CN117106836A - 磷脂酰甘油磷酸酶编码基因在发酵生产胞苷中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了磷脂酰甘油磷酸酶编码基因在发酵生产胞苷中的应用，借助CRISPRi技术对胞苷生产菌株中可能存在的非胞苷代谢途径中的潜在靶点基因进行筛选，筛选出影响胞苷合成的非胞苷代谢途径的有效抑制靶点pgpA、pgpB、pgpC。基于抑制或敲除新靶点pgpA、pgpB、pgpC构建的胞苷生产菌株及利用其发酵生产胞苷的方法，突破了传统理性化分子改造的局限性，为发酵生产胞苷提供了新思路。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程及发酵工程技术领域，具体地，涉及一株胞苷生产菌株的基因工程改造以及利用其发酵生产胞苷的方法。
背景技术
胞苷（Cytidine），又名胞嘧啶核苷，是人体和动植物体内RNA的结构组成部分，具有多种生理活性，在化妆品、食品、保健品和医药等诸多行业具有广泛应用。因此，随着胞苷的市场需求不断扩大，开发一种廉价的可规模化应用的生产工艺十分迫切。
目前，胞苷的生产主要有三种方法：化学合成法、RNA酶水解法和微生物发酵生产法。其中化学合成法主要以胞嘧啶或尿苷为原料通过催化反应生产胞苷，但因反应条件苛刻、环境污染严重等问题存在一定局限性。RNA酶水解法合成胞苷则对原料具有较高的要求，并且存在工艺繁琐、成本较高等问题。利用微生物发酵法生产胞苷又分为添加前体物发酵法和直接发酵法，添加前体尿嘧啶在一定条件下可生产得到胞苷，但前体物质昂贵且产率较低；相比之下，微生物直接发酵法因其具有成本低、工艺简单、环境友好、适合批量生产等优点，更具吸引力和发展前景。
自然条件下能够合成胞苷的微生物种类主要包括大肠杆菌和枯草芽孢杆菌，但天然菌株合成胞苷的产量较低，无法满足大规模生产的需求。近些年来，为提高胞苷产量，常采用传统诱变的方法以及通过微生物代谢工程改造手段对胞苷生产菌株进行基因工程改造。但是，传统诱变的方法具有不确定性强、工作量大等缺陷。另外，由于微生物合成产物的过程中需要协调多个代谢中间物和代谢反应，而这些物质和反应同时还处于更加复杂庞大的细胞相互作用网络中，因此基于代谢工程的理性分子改造往往难以达到预期，具有一定的局限性。综上，目前胞苷的大规模工业提产依然存在瓶颈，有必要寻找突破胞苷代谢途径的新靶点，以期改善发酵法生产胞苷的产量和转化率等重要生产指标。
CRISPR干扰（CRISPR interference，CRISPRi）技术通过dCas9-sgRNA 复合物与目标DNA的靶向结合形成空间位阻抑制目标DNA的转录，形成对目标基因表达的抑制。该技术可用于快速筛选有益的敲低基因靶点，通常用于改善大肠杆菌和许多其他微生物宿主中所需产物的生物合成，作为一种很有前途的基因调控工具，为理性改造复杂的细胞代谢网络提供额外的潜在基因靶点，以增强所需产物的生物合成。
发明内容
为了打破对胞苷生产菌株进行理性化分子改造所存在的局限性，同时也为了解决目前微生物直接发酵法生产胞苷的转化率和产量较低等问题，本发明借助CRISPRi技术对胞苷生产菌株中可能存在的非胞苷代谢途径中的潜在靶点基因进行筛选，选择碳代谢模块中的26个基因作为目标基因，利用CRISPRi系统构建筛选体系，筛选出影响胞苷合成的非胞苷代谢途径的有效抑制靶点pgpA，pgpB和pgpC。pgpA、pgpB、pgpC这三个基因分别编码磷脂酰甘油磷酸酶A、磷脂酰甘油磷酸酶B、磷脂酰甘油磷酸酶C，催化磷脂酰甘油磷酸（PGP）转化为磷脂酰甘油（PG），目前的研究均不能揭示或预测其与胞苷的生产和代谢之间的关联性。
将大肠杆菌的pgpA、pgpB、pgpC基因分别抑制或敲除后得到的突变菌株-ΔpgpA、突变菌株-ΔpgpB、突变菌株-ΔpgpC，其发酵生产胞苷的产量和转化率均得到较大提高。基于抑制或敲除筛选出的新靶点pgpA、pgpB、pgpC构建的胞苷生产菌株及利用其发酵生产胞苷的方法，突破了传统的理性化分子改造的局限性，为发酵法生产胞苷提供了新的思路。
本发明提供一种抑制或敲除磷脂酰甘油磷酸酶编码基因用于改造微生物的用途，其特征在于促进胞苷的生产。
本发明还提供一种通过抑制或敲除磷脂酰甘油磷酸酶编码基因促进微生物发酵生产胞苷的方法。
所述磷脂酰甘油磷酸酶编码基因选自pgpA、pgpB、pgpC。
所述微生物选自大肠杆菌或枯草芽孢杆菌。
所述pgpA编码磷脂酰甘油磷酸酶A，UniProt ID：P18200；所述pgpB编码磷脂酰甘油磷酸酶B，UniProt ID：P0A924；所述pgpC编码磷脂酰甘油磷酸酶C，UniProt ID：P0AD42。
本发明还提供一种用于发酵生产胞苷的突变菌株，其是将大肠杆菌的磷脂酰甘油磷酸酶编码基因抑制或敲除后而得到的，所述磷脂酰甘油磷酸酶编码基因选自pgpA、pgpB、pgpC。
上述突变菌株中，优选对pgpA、pgpB、pgpC进行敲除而得到。
所述pgpA编码磷脂酰甘油磷酸酶A，UniProt ID：P18200；所述pgpB编码磷脂酰甘油磷酸酶B，UniProt ID：P0A924；所述pgpC编码磷脂酰甘油磷酸酶C，UniProt ID：P0AD42。
本发明还提供一种发酵生产胞苷的方法，使用上述突变菌株发酵制备胞苷。
本发明提供一种磷脂酰甘油磷酸酶编码基因在利用大肠杆菌发酵生产胞苷中的应用，所述磷脂酰甘油磷酸酶编码基因选自大肠杆菌基因pgpA、pgpB、pgpC。
所述pgpA为来源于大肠杆菌（Escherichia coli）的磷脂酰甘油磷酸酶A（UniProtID：P18200）的编码基因；所述pgpB为来源于大肠杆菌（Escherichia coli）的磷脂酰甘油磷酸酶B（UniProt ID：P0A924）的编码基因；所述pgpC为来源于大肠杆菌（Escherichia coli）的磷脂酰甘油磷酸酶C（UniProt ID：P0AD42）的编码基因。
上述发酵生产胞苷的方法，具体地以上述突变菌株作为生产菌株，先进行种子培养，再接种到发酵罐中进行胞苷发酵培养。
所述种子培养，接种量为7-10％，培养温度为35-40℃，pH控制在6.5-7.5，溶氧控制在20-40％，残糖控制在0.1-0.3％，培养周期为8-16 h。
所述发酵罐中胞苷发酵培养，接种量为10-15％，培养温度为35-40℃，pH控制在6.5-7.5，溶氧控制在20-40％，残糖控制在0.1-0.3％，发酵周期为60-70h。
所述种子培养基组成为：葡萄糖20-40 g/L、磷酸二氢钾1-5 g/L、酵母浸粉2-10g/L、蛋白胨1-5 g/L、硫酸铵1-5 g/L、柠檬酸1-5 g/L、硫酸镁0.5-1 g/L、七水合硫酸亚铁10-30 mg/L、一水合硫酸锰1-5 mg/L、VB1 0.5-3 mg/L、VH1-5 mg/L、氯化钴1-5 mg/L、硫酸锌1-5 mg/L、消泡剂0.1-1 mL/L、Amp 20-100 µg/mL。
所述发酵罐发酵培养基组成为：葡萄糖10-30 g/L、磷酸氢二钾5-10 g/L、酵母浸粉2-6 g/L、蛋白胨2-10 g/L、硫酸铵2-6 g/L、玉米浆2-8 g/L、柠檬酸1-5 g/L、硫酸镁1-3g/L、七水合硫酸亚铁40-10 mg/L、一水合硫酸锰5-15 mg/L、VB1 0.5-3 mg/L、VH1-5 mg/L、氯化钴1-5 mg/L、硫酸锌1-5 mg/L、硫酸铜0.2-1 mg/L、氯化钙2-6 mg/L、消泡剂0.1-1 mL/L、Amp 20-100 µg/mL。
附图说明
图1 本发明实施例3中26个携带不同sgRNA的菌株摇瓶发酵测试结果
图2 本发明实施例4中突变菌株摇瓶发酵测试结果
图3 本发明实施例5中突变菌株发酵罐发酵测试结果
图4 本发明实施例5中突变菌株发酵罐测试的最终胞苷产量及转化率结果
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步详细阐述本发明。凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件。
表1. 本发明使用及构建的质粒
表2. 本发明使用及构建的菌株
表3. 本发明构建质粒及基因编辑所用引物
实施例1：基础胞苷生产菌株的构建
按照参考文献（Yang K , Li Z .Multistep construction of metabolicallyengineered Escherichia coli for enhanced cytidine biosynthesis[J].Biochemical Engineering Journal, 2019, 154:107433. DOI:10.1016/j.bej.2019.107433.）中所记载的工程菌株CR023（pTrc03）的构建方法，以大肠杆菌Bw25113代替所述文献中的大肠杆菌MG1655作为起始菌株，敲除基因cdd、udk、rihA、rihC、umpH/umpG，构建并转入过表达质粒pTrc99a-pyrE-nudG-ScPHM8-Ptrc-pyrH m-CgpyrG 3m，得到基础胞苷生产菌株，记为T1。
实施例2：CRISPRi系统的构建
（1）T1电转感受态细胞的制备
从LB固体平板培养基（Amp，50 µg/mL）中挑取长势良好的T1单菌落，接种到5 mL的LB液体培养基（Amp，50 µg/mL），于37 ℃摇床过夜活化。次日吸取1 mL过夜培养的菌液接种到装有100mL LB液体培养基（Amp，50 µg/mL）的500 mL锥形瓶中，培养至OD600为0.4-0.6。将菌液在冰上预冷20 min，然后在离心机中4 ℃、4200 rpm离心10min收集菌体，并用预冷的16%甘油反复重悬清洗2-3次，最后加入1 mL预冷的16%甘油溶液，吹吸重悬菌体，并分装100µL／管，液氮速冻，于-80 ℃保存备用。
（2）辅助质粒p15AK-dCas9的转化及筛选
将携带有dCas9基因的辅助质粒p15AK-dCas9电转化至步骤（1）制备好的T1感受态细胞中，并涂布于LB固体平板培养基（Amp，50 µg/mL；Kan，50 µg/mL），在37 ℃培养箱过夜培养。次日，挑取单菌落并使用引物dCas9-JD-F和dCas9-JD-R进行菌落PCR验证。活化菌落PCR验证结果正确的单菌落并用甘油管保藏菌株，记为T1（p15AK-dCas9）；同样地，将空质粒p15AK电转化至T1感受态细胞中，筛选阳性克隆并用甘油管保藏菌株，记为T1（p15AK）。
（3）sgRNA质粒的构建
选取26个碳代谢模块相关的靶点基因：gpsA、glpK、plsX、plsY、plsB、plsC、cdsA、ynbB、pgsA、pgpA、pgpB、pgpC、glpX、fbp、pfkA、lpxC、tktA、gloA、gloB、ldhA、dld、pykF、poxB、ybiw、pflB、tdcE。以质粒pLSG为模板，利用表2中相应引物（SEQ ID NO:4-79）进行PCR扩增以获得含有抑制上述26个靶点所用sgRNA序列的片段，然后通过Gibson组装的方式构建26个靶点基因各自相应的sgRNA表达质粒，记为pLSG-sgRNA。
PCR反应体系及参数均参照Takara PrimerSTAR Max DNA Polymerase使用说明书，反应程序：98 ℃预变性3 min；98 ℃变性30 s，55 ℃退火15 s，75 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃延伸10 min；PCR产物回收后参照2×Hieff Clone Universal Enzyme Premix使用说明书进行Gibson法组装，反应程序：50 ℃，30 min。将Gibson组装产物转化至购买的DH5α感受态细胞中（转化方法参照商用DH5α感受态细胞的使用说明书），并在LB固体平板培养基（Cm，50 µg/mL）中进行筛选。使用pLSG-JD-F和pLSG-JD-R引物进行菌落PCR验证，并将PCR产物送出测序，活化测序结果正确的单菌落并进行质粒提取，质粒提取方法均参照FastPure Plasmid Mini Kit试剂盒使用说明书。
实施例3：利用CRISPRi系统识别大肠杆菌碳代谢相关的高产胞苷靶点
（1）发酵菌株制备
将实施例2获得的26个sgRNA表达质粒pLSG-sgRNA分别电转化至T1（p15AK-dCas9）中（电转化感受态细胞的制备及转化参照实施例2），并涂布于LB固体平板培养基（Cm，34 µg/mL；Kan，50 µg/mL；Amp，50 µg/mL）中进行筛选。挑取单菌落并使用引物pLSG-JD-F和pLSG-JD-R进行菌落PCR验证，挑选结果正确的26个单菌落进行活化并用甘油管保藏菌株，记为T1-sgRNA；同样地，将空质粒pLSG电转化至上述对照菌株T1（p15AK）感受态细胞中，筛选阳性克隆并用甘油管保藏菌株，记为T1（p15AK-pLSG）。
（2）摇瓶发酵测试
①从-80℃冰箱取出步骤（1）保藏的菌株，先在LB固体平板培养基（Cm，34 µg/mL；Kan，50 µg/mL；Amp，50 µg/mL）中划线培养。然后挑取长势良好的单菌落若干接种于LB液体培养基（Cm，34 µg/mL；Kan，50 µg/mL；Amp，50 µg/mL）中于37 ℃摇床过夜培养。
②次日，将过夜活化的种子液接种于含20 mL胞苷发酵培养基的100 mL摇瓶中，使得摇瓶培养基的初始OD600=0.1，然后将摇瓶放至37 ℃，220 rpm摇床进行培养，培养至OD600=0.8-1时添加150 mg/L IPTG和2 g/L阿拉伯糖继续诱导培养20小时左右。
胞苷发酵培养基组成：葡萄糖10 g/L、磷酸二氢钾2 g/L、酵母浸粉4 g/L、蛋白胨2g/L、硫酸铵3 g/L、七水合硫酸镁1.5 g/L、七水合硫酸亚铁20 mg/L、一水合硫酸锰5 mg/L、VB1 1 mg/L、VH0.5 mg/L、氯化钴2 mg/L、硫酸锌2 mg/L、氯化钙10 mg/L以及相应抗生素（Cm，34 µg/mL；Kan，50 µg/mL；Amp，50 µg/mL）。
③培养结束后，取发酵液用离心机离心并取上清液，用高效液相色谱测定发酵液中胞苷的含量。
胞苷检测的高效液相色谱条件：色谱条件：色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C-18（4.6×150mm，5µm）；流动相A：50 mM 磷酸二氢钾，流动相B：50% 甲醇，A: B=（90:10, v/v）；流速为 0.6 mL/min，柱温：30 ℃，检测波长：270 nm；进样量：10 µL。
结果如图1所示，在所选取的26个靶点基因中，当pgpA、pgpB、pgpC和ldhA受到抑制时，对应的生产菌株T1-pgpA、T1-pgpB、T1-pgpC、T1-ldhA的胞苷产量均表现出明显的增产优势，相比携带空质粒的对照菌株T1（p15AK-pLSG），胞苷产量分别提升了89.0%、130.2%、84.7%和88.7%。其中，pgpA、pgpB、pgpC分别编码磷脂酰甘油磷酸酶A（UniProt ID：P18200）、磷脂酰甘油磷酸酶B（UniProt ID：P0A924）、磷脂酰甘油磷酸酶C（UniProt ID：P0AD42），参与细胞膜的修复和重塑。但是，目前尚没有pgpA、pgpB、pgpC三个靶点基因与大肠杆菌胞苷产量之间关联性的研究和报道。
实施例4：正向抑制靶点的基因工程改造及摇瓶发酵测试
根据实施例3的摇瓶发酵结果，确认pgpA（磷脂酰甘油磷酸酶A编码基因）、pgpB（磷脂酰甘油磷酸酶B编码基因）、pgpC（磷脂酰甘油磷酸酶C编码基因）为高产胞苷的抑制靶点，因此在基础胞苷生产菌株T1基因组中分别对上述三个基因进行了敲除改造，并对改造后的菌株进行了摇瓶发酵测试。具体操作如下：
（1）pgpA、pgpB和pgpC基因敲除
通过辅助质粒pSRED的λ-Red重组系统敲除T1基因组中的pgpA、pgpB和pgpC基因，所述pgpA的序列如SEQ ID NO:1所示，所述pgpB的序列如SEQ ID NO:2所示，所述pgpC的序列如SEQ ID NO:3所示。
①线性重组片段的构建
ΔpgpA-1234线性重组片段的构建：以T1基因组为模板，利用引物ΔpgpA-UF/ΔpgpA-UR和ΔpgpA-DF/ΔpgpA-DR分别扩增上下游同源臂，记为片段ΔpgpA-1和ΔpgpA-4；以质粒pSTC为模板，利用引物ΔpgpA-Tet-F/Tet-R和Tet-F/ΔpgpA-Tet-R分段扩增出Tet抗性基因片段，记为ΔpgpA-2和ΔpgpA-3；然后片段ΔpgpA-1和ΔpgpA-2经融合PCR得到片段ΔpgpA-12，片段ΔpgpA-3和ΔpgpA-4经融合PCR得到片段ΔpgpA-34；最后片段ΔpgpA-12和ΔpgpA-34经融合PCR得到线性重组片段ΔpgpA-1234。
PCR反应体系及参数均参照Takara PrimerSTAR Max DNA Polymerase使用说明书，具体地采用Touch-Down PCR程序：98 ℃预变性3 min；98 ℃变性30 s，65 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min（15 s/kb，具体地按照片段大小而定），每个循环退火温度依次降低1 ℃，进行10个循环，直到55 ℃；98 ℃变性30 s，65 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，20个循环；72℃延伸10 min。
ΔpgpB-1234线性重组片段的构建：以T1基因组为模板，利用引物ΔpgpB-UF/ΔpgpB-UR和ΔpgpB-DF/ΔpgpB-DR分别扩增上下游同源臂，记为片段ΔpgpB-1和ΔpgpB-4；以质粒pSTC为模板，利用引物ΔpgpB-Tet-F/T2和T1/ΔpgpB-Tet-R分段扩增出Tet抗性基因片段，记为ΔpgpB-2和ΔpgpB-3；然后参照上述ΔpgpA-1234的构建方法经两步融合PCR得到线性重组片段ΔpgpB-1234。PCR反应体系及参数同上。
ΔpgpC-1234线性重组片段的构建：以T8基因组为模板，利用引物ΔpgpC-UF/pgpC-UR和ΔpgpC-DF/pgpC-DR分别扩增上下游同源臂，记为片段ΔpgpC-1和ΔpgpC-4；以质粒pSTC为模板，利用引物ΔpgpC-Tet-F/T2和T1/ΔpgpC-Tet-R分段扩增出Tet抗性基因片段，记为ΔpgpC-2和ΔpgpC-3；然后参照上述ΔpgpA-1234的构建方法经两步融合PCR得到线性重组片段ΔpgpC-1234。PCR反应体系及参数同上。
②重组电转感受态细胞的制备
从LB平板培养基中挑取已转入辅助质粒pSRED的T1单菌落（感受态制备及转化方法参照实施例2），接种于5 mL LB培养基（Spc，50 µg/mL；Amp，50 µg/mL）中，放至30 ℃摇床过夜活化。次日吸取1 mL过夜培养的菌液接种到装有100mL LB液体培养基（IPTG，2 mM；葡萄糖，10 g/L；Spc，50 µg/mL；Amp，50 µg/mL）的500 mL锥形瓶中，培养至OD600为0.4-0.6。将菌液在冰上预冷20 min后离心收集菌体，并用预冷的16%甘油反复重悬清洗2-3次，最后加入1 mL预冷的16%甘油溶液，吹吸重悬菌体，并分装100 µL／管，液氮速冻，于-80 ℃保存备用。
③转化及阳性克隆的筛选
将构建好的线性重组片段ΔpgpA-1234、ΔpgpB-1234和ΔpgpC-1234电转化至上述制备好的重组电转感受态细胞中，并涂布于LB固体平板培养基（IPTG，2 mM；Tet，10 µg/mL；Spc，50 µg/mL；Amp，50 µg/mL），放至30 ℃培养箱中培养12-16 h。挑取单菌落，分别利用引物ΔpgpA-UF/ΔpgpA-DR、ΔpgpB-UF/ΔpgpB-DR和ΔpgpC-UF/ΔpgpC-DR进行菌落PCR验证得到阳性菌株。
④筛选标记（Tet）的弹出
将已验证阳性的单菌落接种5 mL LB液体培养基（IPTG，2 mM；阿拉伯糖，4 g/L；Spc，50 µg/mL；Amp，50 µg/mL）中，并放至30 ℃摇床诱导约6-8 h。诱导结束后蘸取少许菌液，在LB固体平板培养基（IPTG，2 mM；阿拉伯糖，4 g/L；Spc，50 µg/mL；Amp，50 µg/mL）中划线复筛，然后挑取平板上的单菌落在有无Tet抗性的LB平板培养基中进行对点板实验，筛选出成功弹出筛选标记Tet的菌落，即在无Tet抗性培养基中生长但在含Tet抗性的培养基中不长的菌落。
⑤辅助质粒的消除
筛选出成功弹出Tet基因的菌落，接种于LB液体培养基（Amp，50 µg/mL ）中，放至42 ℃摇床过夜培养。取过夜培养的菌液，在LB固体平板培养基（Amp，50 µg/mL ）中进行划线培养，待长出单菌落后，挑取单菌落在含50 µg/mL Spc抗性和含50 µg/mL Amp的LB固体平板培养基进行对点板实验，对比观察两个培养基中菌落的生长情况，筛选出在含Amp的LB中生长，但在含Spc的LB培养基中不长的菌落，即成功消除辅助质粒的菌落，活化并用甘油管保藏菌株，将成功敲除了pgpA、pgpB、pgpC的突变菌株分别记为T1-1、T1-2、T1-3。
（3）菌株T1-1、T1-2、T1-3摇瓶发酵测试
对上述敲除改造的菌株T1-1、T1-2、T1-3进行摇瓶发酵测试，方法及培养基成分均参照实施例3。
结果如图2所示，相比对照菌株T1，改造后的突变菌株T1-1、T1-2、T1-3的胞苷产量分别提升了26.2%、27.3%、32.1%，糖苷转化率也由T1的 19.8% 分别提升至25.0% 、25.3% 、26.2% 。
上述结果充分说明pgpA、pgpB和pgpC基因是大肠杆菌胞苷合成的抑制靶点，抑制pgpA、pgpB和pgpC基因的表达对大肠杆菌胞苷的合成有促进作用，当分别敲除上述抑制靶点后，大肠杆菌的胞苷合成的产量和转化率均得到较大提升。
实施例5：利用突变菌株进行胞苷发酵生产
（1）从-80 ℃冰箱取出实施例4中保藏的菌株T1-1、T1-2、T1-3，先在LB固体平板培养基（Amp，50 µg/mL）中划线并放至37 ℃培养箱进行培养。次日挑取长势良好的单菌落若干再次划线进行传代培养。然后吸取10 mL无菌水到二代培养的固体平板培养基上洗掉全部菌落（无异常菌落），从而获得菌液。
（2）将上述菌液接种到含有6 L种子培养基的10 L发酵罐中进行种子培养，接种量为7-10％，培养温度为35-40℃，pH控制在 6.5-7.5，溶氧控制在20-40％，残糖控制在0.1-0.3％，培养周期为8-16h。发酵罐种子培养基组成为：葡萄糖30 g/L、磷酸二氢钾2 g/L、酵母浸粉6 g/L、蛋白胨2 g/L、硫酸铵3 g/L、柠檬酸2 g/L、硫酸镁0.8 g/L、七水合硫酸亚铁20 mg/L、一水合硫酸锰2 mg/L、VB1 1.5 mg/L、VH2 mg/L、氯化钴2 mg/L、硫酸锌2 mg/L、消泡剂0.5 mL/L、Amp 50 µg/mL。
（3）种子培养完成后，接种到含有15L发酵培养基的50L发酵罐中进行胞苷发酵，接种量为10-15％，培养温度为35-40℃，pH控制在6.5-7.5，溶氧控制在20-40％，残糖控制在0.1-0.3％，发酵周期为64h。期间每隔4 h取样一次，用紫外分光光度计检测OD600，并参照实施例3中的方法用高效液相色谱仪检测发酵液中的胞苷含量。
发酵罐发酵培养基组成：葡萄糖20 g/L、磷酸氢二钾7.5 g/L、酵母浸粉4 g/L、蛋白胨6 g/L、硫酸铵4 g/L、玉米浆5 g/L、柠檬酸2 g/L、硫酸镁1.8 g/L、七水合硫酸亚铁70mg/L、一水合硫酸锰10 mg/L、VB1 1.5 mg/L、VH2 mg/L、氯化钴2 mg/L、硫酸锌2 mg/L、硫酸铜0.5 mg/L、氯化钙4 mg/L、消泡剂0.5 mL/L、Amp 50 µg/mL。
结果如图3和4所示，在发酵罐大量培养时，相比对照菌株T1，突变菌株T1-1、T1-2、T1-3的胞苷产量分别由57.2 g/L提升到了73.6 g/L、77.8 g/L、76.8 g/L，分别提升了28.5%、36 %、34.3 %。同时，突变菌株T1-1、T1-2、T1-3的糖苷转化率也分别由T1的19%分别提升至24.5%、26.0%、25.6%。另外，从图3还可以用明显看出，当发酵超过40小时后，对照菌株T1发酵体系中的胞苷含量趋于平稳不再增加，而三株突变菌株T1-1、T1-2、T1-3发酵体系中的胞苷的量仍然在持续积累、不断增加。
上述结果再次说明抑制pgpA、pgpB和pgpC基因的表达对大肠杆菌胞苷的合成存在较为显著的促进作用，利用抑制或敲除pgpA、pgpB或pgpC基因的大肠杆菌发酵生产胞苷，胞苷的产量和转化率均得到明显提高。这一结果是理性改造大肠杆菌胞苷代谢网络的常规思路所无法预测的。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.抑制或敲除磷脂酰甘油磷酸酶编码基因用于改造微生物的用途，其特征在于促进胞苷的生产。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述磷脂酰甘油磷酸酶编码基因选自pgpA、pgpB、pgpC。
3.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，微生物选自大肠杆菌或枯草芽孢杆菌。
4.如权利要求1-3任一所述的用途，其特征在于，所述pgpA编码磷脂酰甘油磷酸酶A，UniProt ID：P18200；所述pgpB编码磷脂酰甘油磷酸酶B，UniProt ID：P0A924；所述pgpC编码磷脂酰甘油磷酸酶C，UniProt ID：P0AD42。
5.一种通过抑制或敲除磷脂酰甘油磷酸酶编码基因促进微生物发酵生产胞苷的方法，所述磷脂酰甘油磷酸酶编码基因选自pgpA、pgpB、pgpC。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，微生物选自大肠杆菌或枯草芽孢杆菌。
7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述pgpA编码磷脂酰甘油磷酸酶A，UniProt ID：P18200；所述pgpB编码磷脂酰甘油磷酸酶B，UniProt ID：P0A924；所述pgpC编码磷脂酰甘油磷酸酶C，UniProt ID：P0AD42。
8.一种用于发酵生产胞苷的突变菌株，其特征在于，是将大肠杆菌的磷脂酰甘油磷酸酶编码基因抑制或敲除后而得到的，所述磷脂酰甘油磷酸酶编码基因选自pgpA、pgpB、pgpC。
9.如权利要求8所述突变菌株，其特征在于，所述pgpA编码磷脂酰甘油磷酸酶A，UniProt ID：P18200；所述pgpB编码磷脂酰甘油磷酸酶B，UniProt ID：P0A924；所述pgpC编码磷脂酰甘油磷酸酶C，UniProt ID：P0AD42。
10.一种发酵生产胞苷的方法，其特征在于使用权利要求8或9任一所述的突变菌株发酵制备胞苷。
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Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106754602A (zh) * | 2017-01-04 | 2017-05-31 | 苏州华赛生物工程技术有限公司 | 一种生产胞苷的重组微生物及生产胞苷的方法 |
| WO2019009593A2 (en) * | 2017-07-05 | 2019-01-10 | Korea Institute Of Science And Technology | BACTERIUM PRODUCING COMPONENTLY A MONOPHOSPHORYLATED LIPID A AND METHOD FOR PRODUCING A MONOPHOSPHORYLATED LIPID USING THE BACTERIUM |
| CN111321101A (zh) * | 2020-03-06 | 2020-06-23 | 南京工业大学 | 一种利用CRISPR-Cas9技术敲除大肠杆菌中胞苷脱氨酶基因cdd的方法及应用 |
| CN116333953A (zh) * | 2022-10-27 | 2023-06-27 | 宁夏大学 | 一种高产胞嘧啶核苷的基因工程菌及其应用 |
| CN116463273A (zh) * | 2023-03-14 | 2023-07-21 | 江苏香地化学有限公司 | 增强5’-胞苷酸积累的方法及应用 |
| CN116656585A (zh) * | 2023-03-14 | 2023-08-29 | 江苏香地化学有限公司 | 一种促进胞苷合成的方法及应用 |
-
2023
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Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106754602A (zh) * | 2017-01-04 | 2017-05-31 | 苏州华赛生物工程技术有限公司 | 一种生产胞苷的重组微生物及生产胞苷的方法 |
| WO2019009593A2 (en) * | 2017-07-05 | 2019-01-10 | Korea Institute Of Science And Technology | BACTERIUM PRODUCING COMPONENTLY A MONOPHOSPHORYLATED LIPID A AND METHOD FOR PRODUCING A MONOPHOSPHORYLATED LIPID USING THE BACTERIUM |
| CN111492058A (zh) * | 2017-07-05 | 2020-08-04 | 韩国科学技术研究院 | 组成性产生单磷酰脂质a的细菌和利用细菌产生单磷酰脂质a的方法 |
| CN111321101A (zh) * | 2020-03-06 | 2020-06-23 | 南京工业大学 | 一种利用CRISPR-Cas9技术敲除大肠杆菌中胞苷脱氨酶基因cdd的方法及应用 |
| CN116333953A (zh) * | 2022-10-27 | 2023-06-27 | 宁夏大学 | 一种高产胞嘧啶核苷的基因工程菌及其应用 |
| CN116463273A (zh) * | 2023-03-14 | 2023-07-21 | 江苏香地化学有限公司 | 增强5’-胞苷酸积累的方法及应用 |
| CN116656585A (zh) * | 2023-03-14 | 2023-08-29 | 江苏香地化学有限公司 | 一种促进胞苷合成的方法及应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| YI-HSUEH LU ET AL.: ""Three Phosphatidylglycerol-phosphate Phosphatases in the InnerMembraneofEscherichiacoli"", YI-HSUEH LU ET AL., vol. 286, no. 7, pages 4 * |
| 刘逸寒等: ""pgpA 和 tdcG 基因的敲除对大肠杆菌磷脂酰 丝氨酸合成的影响"", 《天津科技大学学报》, vol. 29, no. 6, pages 1 - 6 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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