一株东方伊萨酵母及其全细胞转化产胞二磷胆碱的方法
技术领域
一株东方伊萨酵母及其全细胞转化产胞二磷胆碱的方法,涉及到胞二磷胆碱的制备,属于生物制药技术领域。
背景技术
胞二磷胆碱,又名胞磷胆碱,化学名称是胆碱胞嘧啶-5’-二磷酸酯单纳盐,是卵磷脂生物合成的前体。补充外源性胞二磷胆碱即能激活卵磷脂的生物合成, 刺激脑干网状结构的兴奋,提高苏醒阈值,恢复神经组织机能,改善脑代谢和神经传导,提高患者的意识水平。此外,胞二磷胆碱还是一种重要的核酸药物,能调节脑血管运动张力,改善大脑代谢功能。胞二磷胆碱作用的靶器官是肝脏和脑组织,临床用以治疗颅脑外伤及颅脑术后昏迷、帕金森氏综合症、迟发性运动障碍、神经性耳聋和耳鸣、脑血管疾病以及小脑与脊髓共济失调。鉴于胞二磷胆碱的广泛应用,其制备技术成为较受关注的研究课题。
胞二磷胆碱的生产方法有化学合成法、酶法和微生物转化法,早在20世纪50年代就有报道通过化学法合成胞二磷胆碱,但化学合成的胞二磷胆碱产品不适合药用,随后采用酶促的方法合成胞二磷胆碱,但成本较高。目前常用的方法是微生物转化法,但存在着转化率、产量不高的问题。
微生物细胞转化制备胞二磷胆碱主要是通过ATP的再生体系和胞二磷胆碱合成酶系。ATP的再生是通过糖酵解途径(EMP)来实现,胞二磷胆碱合成酶系包括核苷酸激酶、核苷二磷酸激酶、胆碱激酶和磷酸胆碱胞苷转移酶,ATP是胞二磷胆碱合成过程中磷酸供体。ATP的再生体系与胞二磷胆碱合成酶系偶联时,反应体系中只需存在葡萄糖、磷酸盐、5’-胞苷酸和磷酸胆碱即可合成胞二磷胆碱。因此,胞二磷胆碱的合成速率取决于ATP再生的速率、胞二磷胆碱合成酶系的速率以及二者偶联的速率。
东方伊萨酵母(I. orientalis)细胞中ATP的再生量取决于EMP途径,而通过添加钾离子、镁离子和锰离子等离子可以改变代谢流向,提高ATP的再生速率,从而与胞二磷胆碱酶系速率相匹配,实现高效制备胞二磷胆碱。
发明内容
本发明的目的是使用东方伊萨酵母(I. orientalis)高效制备胞二磷胆碱。
本发明的思路是:以磷酸胆碱、5’-胞苷酸或其前体物质为底物,以葡萄糖为能量供体,通过无机盐提高ATP再生速率,利用东方伊萨酵母(I. orientalis)透性细胞制备胞二磷胆碱。
本发明主要包括以下四个方面:
(1) 胞二磷胆碱的制备是以磷酸胆碱、5’-胞苷酸为底物,以葡萄糖为能量供体,在水溶液中通过透性酵母细胞制备胞二磷胆碱。
(2) 上述(1)的制备方法中,所使用的酵母细胞为东方伊萨酵母(I. orientalis)Z1,中国典型培养物保藏中心,菌种编号为:CCTCC NO:M 2011272。
(3) 上述(1)的制备方法中,葡萄糖为能量供体,一方面提供菌体的能量需求,另一方面为胞二磷胆碱合成酶系提供ATP,本发明中通过添加钾离子、镁离子和锰离子中的一种或组合提高ATP的再生速率。
(4) 上述(1)的制备方法中,使用的酵母细胞经培养离心后得到的酵母全细胞,并在制备的水溶液中添加甲苯来提高细胞的透性,以提高胞二磷胆碱合成酶系的速率。
本发明的技术方案:一株东方伊萨酵母,其命名为东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)Z1,已保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为:CCTCC NO:M 2011272。
用所述东方伊萨酵母全细胞转化产胞二磷胆碱的方法,以磷酸胆碱和5’-胞苷酸为底物,以葡萄糖为能量供体,通过添加无机离子提高ATP再生速率,利用东方伊萨酵母(I. orientalis) CCTCC NO:M 2011272透性细胞制备胞二磷胆碱。
胞二磷胆碱的制备是在水溶液中进行,反应温度为20~40oC,pH为4~9,反应时间为6~24h。
胞二磷胆碱制备中底物磷酸胆碱的起始反应浓度为10~100μmol/mL,5’-胞苷酸的起始反应浓度为10~50μmol/mL;能量供体葡萄糖的起始反应浓度为50~500μmol/mL;添加的无机离子为钾离子、镁离子、锰离子的无机盐形式,可以是磷酸盐、硫酸盐等,添加离子的方式可以是一种或几种离子的组合,其中钾离子的起始反应浓度为0~200μmol/mL,镁离子的起始反应浓度为0~200μmol/mL,锰离子的起始反应浓度为0~50μmol/mL;使用的酵母全细胞为东方伊萨酵母(I. orientalis) CCTCC NO:M 2011272,通过培养离心得到的酵母全细胞,在反应中添加形式是酵母泥,起始添加浓度为200~1000g/L;在反应中通过添加甲苯来改变酵母细胞的通透性,甲苯的起始反应浓度为0.1~10mL/L。
本发明的有益效果:本发明中以葡萄糖为能量供体,一方面提供菌体的能量需求,另一方面为胞二磷胆碱合成酶系提供ATP;通过添加钾离子、镁离子和锰离子中的一种或组合改变代谢流向,提高ATP的再生速率,从而与胞二磷胆碱酶系速率相匹配,实现高效制备胞二磷胆碱。
使用的酵母细胞为经培养离心后得到酵母全细胞,并在制备的水溶液中添加甲苯来提高细胞的透性,以提高胞二磷胆碱合成酶系的速率。
生物材料样品保藏:东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)Z1,已保藏于中国典型培养物保藏中心,地址:中国武汉武汉大学,保藏日期:2011年7月29日,保藏编号为:CCTCC NO:M 2011272。
附图说明
图1本发明制备胞二磷胆碱主要代谢途径示意图。
具体实施方式
实施例1
东方伊萨酵母的培养,所用的酵母培养基为:葡萄糖50 g/L,尿素2.0 g/L,磷酸二氢钾1.5 g/L,七水合硫酸镁0.5 g/L,七水合硫酸锌4.0 mg/L,七水合硫酸铁3.0 mg/L,四水合硫酸锰0.3 mg/L,无水氯化钙1.0 mg/L,生物素0.05 mg/L,以蒸馏水定容。东方伊萨酵母的接种量为10%,于30oC摇床培养24 h,然后4500r/min离心10min,弃上清后得到酵母泥,即可用于制备胞二磷胆碱。
在反应器中配制由25μmol/mL磷酸胆碱,10μmol/mL 5’-胞苷酸,200μmol/mL葡萄糖,5μmol/mL七水合硫酸镁以及上述培养基培养离心得到的酵母泥2000g和水组成的反应液10L,氢氧化钠调节pH 6.0,于32oC转化10h,反应结束后,测定反应液中胞二磷胆碱的产量为2.0 g/L,转化率达到61.9%。
实施例2
在反应器中配制由25μmol/mL磷酸胆碱,10μmol/mL 5’-胞苷酸,200μmol/mL葡萄糖,5μmol/mL七水合硫酸镁以及按照实施例1所述的培养东方伊萨酵母的方法培养离心得到的酵母泥2000g和水组成的反应液10L,氢氧化钠调节pH 6.0,并添加0.1mL/L的甲苯,于32oC转化10h,反应结束后,测定反应液中胞二磷胆碱的产量为2.4g/L,转化率达到74.2%。
实施例3
在反应器中配制由30μmol/mL磷酸胆碱,20μmol/mL 5’-胞苷酸,300μmol/mL葡萄糖,5μmol/mL七水合硫酸镁,10μmol/mL磷酸二氢钾以及按照实施例1所述的培养东方伊萨酵母的方法培养离心得到的酵母泥5000g和水组成的反应液10L,氢氧化钠调节pH 5.0,并添加0.5mL/L的甲苯,于32oC转化10h,反应结束后,测定反应液中胞二磷胆碱的产量为5.1g/L,转化率达到78.9%。
实施例4
在反应器中配制由50μmol/mL磷酸胆碱,40μmol/mL 5’-胞苷酸,400μmol/mL葡萄糖,5μmol/mL七水合硫酸镁,10μmol/mL磷酸二氢钾以及按照实施例1所述的培养东方伊萨酵母的方法培养离心得到的酵母泥5000g和水组成的反应液10L,氢氧化钠调节pH 6.0,并添加0.5mL/L的甲苯,于32oC转化10h,反应结束后,测定反应液中胞二磷胆碱的产量为9.5 g/L,转化率达到73.4%。
实施例5
在反应器中配制由50μmol/mL磷酸胆碱,40μmol/mL 5’-胞苷酸,400μmol/mL葡萄糖,5μmol/mL七水合硫酸镁,1μmol/mL硫酸锰以及按照实施例1所述的培养东方伊萨酵母的方法培养离心得到的酵母泥8000g和水组成的反应液10L,氢氧化钠调节pH 8.0,并添加0.5mL/L的甲苯,于32oC转化10h,反应结束后,测定反应液中胞二磷胆碱的产量为10g/L,转化率达到77.4%。
实施例6
在反应器中配制由50μmol/mL磷酸胆碱,40μmol/mL 5’-胞苷酸,400μmol/mL葡萄糖,5μmol/mL七水合硫酸镁,10μmol/mL磷酸二氢钾以及按照案例1所述的培养东方伊萨酵母的方法培养离心得到的酵母泥7500g和水组成的反应液15L,氢氧化钠调节pH6.0,并添加1mL/L的甲苯,于32oC转化8h,反应结束后,测定反应液中胞二磷胆碱的产量为10.6g/L,转化率达到82%。
实施例7
在反应器中配制由50μmol/mL磷酸胆碱,40μmol/mL 5’-胞苷酸,400μmol/mL葡萄糖,5μmol/mL七水合硫酸镁,10μmol/mL磷酸二氢钾,1μmol/mL硫酸锰以及按照实施例1所述的培养东方伊萨酵母的方法培养离心得到的酵母泥5000g和水组成的反应液10L,氢氧化钠调节pH 6.8,,并添加0.5mL/L的甲苯,于34oC转化10h,反应结束后,测定反应液中胞二磷胆碱的产量为10.4 g/L,转化率达到80.4%。
实施例8
在反应器中配制由50μmol/mL磷酸胆碱,40μmol/mL 5’-胞苷酸,400μmol/mL葡萄糖,5μmol/mL七水合硫酸镁,10μmol/mL磷酸二氢钾,1μmol/mL硫酸锰以及按照实施例1所述的培养东方伊萨酵母的方法培养离心得到的酵母泥5000g和水组成的反应液10L,氢氧化钠调节pH 6.0,并添加1mL/L的甲苯,于30oC转化10h,反应结束后,测定反应液中胞二磷胆碱的产量为10.8g/L,转化率达到83.5%。
实施例9
在反应器中配制由50μmol/mL磷酸胆碱,40μmol/mL 5’-胞苷酸,400μmol/mL葡萄糖,10μmol/mL磷酸二氢钾,1μmol/mL硫酸锰以及按照实施例1所述的培养东方伊萨酵母的方法培养离心得到的酵母泥6000g和水组成的反应液12L,氢氧化钠调节pH 6.5,并添加5mL/L的甲苯,于32oC转化12h,反应结束后,测定反应液中胞二磷胆碱的产量为10.6g/L,转化率达到82%。
实施例10
在反应器中配制由50μmol/mL磷酸胆碱,40μmol/mL 5’-胞苷酸,400μmol/mL葡萄糖,5μmol/mL七水合硫酸镁,10μmol/mL磷酸二氢钾,1μmol/mL硫酸锰以及按照实施例1所述的培养东方伊萨酵母的方法培养离心得到的酵母泥5000g和水组成的反应液10L,氢氧化钠调节pH 6.0,并添加1mL/L的甲苯,于32oC转化12h,反应结束后,测定反应液中胞二磷胆碱的产量为11.2g/L,转化率达到86.6%。