미생물에서의 하나 이상의 효소 또는 단백질, 보다 구체적으로 본원에서 ProP 수송체의 세포내 활성 또는 농도를, 예를 들어 각각의 효소 또는 단백질에 대해 재조합되지 않은 미생물 또는 모 균주에서보다 약한 프로모터를 사용하거나, 또는 각각의 낮은-활성 효소 또는 단백질을 코딩하는 유전자 또는 대립유전자를 사용하거나, 또는 각각의 효소 또는 단백질 또는 오픈 리딩 프레임 또는 유전자를 비활성화시킴으로써, 그리고 적절한 경우에 이러한 측정을 조합함으로써 감소시키거나 또는 제거하는 것을 설명한다.
감쇠의 측정은 각각의 단백질의 활성 또는 농도를 야생형 단백질의 활성 또는 농도, 또는 각각의 효소 또는 단백질에 대해 재조합되지 않은 미생물 또는 모 균주의 단백질의 활성 또는 농도의 0 내지 75%, 0 내지 50%, 0 내지 25%, 0 내지 10%, 또는 0 내지 5%로 낮춘다. 비-재조합 미생물 또는 모 균주는 본 발명에 따른 감쇠 또는 제거가 적용된 미생물을 의미하는 것으로 이해된다.
감쇠는 유전자 또는 오픈 리딩 프레임의 발현 또는 효소 단백질의 촉매 특성을 감소시키거나 또는 제거함으로써 달성될 수 있다. 양쪽 측정은 적절한 경우에 조합될 수 있다.
유전자 발현은 적합한 배양 절차에 의해, 유전자 발현의 신호 구조물의 유전자 변형 (돌연변이)에 의해, 또는 다르게는 안티센스-RNA 기술에 의해 감소될 수 있다. 유전자 발현의 신호 구조물의 예는 리프레서 유전자, 활성화제 유전자, 오퍼레이터, 프로모터, 감쇠인자, 리보솜-결합 부위, 개시 코돈 및 종결인자이다. 이에 대한 정보는 통상의 기술자가 특히 예를 들어 문헌 [Jensen and Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191-195 (1998)), Carrier and Keasling (Biotechnology Progress 15: 58-64 (1999)), Franch and Gerdes (Current Opinion in Microbiology 3: 159-164 (2000)), Kawano et al. (Nucleic Acids Research 33(19), 6268-6276 (2005))] 및 유전학 및 분자 생물학의 공지된 문헌, 예를 들어 문헌 [Knippers ("Molekulare Genetik", 6th edition, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1995) 또는 Winnacker ("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany, 1990)]에서 찾아볼 수 있다.
효소 단백질의 촉매 특성의 변화 또는 감소를 발생시키는 돌연변이는 선행 기술에 개시되어 있으며; 언급될 수 있는 예는 문헌 [Qiu and Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997)), Yano et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 95: 5511-5515 (1998)), Wente and Schachmann (Journal of Biological Chemistry 266: 20833-20839 (1991))]에서의 연구이다. 개관은 유전학 및 분자 생물학의 공지된 문헌, 예를 들어 문헌 [Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986)]에서 찾아볼 수 있다.
고려될 수 있는 돌연변이는 적어도 하나 (1)의 염기 쌍 또는 뉴클레오티드의 전위, 전좌, 삽입 및 결실이다. 효소 활성에 대한 돌연변에 의해 유발된 아미노산 치환의 효과에 따라, 과오 돌연변이 또는 무의미 돌연변이로 지칭된다. 과오 돌연변이는 단백질에서 주어진 아미노산의 상이한 하나의, 보다 구체적으로는 비-보존적 아미노산 치환에 의한 치환으로 이어진다. 이는 상기 단백질의 기능성 또는 활성을 손상시키며, 0 내지 75%, 0 내지 50%, 0 내지 25%, 0 내지 10%, 또는 0 내지 5%로 감소시킨다. 무의미 돌연변이는 유전자의 코딩 영역 내에 정지 코돈을 발생시켜, 결과적으로 번역이 조기에 종결된다. 유전자에서 적어도 하나의 염기 쌍의 삽입 또는 결실은 부정확한 아미노산이 혼입되거나 번역이 조기에 종결된 결과로서 프레임 이동 돌연변이로 이어진다. 정지 코돈이 돌연변이의 결과로서 코딩 영역 내에 생성된 경우에, 이는 마찬가지로 번역을 조기에 종결시킨다. 마찬가지로, 적어도 하나 (1) 또는 그 초과의 코돈의 결실은 전형적으로 효소 활성을 전체적인 손실을 초래한다. WO 03/074719는 적합한 t-RNA 저해제에 의한 코딩 영역에서의 정지-코돈 돌연변이의 억제에 의해 유전자 발현이 감소하는 것을 기재한다.
이러한 돌연변이 발생에 대한 지침은 선행 기술에 속하며, 유전학 및 분자생물학의 공지된 문헌, 예를 들어 문헌 [Knippers ("Molekulare Genetik", 6th edition, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1995), Winnacker ("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany, 1990) 또는 Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986)]에서 찾아볼 수 있다.
"감쇠" ? "낮은 수준의 발현"은 보다 특히 proP 유전자와 관련하여 ProP 수송체의 활성 및/또는 농도가 본원에서 상기 설명된 측정에 의해 야생형 단백질의 활성 및/또는 농도, 또는 ProP 수송체에 대해 재조합되지 않은 미생물 또는 모 균주에서의 단백질의 활성 및/또는 농도의 0 내지 75%, 0 내지 50%, 0 내지 25%, 0 내지 10%, 또는 0 내지 5%로 저하된다는 것을 의미한다.
본 발명에 따르면, L-아미노산은 바람직하게는 미생물에 의해 과다생산된다. "과다생산"은 본 발명에 따르면 L-아미노산에 관한 생산 성능이 미생물의 고유한 필요를 초과하여 크게 증가되는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 L-아미노산은 바람직하게는 황-함유 아미노산, 특히 L-메티오닌, L-시스테인, L-시스틴, L-호모시스테인 또는 L-호모시스틴, 특히 바람직하게는 L-메티오닌이다.
본 발명 따라 본 발명에 따른 방법에 사용되는 미생물은 바람직하게는 감쇠된 proP 유전자가 없는 미생물과 비교하여 증가된 메티오닌 내성을 가짐으로써 구별된다. 바람직하게는, 이들은 본원에서 심지어 리터당 50 또는 60 그램의 L-메티오닌 농도에서, 특히 바람직하게는 심지어 리터당 70, 75, 80, 90, 또는 100 그램의 L-메티오닌 농도에서 성장할 수 있으며, 이는 이들이 이러한 메티오닌 농도에 저항성이기 때문이다. L-메티오닌에 관한 내성 데이터는 본원에서 바람직하게는 상응하는 L-메티오닌 농도를 갖는 최소 한천에 기초한다.
이러한 메티오닌-저항성 균주는 이미 L-메티오닌을 생산한 이. 콜라이 균주로부터 시작하여 메티오닌-함유 최소 한천 상에서의 선택에 의해 단리될 수 있다.
본 발명에 따른 메티오닌-저항성 박테리아는 바람직하게는 선행 기술에 기재된 선택 방법을 이용하여 생성되며, 이러한 방법은 특히 문헌 [Miller (A Short Course in Bacterial Genetics, A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992)) 또는 "Manual of Methods for General Bacteriology" of the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA)]에서 찾아볼 수 있다.
따라서 본 발명의 또 다른 대상은
a) 황-함유 L-아미노산, 바람직하게는 L-메티오닌을 생산할 수 있는 엔테로박테리아세아에 과의 미생물을 증가된 메티오닌 내성에 대해 스크리닝하는 단계;
b) a)에서 생성된 돌연변이체를 단리하고 증식시키는 단계;
c) 임의로, b)에서 수득한 돌연변이체로부터의 핵산을 제공하는 단계;
d) 임의로, c)로부터의 핵산, 및 서열 38의 뉴클레오티드 서열의 위치 1 내지 위치 1000 중의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 제1 프라이머 및 서열 38의 상보적 뉴클레오티드 서열의 위치 2504 내지 위치 3503 중의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 제2 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍으로부터 시작하여, 폴리머라제 연쇄 반응을 이용함으로써 핵산 분자를 제조하는 단계;
e) 임의로, d)에서 수득한 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열을 결정하고, 코딩된 아미노산 서열을 결정하는 단계;
f) 임의로, e)에서 결정된 아미노산 서열을 서열 2와 비교하는 단계; 및
g) 임의로, 수득한 proP 돌연변이체를 확인하는 단계
를 포함하는, 황-함유 L-아미노산, 바람직하게는 L-메티오닌을 개선된 방식으로 생산할 수 있으며 감쇠된 proP 유전자를 보유하는 엔테로박테리아세아에 과의 미생물을 확인하는 방법이다.
proP 유전자의 돌연변이를 특이적으로 수행하기 위해, 돌연변이유발 올리고뉴클레오티드를 사용하는 부위-지정 돌연변이유발 절차 (T. A. Brown: Gentechnologie fuer Einsteiger [orig. title: Gene Cloning and DNA Analysis - An Introduction], Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Germany, 1993), 또는 문헌 [Gait: Oligonucleotide synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) 또는 Newton and Graham (PCR, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1994)]의 매뉴얼에 기재된 바와 같이 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 이용할 수 있다. 돌연변이를 조작하기 위해, 스트라타진(Stratagene) (네덜란드 암스테르담)으로부터의 퀵 체인지(Quick Change) 부위-지정 돌연변이유발 키트가 예를 들어 사용될 수 있다. 이러한 방법은 야생형 균주의 단리된 전체 DNA로부터 시작하는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 선행 기술에 기재된 proP 유전자를 증폭시키는 것, 상기 유전자를 적합한 플라스미드 벡터에 클로닝 하는 것, 및 이어서 DNA를 돌연변이유발 방법에 적용시키는 것을 포함한다. "GeneSOEing" (Gene Splicing by Overlap Extension, Horton, Molecular Biotechnology 3: 93-98 (1995))에 의해, 심지어 점 돌연변이가 PCR에 의해 수득될 수 있다. 뉴클레오티드 서열의 신생 유전자 합성 (예를 들어, GENEART AG (독일 레겐스부르크)에 의함)이 또한 proP 유전자에 돌연변이를 생성시키는데 이용될 수 있다. 생성된 돌연변이는 DNA 서열분석, 예를 들어 문헌 [Sanger et al. (Proceedings of the National Academy of Science USA 74 (12): 5463-5467, 1977)]의 방법에 의해 결정 및 확인될 수 있다.
생성된 대립유전자는 예를 들어 형질전환 및 유전자 또는 대립유전자 치환 방법에 의해 적절한 균주의 염색체로 혼입될 수 있다.
문헌 [Hamilton et al. (Journal of Bacteriology 171, 4617 - 4622 (1989))]에 기재된 종래의 방법은 조건부로 복제되는 pSC101 유도체 pMAK705 또는 pKO3에 의한 유전자 치환의 방법이다 (Link et al., Journal of Bacteriology 179: 6228-6237). 선행 기술에 기재된 다른 방법, 예를 들어 문헌 [Martinez-Morales et al. (Journal of Bacteriology 1999, 7143-7148 (1999)) 또는 Boyd et al. (Journal of Bacteriology 182, 842-847 (2000))]의 방법이 마찬가지로 이용될 수 있다.
또 다른 종래의 방법은 람다 레드(Lambda Red) 레콤비나제에 의해 PCR 또는 유전자 합성에 의해 생성된 DNA 단편을 짧은 상동성 플랭킹 서열을 통해 직접 염색체에 혼입시키는 것, 또는 치환을 수행하는 것으로 이루어진다 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(12), 6640-6645 (2000); Nature Genetics 20, 123 - 128, 1998).
마찬가지로 접합 또는 형질도입에 의해 생성된 대립유전자를 다양한 균주로 전달할 수 있다.
proP 핵산 서열은 미국 국립 생물 정보 센터 (NCBI), 의약 국립 도서관 (미국 메릴랜드주 베데스다)의 데이터베이스, 유럽 분자 생물학 실험실 (EMBL, 독일 하이델베르크 및 영국 캠브리지)의 뉴클레오티드 서열 데이터베이스 또는 일본 (DDBJ, 일본 미시마)의 DNA 데이터베이스에서 찾아볼 수 있다.
설명 목적을 위해, 에스케리키아 콜라이 proP 유전자의 공지된 서열이 서열 1 하에 열거되고, 마찬가지로 엔테로박테리아세아에 과에 속하는 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) 및 시켈라 소네이(Shigella sonnei)의 proP 유전자의 공지된 서열이 서열 3 및 서열 5 하에 열거된다. 이러한 리딩 프레임에 의해 코딩되는 단백질은 서열 2, 서열 4 및 서열 6에 의해 열거된다. proP 유전자에 대한 추가의 뉴클레오티드 서열은 예를 들어 하기 엔테로박테리아세아에: 시켈라 보이디이(Shigella boydii) (등록 번호 NC_007613); 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri) (등록 번호 NC_004741); 시겔라 디센테리아에(Shigella dysenteriae) (등록 번호 NC_007606); 시트로박터 로덴티움(Citrobacter rodentium) (등록 번호 NC_013716); 에르위니아 피리폴리아에(Erwinia pyrifoliae) (등록 번호 NC_012214); 클레브시엘라 뉴모니아에(Klebsiella pneumoniae) (등록 번호 NC_011283)에서 발견된다.
에스케리키아 콜라이 K12 proP 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 또한 삼투압감수성 MFS 수송체 ProP 또는 양성자/호환가능한 용질 공수송체 (등록 번호 11612 (영역: 4328525-4330027); 대안 유전자 명칭: b4111, ECK4104); 문헌 [Grothe et al., Journal of Bacteriology 166, 253-259 (1986); Racher et al., Biochemistry 38, 1676-1684 (1999); Wood, Methods in Enzymology 428, 77-107 (2007)])로 지칭된다.
본 발명에 따른 바람직한 실시양태에서, 감쇠될 proP 유전자는 바람직하게는 서열 1, 3, 5 또는 7의 완전 폴리뉴클레오티드 서열에 기초하여, 특히 바람직하게는 서열 1의 완전 폴리뉴클레오티드 서열에 기초하여 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 특히 적어도 95%, 특히 적어도 98, 99 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 유전자이다.
proP 유전자 및 상기 proP 유전자의 오픈 리딩 프레임에 관한 문헌의 참조가 상기에 지시되어 있다. 이들은 proP 유전자를 감쇠시키기 위해 적절한 방식으로 본 발명에 따라 이용될 수 있다. 또한, 유전자 코드의 축중성으로부터 또는 기능적으로 중성 센스 돌연변이로 인해 발생하는 유전자 또는 오픈 리딩 프레임의 대립유전자가 또한 감쇠된 proP 유전자의 제조에 사용될 수 있다. 내인성 유전자 또는 내인성 오픈 리딩 프레임의 사용이 바람직하다.
기능적으로 중성 센스 돌연변이를 함유하는 proP 유전자의 대립유전자는 다른 것 중에서 이들에 의해 코딩되는 단백질에서 40개 이하 또는 30개 이하 또는 20개 이하, 바람직하게는 10개 이하 또는 5개 이하, 매우 특히 바람직하게는 3개 이하 또는 2개 이하, 또는 정확하게 1개의 보존전 아미노산 치환을 발생시키는 것을 포함한다
방향족 아미노산의 경우에, 보존적 치환은 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신이 서로 치환되는 것이다. 소수성 아미노산의 경우에, 보존적 치환은 류신, 이소류신 및 발린이 서로 치환되는 것이다. 극성 아미노산의 경우에, 보존적 치환은 글루타민 및 아스파라긴이 서로 치환되는 것이다. 염기성 아미노산의 경우에, 보존적 치환은 아르기닌, 리신 및 히스티딘이 서로 치환되는 것이다. 산성 아미노산의 경우에, 보존적 치환은 아스파르트산 및 글루탐산이 서로 치환되는 것이다. 히드록실 기를 함유하는 아미노산의 경우에, 보존적 치환은 세린 및 트레오닌이 서로 치환되는 것이다.
유사하게, N 또는 C 말단에서 적어도 하나 (1)의 아미노산에 의한 확장 또는 말단절단을 부가적으로 함유하는 언급된 단백질의 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 또한 사용될 수 있다. 이러한 확장 또는 말단절단은 10, 5, 3 또는 2개 이하의 아미노산 또는 아미노산 잔기를 구성한다.
적합한 변이체는 또한 적어도 하나 (1)의 아미노산이 삽입되거나 (삽입) 또는 제거된 (결실) 단백질을 코딩하는 것을 포함한다. 인델로서 지칭된 이러한 변형의 최대 개수는 2, 3, 5개일 수 있으나, 10개 아미노산을 초과하는 경우는 없다.
적합한 변이체는 또한 특히 엄격한 조건 하에 서열 1, 서열 3 또는 서열 5 또는 그의 일부, 특히 코딩 영역 및/또는 그에 상보적인 서열을 사용하는 혼성화에 의해 수득가능한 것을 포함한다.
혼성화에 의한 DNA 서열의 확인에 관한 지시사항은 통상의 기술자가 특히 문헌 "The DIG System User's Guide for Filter Hybridization" from Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Germany, 1993) 및 Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255-260 (1991))]의 매뉴얼에서 찾아볼 수 있다. 혼성화는 엄격한 조건 하에 일어나고, 다시 말해 오직 프로브 및 표적 서열, 즉 상기 프로브로 처리된 폴리뉴클레오티드가 적어도 70% 동일한 하이브리드만이 형성된다. 혼성화 (세척 단계 포함)의 엄격성은 완충제 조성, 온도 및 염 농도를 변화시키는 것에 의해 영향을 받거나 결정되는 것으로 공지되어 있다. 혼성화 반응은 일반적으로 세척 단계와 비교하여 상대적으로 낮은 엄격도로 수행된다 (문헌 [Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996]).
예를 들어, 대략 50℃ - 68℃의 온도에서 5x SSC 완충제가 혼성화 반응에 사용될 수 있다. 여기서, 프로브는 또한 프로브의 서열에 대해 70％ 미만으로 동일한 폴리뉴클레오티드와 혼성화할 수 있다. 이러한 하이브리드는 덜 안정하고, 엄격한 조건 하의 세척에 의해 제거된다. 이는 예를 들어 온도를 대략 50℃ - 68℃, 대략 52℃ - 68℃, 대략 54℃ - 68℃, 대략 56℃ - 68℃, 대략 58℃ - 68℃, 대략 60℃ - 68℃, 대략 62℃ - 68℃, 대략 64℃ - 68℃, 대략 66℃ - 68℃로 설정하면서 염 농도를 2x SSC로 낮춤으로써, 적절한 경우에는 후속적으로 0.5x SSC로 낮춤으로써 달성될 수 있다 (The DIG System User's Guide for Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany, 1995). 대략 64℃ - 68℃ 또는 대략 66℃ - 68℃의 온도 범위가 바람직하다. 임의로, 염 농도를 0.2x SSC 또는 0.1x SSC에 상응하는 농도로 낮출 수 있다. 혼성화 온도를 대략 1-2℃의 단계로 50℃에서 68℃로 단계적으로 증가시킴으로써, 예를 들어 사용되는 프로브의 서열 또는 서열 1, 서열 3 또는 서열 5에 제시된 뉴클레오티드 서열에 대해 예를 들어 적어도 70% 또는 적어도 80% 또는 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 폴리뉴클레오티드 단편을 단리할 수 있다. 혼성화에 대한 추가 지침은 "키트"의 형태로 구입할 수 있다 (예를 들어, 로슈 다이아그노스틱스 게엠베하(Roche Diagnostics GmbH) (독일 만하임)로부터의 DIG Easy Hyb, 카탈로그 번호 1603558).
감쇠될 proP 유전자는 바람직하게는 서열 2, 서열 4, 서열 6 또는 서열 8의 아미노산 서열, 바람직하게는 서열 2의 아미노산 서열에 대해 적어도 85%, 특히 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 특히 바람직하게는 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 ProP 수송체 단백질을 코딩하며, 상기 동일성은 바람직하게는 지시된 서열(들)의 전체 길이에 대한 것이다. ProP 수송체 단백질은 바람직하게는 500개 아미노산을 포함하거나 또는 본질적으로 500개 아미노산 길이를 가지며, 500개 아미노산의 길이가 바람직하다. ProP 단백질은 매우 특히 바람직하게는 서열 2의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이를 갖고, 이 서열은 임의로 40개 이하, 30개 이하, 바람직하게는 20개 이하, 10개 이하, 5개 이하, 3개 이하, 2개 이하, 특히 바람직하게는 1개 이하의 보존적 아미노산 치환(들)을 포함할 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 본질적으로 ProP 수송체의 활성을 변경시키지 않고, 다시 말해 본 발명에 따르면 바람직하게는 상기 활성은 출발 서열에 기초하여 상기 보존적 아미노산 치환을 10% 이하만큼 변경시킨다.
이와 관련하여, 용어 "본질적으로 500개 아미노산의 길이"은 폴리펩티드 내의 또는 상기 폴리펩티드의 N- 또는 C-말단 단부에서의 하나 (1) 이상, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 또는 2개 이하의 아미노산의 삽입 또는 결실이 엔테로박테리아세아에 과의 상이한 종 또는 균주에서 코딩된 폴리펩티드의 길이의 약간의 변화를 초래한다는 사실을 고려한다. 그의 한 예는 에르위니아 피리폴리아에(Erwinia pyrifoliae) ProP 단백질이다. 이러한 경우에, 폴리펩티드의 길이 (서열 8 참조)는 501개 아미노산이다.
본 발명에 따른 바람직한 실시양태에서, 서열 1의 proP 유전자의 감쇠는 하기 돌연변이:
a) 핵염기 티민에 의한 서열 1의 폴리뉴클레오티드 서열의 위치 971 또는 대등한 위치에서의 핵염기 구아닌의 치환;
b) 핵염기 시토신에 의한 서열 1의 폴리뉴클레오티드 서열의 위치 1399 또는 대등한 위치에서의 핵염기 티민의 치환;
c) 핵염기 티민에 의한 서열 1의 폴리뉴클레오티드 서열의 위치 1234 또는 대등한 위치에서의 핵염기 구아닌의 치환;
d) 서열 1의 폴리뉴클레오티드 서열의 위치 854에서의 핵염기 아데닌의 결실;
e) 서열 1의 폴리뉴클레오티드 서열의 위치 1173 내지 위치 1223의 핵염기 중 1개 이상의 결실, 바람직하게는 위치 1173 내지 위치 1223의 모든 핵염기의 결실;
f) 서열 1의 폴리뉴클레오티드 서열의 위치 842에서의 핵염기 시토신의 삽입;
g) 서열 1의 폴리뉴클레오티드 서열의 위치 973에서의 1개 이상의 핵염기(들)의 삽입, 바람직하게는 위치 973에서의 19개 핵염기의 삽입;
h) 서열 1의 폴리뉴클레오티드 서열의 위치 183에서의 1개 이상의 핵염기(들)의 삽입, 바람직하게는 위치 183에서의 1359개 핵염기의 삽입 중 어느 것을 갖는 유전자에 의해 달성된다.
본 발명에 따른 바람직한 실시양태에서, 감쇠된 proP 유전자는 따라서 서열 1의 폴리뉴클레오티드에 기초하여, 바람직하게는 서열 1의 폴리뉴클레오티드의 완전 서열에 기초하여 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 특히 적어도 95%, 특히 바람직하게는 적어도 98, 99 또는 100%의 서열 동일성을 가지며, 또한 하기 돌연변이:
a) L-류신, L-이소류신 및 L-발린으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산, 바람직하게는 L-류신을 코딩하는 트리플렛에 의한 서열 2의 위치 324 또는 아미노산 서열의 대등한 위치에서의 L-아르기닌을 코딩하는 트리플렛의 치환;
b) L-리신, L-아르기닌 및 L-히스티딘으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산, 바람직하게는 L-히스티딘을 코딩하는 트리플렛에 의한 서열 2의 위치 467 또는 아미노산 서열의 대등한 위치에서의 L-티로신을 코딩하는 트리플렛의 치환;
c) 정지 코돈을 코딩하는 트리플렛에 의한 서열 2의 위치 412 또는 아미노산 서열의 대등한 위치에서의 L-글루탐산을 코딩하는 트리플렛의 치환;
d) 서열 1의 proP 유전자의 위치 854에서의 핵염기 아데닌의 결실;
e) 서열 1의 proP 유전자의 위치 1173 내지 위치 1223의 핵염기 중 1개 이상의 결실, 바람직하게는 위치 1173 내지 위치 1223의 모든 핵염기의 결실;
f) 서열 1의 proP 유전자의 위치 842에서의 핵염기 시토신의 삽입;
g) 서열 1의 proP 유전자의 위치 973에서의 1개 이상의 핵염기(들)의 삽입, 바람직하게는 위치 973에서의 19개 핵염기의 삽입;
h) 서열 1의 proP 유전자의 위치 183에서의 1개 이상의 핵염기(들)의 삽입, 바람직하게는 위치 183에서의 1359개 핵염기의 삽입
중 하나 이상, 바람직하게는 정확하게 하나를 서열 1의 폴리뉴클레오티드 상에 필수적으로 갖는 폴리뉴클레오티드이다.
서열 1의 폴리뉴클레오티드에 기초하여 지시된 동일성은 본원에서 각각의 경우에 상기 언급된 하나 이상의 명령 돌연변이가 없는 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 것이다.
"대등한 위치"는 예를 들어 클러스탈 W(Clustal W) 프로그램 (Thompson et al., Nucleic Acids Research 22, 4637-4680 (1994)) 또는 MAFFT 프로그램 (Katoh et al., Genome Information 2005; 16(1), 22-33)을 이용하는 정렬에 의해 아미노선 서열을 비교함으로써 용이하게 확인될 수 있다.
본 발명에 따른 미생물 및 엔테로박테리아세아에 과의 본 발명에 따른 공정에 사용되는 미생물은 바람직하게는 속 에스케리키아, 에르위니아, 프로비덴시아 또는 세라티아, 특히 속 에스케리키아의 박테리아이다. 이는 특히 바람직하게는 에스케리키아 콜라이이다.
L-아미노산, 특히 황-함유 L-아미노산을 생산하기 위한 본 발명에 따른 공정에서, 발효는 바람직하게는 무기 황 공급원을 함유하는 배지에서 수행된다. 사용될 수 있는 황 공급원은 예를 들어 디티오술푸르산 (티오술페이트)의 염이며, 적절한 경우에 다른 황 공급원, 예를 들어 예컨대 술페이트, 술파이트 또는 디티오나이트와 함께 사용된다 (또한 EP 출원 11151526.8 참조).
L-아미노산은 바람직하게는 수득한 발효 브로쓰에 축적되며, 이어서 적절한 경우에 단리, 수집 및/또는 정제된다.
L-아미노산은 또한 발효 브로쓰 및/또는 바이오매스로부터의 성분과 함께 단리 또는 수집될 수 있다.
단리된 박테리아 또는 그를 이용한 발효 공정의 산출량은 생성물 농도 (부피당 생성물), 생성물 수율 (소비된 탄소 공급원당 형성된 생성물) 및 생성물 형성 (부피 및 시간당 형성된 생성물)의 군으로부터 선택된 파라미터 또는 그외의 다른 공정 파라미터 및 그의 조합 중 하나 이상과 관련하여 출발 균주 또는 모 균주, 또는 그를 이용한 발효 공정에 기초하여 바람직하게는 적어도 0.5%, 적어도 1%, 적어도 1.5% 또는 적어도 2% 개선된다.
본 발명에 따른 방법에서, 박테리아는 L-아미노산을 생산하기 위해, 예를 들어 PCT/EP2004/008882에 기재된 바와 같이 연속적으로, 또는 회분식 공정 (회분식 배양)으로 또는 유가식 또는 반복된 유가식 공정으로 불연속적으로 배양할 수 있다. 공지된 배양 방법에 대한 일반적 특징의 개요는 문헌 [Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einfuehrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991))] 또는 문헌 [Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Brunswick/Wiesbaden, 1994))]에서 이용가능하다.
사용할 배양 배지 또는 발효 배지는 적합한 방식으로 특정한 균주의 요구를 충족시켜야 한다. 다양한 미생물에 대한 배양 배지의 설명은 문헌 [Manual of Methods for General Bacteriology of the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)]에 포함되어 있다. 용어 배양 배지 및 발효 배지 또는 배지는 교환가능하다.
탄소 공급원으로서, 당 및 탄수화물, 예컨대 예를 들어 글루코스, 수크로스, 락토스, 프룩토스, 말토스, 당밀, 사탕무 또는 사탕수수 가공으로부터의 수크로스-함유 용액, 전분, 전분 가수분해물 및 셀룰로스, 오일 및 지방, 예컨대 예를 들어 대두 오일, 해바라기 오일, 땅콩 오일 및 코코넛 오일, 지방산, 예컨대 예를 들어 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산, 알콜, 예컨대 예를 들어 글리세롤, 메탄올 및 에탄올, 및 유기산, 예컨대 예를 들어 아세트산을 사용할 수 있다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.
사용될 수 있는 질소 공급원은 유기 질소-함유 화합물, 예컨대 펩톤, 효모 추출물, 육류 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두분 및 우레아, 또는 무기 화합물, 예컨대 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이다. 질소 공급원은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.
사용될 수 있는 인 공급원은 인산, 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨, 또는 상응하는 나트륨-함유 염이다.
배양 배지는 추가로 성장에 필요한 염을, 예를 들어 금속, 예컨대 예를 들어 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 및 철의 클로라이드 형태로, 예를 들어 마그네슘 술페이트 또는 철 술페이트의 형태로 포함한다. 최종적으로, 상기-언급된 물질 뿐만 아니라, 아미노산, 예를 들어 호모세린, 및 비타민, 예를 들어 코발라민, 티아민, 비오틴 또는 판토텐산과 같은 필수 성장 인자가 사용될 수 있다.
또한, 특정한 아미노산의 적합한 전구체가 배양 배지에 첨가될 수 있다.
상기 출발 물질은 배양물에 단일 회분식 형태로 첨가되너가 또는 배양 동안 적합한 방식으로 공급될 수 있다.
배양물의 pH는 적합한 방식으로 염기성 화합물, 예컨대 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아 또는 수성 암모니아, 또는 산성 화합물, 예컨대 인산 또는 황산을 사용함으로써 제어된다. pH는 일반적으로 6.0 내지 9.0, 바람직하게는 6.5 내지 8의 값으로 조정된다. 발포를 제어하기 위해, 소포제, 예컨대 예를 들어 지방산 폴리글리콜 에스테르를 사용할 수 있다. 플라스미드의 안정성을 유지하기 위해, 선택적 작용을 하는 적합한 물질, 예컨대 예를 들어 항생제를 배지에 첨가할 수 있다. 호기성 상태를 유지하기 위해, 산소 또는 산소-함유 기체 혼합물, 예컨대 예를 들어 공기가 배양물에 도입된다. 마찬가지로 과산화수소가 풍부한 액체를 사용할 수 있다. 발효는 적절한 경우에 승압에서, 예를 들어 0.03 내지 0.2 Mpa의 압력에서 수행된다. 배양물의 온도는 보통 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다. 회분식 공정에서, 배양은 바람직한 아미노산의 최대량이 형성될 때가지 계속된다. 이러한 목표에는 보통 10시간 내지 160시간 내에 도달한다. 연속적 공정에서, 보다 긴 배양 시간이 가능한다.
적합한 발효 배지가 특히 US 6,221,636, US 5,840,551, US 5,770,409, US 5,605,818, US 5,275,940 및 US 4,224,409에 기재되어 있다.
L-아미노산을 결정하는 방법은 선행 기술에 개시되어 있다. 예를 들어, 분석은 문헌 [Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190)]에 기재된 바와 같이, 후속 닌히드린 유도체화를 수반하는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 수행될 수 있거나, 또는 문헌 [Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174)]에 기재된 바와 같이, 역상 HPLC에 의해 수행될 수 있다.
이러한 방식으로 생산된 발효 브로쓰는 이어서 고체 또는 액체 생성물로 처리된다.
발효 브로쓰는 미생물이 특정 시간 동안 특정 온도에서 배양된 발효 배지를 의미한다. 발효 배지 또는 발효 동안 사용된 배지는 바람직하게는 상기 미생물의 증식 및 바람직한 아미노산의 형성을 보장하는 임의의 물질 또는 성분을 포함한다.
따라서 발효가 완료되면, 생성된 발효 브로쓰는 a) 미생물 세포 증식의 결과로서 형성된 상기 미생물의 바이오매스, b) 발효 중에 형성된 바람직한 아미노산, c) 발효 중에 형성된 유기 부산물, 및 d) 발효에 의해 소모되지 않은, 사용된 발효 배지/발효 배지들 또는 출발 물질의 구성성분, 예컨대 예를 들어 비타민, 예컨대 비오틴, 아미노산, 예컨대 호모세린 또는 염, 예컨대 황산마그네슘을 포함한다.
유기 부산물은 임의로 특정한 바람직한 L-아미노산 뿐만 아니라 발효에 사용된 미생물에 의해 생성되고 배출될 수 있는 물질을 포함한다. 이는 바람직한 아미노산에 비해 30％, 20％ 또는 10％ 미만을 구성하는 L-아미노산을 포함한다. 이들은 또한 1 내지 3개의 카르복실 기를 갖는 유기 산, 예를 들어 예컨대 아세트산, 락트산, 시트르산, 말산 또는 푸마르산을 포함한다. 최종적으로, 이들은 또한 당, 예를 들어 예컨대 트레할로스를 포함한다.
산업적 목적에 적합하고 본 발명에 따라 바람직한 전형적인 발효 브로쓰는 40 g/kg 내지 180 g/kg 또는 50 g/kg 내지 150 g/kg의 아미노산 함량을 갖는다. 바이오매스 함량 (건조 바이오매스로서)은 일반적으로 20 내지 50 g/kg이다.
따라서, 본 발명은 또한 서열 1의 서열에 기초하여 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 특히 적어도 95%, 특히 적어도 98, 99 또는 100%의 동일성 (지시된 동일성은 바람직하게는 서열 1의 전체 서열에 대한 것임)을 가지며,
a) L-류신, L-이소류신 및 L-발린으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산, 바람직하게는 L-류신을 코딩하는 트리플렛에 의한 서열 2의 위치 324 또는 아미노산 서열의 대등한 위치에서의 L-아르기닌을 코딩하는 트리플렛의 치환;
b) L-리신, L-아르기닌 및 L-히스티딘으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산, 바람직하게는 L-히스티딘을 코딩하는 트리플렛에 의한 서열 2의 위치 467 또는 아미노산 서열의 대등한 위치에서의 L-티로신을 코딩하는 트리플렛의 치환;
c) 정지 코돈을 코딩하는 트리플렛에 의한 서열 2의 위치 412 또는 아미노산 서열의 대등한 위치에서의 L-글루탐산을 코딩하는 트리플렛의 치환;
d) 서열 1의 proP 유전자의 위치 854에서의 핵염기 아데닌의 결실;
e) 서열 1의 proP 유전자의 위치 1173 내지 위치 1223의 핵염기 중 1개 이상의 결실, 바람직하게는 위치 1173 내지 위치 1223의 모든 핵염기의 결실;
f) 서열 1의 proP 유전자의 위치 842에서의 핵염기 시토신의 삽입;
g) 서열 1의 proP 유전자의 위치 973에서의 1개 이상의 핵염기(들)의 삽입, 바람직하게는 위치 973에서의 19개 핵염기의 삽입;
h) 서열 1의 proP 유전자의 위치 183에서의 1개 이상의 핵염기(들)의 삽입, 바람직하게는 위치 183에서의 1359개 핵염기의 삽입
으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 서열 1의 폴리뉴클레오티드 상에 필수적으로 갖는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
각각의 경우에 본원에서 서열 1의 폴리뉴클레오티드에 기초하여 지시된 동일성은 상기 언급된 하나 이상의 필수 돌연변이가 없는 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 것이다.
a) 핵염기 티민에 의한 서열 1의 폴리뉴클레오티드 서열의 위치 971 또는 대등한 위치에서의 핵염기 구아닌의 치환;
b) 핵염기 시토신에 의한 서열 1의 폴리뉴클레오티드 서열의 위치 1399 또는 대등한 위치에서의 핵염기 티민의 치환;
c) 핵염기 티민에 의한 서열 1의 폴리뉴클레오티드 서열의 위치 1234 또는 대등한 위치에서의 핵염기 구아닌의 치환;
d) 서열 1의 폴리뉴클레오티드 서열의 위치 854에서의 핵염기 아데닌의 결실;
e) 서열 1의 폴리뉴클레오티드 서열의 위치 1173 내지 위치 1223의 핵염기 중 1개 이상의 결실, 바람직하게는 위치 1173 내지 위치 1223의 모든 핵염기의 결실;
f) 서열 1의 폴리뉴클레오티드 서열의 위치 842에서의 핵염기 시토신의 삽입;
g) 서열 1의 폴리뉴클레오티드 서열의 위치 973에서의 1개 이상의 핵염기(들)의 삽입, 바람직하게는 위치 973에서의 19개 핵염기의 삽입;
h) 서열 1의 폴리뉴클레오티드 서열의 위치 183에서의 1개 이상의 핵염기(들)의 삽입, 바람직하게는 위치 183에서의 1359개 핵염기의 삽입
으로부터 선택된 하나 이상의 필수 돌연변이(들)가 본원에서 특히 바람직하다.
본 발명에 따르면, 바람직하게는 본 발명에 따른 상기-언급된 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 엄격한 혼성화 조건 하에 (상기 엄격한 조건은 바람직하게는 온도가 64℃ 내지 68℃ 범위이고, 완충제의 염 농도가 2xSSC 내지 0.1xSSC 범위인 세척 단계에 의해 이루어짐), 서열 1, 3 또는 5에 상보적인, 바람직하게는 서열 1에 상보적인 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상과의 혼성화에 의해 구별된다.
본 발명에 따른 특히 바람직한 폴리뉴클레오티드는 서열 9, 서열 11, 서열 13, 서열 15, 서열 17, 서열 19, 서열 21 또는 서열 23의 폴리뉴클레오티드에 대해 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 특히 적어도 98, 99 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다.
본 발명에 따른 매우 특히 바람직한 폴리뉴클레오티드는 서열 9, 서열 11, 서열 13, 서열 15, 서열 17, 서열 19, 서열 21 및 서열 23의 폴리뉴클레오티드이고/거나 이를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 또한 서열 2의 서열에 기초하여 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 특히 적어도 95%, 특히 적어도 98, 99 또는 100%의 동일성을 가지며,
a. L-류신, L-이소류신 및 L-발린으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산, 바람직하게는 L-류신에 의한 서열 2의 위치 324 또는 아미노산 서열의 대등한 위치에서의 L-아르기닌의 치환;
b. L-리신, L-아르기닌 및 L-히스티딘으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산, 바람직하게는 L-히스티딘에 의한 서열 2의 위치 467 또는 아미노산 서열의 대등한 위치에서의 L-티로신의 치환;
c. 서열 2의 위치 392 내지 위치 408 또는 아미노산 서열의 대등한 위치의 17개 아미노산의 결실;
d. 서열 2의 서열에 기초하여 C 말단의 최대 420개 아미노산의 결실, 바람직하게는 서열 2의 아미노산 서열의 C 말단의 88, 163, 202, 212 또는 420개 아미노산의 결실
로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 서열 2의 폴리펩티드 상에 필수적으로 갖는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드에 관한 것이다.
본원에 지시된 동일성은 a 및 b의 돌연변이체의 경우에 서열 2의 전체 서열에 대한 것이고, c 및 d의 돌연변이체의 경우에는 각 경우에 지시된 결실된 영역이 없는 서열 2의 서열의 하위영역에 대한 것이다.
본 발명에 따른 바람직한 폴리펩티드는 서열 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 또는 24의 폴리펩티드에 대해 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 특히 적어도 98, 99 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드이다.
본 발명에 따른 특히 바람직한 폴리펩티드는 서열 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 또는 24의 폴리펩티드이고/거나 이를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 및/또는 벡터 및/또는 폴리펩티드를 보유하는 재조합 미생물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 미생물 및 본 발명에 따른 방법에 사용되는 미생물은 바람직하게는 증진된 아스파르테이트 키나제 (EC 2.7.2.4) 효소 활성을 가지며, 피드백-저항성 대립유전자가 제공되는 것이 바람직하다. 이. 콜라이는 thrA, metL 또는 lysC 유전자에 의해 코딩되는 3종의 상이한 아스파르테이트 키나제를 갖는다. 본 발명에 따르면, 존재하는 ThrA 아스파르테이트 키나제의 증진된 활성이 제공되는 것이 특히 바람직하다.
본 발명에 따른 미생물 및 본 발명에 따른 방법에 사용되는 미생물은 또한 바람직하게는 MetA 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라제 (EC 2.3.1.46) 및/또는 CysE 세린 아세틸트랜스퍼라제 (EC 2.3.1.30)의 증가된 활성을 가짐으로써 구별된다.
metJ 유전자에 의해 코딩된 MetJ 조절 단백질을 감쇠시키거나 결실시킴으로써 L-메티오닌 생합성을 증가시키는 것이 또한 가능하다. MetJ는 이. 콜라이에서 L-메티오닌 생합성의 주요 리프레서이다. 따라서, 또한 본 발명에 따르면 감쇠되는 metJ 유전자가 주어지는 것인 바람직하다.
본 발명에 따른 미생물 및 본 발명에 따른 방법에 사용되는 미생물은 또한 바람직하게는 MetK S-아데노실메티오닌 신타제 (EC 2.5.1.6)의 감소된 활성을 가짐으로써 구별된다.
또한, 공지된 아미노산 생합성 경로의 하나 이상의 효소(들), 보충 대사의 또는 효소(들) 또는 환원된 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트 생산을 위한 효소 또는 당분해 효소 또는 PTS 효소 또는 황 대사 효소를 부가적으로 증진시키거나 또는 그의 활성을 증가시키기 위해 엔테로박테리아세아에 과의 박테리아를 사용하여 황-함유 아미노산을 생산하는 것이 유리할 수 있다.
또한, 바람직한 실시양태에서, L-메티오닌-생산 박테리아는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 특징 중 하나 이상을 갖는다:
a) CysPUWA 티오술페이트/술페이트 수송 시스템 (EC 3.6.3.25)의 하나 이상의 성분을 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
b) CysH 3'-포스포아데노신 5'-포스포술페이트 리덕타제 (EC 1.8.4.8)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
c) CysJI 술파이트 리덕타제 (EC 1.8.1.2)의 하나 이상의 성분을 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
d) CysK 시스테인 신타제 A (EC 2.5.1.47)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
e) CysM 시스테인 신타제 B (EC 2.5.1.47)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
f) CysE 세린 아세틸트랜스퍼라제 (EC 2.3.1.30)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
g) GcvTHP-Lpd 글리신 절단 시스템 (EC 2.1.2.10, EC 1.4.4.2, EC 1.8.1.4)의 하나 이상의 성분을 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
h) LipA 리포일 신타제 (EC 2.8.1.8)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
i) LipB 리포일-단백질 리가제 (EC 2.3.1.181)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
j) SerA 포스포글리세레이트 데히드로게나제 (EC 1.1.1.95)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
k) SerB 3-포스포세린 포스파타제 (EC 3.1.3.3)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
l) SerC 3-포스포세린/포스포히드록시트레오닌 아미노트랜스퍼라제 (EC 2.6.1.52)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
m) GlyA 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제 (EC 2.1.2.1)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
n) ThrA 아스파르토키나제 I 및 호모세린 데히드로게나제 I (EC 2.7.2.4, EC 1.1.1.3)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
o) LysC 아스파르테이트 키나제 (EC 2.7.2.4)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
p) Hom 호모세린 데히드로게나제 (EC 1.1.1.3)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
q) MetX 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제 (EC 2.3.1.31)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
r) MetA 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라제 (EC 2.3.1.46)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
s) MetB 시스타티오닌 감마 신타제 (EC 2.5.1.48)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
t) AecD β-C-S-리아제 (EC 4.4.1.8, 또한 베타-리아제로 지칭됨)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
u) MetC 시스타티오닌 베타-리아제 (EC 4.4.1.8)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
v) MetE B12-비의존성 호모시스테인 S-메틸트랜스퍼라제 (EC 2.1.1.14)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
w) MetH B12-의존성 호모시스테인 S-메틸트랜스퍼라제 (EC 2.1.1.13)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
x) MetF 메틸렌 테트라히드로폴레이트 리덕타제 (EC 1.5.1.20)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
y) 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) BrnFE L-메티오닌 엑스포터의 하나 이상의 성분을 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
z) 에스케리키아 콜라이 YgaZH 발린 엑스포터 (b2682, b2683)의 하나 이상의 성분을 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
aa) 추정 에스케리키아 콜라이 YjeH 수송체 (b4141)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
bb) PntAB 피리딘 뉴클레오티드 트랜스히드로게나제 (EC 1.6.1.2)의 하나 이상의 성분을 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
cc) MetZ O-숙시닐호모세린 술프히드릴라제 (EC 2.5.1.48)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
dd) Pyc 포스포엔올피루베이트 카르복실라제 (EC 4.1.1.31)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
ee) RDL2 티오술페이트 황-트랜스퍼라제 (EC 2.8.1.1)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
ff) 티오술페이트-티올 황-트랜스퍼라제 (EC 2.8.1.3)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
gg) 티오술페이트-디티올 황-트랜스퍼라제 (EC 2.8.1.5)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드.
본원에서 바람직한 특징은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 것 중 하나 이상이다:
a) CysPUWA 티오술페이트/술페이트 수송 시스템 (EC 3.6.3.25)의 하나 이상의 성분을 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
b) CysH 3'-포스포아데노신 5'-포스포술페이트 리덕타제 (EC 1.8.4.8)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
c) CysJI 술파이트 리덕타제 (EC 1.8.1.2)의 하나 이상의 성분을 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
d) CysK 시스테인 신타제 A (EC 2.5.1.47)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
e) CysM 시스테인 신타제 B (EC 2.5.1.47)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
f) CysE 세린 아세틸트랜스퍼라제 (EC 2.3.1.30)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
g) GcvTHP-Lpd 글리신 절단 시스템 (EC 2.1.2.10, EC 1.4.4.2, EC 1.8.1.4)의 하나 이상의 성분을 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
h) LipA 리포일 신타제 (EC 2.8.1.8)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
i) LipB 리포일-단백질 리가제 (EC 2.3.1.181)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
j) SerA 포스포글리세레이트 데히드로게나제 (EC 1.1.1.95)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
k) SerB 3-포스포세린 포스파타제 (EC 3.1.3.3)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
l) SerC 3-포스포세린/포스포히드록시트레오닌 아미노트랜스퍼라제 (EC 2.6.1.52)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
m) GlyA 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제 (EC 2.1.2.1)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
n) ThrA 아스파르토키나제 I 및 호모세린 데히드로게나제 I (EC 2.7.2.4, EC 1.1.1.3)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
o) LysC 아스파르테이트 키나제 (EC 2.7.2.4)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
p) Hom 호모세린 데히드로게나제 (EC 1.1.1.3)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
q) MetX 호모세린 아세틸트랜스퍼라제 (EC 2.3.1.31)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
r) MetA 호모세린 O-트랜스숙시닐라제 (EC 2.3.1.46)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
s) MetB 시스타티오닌 감마 신타제 (EC 2.5.1.48)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
t) AecD β-C-S-리아제 (EC 4.4.1.8, 또한 베타-리아제로 지칭됨)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
u) MetC 시스타티오닌 베타-리아제 (EC 4.4.1.8)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
v) MetE B12-비의존성 호모시스테인 S-메틸트랜스퍼라제 (EC 2.1.1.14)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
w) MetH B12-의존성 호모시스테인 S-메틸트랜스퍼라제 (EC 2.1.1.13)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
x) MetF 메틸렌 테트라히드로폴레이트 리덕타제 (EC 1.5.1.20)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
y) RDL2 티오술페이트 황-트랜스퍼라제 (EC 2.8.1.1)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드.
매우 특히 바람직한 특징은 본원에서 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
a) ThrA 아스파르토키나제 I 및 호모세린 데히드로게나제 I (EC 2.7.2.4, EC 1.1.1.3)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
b) CysE 세린 아세틸트랜스퍼라제 (EC 2.3.1.30)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
c) LysC 아스파르테이트 키나제 (EC 2.7.2.4)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
d) Hom 호모세린 데히드로게나제 (EC 1.1.1.3)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
e) MetX 호모세린 아세틸트랜스퍼라제 (EC 2.3.1.31)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
f) MetA 호모세린 O-트랜스숙시닐라제 (EC 2.3.1.46)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
g) MetB 시스타티오닌 감마 신타제 (EC 2.5.1.48)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
h) AecD β-C-S-리아제 (EC 4.4.1.8, 또한 베타-리아제로 지칭됨)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
i) MetC 시스타티오닌 베타-리아제 (EC 4.4.1.8)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
j) MetE B12-비의존성 호모시스테인 S-메틸트랜스퍼라제 (EC 2.1.1.14)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
k) MetH B12-의존성 호모시스테인 S-메틸트랜스퍼라제 (EC 2.1.1.13)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
l) MetF 메틸렌 테트라히드로폴레이트 리덕타제 (EC 1.5.1.20)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
m) RDL2 티오술페이트 황-트랜스퍼라제 (EC 2.8.1.1)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드.
본 발명에 따르면, 용어 "과다발현", "증진" 또는 "증가된 활성"은 상응하는 DNA에 의해 코딩된 미생물의 하나 이상의 효소의 세포내 효소적 활성의 증가를 설명한다.
효소적 활성은 이론적으로, 예를 들어 효소를 코딩하는 유전자 서열 또는 유전자 서열들의 카피수를 증가시키거나, 강한 프로모터를 이용하거나 또는 증가된 활성을 갖는 상응하는 효소를 코딩하는 유전자 또는 대립유전자를 사용함으로써, 그리고 적절한 경우에 이러한 수단을 조합함으로써 증가될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따라 유전자 변형된 세포는 바람직한 유전자를 포함하는 벡터가, 상기 유전자 또는 그의 부분의 대립유전자, 및 상기 유전자의 발현을 가능하게 하는 벡터로의 형질전환, 형질도입, 접합, 또는 이러한 방법의 조합에 의해 생성된다. 이종 발현은 특히 유전자 또는 대립유전자를 세포의 염색체로 또는 염색체외적으로 복제하는 벡터로 통합시킴으로써 달성된다.
피루베이트 카르복실라제의 예에 의해 세포에서의 효소적 활성을 증가시킬 가능성의 개관은 DE-A-100 31 999에 제공되며, 이는 본원에 참조로 포함되고, 세포에서의 효소적 활성을 증가시킬 가능성에 관한 그의 개시 내용은 본 발명의 개시내용의 일부를 형성한다.
효소적 활성의 증가는 예를 들어 상응하는 폴리뉴클레오티드의 카피수를 염색체적으로 또는 염색체외적으로 하나 이상의 카피만큼 증가시킴으로써 달성될 수 있다.
카피수를 증가시키기 위해 널리 이용되는 방법은 상응하는 폴리뉴클레오티드를 벡터, 바람직하게는 박테리아에 의해 복제되는 플라스미드에 도입하는 것을 포함한다.
엔테로박테리아세아에를 위한 적합한 플라스미드 벡터의 예는 pACYC184 (Bartolome et al.; Gene 102: 75-78 (1991)), pTrc99A (Amann et al.; Gene 69: 301-315 (1988)) 또는 pSC101 유도체 (Vocke and Bastia; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80(21): 6557-6561 (1983))로부터 유래된 클로닝 벡터이며, 이들이 사용될 수 있다. pCL1920 (Lerner, C.G. and Inouye, M., Nucl. Acids Res. (1990) 18:4631 [PMID: 2201955])으로부터 유래된 플라스미드가 또한 특히 적합하다. 박테리아 인공 염색체 (BAC), 예컨대 예를 들어 pCC1BAC (에피센트레 바이오테크놀로지스(EPICENTRE Biotechnologies), 미국 매디슨)로부터 유래된 플라스미드 벡터는 마찬가지로 이. 콜라이에서 상응하는 폴리뉴클레오티드의 카피수를 증가시키는데 적합하다.
또한, 트랜스포손, 삽입 요소 (IS 요소) 또는 파지가 벡터로 사용될 수 있다. 이러한 유전자 시스템은 예를 들어 특허 명세서 US 4,822,738, US 5,804,414 및 US 5,804,414에 기재되어 있다. WO 92/02627에 기재된 IS 요소 ISaB1 또는 플라스미드 pXZ10142의 Tn 45 트랜스포손 (문헌 ["Handbook of Corynebacterium glutamicum" (editors: L. Eggeling and M. Bott)]이 동일한 방식으로 사용될 수 있다.
과다발현을 달성하기 위한 또 다른 광범위한 방법은 염색체 유전자 증폭 방법이다. 이 방법에서, 관심 폴리뉴클레오티드의 1개 이상의 추가의 카피가 박테리아의 염색체에 삽입된다. 이러한 증폭 방법은 예를 들어 WO 03/014330 또는 WO 03/040373에 기재되어 있다.
과다발현을 달성하기 위한 추가의 방법은 각각의 유전자 또는 대립유전자를 기능적 방식으로 프로모터 또는 발현 카세트에 연결시키는 것 (작동가능하게 연결됨)을 포함한다. 이. 콜라이에 적합한 프로모터의 공지된 예는 프로모터 T3, T7, SP6, M13, lac, tac 및 trc이다 (문헌 [Amann et al. (Gene 69(2), 301-315 (1988)) 및 Amann and Brosius (Gene 40(2-3), 183-190 (1985))]에 기재됨). 이러한 프로모터는 예를 들어 해당 유전자의 상류에 전형적으로 개시 코돈으로부터 대략 1-500개 핵염기의 거리에서 삽입될 수 있다. US 5,939,307은 발현 카세트 또는 프로모터, 예컨대 예를 들어 tac 프로모터, trp 프로모터, lpp 프로모터 또는 파지 λ PL 및 PR 프로모터의 예를 들어 염색체 트레오닌 오페론의 상류로의 혼입이 발현의 증가를 달성시킬 수 있다고 보고하였다. 파지 T7의 프로모터, 기어-박스 프로모터, nar 프로모터, 또는 유전자 rrsG, rnpB, csrA, csrB, ompA, fusA, pepQ, rplX 또는 rpsG의 프로모터가 동일한 방식으로 사용될 수 있다. 이러한 발현 카세트 또는 프로모터는 또한 EP 0 593 792에 기재된 바와 같이 플라스미드-결합된 유전자의 과다발현에 사용될 수 있다. lacIQ 대립유전자를 사용함으로써, 이는 다시 플라스미드-결합된 유전자의 발현을 제어할 수 있다 (Glascock and Weickert, Gene 223, 221-231 (1998)). 또한, 하나 이상의 뉴클레오티드 치환, 삽입(들) 및/또는 결실(들)에 의한 그의 서열의 변형으로 인해 프로모터의 활성이 증가될 수 있다.
효소 활성의 증가가 내인성 유전자의 돌연변이에 의해 수행되는 경우에, 이러한 돌연변이는 통상적인 방법에 의해 비-표적화된 방식으로, 예를 들어 UV 조사 또는 돌연변이-유발 화학물질에 의해, 또는 결실(들), 삽입(들) 및/또는 뉴클레오티드 치환(들)과 같은 유전 공학 방법에 의해 표적화된 방식으로 생성될 수 있다. 상기 돌연변이는 유전자 변형된 세포를 생산한다. 특히 바람직한 돌연변이체 효소는 특히 또한 더 이상 피드백-억제될 수 없거나, 또는 적어도 야생형 효소와 비교하여 감소된 피드백 억제를 갖는 효소이다.
효소 활성의 증가가 효소의 발현을 증가시킴으로써 수행되는 경우에, 예를 들어 상응하는 유전자의 카피수를 증가시키거나 또는 구조 유전자 상류의 프로모터 및 조절 영역 또는 리보솜 결합 부위를 돌연변이시킨다. 구조 유전자 활동의 상류에 혼입된 발현 카세트는 동일한 방식으로 작용한다. 유도성 프로모터 추가로 언제든지 발현을 증가시킬 수 있다. 그러나, 또한, 소위 "인핸서"는 또한 조절 서열로서 효소 유전자에 할당될 수 있고, 이는 마찬가지로 RNA 폴리머라제와 DNA 사이의 개선된 상호작용에 의해 증가된 유전자 발현을 일으킨다. 마찬가지로 mRNA 수명을 연장시키는 수단은 발현을 개선시킨다. 또한, 효소 활성은 마찬가지로 효소 단백질의 분해를 방지함으로써 증진된다. 이와 관련하여, 유전자 또는 유전자 구축물은 상이한 카피수를 갖는 플라스미드에 존재하거나 또는 염색체에 통합되고, 증폭된다. 대안적으로, 해당 유전자의 과다발현은 또한 배지 조성 및 배양 절차를 변형시킴으로써 달성될 수 있다. 통상의 기술자는 이를 위한 지시사항을 특히 문헌 [Martin et al. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya and Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991))], EP-A-0 472 869, US 4,601,893, [Schwarzer and Puehler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991)), Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993))], WO-A-96/15246, [Malumbres et al. (Gene 134, 15-24 (1993))], JP-A-10-229891, [Jensen and Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998))] 및 공지의 유전학 및 분자 생물학 문헌에서 찾을 수 있다. 상기에 기재된 수단은 돌연변이와 같이 유전자 변형 세포를 생성한다.
또한 염색체로의 통합에 의한 유전자 증폭의 과정이 적용될 수 있는 플라스미드 벡터가 또한 적합하다. 교배 사건에 의해 상동 재조합 후에, 생성된 균주는 적어도 2개의 카피의 해당 유전자를 함유한다. 이. 콜라이에 대한 과정은 예를 들어 문헌 [Link, A.J., Phillips, D. and Church, G.M. (1997), J. Bacteriology 179: 6228-6237]에 기재되어 있다.
레콤비나제-매개 과정, 예를 들어 문헌 [Datsenko KA, Wanner BL., 2000, Proc Natl Acad Sci USA., 97(12):6640-5]에 기재된 것은 또한 염색체에서 DNA의 삽입 또는 결실에 이용될 수 있다.
상기 및 하기 설명에서 사용된 어구 "그의 야생형 균주 또는 출발 균주보다 증가된 효소 활성"은 항상 바람직하게는 적어도 2배, 특히 바람직하게는 적어도 10배, 추가로 바람직하게는 적어도 100배, 추가로 보다 더 바람직하게는 적어도 1,000배, 가장 바람직하게는 적어도 10,000배로 증가한 특정한 효소의 활성을 의미한다. 또한 "그의 야생형 균주 또는 출발 균주보다 증가된 효소 활성"을 갖는 본 발명에 따른 세포는 특히 야생형 또는 출발 균주가 상기 효소의 검출가능한 활성을 전혀 또는 거의 갖지 않고, 오직 예를 들어 과다발현에 의해 효소 활성을 증가시킨 후에만 이러한 효소의 검출가능한 활성을 나타내는 세포를 또한 포함한다. 이와 관련하여, 하기 설명에 사용된 용어 "과다발현" 또는 어구 "발현의 증가"는 또한 출발 세포, 예를 들어 야생형 세포가 검출가능한 발현을 전혀 또는 거의 갖지 않고, 효소의 검출가능한 발현이 오직 재조합 과정에 의해서만 유도되는 경우를 포함한다.
다양한 효소의 효소적 활성을 결정하는 방법은 문헌에서 찾아볼 수 있다.
상기-언급된 효소 또는 유전자의 발현은 적절한 평가 소프트웨어를 이용하여 1- 및 2-차원 단백질을 겔 분획화 및 겔에서의 단백질 농도의 후속 광학적 확인에 의해 검출될 수 있다. 효소 활성의 증가가 전적으로 상응하는 유전자의 발현 증가에 기초하는 경우에, 효소 활성의 증가는 야생형 및 유전자 변형 세포 사이의 1- 또는 2-차원 단백질 분획화에 의해 간단한 방식으로 정량화될 수 있다. 박테리아의 경우에 단백질 겔을 제조하고 단백질을 확인하는 통상적인 방법은 문헌 [Hermann et al. (Electrophoresis, 22: 1712.23 (2001)]에 기재된 절차이다. 단백질 농도는 마찬가지로 검출할 단백질에 특이적인 항체와의 웨스턴 블롯 하이브리드화 (Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY USA, 1989) 및 농도 측정을 위한 적당한 소프트웨어를 사용하는 후속 광학적 평가 (Lohaus and Meyer (1989) Biospektrum, 5: 32-39; Lottspeich (1999), Angewandte Chemie 111: 2630-2647)에 의해 분석될 수 있다. DNA-결합 단백질의 활성은 DNA 밴드 이동 검정 (겔 지연으로도 지칭됨)에 의해 측정할 수 있다 (Wilson et al. (2001) Journal of Bacteriology, 183: 2151-2155). 다른 유전자의 발현에 대한 DNA-결합 단백질의 작용은 다양한 상세하게 기재된 리포터 유전자 검정 방법에 의해 검출될 수 있다 (Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY USA, 1989). 세포내 효소적 활성은 기재된 다양한 방법에 의해 결정될 수 있다 (Donahue et al. (2000) Journal of Bacteriology 182 (19): 5624-5627; Ray et al. (2000) Journal of Bacteriology 182 (8): 2277-2284; Freedberg et al. (1973) Journal of Bacteriology 115 (3): 816-823). 하기 설명에서 특정한 효소의 활성을 결정하는 구체적인 방법이 지시되지 않은 경우에, 효소 활성의 증가 및 또한 효소 활성의 감소는 바람직하게는 문헌 [Hermann et al., Electophoresis, 22: 1712-23 (2001), Lohaus et al., Biospektrum 5 32-39 (1998), Lottspeich, Angewandte Chemie 111: 2630-2647 (1999) 및 Wilson et al., Journal of Bacteriology 183: 2151-2155 (2001)]에 기재된 방법에 의해 결정된다.
또한 바람직하지 않은 이차 반응을 제거하기 위해 L-아미노산, 특히 L-메티오닌의 생산이 유리할 수 있다 (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982).
따라서, 이. 콜라이에서 L-메티오닌의 생산을 개선하기 위해, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자 중 하나 이상을 감쇠시키거나, 임의로는 작동하지 않도록 하거나, 또는 발현을 감소시키는 것이 적합할 수 있다:
a) L-메티오닌 생합성의 전사 조절제 (MetJ) (b3938, ECK3930)를 코딩하는 metJ 유전자,
b) 글루코스-6-포스페이트 이소머라제 (Pgi, EC 번호 5.3.1.9) (b4025, ECK4017)를 코딩하는 pgi 유전자,
c) 호모세린 키나제 (ThrB, EC 2.7.1.39) (b0003, ECK0003)를 코딩하는 thrB 유전자,
d) S-아데노실메티오닌 신타제 (MetK, EC 번호 2.5.1.6) (b2942, ECK2937)를 코딩하는 metK 유전자,
e) 디히드로디피콜리네이트 신타제 (DapA, EC 번호 4.2.1.52) (b2478, ECK2474)를 코딩하는 dapA 유전자,
f) 포스포엔올피루베이트 카르복시키나제 (Pck, EC 번호 4.1.1.49) (b3403, ECK3390)를 코딩하는 pck 유전자,
g) 포르밀테트라히드로폴레이트 히드롤라제 (PurU, EC 번호 3.5.1.10) (b1232, ECK1227)를 코딩하는 purU 유전자,
h) 피루베이트 키나제 II (PykA, EC 번호 2.7.1.40) (b1854, ECK1855)를 코딩하는 pykA 유전자,
i) 피루베이트 키나제 I (PykF, EC 2.7.1.40) (b1676, ECK1672)를 코딩하는 pykF 유전자,
j) L-메티오닌 수송체의 서브유닛 (MetQNI) (b0197, ECK0197)를 코딩하는 metQ 유전자,
k) L-메티오닌 수송체의 서브유닛 (MetQNI) (b0198, ECK0198)를 코딩하는 metI 유전자,
l) L-메티오닌 수송체의 서브유닛 (MetQNI) (b0199, ECK0199)를 코딩하는 metN 유전자,
m) 데옥시시티딘-5'-트리포스페이트 데아미나제 (Dcd, EC 번호 3.5.4.13) (b2065, ECK2059)를 코딩하는 dcd 유전자,
n) 추정 N-아실트랜스퍼라제 (YncA, 메타볼릭 익스플로러(Metabolic Explorer) WO2010/020681) (b1448, ECK1442)를 코딩하는 yncA 유전자,
o) FnrS 조절 sRNA (b4699, ECK4511)를 코딩하는 fnrS 유전자,
p) RpoS 시그마 인자 (b2741, ECK2736)를 코딩하는 rpoS 유전자.
특히 바람직한 특징은 본원에서 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
a) L-메티오닌 생합성의 전사 조절제 (MetJ) (b3938, ECK3930)를 코딩하는 metJ 유전자,
b) S-아데노실메티오닌 신타제 (MetK, EC 번호 2.5.1.6) (b2942, ECK2937)를 코딩하는 metK 유전자,
c) 포스포엔올피루베이트 카르복시키나제 (Pck, EC 번호 4.1.1.49) (b3403, ECK3390)를 코딩하는 pck 유전자,
d) 포르밀테트라히드로폴레이트 히드롤라제 (PurU, EC 번호 3.5.1.10) (b1232, ECK1227)를 코딩하는 purU 유전자,
e) 피루베이트 키나제 II (PykA, EC 번호 2.7.1.40) (b1854, ECK1855)를 코딩하는 pykA 유전자,
f) 피루베이트 키나제 I (PykF, EC 2.7.1.40) (b1676, ECK1672)를 코딩하는 pykF 유전자,
g) L-메티오닌 수송체의 서브유닛 (MetQNI) (b0197, ECK0197)를 코딩하는 metQ 유전자,
h) L-메티오닌 수송체의 서브유닛 (MetQNI) (b0198, ECK0198)를 코딩하는 metI 유전자,
i) L-메티오닌 수송체의 서브유닛 (MetQNI) (b0199, ECK0199)를 코딩하는 metN 유전자,
j) 추정 N-아실트랜스퍼라제 (YncA, 메타볼릭 익스플로러 WO2010/020681) (b1448, ECK1442)를 코딩하는 yncA 유전자,
k) RpoS 시그마 인자 (b2741, ECK2736)를 코딩하는 rpoS 유전자.
매우 특히 바람직한 특징은 본원에서 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
a) L-메티오닌 생합성의 전사 조절제 (MetJ) (b3938, ECK3930)를 코딩하는 metJ 유전자,
b) S-아데노실메티오닌 신타제 (MetK, EC 번호 2.5.1.6) (b2942, ECK2937)를 코딩하는 metK 유전자,
c) L-메티오닌 수송체의 서브유닛 (MetQNI) (b0197, ECK0197)을 코딩하는 metQ 유전자,
d) L-메티오닌 수송체의 서브유닛 (MetQNI) (b0198, ECK0198)을 코딩하는 metI 유전자,
e) L-메티오닌 수송체의 서브유닛 (MetQNI) (b0199, ECK0199)을 코딩하는 metN 유전자,
f) 추정 N-아실트랜스퍼라제 (YncA, 메타볼릭 익스플로러 WO2010/020681) (b1448, ECK1442)를 코딩하는 yncA 유전자,
g) RpoS 시그마 인자 (b2741, ECK2736)를 코딩하는 rpoS 유전자.
적절한 경우에, 감쇠의 측정은 메티오닌 생산을 증가시키기 위한 유전자의 증진을 나타내는 측정에 더하여 또는 적합하게는 이와 조합되어 수행된다.
본 발명에 따르면, 본 발명에 따른 측정 전에 L-아미노산을 생산하는 미생물은 야생형 균주 및 빈번하게 사용되는 실험실 균주, 예컨대 특히 DH5α, DH5αmcr, W3110, MG1655, MC4100, Y1089, H560, BL21 및 MM152를 포함하지 않는다.
그러나, L-아미노산 생산 미생물은 상기 야생형 균주로부터 유래되고, 빈번하게 사용되는 실험실 균주일 수 있다.
따라서, 미생물의 출발 균주는 바람직하게는 에스케리키아 콜라이 MG1655, 에스케리키아 콜라이 W3110, 에스케리키아 콜라이 DH5α, 에스케리키아 콜라이 DH10B, 에스케리키아 콜라이 BW2952, 에스케리키아 콜라이 REL606으로 이루어진 군으로부터 유래된다.
본 발명에 따라 바람직한 L-메티오닌-배출 또는 -생산 균주의 예는 생산 플라스미드 pME101-thrA*1-cysE-Pgap-metA*11 및 pCC1BAC-serB-glyA-serA-serC를 보유하는 이. 콜라이 생산자 균주 MG1655 ΔmetJ metA*11 Ptrc-metH Ptrc-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH ΔpykF ΔpykA Ptrc09-gcvTHP ΔpurU Ptrc36-ARNmst17-metF이다 (WO2009/043803).
본 발명에 따라 바람직한 L-메티오닌-배출 또는 -생산 균주의 또 다른 예는 생산 플라스미드 pME101-thrA*1-cysE-Pgap-metA*11을 보유하는 이. 콜라이 생산자 균주 MG1655 ΔmetJ Ptrc-metH Ptrc-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP이다.
이. 콜라이 생산자 균주 MG1655ΔmetJ Ptrc-metH Ptrc-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP는 특허 출원 WO2009/043803에 기재된 바와 같이 일련의 P1 형질도입 및 치유에 의해 클로닝될 수 있다. 균주는 이. 콜라이 K12 MG1655 야생형 균주에 기초한다. 하기 변형이 이러한 균주의 게놈에 도입된다:
ㆍ L-메티오닌 생합성의 리프레서에 대한 metJ 유전자가 결실된다.
ㆍ 강한 trc 프로모터가 metH 유전자 (코발라민-의존성 메티오닌 신타제를 코딩함)의 상류에 삽입된다.
ㆍ 강한 trc 프로모터가 metF 유전자 (5,10-메틸렌테트라히드로폴레이트 리덕타제를 코딩함)의 상류에 삽입된다.
ㆍ 강한 trcF 프로모터가 cysPUWAM 오페론의 상류에 삽입된다. cysPUWA는 술페이트/티오술페이트 섭취 수송체를 코딩한다. cysM은 시스테인 신타제 B를 코딩한다.
ㆍ 강한 trcF 프로모터는 cysJIH 오페론의 상류에 삽입된다. cysJI는 술파이트 리덕타제를 코딩하고, cysH는 3'-포스포아데닐릴-술페이트 리덕타제를 코딩한다.
ㆍ 강한 trc09 프로모터는 gcvTHP 오페론의 상류에 삽입된다. gcvT , gcvH 및 gcvP는 글리신 절단 시스템의 3종의 성분을 코딩한다.
이. 콜라이 생산 플라스미드 pME101-thrA*1-cysE-Pgap-metA*11의 클로닝은 특허 출원 WO2007/077041 및 WO2009/043803에 기재되어 있다. 플라스미드는 pCL1920 벡터에 기초하여 낮은 카피 수를 갖는 것 (낮은 카피 플라스미드)이다 (Lerner, C.G. and Inouye, M., Nucl. Acids Res. (1990) 18:4631 [PMID: 2201955]). 빈 플라스미드, pME101은 lac 리프레서의 강하게 발현되는 대립유전자를 코딩하는 lacI q 유전자를 보유한다. thrA *1 유전자는 Lac 리프레서에 의해 억제될 수 있는 강한 trc 프로모터의 하류에 클로닝된다. 이는 이. 콜라이 ThrA 아스파르테이트 키나제/호모세린 데히드로게나제의 피드백-저항성 변이체를 코딩한다. 하류에는 동일한 배향으로 cysE 유전자가 그의 천연 프로모터와 함께 존재한다. 이는 이. 콜라이 세린 아세틸트랜스퍼라제를 코딩한다. cysE는 metA *11 유전자의 발현을 제어하는 강한 이. 콜라이 gapA 프로모터의 하류에 있다. metA *11은 이. 콜라이 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라제의 피드백-저항성 변이체를 코딩한다.
언급될 수 있는 본 발명에 따라 바람직한 다른 L-메티오닌-배출 또는 -생산 미생물의 예는 하기 균주이다:
- 이. 콜라이 TF4076BJF metA#10 + metYX(Lm) (WO2008/127240; 페이지 46);
- 이. 콜라이 W3110ㅿJ/pKP451 (EP 1 445 310 B1, 페이지 7, 실시예 4);
- 이. 콜라이 WㅿthrBCㅿmetJmetK32 pMWPthrmetA4ㅿ5ㅿ9 (Yoshihiro Usuda and Osamu Kurahashi, 2005, Applied and Environmental Microbiology, Vol. 71, NO: 6, pp. 3228-3234);
- W3110/pHC34 (WO01/27307 페이지 13, 실시예 3);
- 이. 콜라이 ECM2 (EP2205754A2, EP2326724A1 및 EP12156052.8).
다양한 적합한 미생물의 추가의 예는 문헌 [Gomes et al. (Enzyme and Microbial Technology 37 (2005), 3-18)]에 기재되어 있다.
에스케리키아 콜라이의 유전자 또는 오픈 리딩 프레임 (ORF)의 뉴클레오티드 서열은 선행 기술에 속하고, 문헌 [Blattner et al. (Science 277: 1453-1462 (1997))]에 의해 공개된 에스케리키아 콜라이 게놈 서열에서 찾아볼 수 있다. 숙주에 내인성이 효소 (메티오닌 아미노펩티다제)는 N-말단 아미노산 메티오닌을 제거할 수 있는 것으로 알려져 있다.
유전학 및 분자 생물학의 용어에 대해 보다 상세한 설명은 유전학 및 분자 생물학의 공지된 문헌, 예컨대 예를 들어 문헌 [Birge (Bacterial and Bacteriophage Genetics, 4th ed., Springer Verlag, New York (USA), 2000)] 또는 문헌 [Berg, Tymoczko and Stryer (Biochemistry, 5th ed., Freeman and Company, New York (USA), 2002)] 또는 문헌 [Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, (3-volume set), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001)]에서 찾아볼 수 있다.
용어 "유전자"는 본원에서 우선 단백질 (폴리펩티드), 이 경우에 (p)ppGpp 신테타제 II의 활성을 갖는 폴리펩티드의 생산 (번역)에 대한 정보를 포함하는 리보핵산 (RNA)의 생산 (전사)에 대한 정보를 포함하는 데옥시리보핵산 (DNA) 상의 부분을 의미한다. 유전자 또는 폴리뉴클레오티드가 단백질 생산을 위한 정보를 포함하고 있다는 사실은 또한 유전자 또는 RNA에 의한 단백질 또는 폴리펩티드의 코딩으로 지칭된다. 내인성 유전자 및 폴리뉴클레오티드는 각각 종의 집단에 존재하는 오픈 리딩 프레임 (ORF), 유전자 또는 대립유전자 및 그의 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 용어 "유전자" 및 "ORF" (오픈 리딩 프레임)는 본 발명에서 유의어로 사용된다.
용어 "폴리뉴클레오티드"는 일반적으로 비-변형된 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있는 폴리리보뉴클레오티드 및 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 지칭한다.
용어 "폴리펩티드"는 펩티드 결합을 통해 연결된 2개 이상의 아미노산을 함유하는 펩티드 또는 단백질을 나타낸다. 용어 폴리펩티드 및 단백질은 유의어로 사용된다. 단백질은 모든 세포의 기초적 빌딩 블록이다. 이들은 세포 구조를 제공할 뿐만 아니라 또한 물질을 수송하고, 화학 반응을 촉매하고, 신호전달 작용제를 인지하는 분자 "기기"이다.
"단백질생성 아미노산"은 천연 단백질, 다시 말해 미생물, 식물, 동물 및 인간의 단백질에서 발현되는 아미노산을 의미한다. 이들은 보다 특히 L-아스파르트산, L-아스파라긴, L-트레오닌, L-세린, L-글루탐산, L-글루타민, 글리신, L-알라닌, L-시스테인, L-발린, L-메티오닌, L-이소류신, L-류신, L-티로신, L-페닐알라닌, L-히스티딘, L-리신, L-트립토판, L-프롤린 및 L-아르기닌, 및 또한 셀레노시스테인으로 이루어진 군으로부터 선택된 L-아미노산을 포함한다. 단백질생성 아미노산은 항상 α-아미노산이다. α-탄소 원자는, 각각의 이들 아미노산의 2종의 거울상이성질체가 존재하는 아미노산 글리신은 별도로 하고, 모든 단백질생성 아미노산 (이들은 키랄 분자임)의 경우에 비대칭성이다. 2종의 거울상이성질체 중 오직 1종이 단백질생성 L-아미노산이고: 단백질 합성에 요구되는 수단 - 리보솜, tRNA, 아미노아실-tRNA 신테타제 (tRNA를 아미노산으로 채움) 및 기타-은 그 자체로 또한 키랄이고, 오직 L-변이체를 인식할 수 있다.
용어 "유전자 발현" (요약하여 "발현")은 일반적으로 표현형에 의한 유전자 정보의 구현을 지칭한다. 보다 좁은 의미에서, 유전자 발현은 유전자의 RNA로의 전사, 이러한 RNA의 효소적 활성을 가질 수 있는 폴리펩티드로의 후속 번역을 지칭한다.
"출발 균주" (모 균주)는 하나 이상의 아미노산, 펩티드 또는 단백질의 생산성을 증가시키는 수단, 또는 하나 이상의 효소의 활성을 증가시키는 수단 (예를 들어, 과다발현으로 이어지는 수단)을 적용한 미생물 균주를 의미한다. 출발 균주는 야생형 균주 또는 다르게는 이전에 변형된 균주 (예를 들어 L-아미노산를 생산하는 미생물 (생산자 균주))일 수 있다.
세포의 "야생형"은 바람직하게는 그의 게놈이 진화에 의해 자연적으로 발생된 상태에 있는 세포를 지칭한다. 용어는 전체 세포 및 개별 유전자 둘 다에 사용된다. 따라서 용어 "야생형"은 특히 그의 유전자 서열이 적어도 부분적으로 인간에 의해 재조합 과정에 의해 변형된 세포 또는 유전자를 포함하지 않는다.
본 발명은 예시적 실시양태에 기초하여 하기에 보다 상세히 설명될 것이다.
에스케리키아 콜라이에 사용된 최소 (M9) 및 완전 (LB) 배지는 문헌 [J.H. Miller (A Short Course in Bacterial Genetics (1992), Cold Spring Harbor Laboratory Press)]에 기재되어 있다. 달리 기재되지 않는다면, 에스케리키아 콜라이로부터의 플라스미드 DNA의 단리 및 제한, 라이게이션, 클레나우 처리 및 알칼리성 포스파타제 처리와 관련된 모든 기술은 문헌 [Sambrook et al. (Molecular Cloning - A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press)]에 따라 수행한다. 달리 기재되지 않는다면, 에스케리키아 콜라이의 형질전환은 문헌 [Chung et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 86: 2172-2175 (1989))]에 따라 수행한다.
달리 기재되지 않는다면, 균주 및 형질전환체를 생산하기 위한 인큐베이션 온도는 37℃이다.
실시예 1
L-메티오닌-내성 돌연변이체의 스크리닝
L-메티오닌-생산 이. 콜라이 균주 ECM2는 K12 야생형 균주 MG1655에 기초한다. EP2205754A2, EP2326724A1 및 EP12156052.8에 기재된 바와 같이, ECM2 균주는 피드백-저항성 metA 대립유전자, 유전자 metJ, yncA, pykA 및 pykF의 결실, spoT 유전자의 변이체, 및 각각의 유전자 metH, metF, gcvT, cysP 및 cysJ 의 상류의 프로모터 증강을 보유한다.
1.1 serC 유전자의 플라스미드 pUC18로의 클로닝
에스케리키아 콜라이 MG1655로부터의 serC 유전자를 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 증폭시키고, 이어서 pUC18 플라스미드 (퍼멘타스 게엠베하(Fermentas GmbH), 독일 상트 레온-로트)에 클로닝하였다.
PCR 프라이머 serCF(XbaI) 및 serCR(HindIII)은 각각의 경우에 그의 5' 말단에 6개의 랜덤 뉴클레오티드를 갖고 그 뒤에 각각 제한 엔도뉴클레아제 XbaI (TCTAGA) 및 HindIII (AAGCTT)에 대한 인식 서열을 갖는다. serCF(XbaI)의 뉴클레오티드 13 내지 38은 이. 콜라이 MG1655 게놈에서 위치 956619 내지 956644에 결합한다. serCR(HindIII)의 뉴클레오티드 13 내지 37은 이. 콜라이 MG1655 게놈에서 위치 958028 내지 958004에 결합한다.
serCF(XbaI) (서열 25)
5' AGGTGCTCTAGAGTCCGCGCTGTGCAAATCCAGAATGG 3'
serCR(HindIII) (서열 26)
5' TACACCAAGCTTAACTCTCTACAACAGAAATAAAAAC 3'
serC 유전자를 프라이머 serCF(XbaI) 및 serCR(HindIII) 및 퓨전(Phusion) DNA 폴리머라제 (핀자임스 오이(Finnzymes Oy), 핀란드 에스푸)를 사용하는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 이용하여 증폭시켰다. 이. 콜라이 MG1655의 게놈 DNA가 주형으로 제공된다. 생성된 DNA 단편은 1434 bp 크기였다. 이를 XbaI 및 HindIII 제한 엔도뉴클레아제에 의해 절단하고, 퀴아퀵(QIAquick) PCR 정제 키트 (퀴아젠(Qiagen), 독일 힐덴)에 의해 정제하였다. 비-메틸화 pUC18 플라스미드 DNA를 XbaI 및 HindIII 제한 엔도뉴클레아제에 의해 절단하고, 퀴아퀵 PCR 정제 키트 (퀴아젠, 독일 힐덴)에 의해 정제하였다. 이어서, 절단된 플라스미드를 PCR 생성물과 라이게이션시키고, 이. 콜라이 DH5α로 형질전환시켰다. serC 유전자를 함유하는 플라스미드 클론을 제한 절단 및 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 생성된 플라스미드를 pUC18-serC로 명명하였다.
1.2 serA 유전자의 pUC18-serC 플라스미드로의 클로닝
에스케리키아 콜라이 MG1655로부터의 serA 유전자를 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 증폭시키고, 이어서 pUC18-serC 플라스미드에 클로닝하였다.
PCR 프라이머 serAF(XbaI)는 그의 5' 말단에 6개의 랜덤 뉴클레오티드를 갖고, 그 뒤에 XbaI 제한 엔도뉴클레아제 (TCTAGA)에 대한 인식 서열을 갖는다. 뉴클레오티드 12 내지 33은 이. 콜라이 MG1655 게놈에서 위치 3055199 내지 3055220에 결합한다. PCR 프라이머 serAR(SHSSNB)은 그의 5' 말단에 6개의 랜덤 뉴클레오티드를 갖고, 그 뒤에 제한 엔도뉴클레아제 SacI, HindIII, SphI, SmaI, NotI 및 BglII에 대한 인식 서열을 갖는다. 뉴클레오티드 49 내지 58은 이. 콜라이 MG1655 게놈에서 위치 3056880 내지 3056861에 결합한다.
serAF(XbaI) (서열 27)
5' CTGTAGTCTAGATTAGTACAGCAGACGGGCGCG 3'
serAR(SHSSNB) (서열 28)
5' CAAGAGCTCAAGCTTGCATGCGATTCCCGGGCGGCCGCAATAAGATCTCCGTCAGGGCGTGGTGACCG 3'
serA 유전자를 프라이머 serAF(XbaI) 및 serAR(SHSSNB) 및 퓨전 DNA 폴리머라제 (핀자임스 오이, 핀란드 에스푸)를 사용하는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 이용하여 증폭시켰다. 이. 콜라이 MG1655의 게놈 DNA가 주형으로 제공되었다. 생성된 DNA 단편은 1731 bp 크기였다.
이를 XbaI 및 SacI 제한 엔도뉴클레아제에 의해 절단하고, 퀴아퀵 PCR 정제 키트 (퀴아젠, 독일 힐덴)에 의해 정제하였다. pUC18-serC 플라스미드를 마찬가지로 XbaI 및 SacI 제한 엔도뉴클레아제에 의해 절단하고, 퀴아퀵 PCR 정제 키트 (퀴아젠, 독일 힐덴)에 의해 정제하였다. 이어서, 절단된 플라스미드를 PCR 생성물과 라이게이션시키고, 이. 콜라이 DH5α로 형질전환시켰다. serA 유전자를 함유하는 플라스미드 클론을 제한 절단 및 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 생성된 플라스미드를 pUC18-serAC로 명명하였다.
1.3 serB 유전자의 pUC18 - serAC 플라스미드로의 클로닝
에스케리키아 콜라이 MG1655로부터의 serB 유전자를 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 증폭시키고, 이어서 pUC18-serAC 플라스미드에 클로닝하였다.
PCR 프라이머 serB(SphI)는 그의 5' 말단에 6개의 랜덤 뉴클레오티드를 갖고, 그 뒤에 SphI 제한 엔도뉴클레아제 (GCATGC)에 대한 인식 서열을 갖는다. 뉴클레오티드 13 내지 34는 이. 콜라이 MG1655 게놈에서 위치 4622816 내지 4622837에 결합한다.
PCR 프라이머 serB(SmaI)는 그의 5' 말단에 6개의 랜덤 뉴클레오티드를 갖고, 그 뒤에 제한 엔도뉴클레아제 SalI (GTCGAC) 및 SmaI (CCCGGG)에 대한 인식 서열을 갖는다. 뉴클레오티드 54 내지 75는 이. 콜라이 MG1655 게놈에서 위치 4623887 내지 4623866에 결합한다.
serB(SphI) (서열 29)
5' CCATGCGCATGCCCACCCTTTGAAAATTTGAGAC 3'
serB(SmaI) (서열 30)
5' CCGCATGTCGACATCCCGGGGCAGAAAGGCCCACCCGAAGGTGAGCCAGTGTG
ATTACTTCTGATTCAGGCTGCC 3'
serB 유전자를 프라이머 serB(SphI) 및 serB(SmaI) 및 퓨전 DNA 폴리머라제 (핀자임스 오이, 핀란드 에스푸)를 사용하는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 이용하여 증폭시켰다. 이. 콜라이 MG1655의 게놈 DNA가 주형으로 제공되었다. 생성된 DNA 단편은 1137 bp 크기였다.
이를 SphI 및 SmaI 제한 엔도뉴클레아제에 의해 절단하고, 퀴아퀵 PCR 정제 키트 (퀴아젠, 독일 힐덴)에 의해 정제하였다. pUC18-serAC 플라스미드를 마찬가지로 SphI 및 SmaI 제한 엔도뉴클레아제에 의해 절단하고, 알칼리성 포스파타제에 의해 탈인산화하고, 퀴아퀵 PCR 정제 키트 (퀴아젠, 독일 힐덴)에 의해 정제하였다. 이어서, 절단된 플라스미드를 PCR 생성물과 라이게이션시키고, 이. 콜라이 DH5α로 형질전환시켰다. serB 유전자를 함유하는 플라스미드 클론을 제한 절단 및 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 생성된 플라스미드를 pUC18-serBAC로 명명하였다.
1.4 glyA 유전자의 pUC18-serBAC 플라스미드로의 클로닝
에스케리키아 콜라이 MG1655로부터의 glyA 유전자를 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 증폭시키고, 이어서 pUC18-serBAC 플라스미드에 클로닝하였다.
PCR 프라이머 glyA-하류는 그의 5' 말단에 6개의 랜덤 뉴클레오티드를 갖고, 그 뒤에 BglII 제한 엔도뉴클레아제 (AGATCT)에 대한 인식 서열을 갖는다. 뉴클레오티드 13 내지 35는 이. 콜라이 MG1655 게놈에서 위치 2682063 내지 2682085에 결합한다.
PCR 프라이머 glyA-상류는 그의 5' 말단에 6개의 랜덤 뉴클레오티드를 갖고, 그 뒤에 NotI 제한 엔도뉴클레아제 (GCGGCCGC)에 대한 인식 서열을 갖는다. 뉴클레오티드 15 내지 33은 이. 콜라이 MG1655 게놈에서 위치 2683762 내지 2683744에 결합한다.
glyA-하류(서열 31)
5' ATCTAAAGATCTGTTACGACAGATTTGATGGCGCG 3'
glyA-상류 (서열 32)
5' TTCATCGCGGCCGCGAAAGAATGTGATGAAGTG 3'
glyA 유전자를 프라이머 glyA-하류 및 glyA-상류 및 퓨전 DNA 폴리머라제 (핀자임스 오이, 핀란드 에스푸)를 사용하는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 이용하여 증폭시켰다. 이. 콜라이 MG1655의 게놈 DNA가 주형으로 제공되었다. 생성된 DNA 단편은 1726 bp 크기였다.
이를 BglII 및 NotI 제한 엔도뉴클레아제에 의해 절단하고, 퀴아퀵 PCR 정제 키트 (퀴아젠, 독일 힐덴)에 의해 정제하였다. pUC18-serBAC 플라스미드를 마찬가지로 BglII 및 NotI 제한 엔도뉴클레아제에 의해 절단하고, 퀴아퀵 PCR 정제 키트 (퀴아젠, 독일 힐덴)에 의해 정제하였다. 이어서, 절단된 플라스미드를 PCR 생성물과 라이게이션시키고, 이. 콜라이 DH5α로 형질전환시켰다. glyA 유전자를 함유하는 플라스미드 클론을 제한 절단 및 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 생성된 플라스미드를 pUC18-serB-glyA-serAC로 명명하였다.
1.5 유전자 serB-glyA-serAC의 pUC18-serB-glyA-serAC에서 pCC1-BAC로의 클로닝
pUC18-serB-glyA-serAC 플라스미드를 HindIII 제한 엔도뉴클레아제에 의해 절단하고, DNA 단편을 아가로스 겔 전기영동에 의해 분획화하였다. 유전자 serB, glyA, serA 및 serC를 함유하는 5.9 kb DNA 단편을 겔로부터 단리하였다. 단편을 HindIII에 의해 이미 절단된 플라스미드 pCC1BAC 클로닝-준비 벡터 (Hind III) (에피센트레(Epicentre)/미국 매디슨)와 라이게이션시키고, 이. 콜라이 EPI300으로 형질전환시켰다. serB, glyA, serA 및 serC를 포함하는 DNA 단편을 함유하는 플라스미드 클론을 제한 절단 및 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 생성된 생산 플라스미드를 pCC3으로 명명하였다.
1.6 pME-RDL2a 생산 플라스미드의 클로닝
pME-RDL2a 생산 플라스미드를 EP 출원 11151526.8에 기재된 바와 같이 클로닝하였다. 이는 에스케리키아 콜라이 cysE 유전자, 에스케리키아 콜라이 thrA 및 metA 유전자의 피드백-저항성 대립유전자, 및 사카로미세스 세레비지아에 RDL2p 티오술페이트 황-트랜스퍼라제를 코딩하는 RDL2a 유전자를 포함한다. 이는 추가로 스트렙토마이신-저항성 유전자를 포함한다.
1.7 균주 ECM2의 생산 플라스미드로의 형질전환
ECM2 균주를 실시예 1.5의 pCC3 생산 플라스미드로 형질전환시키고, 형질전환체를 20 mg/l 클로람페니콜에 의해 선택하였다. 이어서, 세포를 실시예 1.6의 pME-RDL2a 플라스미드로 형질전환시키고, 생성된 형질전환체를 20 mg/l 클로람페니콜 + 100 mg/l 스트렙토마이신에 의해 선택하였다. 생성된 균주를 ECM2/pCC3/pME-RDL2a로 명명하였다.
1.8 L-메티오닌-내성 돌연변이체의 스크리닝 및 서열분석
L-메티오닌-내성 돌연변이체는 ECM2/pCC3/pME-RDL2a 균주의 전배양물을 75g/l L-메티오닌 (머크(Merck), 독일 프랑크푸르트)을 함유하는 PC1 최소 배지 플레이트 (표 1, 14 g/l 한천 포함)에 플레이팅함으로써 선택하였다. 전배양물은 100μl의 세포 배양물을 접종한 10 ml의 전배양 배지 (2.5 g/l 글루코스를 함유하는 LB 배지 10% 및 PC1 최소 배지 90%)를 포함하고, 이를 37℃에서 10시간 동안 배양하였다.
[표 1]
Figure 112015025852989-pct00001
5일의 인큐베이션 후에, L-메티오닌-내성 돌연변이체의 단일 콜로니를 플레이트로부터 단리하였다.
서열분석을 준비하기 위해, 플라스미드 pCC3 및 pME-RDL2a를 더 이상 함유하지 않는 ECM2/pCC3/pME-RDL2a 균주의 L-메티오닌-내성 돌연변이체의 유도체를 대략 6세대 동안 항생제-무함유 LB 배지에서 증식시킨 후에 단리하였다. 수득한 균주는 스트렙토마이신- 및 클로람페니콜-민감성이다.
염색체 DNA를 8개의 돌연변이체로부터 단리하였다. 이 DNA를 전체 게놈 서열분석 (GATC, 독일 콘스탄스)에 사용하였다.
ECM2 출발 균주와 비교하여, 돌연변이는 유일하게 proP 유전자에서 발견되었다. 하기 표 2는 돌연변이를 열거한다. proP 대립유전자의 서열은 서열 9 내지 서열 24에 제시된다.
[표 2]
Figure 112015025852989-pct00002
부다페스트 조약에 따라, 균주 DM2321, DM2322, DM2323, DM2324, DM2325, DM2326, DM2327 및 DM2328은 DSMZ (도이체 잠룽 폰 미크로오르가니스멘 운트 첼쿨투렌 게엠베하(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH), 독일 38124 브라운슈바이크 인호펜스트라쎄 7 B)에 DSM 번호 DSM 25095 (= DM2321), 25096 (= DM2322), 25097 (= DM2323), 25098 (= DM2324), 25099 (= DM2325), 25100 (= DM2326), 25101 (= DM2327), 및 25102 (= DM2328)로 2011년 8월 23일에 기탁되었다.
실시예 2
L-메티오닌-내성 proP 돌연변이체의 활성 검출
proP 돌연변이체의 ProP 활성을 예를 들어 출발 균주 ECM2와 비교하여 균주 DM2328에 의한 프롤린 섭취를 분석함으로써 결정하였다. 이를 위해, 10 ml 전배양물 1을 LB 배지 중에서 낮동안 37℃에서 진탕시키면서 인큐베이션하였다. 1 ml의 전배양물을 20 ml의 M9 배지로 전달하고 (전배양물 2), 밤새 배양하였다. 전배양물 2를 50 ml의 신선한 M9 배지에 0.2의 OD600으로 접종하였다. 이후에, 세포를 3-4시간 동안 배양하고, 이어서 빙냉 M9 완충제로 3회 세척하고, 2의 OD600으로 조정하고, 얼음 상에 저장하였다.
프롤린 섭취를 방사성표지된 [14C(U)]L-프롤린 (비활성: 1.85 MBq; 하트만 어날리틱(Hartmann Analytic), 독일)에 의해 결정하였다. 이를 위해, 2.3 ml의 세포 현탁액을 각각의 경우에 교반 용기에 넣고, 37℃에서 2분 동안 10 mM 글루코스를 첨가하여 에너지를 공급하였다. 20 μl의 L-[14C]-프롤린을 24.6 mM의 농도로 첨가함으로써 교반하면서 수송 측정을 시작하였다. 상이한 시점에, (0, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105 및 120 s) 200 μl를 각각의 경우에 분리하고, 유리 섬유 필터 (밀리포어(Millipore)) 상에서 피펫팅하였다. 주변 배지를 진공 여과 매니폴드에 의한 흡인에 의해 제거하고, 이후에 세포를 2.5 ml의 0.1 M LiCl 용액으로 2회 세척하였다. 필터를 3.8 ml의 섬광 유체 (로스(Roth), 독일 카를스루에)로 처리하고, 방사성을 섬광 계수기 (LS 6500, 벡크만 인스트루먼츠(Beckman Instruments), 독일 뮌헨)에 의해 측정하였다. 반응 혼합물 중의 전체 활성은 샘플을 여과 없이 직접 측정하여 결정하였다. 분당 붕해 (dpm)를 각각의 샘플에 대해 측정하였다. 섭취 활성을 nmol/min (건조 질량의 mg) (0.36 = 이. 콜라이의 건조 질량 관련 [mg/ml OD=1])로 계산하였다. 수송의 비율 (nmol/mg*min)은 섭취 동역학의 선형 부분으로부터 구하였다. 하기 표 3은 3회 병행 측정의 평균을 나타낸다.
[표 3]
Figure 112015025852989-pct00003
실시예 3
균주 DM2321, DM2322, DM2323, DM2324, DM2325, DM2326, DM2327 및 DM2328의 생산 플라스미드로의 형질전환
균주 DM2321, DM2322, DM2323, DM2324, DM2325, DM2326, DM2327 및 DM2328을 실시예 1.5의 pCC3 생산 플라스미드로 형질전환시키고, 형질전환체를 20 mg/l 클로람페니콜에 의해 선택하였다. 이어서, 세포를 실시예 1.6의 pME-RDL2a 플라스미드로 형질전환시키고, 생성된 형질전환체를 20 mg/l 클로람페니콜 및 100 mg/l 스트렙토마이신에 의해 선택하였다. 생성된 균주를 DM2321/pCC3/pME-RDL2a, DM2322/pCC3/pME-RDL2a, DM2323/pCC3/pME-RDL2a, DM2324/pCC3/pME-RDL2a, DM2325/pCC3/pME-RDL2a, DM2326/pCC3/pME-RDL2a, DM2327/pCC3/pME-RDL2a 및 DM2328/pCC3/pME-RDL2a로 명명하였다.
실시예 4
진탕기 -플라스크 실험에서의 성능 검정
이. 콜라이 L-메티오닌 생산자 균주의 성능을 100 ml 원추형 플라스크에서 생산 시험에 의해 평가하였다. 각각의 경우에 100 μl의 세포 배양물을 접종한 10 ml의 전배양 배지 (2.5 g/l 글루코스를 함유하는 LB 배지 10% 및 PC1 최소 배지 90%)의 전배양물을 37℃에서 10시간 동안 배양하였다. 이어서, 이를 사용하여 각각의 경우에 10 ml의 PC1 최소 배지 (실시예 1의 표 1 참조)에 0.2의 OD 600 nm (에펜도르프 바이오-포토미터(Eppendorf Bio-Photometer); 에펜도르프 아게(Eppendorf AG), 독일 함부르크)으로 접종하고, 배양물을 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 세포외 L-메티오닌 농도를 이온 교환 크로마토그래피, 및 아미노산 분석기 (사이캄 게엠베하(Sykam GmbH), 독일 에레싱)를 이용하는 닌히드린 검출에 의한 포스트-칼럼 유도체화에 의해 결정하였다. 세포외 글루코스 농도를 YSI 2700 선택 글루코스 분석기 (YSI 라이프 사이언시스(YSI Life Sciences), 미국 오하이오주 옐로우 스프링스)를 이용하여 결정하였다. 결과를 표 4에 열거하였다. 24시간 후에 글루코스는 양쪽 배양물에서 완전히 소모되었다.
[표 4]
Figure 112015025852989-pct00004
실시예 5
M8, M4 및 M6 proP 대립유전자의 플라스미드 pMAK705로의 클로닝
DM2321로부터의 proP 대립유전자 M8, DM2323으로부터의 M4 및 DM2326으로부터의 M6을 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 증폭시키고, 이어서 pMAK705 플라스미드에 클로닝하였다.
프라이머 쌍을 proP 대립유전자에 대해 수득한 서열에 기초하여 설계하였으며 (실시예 1 참조), 이는 각각의 경우에 특정한 돌연변이를 포함하는 단편의 증폭을 가능하게 한다. 이어서, 상기 단편은 pMAK705 플라스미드 (Hamilton CM, Aldea M, Washburn BK, Babitzke P, Kushner SR (1989); J Bacteriol.; 171(9): 4617-4622)에 클로닝될 수 있다.
PCR 프라이머 proPmut1(NotI)은 그의 5' 말단에 4개의 랜덤 뉴클레오티드를 갖고, 그 뒤에 HindIII 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열을 갖는다.
PCR 프라이머 proPmut2(BamHI)는 그의 5' 말단에 4개의 랜덤 뉴클레오티드를 갖고, 그 뒤에 BamHI 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열을 갖는다.
proPmut1(NotI)의 뉴클레오티드 13 내지 32는 이. 콜라이 MG1655 게놈에서 위치 4328800 내지 4328819에 결합한다. proPmut2(NotI)의 뉴클레오티드 13 내지 37은 이. 콜라이 MG1655 게놈에서 위치 4330303 내지 4330322에 결합한다.
proPmut1(HindIII) (서열 33)
5' GTCAAAGCTT ATATGGTCGCCAGAAGATCC 3'
proPmut2(BamHI) (서열 34)
5' GTCAGGATCC TCAGCCGCATTACACAGTTG 3'
균주 DM2321, DM2323 및 DM2328 (실시예 1 참조)의 게놈 DNA가 주형으로 제공되었다.
각각의 경우에, proP 유전자에서 각각의 돌연변이에 걸쳐있는 단편을 퓨전 DNA 폴리머라제 (핀자임스 오이, 핀란드 에스푸)를 사용하는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 이용하여 증폭시켰다. E412* 돌연변이를 함유하는 DM2321 (proP-M8 보유)으로부터의 단편은 1564bp 크기였다 (서열 35). 뉴클레오티드 위치 854의 하류 "A"의 결실을 포함하는 DM2323 (proP-M4 보유)으로부터의 단편은 1542bp 크기였다 (서열 36). 뉴클레오티드 위치 973의 하류 19bp 삽입을 함유하는 DM2326 (proP-M6 보유)으로부터의 단편은 1563bp 크기였다 (서열 37).
모든 3개의 단편을 HindIII 및 BamHI 제한 엔도뉴클레아제에 의해 절단하고, 퀴아퀵 PCR 정제 키트 (퀴아젠, 독일 힐덴)에 의해 정제하였다. 이어서, 단편을 사용하여 pMAK705 플라스미드와 라이게이션시켰다.
pMAK705 플라스미드를 HindIII 및 BamHI 제한 엔도뉴클레아제에 의해 절단하고, 알칼리성 포스파타제 (알카리성 포스파타제, 송아지 장, 뉴잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs), 독일 프랑크푸르트 a.M.)에 의해 탈인산화하고, 퀴아퀵 PCR 정제 키트 (퀴아젠, 힐덴)를 통해 정제하였다. 이어서, 플라스미드를 특정한 proP 단편과 혼합하고, 퀵 DNA 리가제 (뉴잉글랜드 바이오랩스, 독일 프랑크푸르트)에 의해 라이게이션하였다. 라이게이션 혼합물을 이. 콜라이 DH5α(Grant et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649)로 형질전환시켰다. 올바른 플라스미드 클론을 20 mg/l 클로람페니콜에 의해 선택하고, 삽입물의 제한 절단 및 후속 서열분석에 의해 확인하였다. 이와 같이 수득한 플라스미드를 pMAK_proP-M4, pMAK_proP-M6 및 pMAK_proP-M8로 명명하였다. pMAK_proP-M8은 도 3에 예시 방식으로 도시된다.
실시예 6
이. 콜라이 균주 ECM2에서의 proP 유전자의 돌연변이유발
L-메티오닌-생산 이. 콜라이 균주 ECM2 (실시예 1 참조)의 염색체 proP 야생형 대립유전자를 각각의 경우에 메티오닌 저항성을 매개하는 proP 대립유전자 M4, M6 및 M8로 대체하였다. 이러한 목적을 위해, 균주를 각각의 경우에 전기천공에 의해 플라스미드 pMAK_proP-M4, pMAK_proP-M6 및 pMAK_proP-M8 (실시예 5 참조)로 형질전환시켰다. pMAK 플라스미드는 클로람페니콜-저항성 유전자 및 온도-민감성 복제 기점을 갖는다. 플라스미드는 이. 콜라이에 의해 30℃에서 복제되지만, 44℃에서는 그렇지 않다. 형질전환 혼합물을 각각의 경우에 20mg/l 클로람페니콜을 함유하는 LB 한천 상에 플레이팅하고, 30℃에서 40시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 접종 루프를 사용하여 분리하고, LB 배지에 재현탁시키고, LB 배지에서 10000-배 희석하였다. 100 μl의 희석액을 20mg/l 클로람페니콜을 함유하는 LB 한천 상에 플레이팅하고, 44℃에서 또 다른 24시간 동안 인큐베이션하였다. 그 결과, pMAK_proP-M4, pMAK_proP-M6 및 pMAK_proP-M8 플라스미드가 각각의 경우에 염색체에 통합된 콜로니가 선택되었다. 각각의 경우에 이들 콜로니 중 하나를 접종 루프를 사용하여 20mg/l 클로람페니콜을 함유하는 LB 한천 상에 얇게 펴고, 44℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 도입된 돌연변이를 하기 프라이머 쌍 (실시예 11 참조)을 사용하는 표준 PCR 방법 (Innis et al. (1990) PCR Protocols. A guide to methods and applications, Academic Press)에 의해 검출하였다:
proPmut1(HindIII) (서열 33)
5' GTCAAAGCTT ATATGGTCGCCAGAAGATCC 3'
proPmut2(BamHI) (서열 34)
5' GTCAGGATCC TCAGCCGCATTACACAGTTG 3'
각각의 경우에 생성된 PCR 생성물을 GATC (독일 콘스탄스)에서 양쪽 프라이머를 사용하여 서열분석하였다. 모든 3개의 proP 대립유전자를 각각의 경우에 이. 콜라이 균주 ECM2에 전달하였으며, 생성된 균주를 ECM2_proP-M4, ECM2_proP-M6 및 ECM2_proP-M8로 명명하였다.
실시예 7
균주 ECM2_proP-M4, ECM2_proP-M6 및 ECM2_proP-M8의 생산 플라스미드로의 형질전환
균주 ECM2_proP-M4, ECM2_proP-M6 및 ECM2_proP-M8를 실시예 1.5의 pCC3 생산 플라스미드로 형질전환시키고, 형질전환체를 20 mg/l 클로람페니콜로 선택하였다. 이어서, 세포를 실시예 1.6의 pME-RDL2a 플라스미드로 형질전환시키고, 생성된 형질전환체를 20 mg/l 클로람페니콜 및 100 mg/l 스트렙토마이신으로 선택하였다. 생성된 균주를 ECM2_proP-M4/pCC3/pME-RDL2a, ECM2_proP-M6/pCC3/pME-RDL2a 및 ECM2_proP-M8/pCC3/pME-RDL2a로 명명하였다.
실시예 8
진탕기 -플라스크 실험의 성능 검정
이. 콜라이 L-메티오닌 생산자 균주 ECM2_proP-M4/pCC3/pME-RDL2a, ECM2_proP-M6/pCC3/pME-RDL2a 및 ECM2_proP-M8/pCC3/pME-RDL2a의 성능을 100 ml 원추형 플라스크에서 생산 시험에 의해 평가하였다. 각각의 경우에 100 μl의 세포 배양물을 접종한 10 ml의 전배양 배지 (2.5 g/l 글루코스를 함유하는 LB 배지 10% 및 PC1 최소 배지 90%)의 전배양물을 37℃에서 10시간 동안 배양하였다. 이어서, 이를 사용하여 각각의 경우에 10 ml의 PC1 최소 배지 (실시예 1의 표 1 참조)에 0.2의 OD 600 nm (에펜도르프 바이오-포토미터; 에펜도르프 아게, 독일 함부르크)으로 접종하고, 배양물을 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 세포외 L-메티오닌 농도를 이온 교환 크로마토그래피, 및 아미노산 분석기 (사이캄 게엠베하, 독일 에레싱)를 이용하는 닌히드린 검출에 의한 포스트-칼럼 유도체화에 의해 결정하였다. 세포외 글루코스 농도를 YSI 2700 선택 글루코스 분석기 (YSI 라이프 사이언시스, 미국 오하이오주 옐로우 스프링스)를 이용하여 결정하였다. 결과가 표 5에 제시된다. 24시간 후에 글루코스는 양쪽 배양물에서 완전히 소모되었다.
[표 5]
Figure 112015025852989-pct00005
SEQUENCE LISTING <110> Evonik Degussa GmbH <120> Verfahren zur fermentativen Herstellung von organisch-chemischen Verbindungen unter Verwendung von verbesserten St?men der Familie Enterobacteriaceae <130> 2011E00314 <160> 38 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1503 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (1)..(1503) <223> Kodierregion proP <400> 1 atg ctg aaa agg aaa aaa gta aaa ccg att acc ctt cgt gat gtc acc 48 Met Leu Lys Arg Lys Lys Val Lys Pro Ile Thr Leu Arg Asp Val Thr 1 5 10 15 att att gat gac ggt aaa ctg cgt aaa gcc att acc gca gca tca ctg 96 Ile Ile Asp Asp Gly Lys Leu Arg Lys Ala Ile Thr Ala Ala Ser Leu 20 25 30 ggt aat gca atg gaa tgg ttc gat ttt ggt gtt tat ggt ttt gtt gct 144 Gly Asn Ala Met Glu Trp Phe Asp Phe Gly Val Tyr Gly Phe Val Ala 35 40 45 tac gca tta ggt aaa gtt ttt ttc ccg ggg gct gac ccc agc gtg cag 192 Tyr Ala Leu Gly Lys Val Phe Phe Pro Gly Ala Asp Pro Ser Val Gln 50 55 60 atg gtt gct gca ctt gcc act ttc tcc gtt ccc ttt ctg att cga ccg 240 Met Val Ala Ala Leu Ala Thr Phe Ser Val Pro Phe Leu Ile Arg Pro 65 70 75 80 ctt ggc gga ctc ttc ttt ggt atg ttg ggc gat aaa tat ggt cgc cag 288 Leu Gly Gly Leu Phe Phe Gly Met Leu Gly Asp Lys Tyr Gly Arg Gln 85 90 95 aag atc ctc gct atc act att gtg att atg tcg atc agt acg ttc tgt 336 Lys Ile Leu Ala Ile Thr Ile Val Ile Met Ser Ile Ser Thr Phe Cys 100 105 110 att ggc tta ata ccg tcc tac gac acg att ggt att tgg gca ccg att 384 Ile Gly Leu Ile Pro Ser Tyr Asp Thr Ile Gly Ile Trp Ala Pro Ile 115 120 125 ctg ctg ttg atc tgt aag atg gca caa ggt ttc tcg gtc ggc ggt gaa 432 Leu Leu Leu Ile Cys Lys Met Ala Gln Gly Phe Ser Val Gly Gly Glu 130 135 140 tat acc ggg gcg tcg ata ttt gtt gcg gaa tac tcc cct gac cgt aaa 480 Tyr Thr Gly Ala Ser Ile Phe Val Ala Glu Tyr Ser Pro Asp Arg Lys 145 150 155 160 cgt ggc ttt atg ggc agc tgg ctg gac ttc ggt tct att gcc ggg ttt 528 Arg Gly Phe Met Gly Ser Trp Leu Asp Phe Gly Ser Ile Ala Gly Phe 165 170 175 gtg ctg ggt gcg ggc gtg gtg gtg tta att tcg acc att gtc ggc gaa 576 Val Leu Gly Ala Gly Val Val Val Leu Ile Ser Thr Ile Val Gly Glu 180 185 190 gcg aac ttc ctc gat tgg ggc tgg cgt att ccg ttc ttt atc gct ctg 624 Ala Asn Phe Leu Asp Trp Gly Trp Arg Ile Pro Phe Phe Ile Ala Leu 195 200 205 ccg tta ggg att atc ggg ctt tac ctg cgc cat gcg ctg gaa gag act 672 Pro Leu Gly Ile Ile Gly Leu Tyr Leu Arg His Ala Leu Glu Glu Thr 210 215 220 ccg gcg ttc cag cag cat gtc gat aaa ctg gaa cag ggc gac cgt gaa 720 Pro Ala Phe Gln Gln His Val Asp Lys Leu Glu Gln Gly Asp Arg Glu 225 230 235 240 ggt ttg cag gat ggc ccg aaa gtc tcg ttt aaa gag att gcc act aaa 768 Gly Leu Gln Asp Gly Pro Lys Val Ser Phe Lys Glu Ile Ala Thr Lys 245 250 255 tac tgg cgc agc ctg ttg aca tgt att ggt ctg gta att gcc acc aac 816 Tyr Trp Arg Ser Leu Leu Thr Cys Ile Gly Leu Val Ile Ala Thr Asn 260 265 270 gtg act tac tac atg ttg ctg acc tat atg ccg agt tat ttg tcg cat 864 Val Thr Tyr Tyr Met Leu Leu Thr Tyr Met Pro Ser Tyr Leu Ser His 275 280 285 aac ctg cat tac tcc gaa gac cac ggg gtg ctg att att atc gcc att 912 Asn Leu His Tyr Ser Glu Asp His Gly Val Leu Ile Ile Ile Ala Ile 290 295 300 atg atc ggt atg ctg ttt gtc cag ccg gtg atg ggc ttg ctg agt gac 960 Met Ile Gly Met Leu Phe Val Gln Pro Val Met Gly Leu Leu Ser Asp 305 310 315 320 cgt ttt ggc cgt cgt ccg ttt gtg cta ctt ggt agt gtt gcc ctg ttt 1008 Arg Phe Gly Arg Arg Pro Phe Val Leu Leu Gly Ser Val Ala Leu Phe 325 330 335 gtg ttg gcg atc ccg gcg ttt att ctg att aac agt aac gtc atc ggc 1056 Val Leu Ala Ile Pro Ala Phe Ile Leu Ile Asn Ser Asn Val Ile Gly 340 345 350 ctg att ttt gcc ggg tta ctg atg ctg gcg gtg atc ctt aac tgc ttt 1104 Leu Ile Phe Ala Gly Leu Leu Met Leu Ala Val Ile Leu Asn Cys Phe 355 360 365 acg ggc gtt atg gct tct acc ttg cca gcg atg ttc ccg acg cat atc 1152 Thr Gly Val Met Ala Ser Thr Leu Pro Ala Met Phe Pro Thr His Ile 370 375 380 cgt tac agc gcg ctg gcg gcg gca ttt aat att tcg gtg ctg gtt gcc 1200 Arg Tyr Ser Ala Leu Ala Ala Ala Phe Asn Ile Ser Val Leu Val Ala 385 390 395 400 ggt ctg acg cca acg ctg gcg gcc tgg ctg gtc gaa agc tcg cag aat 1248 Gly Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala Trp Leu Val Glu Ser Ser Gln Asn 405 410 415 ctg atg atg cct gcc tat tac ctg atg gta gtg gcg gtg gtt ggt tta 1296 Leu Met Met Pro Ala Tyr Tyr Leu Met Val Val Ala Val Val Gly Leu 420 425 430 atc acc ggc gta acc atg aaa gag acg gca aat cgt ccg ttg aaa ggt 1344 Ile Thr Gly Val Thr Met Lys Glu Thr Ala Asn Arg Pro Leu Lys Gly 435 440 445 gcg aca ccg gcg gcg tca gat ata cag gaa gcg aag gaa att ctc gtc 1392 Ala Thr Pro Ala Ala Ser Asp Ile Gln Glu Ala Lys Glu Ile Leu Val 450 455 460 gag cat tac gat aat atc gag cag aaa atc gat gat att gac cac gag 1440 Glu His Tyr Asp Asn Ile Glu Gln Lys Ile Asp Asp Ile Asp His Glu 465 470 475 480 att gcc gat ttg cag gcg aaa cgt acc cgc ctg gtg cag caa cat ccg 1488 Ile Ala Asp Leu Gln Ala Lys Arg Thr Arg Leu Val Gln Gln His Pro 485 490 495 cga att gat gaa taa 1503 Arg Ile Asp Glu 500 <210> 2 <211> 500 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 2 Met Leu Lys Arg Lys Lys Val Lys Pro Ile Thr Leu Arg Asp Val Thr 1 5 10 15 Ile Ile Asp Asp Gly Lys Leu Arg Lys Ala Ile Thr Ala Ala Ser Leu 20 25 30 Gly Asn Ala Met Glu Trp Phe Asp Phe Gly Val Tyr Gly Phe Val Ala 35 40 45 Tyr Ala Leu Gly Lys Val Phe Phe Pro Gly Ala Asp Pro Ser Val Gln 50 55 60 Met Val Ala Ala Leu Ala Thr Phe Ser Val Pro Phe Leu Ile Arg Pro 65 70 75 80 Leu Gly Gly Leu Phe Phe Gly Met Leu Gly Asp Lys Tyr Gly Arg Gln 85 90 95 Lys Ile Leu Ala Ile Thr Ile Val Ile Met Ser Ile Ser Thr Phe Cys 100 105 110 Ile Gly Leu Ile Pro Ser Tyr Asp Thr Ile Gly Ile Trp Ala Pro Ile 115 120 125 Leu Leu Leu Ile Cys Lys Met Ala Gln Gly Phe Ser Val Gly Gly Glu 130 135 140 Tyr Thr Gly Ala Ser Ile Phe Val Ala Glu Tyr Ser Pro Asp Arg Lys 145 150 155 160 Arg Gly Phe Met Gly Ser Trp Leu Asp Phe Gly Ser Ile Ala Gly Phe 165 170 175 Val Leu Gly Ala Gly Val Val Val Leu Ile Ser Thr Ile Val Gly Glu 180 185 190 Ala Asn Phe Leu Asp Trp Gly Trp Arg Ile Pro Phe Phe Ile Ala Leu 195 200 205 Pro Leu Gly Ile Ile Gly Leu Tyr Leu Arg His Ala Leu Glu Glu Thr 210 215 220 Pro Ala Phe Gln Gln His Val Asp Lys Leu Glu Gln Gly Asp Arg Glu 225 230 235 240 Gly Leu Gln Asp Gly Pro Lys Val Ser Phe Lys Glu Ile Ala Thr Lys 245 250 255 Tyr Trp Arg Ser Leu Leu Thr Cys Ile Gly Leu Val Ile Ala Thr Asn 260 265 270 Val Thr Tyr Tyr Met Leu Leu Thr Tyr Met Pro Ser Tyr Leu Ser His 275 280 285 Asn Leu His Tyr Ser Glu Asp His Gly Val Leu Ile Ile Ile Ala Ile 290 295 300 Met Ile Gly Met Leu Phe Val Gln Pro Val Met Gly Leu Leu Ser Asp 305 310 315 320 Arg Phe Gly Arg Arg Pro Phe Val Leu Leu Gly Ser Val Ala Leu Phe 325 330 335 Val Leu Ala Ile Pro Ala Phe Ile Leu Ile Asn Ser Asn Val Ile Gly 340 345 350 Leu Ile Phe Ala Gly Leu Leu Met Leu Ala Val Ile Leu Asn Cys Phe 355 360 365 Thr Gly Val Met Ala Ser Thr Leu Pro Ala Met Phe Pro Thr His Ile 370 375 380 Arg Tyr Ser Ala Leu Ala Ala Ala Phe Asn Ile Ser Val Leu Val Ala 385 390 395 400 Gly Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala Trp Leu Val Glu Ser Ser Gln Asn 405 410 415 Leu Met Met Pro Ala Tyr Tyr Leu Met Val Val Ala Val Val Gly Leu 420 425 430 Ile Thr Gly Val Thr Met Lys Glu Thr Ala Asn Arg Pro Leu Lys Gly 435 440 445 Ala Thr Pro Ala Ala Ser Asp Ile Gln Glu Ala Lys Glu Ile Leu Val 450 455 460 Glu His Tyr Asp Asn Ile Glu Gln Lys Ile Asp Asp Ile Asp His Glu 465 470 475 480 Ile Ala Asp Leu Gln Ala Lys Arg Thr Arg Leu Val Gln Gln His Pro 485 490 495 Arg Ile Asp Glu 500 <210> 3 <211> 1503 <212> DNA <213> Salmonella enterica <220> <221> CDS <222> (1)..(1503) <223> Kodierregion proP <400> 3 atg ctg aaa agg aaa aaa ata aaa ccg att aca ctg ggc gat gtg acc 48 Met Leu Lys Arg Lys Lys Ile Lys Pro Ile Thr Leu Gly Asp Val Thr 1 5 10 15 atc att gat gat ggt aaa ctt cgc aaa gcg att acc gcc gcc tcg ctg 96 Ile Ile Asp Asp Gly Lys Leu Arg Lys Ala Ile Thr Ala Ala Ser Leu 20 25 30 ggc aac gcg atg gag tgg ttt gat ttt ggt gtt tat gga ttt gtt gcc 144 Gly Asn Ala Met Glu Trp Phe Asp Phe Gly Val Tyr Gly Phe Val Ala 35 40 45 tac gcg ttg ggt aaa gtc ttt ttc ccc ggc gcc gat ccc agc gtc cag 192 Tyr Ala Leu Gly Lys Val Phe Phe Pro Gly Ala Asp Pro Ser Val Gln 50 55 60 atg att gcc gcg ctg gcc acg ttt tcc gtt ccc ttc ctg att cgt ccg 240 Met Ile Ala Ala Leu Ala Thr Phe Ser Val Pro Phe Leu Ile Arg Pro 65 70 75 80 ctc ggc ggg tta ttc ttt ggt atg ctc ggc gat aaa tac ggg cgc cag 288 Leu Gly Gly Leu Phe Phe Gly Met Leu Gly Asp Lys Tyr Gly Arg Gln 85 90 95 aag atc ctg gcg atc acg att gtg att atg tcg atc agt acc ttc tgt 336 Lys Ile Leu Ala Ile Thr Ile Val Ile Met Ser Ile Ser Thr Phe Cys 100 105 110 atc ggg tta atc ccc tct tac gcg acg atc ggt atc tgg gcg cca ata 384 Ile Gly Leu Ile Pro Ser Tyr Ala Thr Ile Gly Ile Trp Ala Pro Ile 115 120 125 ctg ttg ttg ctg tgt aaa atg gcg cag ggc ttc tcg gtt ggc ggg gaa 432 Leu Leu Leu Leu Cys Lys Met Ala Gln Gly Phe Ser Val Gly Gly Glu 130 135 140 tat acc ggc gcg tcg atc ttt gtc gcg gaa tat tcg ccg gat cgt aaa 480 Tyr Thr Gly Ala Ser Ile Phe Val Ala Glu Tyr Ser Pro Asp Arg Lys 145 150 155 160 cgc gga ttt atg gga agc tgg ctg gat ttt ggt tct atc gcc gga ttc 528 Arg Gly Phe Met Gly Ser Trp Leu Asp Phe Gly Ser Ile Ala Gly Phe 165 170 175 gtg ctg ggc gcg ggc gtg gtg gtc ttg atc tcg acg att gtc ggc gag 576 Val Leu Gly Ala Gly Val Val Val Leu Ile Ser Thr Ile Val Gly Glu 180 185 190 gag aat ttc ctt gag tgg ggc tgg cgt att ccg ttc ttt atc gcc ctg 624 Glu Asn Phe Leu Glu Trp Gly Trp Arg Ile Pro Phe Phe Ile Ala Leu 195 200 205 cca ttg ggg att att ggt ctc tac tta cgc cat gcg ctg gag gag acg 672 Pro Leu Gly Ile Ile Gly Leu Tyr Leu Arg His Ala Leu Glu Glu Thr 210 215 220 cca gcg ttt cag cag cac gtg gat aaa ctg gag cag ggc gac cgc gaa 720 Pro Ala Phe Gln Gln His Val Asp Lys Leu Glu Gln Gly Asp Arg Glu 225 230 235 240 ggg ttg cag gat ggg ccg aaa gtc tcc ttt aaa gag att gcc acc aaa 768 Gly Leu Gln Asp Gly Pro Lys Val Ser Phe Lys Glu Ile Ala Thr Lys 245 250 255 cac tgg cgt agc ctg ttg tca tgt atc ggt ctg gtg att gcc acc aac 816 His Trp Arg Ser Leu Leu Ser Cys Ile Gly Leu Val Ile Ala Thr Asn 260 265 270 gtg acc tac tac atg ctg ctc acc tac atg ccg agc tac ctg tcg cat 864 Val Thr Tyr Tyr Met Leu Leu Thr Tyr Met Pro Ser Tyr Leu Ser His 275 280 285 aac ctg cac tat tct gaa gat cac ggc gtg ttg att atc atc gcc att 912 Asn Leu His Tyr Ser Glu Asp His Gly Val Leu Ile Ile Ile Ala Ile 290 295 300 atg atc ggg atg ctg ttt gtg cag ccg gtg atg ggg ctg ctg agc gac 960 Met Ile Gly Met Leu Phe Val Gln Pro Val Met Gly Leu Leu Ser Asp 305 310 315 320 cgt ttc ggt cga cgt cca ttt gtg att atg ggc agc att gcg ctg ttc 1008 Arg Phe Gly Arg Arg Pro Phe Val Ile Met Gly Ser Ile Ala Leu Phe 325 330 335 gcg ctg gcg atc ccg gcc ttc atc ctg att aac agt aac gtt att ggc 1056 Ala Leu Ala Ile Pro Ala Phe Ile Leu Ile Asn Ser Asn Val Ile Gly 340 345 350 ctg att ttt gca ggt ttg ttg atg ctg gcg gtg att ctg aac tgc ttt 1104 Leu Ile Phe Ala Gly Leu Leu Met Leu Ala Val Ile Leu Asn Cys Phe 355 360 365 acc ggg gtg atg gcc tcg aca ttg ccg gcg atg ttt ccg acg cat att 1152 Thr Gly Val Met Ala Ser Thr Leu Pro Ala Met Phe Pro Thr His Ile 370 375 380 cgt tat agc gcg ctg gcg gcg gct ttt aat atc tct gta ttg att gcc 1200 Arg Tyr Ser Ala 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tca ctg 96 Ile Ile Asp Asp Gly Lys Leu Arg Lys Ala Ile Thr Ala Ala Ser Leu 20 25 30 ggt aat gca atg gaa tgg ttc gat ttt ggt gtt tat ggt ttt gtt gct 144 Gly Asn Ala Met Glu Trp Phe Asp Phe Gly Val Tyr Gly Phe Val Ala 35 40 45 tac gca tta ggt aaa gtt ttt ttc ccg ggg gct gac ccc agc gtg cag 192 Tyr Ala Leu Gly Lys Val Phe Phe Pro Gly Ala Asp Pro Ser Val Gln 50 55 60 atg gtt gct gca ctt gcc act ttc tcc gtt ccc ttt ctg att cga ccg 240 Met Val Ala Ala Leu Ala Thr Phe Ser Val Pro Phe Leu Ile Arg Pro 65 70 75 80 ctt ggc gga ctc ttc ttt ggt atg ttg ggc gat aaa tat ggt cgc cag 288 Leu Gly Gly Leu Phe Phe Gly Met Leu Gly Asp Lys Tyr Gly Arg Gln 85 90 95 aag atc ctc gct atc act att gtg att atg tcg atc agt acg ttc tgt 336 Lys Ile Leu Ala Ile Thr Ile Val Ile Met Ser Ile Ser Thr Phe Cys 100 105 110 att ggc tta ata ccg tcc tac gac acg att ggt att tgg gca ccg att 384 Ile Gly Leu Ile Pro Ser Tyr Asp Thr Ile Gly Ile Trp Ala Pro Ile 115 120 125 ctg ctg ttg atc tgt aag atg gca caa ggt ttc tcg gtc ggc ggt gaa 432 Leu Leu Leu Ile Cys Lys Met Ala Gln Gly Phe Ser Val Gly Gly Glu 130 135 140 tat acc ggg gcg tcg ata ttt gtt gcg gaa tac tcc cct gac cgt aaa 480 Tyr Thr Gly Ala Ser Ile Phe Val Ala Glu Tyr Ser Pro Asp Arg Lys 145 150 155 160 cgt ggc ttt atg ggc agc tgg ctg gac ttc ggt tct att gcc ggg ttt 528 Arg Gly Phe Met Gly Ser Trp Leu Asp Phe Gly Ser Ile Ala Gly Phe 165 170 175 gtg ctg ggt gcg ggc gtg gtg gtg tta att tcg acc att gtc ggc gaa 576 Val Leu Gly Ala Gly Val Val Val Leu Ile Ser Thr Ile Val Gly Glu 180 185 190 gcg aac ttc ctc gat tgg ggc tgg cgt att ccg ttc ttt atc gct ctg 624 Ala Asn Phe Leu Asp Trp Gly Trp Arg Ile Pro Phe Phe Ile Ala Leu 195 200 205 ccg tta ggg att atc ggg ctt tac ctg cgc cat gcg ctg gaa gag act 672 Pro Leu Gly Ile Ile Gly Leu Tyr Leu Arg His Ala Leu Glu Glu Thr 210 215 220 ccg gcg ttc cag cag cat gtc gat aaa ctg gaa cag ggc gac cgt gaa 720 Pro Ala Phe Gln Gln His Val Asp Lys Leu Glu Gln Gly Asp Arg Glu 225 230 235 240 ggt ttg cag gat ggc ccg aaa gtc tcg ttt aaa gag att gcc act aaa 768 Gly Leu Gln Asp Gly Pro Lys Val Ser Phe Lys Glu Ile Ala Thr Lys 245 250 255 tac tgg cgc agc ctg ttg aca tgt att ggt ctg gta att gcc acc aac 816 Tyr Trp Arg Ser Leu Leu Thr Cys Ile Gly Leu Val Ile Ala Thr Asn 260 265 270 gtg act tac tac atg ttg ctg acc tat atg ccg agt tat ttg tcg cat 864 Val Thr Tyr Tyr Met Leu Leu Thr Tyr Met Pro Ser Tyr Leu Ser His 275 280 285 aac ctg cat tac tcc gaa gac cac ggg gtg ctg att att atc gcc att 912 Asn Leu His Tyr Ser Glu Asp His Gly Val Leu Ile Ile Ile Ala Ile 290 295 300 atg atc ggt atg ctg ttt gtc cag ccg gtg atg ggc ttg ctg agt gac 960 Met Ile Gly Met Leu Phe Val Gln Pro Val Met Gly Leu Leu Ser Asp 305 310 315 320 cgt ttt ggc cgt cgt ccg ttt gtg cta ctt ggt agt gtt gcc ctg ttt 1008 Arg Phe Gly Arg Arg Pro Phe Val Leu Leu Gly Ser Val Ala Leu Phe 325 330 335 gtg ttg gcg atc ccg gcg ttt att ctg att aac agt aac gtc atc ggc 1056 Val Leu Ala Ile Pro Ala Phe Ile Leu Ile Asn Ser Asn Val Ile Gly 340 345 350 ctg att ttt gcc ggg tta ctg atg ctg gcg gtg atc ctt aac tgc ttt 1104 Leu Ile Phe Ala Gly Leu Leu Met Leu Ala Val Ile Leu Asn Cys Phe 355 360 365 acg ggc gtt atg gct tct acc ttg cca gcg atg ttc ccg acg cat atc 1152 Thr Gly Val Met Ala Ser Thr Leu Pro Ala Met Phe Pro Thr His Ile 370 375 380 cgt tac agc gcg ctg gcg gcg gca ttt aat att tcg gtg ctg gtt gcc 1200 Arg Tyr Ser Ala Leu Ala Ala Ala Phe Asn Ile Ser Val Leu Val Ala 385 390 395 400 ggt ctg acg cca acg ctg gcg gcc tgg ctg gtc taa agctcgcaga 1246 Gly Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala Trp Leu Val 405 410 atctgatgat gcctgcctat tacctgatgg tagtggcggt ggttggttta atcaccggcg 1306 taaccatgaa agagacggca aatcgtccgt tgaaaggtgc gacaccggcg gcgtcagata 1366 tacaggaagc gaaggaaatt ctcgtcgagc attacgataa tatcgagcag aaaatcgatg 1426 atattgacca cgagattgcc gatttgcagg cgaaacgtac ccgcctggtg cagcaacatc 1486 cgcgaattga tgaataa 1503 <210> 10 <211> 411 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 10 Met Leu Lys Arg Lys Lys Val Lys Pro Ile Thr Leu Arg Asp Val Thr 1 5 10 15 Ile Ile Asp Asp Gly Lys Leu 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40 45 Tyr Ala Leu Gly Lys Val Phe Phe Pro Gly Ala Asp Pro Ser Val Gln 50 55 60 Met Val Ala Ala Leu Ala Thr Phe Ser Val Pro Phe Leu Ile Arg Pro 65 70 75 80 Leu Gly Gly Leu Phe Phe Gly Met Leu Gly Asp Lys Tyr Gly Arg Gln 85 90 95 Lys Ile Leu Ala Ile Thr Ile Val Ile Met Ser Ile Ser Thr Phe Cys 100 105 110 Ile Gly Leu Ile Pro Ser Tyr Asp Thr Ile Gly Ile Trp Ala Pro Ile 115 120 125 Leu Leu Leu Ile Cys Lys Met Ala Gln Gly Phe Ser Val Gly Gly Glu 130 135 140 Tyr Thr Gly Ala Ser Ile Phe Val Ala Glu Tyr Ser Pro Asp Arg Lys 145 150 155 160 Arg Gly Phe Met Gly Ser Trp Leu Asp Phe Gly Ser Ile Ala Gly Phe 165 170 175 Val Leu Gly Ala Gly Val Val Val Leu Ile Ser Thr Ile Val Gly Glu 180 185 190 Ala Asn Phe Leu Asp Trp Gly Trp Arg Ile Pro Phe Phe Ile Ala Leu 195 200 205 Pro Leu Gly Ile Ile Gly Leu Tyr Leu Arg His Ala Leu Glu Glu Thr 210 215 220 Pro Ala Phe Gln Gln His Val Asp Lys Leu Glu Gln Gly Asp Arg Glu 225 230 235 240 Gly Leu Gln Asp Gly Pro Lys Val Ser Phe Lys Glu Ile Ala Thr Lys 245 250 255 Tyr Trp Arg Ser Leu Leu Thr Cys Ile Gly Leu Val Ile Ala Thr Asn 260 265 270 Val Thr Tyr Tyr Met Leu Leu Thr Tyr Met Pro Ser Tyr Leu Ser His 275 280 285 Asn Leu His Tyr Ser Glu Asp His Gly Val Leu Ile Ile Ile Ala Ile 290 295 300 Met Ile Gly Met Leu Phe Val Gln Pro Val Met Gly Leu Leu Ser Asp 305 310 315 320 Arg Phe Gly Arg Arg Pro Phe Val Leu Leu Ala Ser Val Cys Ala Thr 325 330 335 Trp <210> 21 <211> 1503 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (1)..(1503) <223> Kodierregion proP M5-Allel (Austausch g zu t an Position 971 bedingt AA-Austausch R324L) <400> 21 atg ctg aaa agg aaa aaa gta aaa ccg att acc ctt cgt gat gtc acc 48 Met Leu Lys Arg Lys Lys Val Lys Pro Ile Thr Leu Arg Asp Val Thr 1 5 10 15 att att gat gac ggt aaa ctg cgt aaa gcc att acc gca gca tca ctg 96 Ile Ile Asp Asp Gly Lys Leu Arg Lys Ala Ile Thr Ala Ala Ser Leu 20 25 30 ggt aat gca atg gaa tgg ttc gat ttt ggt gtt tat ggt ttt gtt gct 144 Gly Asn Ala Met Glu Trp Phe Asp Phe Gly Val Tyr Gly Phe Val Ala 35 40 45 tac gca tta ggt aaa gtt ttt ttc ccg ggg gct gac ccc agc gtg cag 192 Tyr Ala Leu Gly Lys Val Phe Phe Pro Gly Ala Asp Pro Ser Val Gln 50 55 60 atg gtt gct gca ctt gcc act ttc tcc gtt ccc ttt ctg att cga ccg 240 Met Val Ala Ala Leu Ala Thr Phe Ser Val Pro Phe Leu Ile Arg Pro 65 70 75 80 ctt ggc gga ctc ttc ttt ggt atg ttg ggc gat aaa tat ggt cgc cag 288 Leu Gly Gly Leu Phe Phe Gly Met Leu Gly Asp Lys Tyr Gly Arg Gln 85 90 95 aag atc ctc gct atc act att gtg att atg tcg atc agt acg ttc tgt 336 Lys Ile Leu Ala Ile Thr Ile Val Ile Met Ser Ile Ser Thr Phe Cys 100 105 110 att ggc tta ata ccg tcc tac gac acg att ggt att tgg gca ccg att 384 Ile Gly Leu Ile Pro Ser Tyr Asp Thr Ile Gly Ile Trp Ala Pro Ile 115 120 125 ctg ctg ttg atc tgt aag atg gca caa ggt ttc tcg gtc ggc ggt gaa 432 Leu Leu Leu Ile Cys Lys Met Ala Gln Gly Phe Ser Val Gly Gly Glu 130 135 140 tat acc ggg gcg tcg ata ttt gtt gcg gaa tac tcc cct gac cgt aaa 480 Tyr Thr Gly Ala Ser Ile Phe Val Ala Glu Tyr Ser Pro Asp Arg Lys 145 150 155 160 cgt ggc ttt atg ggc agc tgg ctg gac ttc ggt tct att gcc ggg ttt 528 Arg Gly Phe Met Gly Ser Trp Leu Asp Phe Gly Ser Ile Ala Gly Phe 165 170 175 gtg ctg ggt gcg ggc gtg gtg gtg tta att tcg acc att gtc ggc gaa 576 Val Leu Gly Ala Gly Val Val Val Leu Ile Ser Thr Ile Val Gly Glu 180 185 190 gcg aac ttc ctc gat tgg ggc tgg cgt att ccg ttc ttt atc gct ctg 624 Ala Asn Phe Leu Asp Trp Gly Trp Arg Ile Pro Phe Phe Ile Ala Leu 195 200 205 ccg tta ggg att atc ggg ctt tac ctg cgc cat gcg ctg gaa gag act 672 Pro Leu Gly Ile Ile Gly Leu Tyr Leu Arg His Ala Leu Glu Glu Thr 210 215 220 ccg gcg ttc cag cag cat gtc gat aaa ctg gaa cag ggc gac cgt gaa 720 Pro Ala Phe Gln Gln His Val Asp Lys Leu Glu Gln Gly Asp Arg Glu 225 230 235 240 ggt ttg cag gat ggc ccg aaa gtc tcg ttt aaa gag att gcc act aaa 768 Gly Leu Gln Asp Gly Pro Lys Val Ser Phe Lys Glu Ile Ala Thr Lys 245 250 255 tac tgg cgc agc ctg ttg aca tgt att ggt ctg gta att gcc acc aac 816 Tyr Trp Arg Ser Leu Leu Thr Cys Ile Gly Leu Val Ile Ala Thr Asn 260 265 270 gtg act tac tac atg ttg ctg acc tat atg ccg agt tat ttg tcg cat 864 Val Thr Tyr Tyr Met Leu Leu Thr Tyr Met Pro Ser Tyr Leu Ser His 275 280 285 aac ctg cat tac tcc gaa gac cac ggg gtg ctg att att atc gcc att 912 Asn Leu His Tyr Ser Glu Asp His Gly Val Leu Ile Ile Ile Ala Ile 290 295 300 atg atc ggt atg ctg ttt gtc cag ccg gtg atg ggc ttg ctg agt gac 960 Met Ile Gly Met Leu Phe Val Gln Pro Val Met Gly Leu Leu Ser Asp 305 310 315 320 cgt ttt ggc ctt cgt ccg ttt gtg cta ctt ggt agt gtt gcc ctg ttt 1008 Arg Phe Gly Leu Arg Pro Phe Val Leu Leu Gly Ser Val Ala Leu Phe 325 330 335 gtg ttg gcg atc ccg gcg ttt att ctg att aac agt aac gtc atc ggc 1056 Val Leu Ala Ile Pro Ala Phe Ile Leu Ile Asn Ser Asn Val Ile Gly 340 345 350 ctg att ttt gcc ggg tta ctg atg ctg gcg gtg atc ctt aac tgc ttt 1104 Leu Ile Phe Ala Gly Leu Leu Met Leu Ala Val Ile Leu Asn Cys Phe 355 360 365 acg ggc gtt atg gct tct acc ttg cca gcg atg ttc ccg acg cat atc 1152 Thr Gly Val Met Ala Ser Thr Leu Pro Ala Met Phe Pro Thr His Ile 370 375 380 cgt tac agc gcg ctg gcg gcg gca ttt aat att tcg gtg ctg gtt gcc 1200 Arg Tyr Ser Ala Leu Ala Ala Ala Phe Asn Ile Ser Val Leu Val Ala 385 390 395 400 ggt ctg acg cca acg ctg gcg gcc tgg ctg gtc gaa agc tcg cag aat 1248 Gly Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala Trp Leu Val Glu Ser Ser Gln Asn 405 410 415 ctg atg atg cct gcc tat tac ctg atg gta gtg gcg gtg gtt ggt tta 1296 Leu Met Met Pro Ala Tyr Tyr Leu Met Val Val Ala Val Val Gly Leu 420 425 430 atc acc ggc gta acc atg aaa gag acg gca aat cgt ccg ttg aaa ggt 1344 Ile Thr Gly Val Thr Met Lys Glu Thr Ala Asn Arg Pro Leu Lys Gly 435 440 445 gcg aca ccg gcg gcg tca gat ata cag gaa gcg aag gaa att ctc gtc 1392 Ala Thr Pro Ala Ala Ser Asp Ile Gln Glu Ala Lys Glu Ile Leu Val 450 455 460 gag cat tac gat aat atc gag cag aaa atc gat gat att gac cac gag 1440 Glu His Tyr Asp Asn Ile Glu Gln Lys Ile Asp Asp Ile Asp His Glu 465 470 475 480 att gcc gat ttg cag gcg aaa cgt acc cgc ctg gtg cag caa cat ccg 1488 Ile Ala Asp Leu Gln Ala Lys Arg Thr Arg Leu Val Gln Gln His Pro 485 490 495 cga att gat gaa taa 1503 Arg Ile Asp Glu 500 <210> 22 <211> 500 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 22 Met Leu Lys Arg Lys Lys Val Lys Pro Ile Thr Leu Arg Asp Val Thr 1 5 10 15 Ile Ile Asp Asp Gly Lys Leu Arg Lys Ala Ile Thr Ala Ala Ser Leu 20 25 30 Gly Asn Ala Met Glu Trp Phe Asp Phe Gly Val Tyr Gly Phe Val Ala 35 40 45 Tyr Ala Leu Gly Lys Val Phe Phe Pro Gly Ala Asp Pro Ser Val Gln 50 55 60 Met Val Ala Ala Leu Ala Thr Phe Ser Val Pro Phe Leu Ile Arg Pro 65 70 75 80 Leu Gly Gly Leu Phe Phe Gly Met Leu Gly Asp Lys Tyr Gly Arg Gln 85 90 95 Lys Ile Leu Ala Ile Thr Ile Val Ile Met Ser Ile Ser Thr Phe Cys 100 105 110 Ile Gly Leu Ile Pro Ser Tyr Asp Thr Ile Gly Ile Trp Ala Pro Ile 115 120 125 Leu Leu Leu Ile Cys Lys Met Ala Gln Gly Phe Ser Val Gly Gly Glu 130 135 140 Tyr Thr Gly Ala Ser Ile Phe Val Ala Glu Tyr Ser Pro Asp Arg Lys 145 150 155 160 Arg Gly Phe Met Gly Ser Trp Leu Asp Phe Gly Ser Ile Ala Gly Phe 165 170 175 Val Leu Gly Ala Gly Val Val Val Leu Ile Ser Thr Ile Val Gly Glu 180 185 190 Ala Asn Phe Leu Asp Trp Gly Trp Arg Ile Pro Phe Phe Ile Ala Leu 195 200 205 Pro Leu Gly Ile Ile Gly Leu Tyr Leu Arg His Ala Leu Glu Glu Thr 210 215 220 Pro Ala Phe Gln Gln His Val Asp Lys Leu Glu Gln Gly Asp Arg Glu 225 230 235 240 Gly Leu Gln Asp Gly Pro Lys Val Ser Phe Lys Glu Ile Ala Thr Lys 245 250 255 Tyr Trp Arg Ser Leu Leu Thr Cys Ile Gly Leu Val Ile Ala Thr Asn 260 265 270 Val Thr Tyr Tyr Met Leu Leu Thr Tyr Met Pro Ser Tyr Leu Ser His 275 280 285 Asn Leu His Tyr Ser Glu Asp His Gly Val Leu Ile Ile Ile Ala Ile 290 295 300 Met Ile Gly Met Leu Phe Val Gln Pro Val Met Gly Leu Leu Ser Asp 305 310 315 320 Arg Phe Gly Leu Arg Pro Phe Val Leu Leu Gly Ser Val Ala Leu Phe 325 330 335 Val Leu Ala Ile Pro Ala Phe Ile Leu Ile Asn Ser Asn Val Ile Gly 340 345 350 Leu Ile Phe Ala Gly Leu Leu Met Leu Ala Val Ile Leu Asn Cys Phe 355 360 365 Thr Gly Val Met Ala Ser Thr Leu Pro Ala Met Phe Pro Thr His Ile 370 375 380 Arg Tyr Ser Ala Leu Ala Ala Ala Phe Asn Ile Ser Val Leu Val Ala 385 390 395 400 Gly Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala Trp Leu Val Glu Ser Ser Gln Asn 405 410 415 Leu Met Met Pro Ala Tyr Tyr Leu Met Val Val Ala Val Val Gly Leu 420 425 430 Ile Thr Gly Val Thr Met Lys Glu Thr Ala Asn Arg Pro Leu Lys Gly 435 440 445 Ala Thr Pro Ala Ala Ser Asp Ile Gln Glu Ala Lys Glu Ile Leu Val 450 455 460 Glu His Tyr Asp Asn Ile Glu Gln Lys Ile Asp Asp Ile Asp His Glu 465 470 475 480 Ile Ala Asp Leu Gln Ala Lys Arg Thr Arg Leu Val Gln Gln His Pro 485 490 495 Arg Ile Asp Glu 500 <210> 23 <211> 2852 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (1)..(243) <223> Kodierregion proP M2-Allel (1359bp Insertion nach Nukleotidposition 183) <400> 23 atg ctg aaa agg aaa aaa gta aaa ccg att acc ctt cgt gat gtc acc 48 Met Leu Lys Arg Lys Lys Val Lys Pro Ile Thr Leu Arg Asp Val Thr 1 5 10 15 att att gat gac ggt aaa ctg cgt aaa gcc att acc gca gca tca ctg 96 Ile Ile Asp Asp Gly Lys Leu Arg Lys Ala Ile Thr Ala Ala Ser Leu 20 25 30 ggt aat gca atg gaa tgg ttc gat ttt ggt gtt tat ggt ttt gtt gct 144 Gly Asn Ala Met Glu Trp Phe Asp Phe Gly Val Tyr Gly Phe Val Ala 35 40 45 tac gca tta ggt aaa gtt ttt ttc ccg ggg gct gac ccc ata agc gct 192 Tyr Ala Leu Gly Lys Val Phe Phe Pro Gly Ala Asp Pro Ile Ser Ala 50 55 60 aac tta agg gtt gaa cca tct gaa gaa tgc gac gcc tcg gtg cct cgt 240 Asn Leu Arg Val Glu Pro Ser Glu Glu Cys Asp Ala Ser Val Pro Arg 65 70 75 80 taa gacgatgcct cgcgttcttc aattgcgttt tgtaggctgt cagggatact 293 gtcccacgaa tggccacctg taagctccag atgaccattt ttgttattct ccacaacgag 353 ttagttcttc ttttcggatc cggcacttct gggggggaaa tccagcgatg gctggattat 413 gtcgtcaatt aaaaatgcgg cgagtagatt agcaaatatc cacgctttcg cgagttcagg 473 ttcctttgca cgcaaagcat ccaggtgcag caaacttttg agccgcttaa aagccagttc 533 aatttgccat cgcagacggt aacaatcagc cacttgctct gctgaatatt catcttccgg 593 taatgatgtt agcaatagca catggcccgc tgcttccagc gtttccgcct gaactactcg 653 tccttttcga cgattctcgc tgagcagtcg ggttttactg attaatgctt tttcgggagg 713 aagtgatacg gcaatgagac gtgccggaaa gggagctccg gcttttttat tacctgaatt 773 gcctatcatt acagtggttt caccgttctt accgcaatcc agcccgcgca gaaaacccat 833 catgtcaaag cgcattcctt ctgcagttaa ccagcgcaat cctcgccagt gaacccggac 893 gatataatca gcttctccaa aagcaagtga gcggatacat tcgggacgcg aaccgaatcc 953 ccggtcagca atgcgtatct cgtctgccgt ttgcgcaaat cggtccagcc gttcagcgtc 1013 tctgctgtcg gttagctcaa aatcagtgaa ctgacaggta tgaggatcat atcccatatg 1073 tagtcgccat tcagcgctgc cgcccccggg cgcactgatt gctgttccat cgacaagacg 1133 caatctcttt ccgcttgtac aacccgtaac tgcggcgcgt acagcaagtg tttgtgcggc 1193 aagtatgcca aaccagtcgg cggcattccg cagccgcttc aggagagcca cgtcagataa 1253 tgttgcaacg tcatggagct gagcccatgc agtgacttca cgtaatgaca tccccccggg 1313 gccgtaagcc agccccagac gtagcagagt tgcagcatca cgaatttcgc ggcggcgggt 1373 tagagccccg gcattacgtg ccgaagtatc cagttcttcg ggcttaccaa tatgggccag 1433 aattgctgac cagttatcgt gagagtaatt catcggcacg ttaaatcata tcaggcgtaa 1493 taccacaacc cttaagttag cgcttatggg gctgacccca gcgtgcagat ggttgctgca 1553 cttgccactt tctccgttcc ctttctgatt cgaccgcttg gcggactctt ctttggtatg 1613 ttgggcgata aatatggtcg ccagaagatc ctcgctatca ctattgtgat tatgtcgatc 1673 agtacgttct gtattggctt aataccgtcc tacgacacga ttggtatttg ggcaccgatt 1733 ctgctgttga tctgtaagat ggcacaaggt ttctcggtcg gcggtgaata taccggggcg 1793 tcgatatttg ttgcggaata ctcccctgac cgtaaacgtg gctttatggg cagctggctg 1853 gacttcggtt ctattgccgg gtttgtgctg ggtgcgggcg tggtggtgtt aatttcgacc 1913 attgtcggcg aagcgaactt cctcgattgg ggctggcgta ttccgttctt tatcgctctg 1973 ccgttaggga ttatcgggct ttacctgcgc catgcgctgg aagagactcc ggcgttccag 2033 cagcatgtcg ataaactgga acagggcgac cgtgaaggtt tgcaggatgg cccgaaagtc 2093 tcgtttaaag agattgccac taaatactgg cgcagcctgt tgacatgtat tggtctggta 2153 attgccacca acgtgactta ctacatgttg ctgacctata tgccgagtta tttgtcgcat 2213 aacctgcatt actccgaaga ccacggggtg ctgattatta tcgccattat gatcggtatg 2273 ctgtttgtcc agccggtgat gggcttgctg agtgaccgtt ttggccgtcg tccgtttgtg 2333 ctacttggta gtgttgccct gtttgtgttg gcgatcccgg cgtttattct gattaacagt 2393 aacgtcatcg gcctgatttt tgccgggtta ctgatgctgg cggtgatcct taactgcttt 2453 acgggcgtta tggcttctac cttgccagcg atgttcccga cgcatatccg ttacagcgcg 2513 ctggcggcgg catttaatat ttcggtgctg gttgccggtc tgacgccaac gctggcggcc 2573 tggctggtcg aaagctcgca gaatctgatg atgcctgcct attacctgat ggtagtggcg 2633 gtggttggtt taatcaccgg cgtaaccatg aaagagacgg caaatcgtcc gttgaaaggt 2693 gcgacaccgg cggcgtcaga tatacaggaa gcgaaggaaa ttctcgtcga gcattacgat 2753 aatatcgagc agaaaatcga tgatattgac cacgagattg ccgatttgca ggcgaaacgt 2813 acccgcctgg tgcagcaaca tccgcgaatt gatgaataa 2852 <210> 24 <211> 80 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 24 Met Leu Lys Arg Lys Lys Val Lys Pro Ile Thr Leu Arg Asp Val Thr 1 5 10 15 Ile Ile Asp Asp Gly Lys Leu Arg Lys Ala Ile Thr Ala Ala Ser Leu 20 25 30 Gly Asn Ala Met Glu Trp Phe Asp Phe Gly Val Tyr Gly Phe Val Ala 35 40 45 Tyr Ala Leu Gly Lys Val Phe Phe Pro Gly Ala Asp Pro Ile Ser Ala 50 55 60 Asn Leu Arg Val Glu Pro Ser Glu Glu Cys Asp Ala Ser Val Pro Arg 65 70 75 80 <210> 25 <211> 38 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> Primer serCF(XbaI) <400> 25 aggtgctcta gagtccgcgc tgtgcaaatc cagaatgg 38 <210> 26 <211> 37 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> misc_feature <222> (1)..(37) <223> Primer serCR(HindIII) <400> 26 tacaccaagc ttaactctct acaacagaaa taaaaac 37 <210> 27 <211> 33 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> misc_feature <222> (1)..(33) <223> Primer serAF(XbaI) <400> 27 ctgtagtcta gattagtaca gcagacgggc gcg 33 <210> 28 <211> 68 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> misc_feature <222> (1)..(68) <223> Primer serAR(SHSSNB) <400> 28 caagagctca agcttgcatg cgattcccgg gcggccgcaa taagatctcc gtcagggcgt 60 ggtgaccg 68 <210> 29 <211> 34 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> misc_feature <222> (1)..(34) <223> Primer serB(SphI) <400> 29 ccatgcgcat gcccaccctt tgaaaatttg agac 34 <210> 30 <211> 75 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> misc_feature <222> (1)..(75) <223> Primer serB(SmaI) <400> 30 ccgcatgtcg acatcccggg gcagaaaggc ccacccgaag gtgagccagt gtgattactt 60 ctgattcagg ctgcc 75 <210> 31 <211> 35 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> misc_feature <222> (1)..(35) <223> Primer glyA-downstream <400> 31 atctaaagat ctgttacgac agatttgatg gcgcg 35 <210> 32 <211> 33 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> misc_feature <222> (1)..(33) <223> glyA-upstream <400> 32 ttcatcgcgg ccgcgaaaga atgtgatgaa gtg 33 <210> 33 <211> 30 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> misc_feature <222> (1)..(30) <223> Primer proPmut1(HindIII) <400> 33 gtcaaagctt atatggtcgc cagaagatcc 30 <210> 34 <211> 30 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> misc_feature <222> (1)..(30) <223> Primer proPmut2(BamHI) <400> 34 gtcaggatcc tcagccgcat tacacagttg 30 <210> 35 <211> 1564 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> misc_feature <222> (5)..(10) <223> Erkennungssequenz HindIII <220> <221> mutation <222> (969)..(969) <223> M8-Mutation: Austausch a zu t an Position 1234, bedingt E412* <220> <221> misc_feature <222> (1534)..(1539) <223> Erkennungssequenz BamHI <400> 35 gtcaaagctt atatggtcgc cagaagatcc tcgctatcac tattgtgatt atgtcgatca 60 gtacgttctg tattggctta ataccgtcct acgacacgat tggtatttgg gcaccgattc 120 tgctgttgat ctgtaagatg gcacaaggtt tctcggtcgg cggtgaatat accggggcgt 180 cgatatttgt tgcggaatac tcccctgacc gtaaacgtgg ctttatgggc agctggctgg 240 acttcggttc tattgccggg tttgtgctgg gtgcgggcgt ggtggtgtta atttcgacca 300 ttgtcggcga agcgaacttc ctcgattggg gctggcgtat tccgttcttt atcgctctgc 360 cgttagggat tatcgggctt tacctgcgcc atgcgctgga agagactccg gcgttccagc 420 agcatgtcga taaactggaa cagggcgacc gtgaaggttt gcaggatggc ccgaaagtct 480 cgtttaaaga gattgccact aaatactggc gcagcctgtt gacatgtatt ggtctggtaa 540 ttgccaccaa cgtgacttac tacatgttgc tgacctatat gccgagttat ttgtcgcata 600 acctgcatta ctccgaagac cacggggtgc tgattattat cgccattatg atcggtatgc 660 tgtttgtcca gccggtgatg ggcttgctga gtgaccgttt tggccgtcgt ccgtttgtgc 720 tacttgcgtc cgtttgtgct acttggtagt gttgccctgt ttgtgttggc gatcccggcg 780 tttattctga ttaacagtaa cgtcatcggc ctgatttttg ccgggttact gatgctggcg 840 gtgatcctta actgctttac gggcgttatg gcttctacct tgccagcgat gttcccgacg 900 catatccgtt acagcgcgct ggcggcggca tttaatattt cggtgctggt tgccggtctg 960 acgccaacgc tggcggcctg gctggtcgaa agctcgcaga atctgatgat gcctgcctat 1020 tacctgatgg tagtggcggt ggttggttta atcaccggcg taaccatgaa agagacggca 1080 aatcgtccgt tgaaaggtgc gacaccggcg gcgtcagata tacaggaagc gaaggaaatt 1140 ctcgtcgagc attacgataa tatcgagcag aaaatcgatg atattgacca cgagattgcc 1200 gatttgcagg cgaaacgtac ccgcctggtg cagcaacatc cgcgaattga tgaataagct 1260 gaaacggatg gcctgatgtg acgctgtctt atcaggccaa ttgaactctt aaggttcact 1320 taatctctga cgcgcatact ctcctccagg ttaacggagg agagtgcaat gaaaaaccgt 1380 gtttatgaaa gtttaactac cgtgttcagc gtgctggtgg tcagcagctt tctttatatc 1440 tggtttgcca cgtactgatc tttcttcagc cgtacccagg cccgcgtgcc ggaagtctct 1500 tgccggtttt gcaggaaaaa ctgcccgtga tgcaactgtg taatgcggct gagcggccgc 1560 tcag 1564 <210> 36 <211> 1542 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> misc_feature <222> (5)..(10) <223> Erkennungssequenz HindIII <220> <221> mutation <222> (588)..(589) <223> M4-Mutation: Deletion eines A nach Nukleotidposition 854 <220> <221> misc_feature <222> (1533)..(538) <223> Erkennungssequenz BamHI <400> 36 gtcaaagctt atatggtcgc cagaagatcc tcgctatcac tattgtgatt atgtcgatca 60 gtacgttctg tattggctta ataccgtcct acgacacgat tggtatttgg gcaccgattc 120 tgctgttgat ctgtaagatg gcacaaggtt tctcggtcgg cggtgaatat accggggcgt 180 cgatatttgt tgcggaatac tcccctgacc gtaaacgtgg ctttatgggc agctggctgg 240 acttcggttc tattgccggg tttgtgctgg gtgcgggcgt ggtggtgtta atttcgacca 300 ttgtcggcga agcgaacttc ctcgattggg gctggcgtat tccgttcttt atcgctctgc 360 cgttagggat tatcgggctt tacctgcgcc atgcgctgga agagactccg gcgttccagc 420 agcatgtcga taaactggaa cagggcgacc gtgaaggttt gcaggatggc ccgaaagtct 480 cgtttaaaga gattgccact aaatactggc gcagcctgtt gacatgtatt ggtctggtaa 540 ttgccaccaa cgtgacttac tacatgttgc tgacctatat gccgagtttt tgtcgcataa 600 cctgcattac tccgaagacc acggggtgct gattattatc gccattatga tcggtatgct 660 gtttgtccag ccggtgatgg gcttgctgag tgaccgtttt ggccgtcgtc cgtttgtgct 720 acttggtagt gttgccctgt ttgtgttggc gatcccggcg tttattctga ttaacagtaa 780 cgtcatcggc ctgatttttg ccgggttact gatgctggcg gtgatcctta actgctttac 840 gggcgttatg gcttctacct tgccagcgat gttcccgacg catatccgtt acagcgcgct 900 ggcggcggca tttaatattt cggtgctggt tgccggtctg acgccaacgc tggcggcctg 960 gctggtcgaa agctcgcaga atctgatgat gcctgcctat tacctgatgg tagtggcggt 1020 ggttggttta atcaccggcg taaccatgaa agagacggca aatcgtccgt tgaaaggtgc 1080 gacaccggcg gcgtcagata tacaggaagc gaaggaaatt ctcgtcgagc attacgataa 1140 tatcgagcag aaaatcgatg atattgacca cgagattgcc gatttgcagg cgaaacgtac 1200 ccgcctggtg cagcaacatc cgcgaattga tgaataagct gaaacggatg gcctgatgtg 1260 acgctgtctt atcaggccaa ttgaactctt aaggttcact taatctctga cgcgcatact 1320 ctcctccagg ttaacggagg agagtgcaat gaaaaaccgt gtttatgaaa gtttaactac 1380 cgtgttcagc gtgctggtgg tcagcagctt tctttatatc tggtttgcca cgtactgatc 1440 tttcttcagc cgtacccagg cccgcgtgcc ggaagtctct tgccggtttt gcaggaaaaa 1500 ctgcccgtga tgcaactgtg taatgcggct gaggatcctg ac 1542 <210> 37 <211> 1563 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> misc_feature <222> (5)..(10) <223> Erkennungssequenz HindIII <220> <221> mutation <222> (722)..(740) <223> M6-Mutation: 19bp Insertion nach Nukleotidposition 973 <220> <221> misc_feature <222> (1553)..(1558) <223> Erkennungssequenz BamHI <400> 37 gtcaaagctt atatggtcgc cagaagatcc tcgctatcac tattgtgatt atgtcgatca 60 gtacgttctg tattggctta ataccgtcct acgacacgat tggtatttgg gcaccgattc 120 tgctgttgat ctgtaagatg gcacaaggtt tctcggtcgg cggtgaatat accggggcgt 180 cgatatttgt tgcggaatac tcccctgacc gtaaacgtgg ctttatgggc agctggctgg 240 acttcggttc tattgccggg tttgtgctgg gtgcgggcgt ggtggtgtta atttcgacca 300 ttgtcggcga agcgaacttc ctcgattggg gctggcgtat tccgttcttt atcgctctgc 360 cgttagggat tatcgggctt tacctgcgcc atgcgctgga agagactccg gcgttccagc 420 agcatgtcga taaactggaa cagggcgacc gtgaaggttt gcaggatggc ccgaaagtct 480 cgtttaaaga gattgccact aaatactggc gcagcctgtt gacatgtatt ggtctggtaa 540 ttgccaccaa cgtgacttac tacatgttgc tgacctatat gccgagttat ttgtcgcata 600 acctgcatta ctccgaagac cacggggtgc tgattattat cgccattatg atcggtatgc 660 tgtttgtcca gccggtgatg ggcttgctga gtgaccgttt tggccgtcgt ccgtttgtgc 720 tacttgcgtc cgtttgtgct acttggtagt gttgccctgt ttgtgttggc gatcccggcg 780 tttattctga ttaacagtaa cgtcatcggc ctgatttttg ccgggttact gatgctggcg 840 gtgatcctta actgctttac gggcgttatg gcttctacct tgccagcgat gttcccgacg 900 catatccgtt acagcgcgct ggcggcggca tttaatattt cggtgctggt tgccggtctg 960 acgccaacgc tggcggcctg gctggtcgaa agctcgcaga atctgatgat gcctgcctat 1020 tacctgatgg tagtggcggt ggttggttta atcaccggcg taaccatgaa agagacggca 1080 aatcgtccgt tgaaaggtgc gacaccggcg gcgtcagata tacaggaagc gaaggaaatt 1140 ctcgtcgagc attacgataa tatcgagcag aaaatcgatg atattgacca cgagattgcc 1200 gatttgcagg cgaaacgtac ccgcctggtg cagcaacatc cgcgaattga tgaataagct 1260 gaaacggatg gcctgatgtg acgctgtctt atcaggccaa ttgaactctt aaggttcact 1320 taatctctga cgcgcatact ctcctccagg ttaacggagg agagtgcaat gaaaaaccgt 1380 gtttatgaaa gtttaactac cgtgttcagc gtgctggtgg tcagcagctt tctttatatc 1440 tggtttgcca cgtactgatc tttcttcagc cgtacccagg cccgcgtgcc ggaagtctct 1500 tgccggtttt gcaggaaaaa ctgcccgtga tgcaactgtg taatgcggct gagggatcct 1560 cag 1563 <210> 38 <211> 3503 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> gene <222> (1001)..(2503) <223> Kodierregion proP <400> 38 ttctttcgcg tgtgcagctt cagacatgga cgaacggcgg catgttaaat gcgccgctta 60 gcctgcgtct gacattggtg gaaaaactgg cgtcgatgct ggatcccggt catctggcac 120 tgacgcagat cgcgcagcat ctggcgctgc tgcaaaaaat ggatcaccgc cagcactctg 180 ctttcccgga gctcccccag caaattgccg ccttgtatga gtggttttca gcccgttgtc 240 gctggaagga aaaggcgtta acgcaacgag gcctactggt gcaggcaggt gatcagagcg 300 agcaaatttt tacccgctgg cgtgctgggg cgtataacgc ctggtcgttg cctgggcgct 360 gttttatcgt tctggaggag ttgcgctggg gggcatttgg cgatgcctgc cgtctgggaa 420 gcccgcaagc ggtggcgttg ttgctgggtg atttgctcga gaaagcgaca caacatctgg 480 cagagagtat caatgcggca ccgaccacgc gtcactatta ccatcagtgg tttgcctctt 540 cgaccgttcc gacgggcggg gagcatgctg attttttaag ttggctggga aagtggacca 600 cggcagataa acaacccgtt tgctggtcag tgacccaacg ctggcaaact gtcgcgctgg 660 ggatgccacg actctgttca gcgcagcgtc tggcgggggc aatgctcgag gaaatcttct 720 ctgtaaattt ggcgtaaata atcagttaca tcaatgagtc ctaaacgaaa tccatgtgtg 780 aagttgatca caaatttaaa cactggtagg gtaaaaaggt cattaactgc ccaattcagg 840 cgtcaactgg tttgattgta cattccttaa ccggagggtg taagcaaacc cgctacgctt 900 gttacagaga ttgcatcctg caattcccgc tccccttttg cggccgtcgc gctgattttt 960 ctggcgtttg cggaaatggg ccaactctgc gaggaaagct atgctgaaaa ggaaaaaagt 1020 aaaaccgatt acccttcgtg atgtcaccat tattgatgac ggtaaactgc gtaaagccat 1080 taccgcagca tcactgggta atgcaatgga atggttcgat tttggtgttt atggttttgt 1140 tgcttacgca ttaggtaaag tttttttccc gggggctgac cccagcgtgc agatggttgc 1200 tgcacttgcc actttctccg ttccctttct gattcgaccg cttggcggac tcttctttgg 1260 tatgttgggc gataaatatg gtcgccagaa gatcctcgct atcactattg tgattatgtc 1320 gatcagtacg ttctgtattg gcttaatacc gtcctacgac acgattggta tttgggcacc 1380 gattctgctg ttgatctgta agatggcaca aggtttctcg gtcggcggtg aatataccgg 1440 ggcgtcgata tttgttgcgg aatactcccc tgaccgtaaa cgtggcttta tgggcagctg 1500 gctggacttc ggttctattg ccgggtttgt gctgggtgcg ggcgtggtgg tgttaatttc 1560 gaccattgtc ggcgaagcga acttcctcga ttggggctgg cgtattccgt tctttatcgc 1620 tctgccgtta gggattatcg ggctttacct gcgccatgcg ctggaagaga ctccggcgtt 1680 ccagcagcat gtcgataaac tggaacaggg cgaccgtgaa ggtttgcagg atggcccgaa 1740 agtctcgttt aaagagattg ccactaaata ctggcgcagc ctgttgacat gtattggtct 1800 ggtaattgcc accaacgtga cttactacat gttgctgacc tatatgccga gttatttgtc 1860 gcataacctg cattactccg aagaccacgg ggtgctgatt attatcgcca ttatgatcgg 1920 tatgctgttt gtccagccgg tgatgggctt gctgagtgac cgttttggcc gtcgtccgtt 1980 tgtgctactt ggtagtgttg ccctgtttgt gttggcgatc ccggcgttta ttctgattaa 2040 cagtaacgtc atcggcctga tttttgccgg gttactgatg ctggcggtga tccttaactg 2100 ctttacgggc gttatggctt ctaccttgcc agcgatgttc ccgacgcata tccgttacag 2160 cgcgctggcg gcggcattta atatttcggt gctggttgcc ggtctgacgc caacgctggc 2220 ggcctggctg gtcgaaagct cgcagaatct gatgatgcct gcctattacc tgatggtagt 2280 ggcggtggtt ggtttaatca ccggcgtaac catgaaagag acggcaaatc gtccgttgaa 2340 aggtgcgaca ccggcggcgt cagatataca ggaagcgaag gaaattctcg tcgagcatta 2400 cgataatatc gagcagaaaa tcgatgatat tgaccacgag attgccgatt tgcaggcgaa 2460 acgtacccgc ctggtgcagc aacatccgcg aattgatgaa taagctgaaa cggatggcct 2520 gatgtgacgc tgtcttatca ggccaattga actcttaagg ttcacttaat ctctgacgcg 2580 catactctcc tccaggttaa cggaggagag tgcaatgaaa aaccgtgttt atgaaagttt 2640 aactaccgtg ttcagcgtgc tggtggtcag cagctttctt tatatctggt ttgccacgta 2700 ctgatctttc ttcagccgta cccaggcccg cgtgccggaa gtctcttgcc ggttttgcag 2760 gaaaaactgc ccgtgatgca actgtgtaat gcggctgaca atacttaacc ccagaccaat 2820 cccgccataa cggctgtcca tacgtacaaa cgctttactc aactccccgc atttactctc 2880 atcaatacct ggtccttcat cttcaactgc catgaccgct ccgtcatctt cttgcagctt 2940 aatcataatg ttgctgcctt gcgggctgta acgatgggcg ttttctacca ggtttcgcaa 3000 taacatccgc agcagggttg catcaccctg aacggtgatg tcggcggcgc tctctggcaa 3060 tagcagggtt tgctgtcgct ggtcgagcat ggtactgagt tcgtcatacg aggggagaat 3120 gacatcttcc agcagtttta catgttgata attaccggaa gaaaatgact gtccggcacg 3180 cgccagttgc agcagctggg agacgctctc catcatctga tcaagccgtg ccactaacgg 3240 tgctacatca atgtgatgcg ttttcgccag cagttccaga tgcaaacgca cccccgccag 3300 tggcgttcgc agttcgtgcg cgacgtcagc ggtaaacaac ctttcgttat ccagcgtgct 3360 ggtcaggcga ctgaccagat cgtttaacgc cgaaaccacc gcttcgattt cgagggtggc 3420 gctgtgaatg gcaatgggcg ttaagttgtc ggcggtgcgc gcttccagct ctttttgcag 3480 ctccgccagc gggcgggtga tgc 3503 201100314 2

Claims (36)

  1. proP 유전자가 감쇠된 미생물을 사용하는 것을 특징으로 하며, 여기서 "감쇠된"은 proP 유전자의 발현이 감소된 것을 의미하고,
    추가로, 상기 미생물이
    a) 티오술페이트/술페이트 수송 시스템 CysPUWA (EC 3.6.3.25)의 하나 이상의 성분을 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
    b) 3'-포스포아데노신 5'-포스포술페이트 리덕타제 CysH (EC 1.8.4.8)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
    c) 술파이트 리덕타제 CysJI (EC 1.8.1.2)의 하나 이상의 성분을 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
    d) 시스테인 신타제 A CysK (EC 2.5.1.47)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
    e) 시스테인 신타제 B CysM (EC 2.5.1.47)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
    f) 세린 아세틸트랜스퍼라제 CysE (EC 2.3.1.30)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
    g) 글리신 절단 시스템 GcvTHP-Lpd (EC 2.1.2.10, EC 1.4.4.2, EC 1.8.1.4)의 하나 이상의 성분을 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
    h) 리포일 신타제 LipA (EC 2.8.1.8)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
    i) 리포일 단백질 리가제 LipB (EC 2.3.1.181)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
    j) 포스포글리세레이트 데히드로게나제 SerA (EC 1.1.1.95)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
    k) 3-포스포세린 포스파타제 SerB (EC 3.1.3.3)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
    l) 3-포스포세린/포스포히드록시트레오닌 아미노트랜스퍼라제 SerC (EC 2.6.1.52)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
    m) 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제 GlyA (EC 2.1.2.1)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
    n) 아스파르토키나제 I 및 호모세린 데히드로게나제 I ThrA (EC 2.7.2.4, EC 1.1.1.3)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
    o) 증진된 아스파르테이트 키나제 효소 활성 또는 아스파르테이트 키나제 LysC (EC 2.7.2.4)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
    p) 호모세린 데히드로게나제 Hom (EC 1.1.1.3)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
    q) 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제 MetX (EC 2.3.1.31)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
    r) 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라제 MetA (EC 2.3.1.46)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
    s) 시스타티오닌 감마-신타제 MetB (EC 2.5.1.48)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
    t) β-C-S-리아제 AecD (EC 4.4.1.8, 또한 베타-리아제로 지칭됨)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
    u) 시스타티오닌 베타-리아제 MetC (EC 4.4.1.8)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
    v) B12-비의존성 호모시스테인 S-메틸트랜스퍼라제 MetE (EC 2.1.1.14)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
    w) B12-의존성 호모시스테인 S-메틸트랜스퍼라제 MetH (EC 2.1.1.13)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
    x) 메틸렌 테트라히드로폴레이트 리덕타제 MetF (EC 1.5.1.20)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
    y) 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)으로부터의 L-메티오닌 엑스포터 BrnFE의 하나 이상의 성분을 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
    z) 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터의 발린 엑스포터 YgaZH (b2682, b2683)의 하나 이상의 성분을 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
    aa) 에스케리키아 콜라이로부터의 추정 수송체 YjeH (b4141)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
    bb) 피리딘 뉴클레오티드 트랜스히드로게나제 PntAB (EC 1.6.1.2)의 하나 이상의 성분을 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
    cc) O-숙시닐호모세린 술프히드릴라제 MetZ (EC 2.5.1.48)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
    dd) 포스포엔올피루베이트 카르복실라제 Pyc (EC 4.1.1.31)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
    ee) 티오술페이트 황-트랜스퍼라제 RDL2 (EC 2.8.1.1)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
    ff) 티오술페이트-티올 황-트랜스퍼라제 (EC 2.8.1.3)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
    gg) 티오술페이트-디티올 황-트랜스퍼라제 (EC 2.8.1.5)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
    hh) 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라제 MetA (EC 2.3.1.46)의 증가된 활성,
    ii) 세린 아세틸트랜스퍼라제 CysE (EC 2.3.1.30)의 증가된 활성,
    jj) L-메티오닌 생합성의 전사 조절제 (MetJ)를 코딩하는 유전자 metJ (b3938, ECK3930)의 감쇠,
    kk) 글루코스-6-포스페이트 이소머라제 (Pgi, EC 번호 5.3.1.9)를 코딩하는 유전자 pgi (b4025, ECK4017)의 감쇠,
    ll) 호모세린 키나제 (ThrB, EC 2.7.1.39)를 코딩하는 유전자 thrB (b0003, ECK0003)의 감쇠
    mm) S-아데노실메티오닌 신타제 (MetK, EC 번호 2.5.1.6)를 코딩하는 유전자 metK (b2942, ECK2937)의 감쇠,
    nn) 디히드로디피콜리네이트 신타제 (DapA, EC 번호 4.2.1.52)를 코딩하는 유전자 dapA (b2478, ECK2474)의 감쇠,
    oo) 포스포엔올피루베이트 카르복시키나제 (Pck, EC 번호 4.1.1.49)를 코딩하는 유전자 pck (b3403, ECK3390)의 감쇠,
    pp) 포르밀테트라히드로폴레이트 히드롤라제 (PurU, EC 번호 3.5.1.10)를 코딩하는 유전자 purU (b1232, ECK1227)의 감쇠,
    qq) 피루베이트 키나제 II (PykA, EC 번호 2.7.1.40)를 코딩하는 유전자 pykA (b1854, ECK1855)의 감쇠,
    rr) 피루베이트 키나제 I (PykF, EC 번호 2.7.1.40)를 코딩하는 유전자 pykF (b1676, ECK1672)의 감쇠,
    ss) L-메티오닌 수송체의 서브유닛 (MetQNI)를 코딩하는 유전자 metQ (b0197, ECK0197)의 감쇠,
    tt) L-메티오닌 수송체의 서브유닛 (MetQNI)를 코딩하는 유전자 metI (b0198, ECK0198)의 감쇠,
    uu) L-메티오닌 수송체의 서브유닛 (MetQNI)를 코딩하는 유전자 metN (b0199, ECK0199)의 감쇠,
    vv) 데옥시시티딘 5'-트리포스페이트 데아미나제 (Dcd, EC 번호 3.5.4.13)를 코딩하는 유전자 dcd (b2065, ECK2059)의 감쇠,
    ww) 추정 N-아실트랜스퍼라제 (YncA, 메타볼릭 익스플로러(Metabolic Explorer) WO2010/020681)를 코딩하는 유전자 yncA (b1448, ECK1442)의 감쇠,
    xx) 시그마 인자 RpoS를 코딩하는 유전자 rpoS (b2741, ECK2736)의 감쇠,
    yy) 조절 단백질 MetJ의 감쇠,
    zz) S-아데노실메티오닌 신타제 MetK의 감쇠
    로 이루어진 군으로부터 선택된 특징 중 하나 이상을 갖는 것을 특징으로 하고, 여기서 "감쇠"는 상응하는 단백질의 활성 또는 농도가 상응하는 단백질에 대해 재조합되지 않은 미생물에서의 상기 단백질의 활성 또는 농도의 0 내지 75%로 저하되는 것을 의미하는 것으로 이해되어야 하며, "과다발현", "증진" 또는 "증가된 활성"은 상응하는 단백질의 활성이 야생형 균주에 비해 적어도 2배 증가하는 것을 의미하는 것으로 이해되어야 하는 것인, 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae) 과의 미생물의 발효에 의한 L-메티오닌 또는 L-메티오닌을 함유하는 사료 첨가제의 생산 방법.
  2. 제1항에 있어서, proP 유전자가 제거된 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, proP 유전자가, ProP 수송체의 활성 또는 농도가 ProP 수송체에 대해 재조합되지 않은 미생물에서의 상기 단백질의 활성 또는 농도의 0 내지 75%로 저하되도록 하는 낮은 수준으로 발현되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물이 L-메티오닌을 과다생산하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물이 L-메티오닌을 배지 중에 축적시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물이 L-메티오닌을 세포 중에 축적시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물이 감쇠된 proP 유전자가 없는 미생물에 비해 증가된 메티오닌 내성을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 엔테로박테리아세아에 과의 미생물이 에스케리키아(Escherichia), 에르위니아(Erwinia), 프로비덴시아(Providencia) 또는 세라티아(Serratia) 속의 박테리아인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 에스케리키아 속의 미생물이 에스케리키아 콜라이인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, proP 유전자가 서열 1에 따른 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 감쇠된 proP 유전자가 하기 돌연변이:
    a. L-류신, L-이소류신 및 L-발린으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산을 코딩하는 트리플렛에 의한 서열 2의 위치 324에서의 L-아르기닌을 코딩하는 트리플렛의 치환;
    b. L-리신, L-아르기닌 및 L-히스티딘으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산을 코딩하는 트리플렛에 의한 서열 2의 위치 467에서의 L-티로신을 코딩하는 트리플렛의 치환;
    c. 정지 코돈을 코딩하는 트리플렛에 의한 서열 2의 위치 412에서의 L-글루탐산을 코딩하는 트리플렛의 치환;
    d. 서열 1의 proP 유전자의 위치 854에서의 핵염기 아데닌의 결실;
    e. 서열 1의 proP 유전자의 위치 1173 내지 위치 1223의 핵염기 중 1개 이상의 결실 또는 위치 1173 내지 위치 1223의 모든 핵염기의 결실;
    f. 서열 1의 proP 유전자의 위치 842에서 핵염기 시토신의 삽입;
    g. 서열 1의 proP 유전자의 위치 973에서 1개 이상의 핵염기(들)의 삽입 또는 위치 973에서 19개 핵염기의 삽입;
    h. 서열 1의 proP 유전자의 위치 183에서 1개 이상의 핵염기(들)의 삽입 또는 위치 183에서 1359개 핵염기의 삽입
    중 하나 이상을 서열 1의 폴리뉴클레오티드 상에 갖는 폴리뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 발효가 무기 황 공급원을 함유하는 배지 중에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, L-메티오닌이 수득된 발효 브로쓰 중에 축적되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, L-메티오닌이 추가로 단리, 수집, 또는 정제되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, L-메티오닌이 발효 브로쓰 또는 바이오매스 또는 둘 다로부터의 성분과 함께 단리되거나 또는 수집되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. L-메티오닌을 생산하는 것을 특징으로 하며, 추가로,
    a) 티오술페이트/술페이트 수송 시스템 CysPUWA (EC 3.6.3.25)의 하나 이상의 성분을 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
    b) 3'-포스포아데노신 5'-포스포술페이트 리덕타제 CysH (EC 1.8.4.8)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
    c) 술파이트 리덕타제 CysJI (EC 1.8.1.2)의 하나 이상의 성분을 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
    d) 시스테인 신타제 A CysK (EC 2.5.1.47)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
    e) 시스테인 신타제 B CysM (EC 2.5.1.47)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
    f) 세린 아세틸트랜스퍼라제 CysE (EC 2.3.1.30)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
    g) 글리신 절단 시스템 GcvTHP-Lpd (EC 2.1.2.10, EC 1.4.4.2, EC 1.8.1.4)의 하나 이상의 성분을 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
    h) 리포일 신타제 LipA (EC 2.8.1.8)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
    i) 리포일 단백질 리가제 LipB (EC 2.3.1.181)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
    j) 포스포글리세레이트 데히드로게나제 SerA (EC 1.1.1.95)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
    k) 3-포스포세린 포스파타제 SerB (EC 3.1.3.3)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
    l) 3-포스포세린/포스포히드록시트레오닌 아미노트랜스퍼라제 SerC (EC 2.6.1.52)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
    m) 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제 GlyA (EC 2.1.2.1)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
    n) 아스파르토키나제 I 및 호모세린 데히드로게나제 I ThrA (EC 2.7.2.4, EC 1.1.1.3)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
    o) 증진된 아스파르테이트 키나제 효소 활성 또는 아스파르테이트 키나제 LysC (EC 2.7.2.4)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
    p) 호모세린 데히드로게나제 Hom (EC 1.1.1.3)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
    q) 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제 MetX (EC 2.3.1.31)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
    r) 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라제 MetA (EC 2.3.1.46)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
    s) 시스타티오닌 감마-신타제 MetB (EC 2.5.1.48)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
    t) β-C-S-리아제 AecD (EC 4.4.1.8, 또한 베타-리아제로 지칭됨)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
    u) 시스타티오닌 베타-리아제 MetC (EC 4.4.1.8)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
    v) B12-비의존성 호모시스테인 S-메틸트랜스퍼라제 MetE (EC 2.1.1.14)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
    w) B12-의존성 호모시스테인 S-메틸트랜스퍼라제 MetH (EC 2.1.1.13)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
    x) 메틸렌 테트라히드로폴레이트 리덕타제 MetF (EC 1.5.1.20)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
    y) 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터의 L-메티오닌 엑스포터 BrnFE의 하나 이상의 성분을 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
    z) 에스케리키아 콜라이로부터의 발린 엑스포터 YgaZH (b2682, b2683)의 하나 이상의 성분을 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
    aa) 에스케리키아 콜라이로부터의 추정 수송체 YjeH (b4141)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
    bb) 피리딘 뉴클레오티드 트랜스히드로게나제 PntAB (EC 1.6.1.2)의 하나 이상의 성분을 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
    cc) O-숙시닐호모세린 술프히드릴라제 MetZ (EC 2.5.1.48)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
    dd) 포스포엔올피루베이트 카르복실라제 Pyc (EC 4.1.1.31)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
    ee) 티오술페이트 황-트랜스퍼라제 RDL2 (EC 2.8.1.1)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
    ff) 티오술페이트-티올 황-트랜스퍼라제 (EC 2.8.1.3)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
    gg) 티오술페이트-디티올 황-트랜스퍼라제 (EC 2.8.1.5)를 코딩하는 과다발현된 폴리뉴클레오티드,
    hh) 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라제 MetA (EC 2.3.1.46)의 증가된 활성,
    ii) 세린 아세틸트랜스퍼라제 CysE (EC 2.3.1.30)의 증가된 활성,
    jj) L-메티오닌 생합성의 전사 조절제 (MetJ)를 코딩하는 유전자 metJ (b3938, ECK3930)의 감쇠,
    kk) 글루코스-6-포스페이트 이소머라제 (Pgi, EC 번호 5.3.1.9)를 코딩하는 유전자 pgi (b4025, ECK4017)의 감쇠,
    ll) 호모세린 키나제 (ThrB, EC 2.7.1.39)를 코딩하는 유전자 thrB (b0003, ECK0003)의 감쇠
    mm) S-아데노실메티오닌 신타제 (MetK, EC 번호 2.5.1.6)를 코딩하는 유전자 metK (b2942, ECK2937)의 감쇠,
    nn) 디히드로디피콜리네이트 신타제 (DapA, EC 번호 4.2.1.52)를 코딩하는 유전자 dapA (b2478, ECK2474)의 감쇠,
    oo) 포스포엔올피루베이트 카르복시키나제 (Pck, EC 번호 4.1.1.49)를 코딩하는 유전자 pck (b3403, ECK3390)의 감쇠,
    pp) 포르밀테트라히드로폴레이트 히드롤라제 (PurU, EC 번호 3.5.1.10)를 코딩하는 유전자 purU (b1232, ECK1227)의 감쇠,
    qq) 피루베이트 키나제 II (PykA, EC 번호 2.7.1.40)를 코딩하는 유전자 pykA (b1854, ECK1855)의 감쇠,
    rr) 피루베이트 키나제 I (PykF, EC 번호 2.7.1.40)를 코딩하는 유전자 pykF (b1676, ECK1672)의 감쇠,
    ss) L-메티오닌 수송체의 서브유닛 (MetQNI)를 코딩하는 유전자 metQ (b0197, ECK0197)의 감쇠,
    tt) L-메티오닌 수송체의 서브유닛 (MetQNI)를 코딩하는 유전자 metI (b0198, ECK0198)의 감쇠,
    uu) L-메티오닌 수송체의 서브유닛 (MetQNI)를 코딩하는 유전자 metN (b0199, ECK0199)의 감쇠,
    vv) 데옥시시티딘 5'-트리포스페이트 데아미나제 (Dcd, EC 번호 3.5.4.13)를 코딩하는 유전자 dcd (b2065, ECK2059)의 감쇠,
    ww) 추정 N-아실트랜스퍼라제 (YncA, 메타볼릭 익스플로러 WO2010/020681)를 코딩하는 유전자 yncA (b1448, ECK1442)의 감쇠,
    xx) 시그마 인자 RpoS를 코딩하는 유전자 rpoS (b2741, ECK2736)의 감쇠,
    yy) 조절 단백질 MetJ의 감쇠,
    zz) S-아데노실메티오닌 신타제 MetK의 감쇠
    로 이루어진 군으로부터 선택된 특징 중 하나 이상을 갖는 것을 특징으로 하고, 여기서 "감쇠"는 상응하는 단백질의 활성 또는 농도가 상응하는 단백질에 대해 재조합되지 않은 미생물에서의 상기 단백질의 활성 또는 농도의 0 내지 75%로 저하되는 것을 의미하는 것으로 이해되어야 하며, "과다발현", "증진" 또는 "증가된 활성"은 상응하는 단백질의 활성이 야생형 균주에 비해 적어도 2배 증가하는 것을 의미하는 것으로 이해되어야 하는 것인, 감쇠된 proP 유전자를 보유하는 엔테로박테리아세아에 과의 미생물.
  17. 제16항에 있어서, L-메티오닌을 배지로 분비하는 것을 특징으로 하는, 미생물.
  18. 제16항에 있어서, L-메티오닌을 세포 중에 축적시키는 것을 특징으로 하는 미생물.
  19. 제16항 또는 제17항에 있어서, L-메티오닌을 배지 중에 축적시키는 것을 특징으로 하는 미생물.
  20. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, proP 유전자가 제거된 것을 특징으로 하는 미생물.
  21. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, proP 유전자가, ProP 수송체의 활성 또는 농도가 ProP 수송체에 대해 재조합되지 않은 미생물에서의 상기 단백질의 활성 또는 농도의 0 내지 75%로 저하되도록 하는 낮은 수준으로 발현되는 것을 특징으로 하는 미생물.
  22. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, L-메티오닌을 과다생산하는 것을 특징으로 하는 미생물.
  23. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 감쇠된 proP 유전자가 없는 미생물에 비해 증가된 메티오닌 내성을 갖는 것을 특징으로 하는 미생물.
  24. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 엔테로박테리아세아에 과의 미생물이 에스케리키아, 에르위니아, 프로비덴시아 또는 세라티아 속의 박테리아인 것을 특징으로 하는 미생물.
  25. 제24항에 있어서, 에스케리키아 속의 미생물이 에스케리키아 콜라이인 것을 특징으로 하는 미생물.
  26. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, proP 유전자가 서열 1에 따른 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 미생물.
  27. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 감쇠된 proP 유전자가 하기 돌연변이:
    a. L-류신, L-이소류신 및 L-발린으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산을 코딩하는 트리플렛에 의한 서열 2의 위치 324 또는 아미노산 서열의 대등한 위치에서의 L-아르기닌을 코딩하는 트리플렛의 치환;
    b. L-리신, L-아르기닌 및 L-히스티딘으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산을 코딩하는 트리플렛에 의한 서열 2의 위치 467 또는 아미노산 서열의 대등한 위치에서의 L-티로신을 코딩하는 트리플렛의 치환;
    c. 정지 코돈을 코딩하는 트리플렛에 의한 서열 2의 위치 412 또는 아미노산 서열의 대등한 위치에서의 L-글루탐산을 코딩하는 트리플렛의 치환;
    d. 서열 1의 proP 유전자의 위치 854에서의 핵염기 아데닌의 결실;
    e. 서열 1의 proP 유전자의 위치 1173 내지 위치 1223의 핵염기 중 1개 이상의 결실 또는 위치 1173 내지 위치 1223의 모든 핵염기의 결실;
    f. 서열 1의 proP 유전자의 위치 842에서 핵염기 시토신의 삽입;
    g. 서열 1의 proP 유전자의 위치 973에서 1개 이상의 핵염기(들)의 삽입 또는 위치 973에서 19개 핵염기의 삽입;
    h. 서열 1의 proP 유전자의 위치 183에서 1개 이상의 핵염기(들)의 삽입 또는 위치 183에서 1359개 핵염기의 삽입
    중 하나 이상을 서열 1의 폴리뉴클레오티드 상에 갖는 폴리뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 미생물.
  28. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, ThrA 아스파르테이트 키나제/호모세린 데히드로게나제의 증가된 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 미생물.
  29. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, MetA 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라제 또는 CysE 세린 아세틸트랜스퍼라제 또는 둘 다의 증가된 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 미생물.
  30. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, L-메티오닌 생합성의 MetJ 전사 조절제 또는 MetK S-아데노실메티오닌 신타제 또는 둘 다의 감소된 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 미생물.
  31. a. L-류신, L-이소류신 및 L-발린으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산을 코딩하는 트리플렛에 의한 서열 2의 위치 324에서의 L-아르기닌을 코딩하는 트리플렛의 치환;
    b. L-리신, L-아르기닌 및 L-히스티딘으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산을 코딩하는 트리플렛에 의한 서열 2의 위치 467에서의 L-티로신을 코딩하는 트리플렛의 치환;
    c. 정지 코돈을 코딩하는 트리플렛에 의한 서열 2의 위치 412에서의 L-글루탐산을 코딩하는 트리플렛의 치환;
    d. 서열 1의 proP 유전자의 위치 854에서의 핵염기 아데닌의 결실;
    e. 서열 1의 proP 유전자의 위치 1173 내지 위치 1223의 핵염기 중 1개 이상의 결실 또는 위치 1173 내지 위치 1223의 모든 핵염기의 결실;
    f. 서열 1의 proP 유전자의 위치 842에서 핵염기 시토신의 삽입;
    g. 서열 1의 proP 유전자의 위치 973에서 1개 이상의 핵염기(들)의 삽입 또는 위치 973에서 19개 핵염기의 삽입;
    h. 서열 1의 proP 유전자의 위치 183에서 1개 이상의 핵염기(들)의 삽입 또는 위치 183에서 1359개 핵염기의 삽입
    으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 서열 1의 폴리뉴클레오티드 상에 갖는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  32. 제31항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  33. a. L-류신, L-이소류신 및 L-발린으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의한 서열 2의 위치 324에서의 L-아르기닌의 치환;
    b. L-리신, L-아르기닌 및 L-히스티딘으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의한 서열 2의 위치 467에서의 L-티로신의 치환;
    c. 서열 2의 위치 392 내지 위치 408의 17개 아미노산의 결실;
    d. 서열 2의 서열에 기초하여 C 말단의 최대 420개 아미노산의 결실 또는 서열 2의 아미노산 서열의 C 말단의 88, 163, 202, 212 또는 420개 아미노산의 결실
    로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 서열 2의 폴리펩티드 상에 갖는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  34. 제31항에 따른 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 제33항에 따른 폴리펩티드 중 하나 이상을 보유하는 재조합 미생물.
  35. a. L-메티오닌을 생산할 수 있는 엔테로박테리아세아에 과의 미생물을 증가된 메티오닌 내성에 대해 스크리닝하는 단계;
    b. a)에서 생성된 돌연변이체를 단리하고 증식시키는 단계;
    c. b)에서 수득한 돌연변이체로부터 핵산을 제공하는 단계;
    d. c)로부터의 핵산, 및 서열 38의 뉴클레오티드 서열의 위치 1 내지 위치 1000 중의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 제1 프라이머 및 서열 38의 상보적 뉴클레오티드 서열의 위치 2504 내지 위치 3503 중의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 제2 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍으로부터 시작하여, 폴리머라제 연쇄 반응을 이용함으로써 핵산 분자를 제조하는 단계;
    e. d)에서 수득한 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열을 결정하고, 코딩한 아미노산 서열을 결정하는 단계;
    f. e)에서 결정된 아미노산 서열을 서열 2와 비교하는 단계; 및
    g. 수득한 proP 돌연변이체를 확인하는 단계
    를 포함하는, L-메티오닌을 개선된 방식으로 생산할 수 있으며 감쇠된 proP 유전자를 보유하는 엔테로박테리아세아에 과의 미생물을 확인하는 방법.
  36. 삭제
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Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3280794B1 (en) 2015-04-07 2020-05-27 Metabolic Explorer A modified microorganism for the optimized production of 2,4-dihydroxyburyrate with enhanced 2,4-dihydroxybutyrate efflux
WO2017082866A1 (en) * 2015-11-10 2017-05-18 Hebert Freddie System and method for producing a comestible protein meal and fuel from a feedstock
KR101756338B1 (ko) * 2016-01-15 2017-07-10 고려대학교 산학협력단 L-시스테인 생산용 변이미생물 및 이를 이용한 l-시스테인의 제조방법
KR102430878B1 (ko) 2016-07-08 2022-08-09 메타볼릭 익스플로러 당 포스포트랜스퍼라제 시스템 (pts)을 코딩하는 유전자를 포함하는 미생물에 의한 관심 분자의 발효적 생산을 위한 방법
WO2018091525A1 (en) 2016-11-15 2018-05-24 Danmarks Tekniske Universitet Bacterial cells with improved tolerance to diacids
CN110129294B (zh) * 2018-02-02 2021-12-24 中国科学院天津工业生物技术研究所 高丝氨酸乙酰基转移酶突变体及其宿主细胞和应用
CN109055417B (zh) * 2018-08-28 2020-07-07 浙江新和成股份有限公司 一种重组微生物、其制备方法及其在生产辅酶q10中的应用
JP7301220B2 (ja) 2019-08-30 2023-06-30 エイチイエム ファーマ インコーポレイテッド Ｐｍａｓ方法を利用したパーソナライズ腸内環境改善物質スクリーニング方法
KR102124474B1 (ko) * 2019-08-30 2020-06-19 주식회사 에이치이엠 Pmas방법을 이용한 개인 맞춤형 장내 환경 개선 물질 스크리닝 방법
CN112779202B (zh) * 2021-01-18 2022-10-11 江南大学 一种敲除基因proP和proVWX高产苏氨酸的工程菌及其应用
KR20230042953A (ko) * 2021-09-23 2023-03-30 씨제이제일제당 (주) 고농도 l-글루탐산을 생산하기 위한 균주 및 이를 이용한 l-글루탐산 생산방법
CN114410628A (zh) * 2021-12-20 2022-04-29 华南理工大学 抗酸表达盒与应用以及高通量筛选用于微生物发酵的抗胁迫表达盒的方法
KR20230123543A (ko) * 2022-02-16 2023-08-24 대상 주식회사 시그마 38 신규 변이체 및 이를 이용한 l-방향족 아미노산 생산 방법
KR20230139598A (ko) * 2022-03-28 2023-10-05 씨제이제일제당 (주) O-아세틸 호모세린 생산 미생물 및 이를 이용한 o-아세틸 호모세린 또는 l-메치오닌 생산 방법

Family Cites Families (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS54105293A (en) 1978-02-01 1979-08-18 Ajinomoto Co Inc Preparation of l-proline by fermentation
US4601893A (en) 1984-02-08 1986-07-22 Pfizer Inc. Laminate device for controlled and prolonged release of substances to an ambient environment and method of use
EP0158940B1 (en) 1984-04-04 1991-12-11 Ajinomoto Co., Inc. Transducible composite plasmid
FR2665711B1 (fr) 1990-08-08 1993-08-13 Centre Nat Rech Scient Integron de corynebacterie, procede de transformation d'une corynebacterie par ledit integron et corynebacterie obtenue.
DE4027453A1 (de) 1990-08-30 1992-03-05 Degussa Neue plasmide aus corynebacterium glutamicum und davon abgeleitete plasmidvektoren
JP3023615B2 (ja) 1990-08-30 2000-03-21 協和醗酵工業株式会社 発酵法によるｌ―トリプトファンの製造法
DE4130867A1 (de) 1991-09-17 1993-03-18 Degussa Verfahren zur fermentativen herstellung von aminosaeuren
DE69219775T3 (de) 1992-10-14 2004-08-05 Ajinomoto Co., Inc. Neuartiges L-threoninproduzierendes Mikrobakterium und eine Herstellungsmethode für L-Threonin
JP3369231B2 (ja) 1992-12-03 2003-01-20 協和醗酵工業株式会社 芳香族アミノ酸の製造法
DE4440118C1 (de) 1994-11-11 1995-11-09 Forschungszentrum Juelich Gmbh Die Genexpression in coryneformen Bakterien regulierende DNA
FR2736066B1 (fr) 1995-06-30 1998-11-20 Ajinomoto Kk Procede d'amplification d'un gene par transposon artificiel, bacterie coryneforme obtenue par ce procede et procede de production d'un acide amine a l'aide de cette bacterie
DE19547361A1 (de) 1995-12-19 1997-06-26 Degussa Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren durch Fermentation
US5939307A (en) 1996-07-30 1999-08-17 The Archer-Daniels-Midland Company Strains of Escherichia coli, methods of preparing the same and use thereof in fermentation processes for l-threonine production
JP4075087B2 (ja) 1996-12-05 2008-04-16 味の素株式会社 Ｌ−リジンの製造法
JPH10229891A (ja) 1997-02-20 1998-09-02 Mitsubishi Rayon Co Ltd マロン酸誘導体の製造法
EP1115152A4 (en) 1997-07-18 2001-08-29 Hitachi Chemical Co Ltd PUNCHED ADHESIVE TAPE FOR SEMICONDUCTORS, PRODUCTION METHOD OF A LADDER FRAME WITH SUCH ADHESIVE TAPE, LADDER FRAME WITH ADHESIVE TAPE AND SEMICONDUCTOR ARRANGEMENT WITH ONE LADDER FRAME
DE10031999A1 (de) 1999-09-09 2001-04-19 Degussa Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure unter Verwendung coryneformer Bakterien
DE19949579C1 (de) 1999-10-14 2000-11-16 Consortium Elektrochem Ind Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Cystein oder L-Cystein-Derivaten
JP2002183354A (ja) 2000-12-18 2002-06-28 Yamaha Corp コンテンツ配信システムおよびコンテンツ配信方法およびコンピュータプログラムを記憶した記憶媒体およびコンピュータプログラム
AU2002355462A1 (en) 2001-08-06 2003-02-24 Degussa Ag Coryneform bacteria which produce chemical compounds ii
CA2455878A1 (en) 2001-08-06 2003-05-15 Degussa Ag Production of l-lysine by genetically modified corynebacterium glutamicum strains
US7319026B2 (en) 2002-03-07 2008-01-15 Degussa Ag Amino acid-producing bacteria and a process for preparing L-amino acids
DE10305774A1 (de) 2003-02-06 2004-08-26 Consortium für elektrochemische Industrie GmbH Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Methionin
KR100608084B1 (ko) * 2004-02-05 2006-08-02 씨제이 주식회사 ｉｃｌＲ 유전자가 불활성화된 Ｌ-쓰레오닌을 생산하는 미생물, 그를 제조하는 방법 및 그를 이용한 Ｌ-쓰레오닌의 제조방법
DE102004009454A1 (de) * 2004-02-27 2005-09-15 Degussa Ag Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von rekombinanten Mikroorganismen
KR100651220B1 (ko) 2004-06-29 2006-11-29 씨제이 주식회사 Ｌ-메씨오닌 생산 균주 및 상기 균주를 이용한ｌ-메씨오닌의 생산방법
JP5172697B2 (ja) 2006-01-04 2013-03-27 メタボリック エクスプローラー 硫酸透過酵素の発現が増強された微生物を用いてメチオニンおよびその前駆体ホモセリンまたはスクシニルホモセリンを製造するための方法
RU2312894C1 (ru) 2006-02-16 2007-12-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ГЕН leuO
ES2575906T3 (es) 2007-04-11 2016-07-04 Cj Cheiljedang Corporation Composiciones y métodos de producir metionina
WO2009043372A1 (en) * 2007-10-02 2009-04-09 Metabolic Explorer Increasing methionine yield
KR101620651B1 (ko) 2008-08-20 2016-05-12 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이. 다공성 실리카 유리 상에 팔라듐을 포함하는 신규의 선택적 수소화 촉매 및 이의 용도
WO2010020290A1 (en) 2008-08-22 2010-02-25 Metabolic Explorer Producing methionine without n-acetyl methionine
EP2479279A1 (de) 2011-01-20 2012-07-25 Evonik Degussa GmbH Verfahren zur fermentativen Herstellung schwefelhaltiger Aminosäuren

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Journal of Bacteriology (1995) 177(1):144-151
PLoS Biology (2004) 2(11):e336
Progress in Biophysics & Molecular Biology (1991) 56(3):145-185

Also Published As

Publication number Publication date
EP2700715A1 (de) 2014-02-26
PL2700715T3 (pl) 2019-03-29
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JP2015525576A (ja) 2015-09-07
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CN104812906B (zh) 2019-09-06
WO2014029592A1 (de) 2014-02-27
KR20150041803A (ko) 2015-04-17
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RU2015109636A (ru) 2016-10-10
ES2689754T3 (es) 2018-11-15
US20150353973A1 (en) 2015-12-10
EP2700715B1 (de) 2018-07-25

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