CN111647636B - 一种利用酵母全细胞催化合成胞二磷胆碱的方法 - Google Patents

一种利用酵母全细胞催化合成胞二磷胆碱的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体公开了一种利用酵母全细胞催化合成胞二磷胆碱的方法，所述的培养基包含醛类化合物和醇类化合物。本发明通过在该培养基对酵母进行催化，制备获得含有胞二磷胆碱的催化合成液。该本发明方法单批催化合成时间由40h缩短至24h，产量由6g/L提高至15g/L。本发明所用的催化促进剂添加量少，成本低，操作简单，效果明显。

Description

一种利用酵母全细胞催化合成胞二磷胆碱的方法
技术领域
本发明属于微生物催化合成领域，具体涉及一种利用酵母全细胞催化合成胞二磷胆碱的方法。
背景技术
胞二磷胆碱在临床上有广泛应用：治疗神经退化疾病，如头部外伤、脑卒中、脑部老化、帕金森症、肌萎缩侧索硬化症和阿滋海默症；外源胞二磷胆碱对迟发性运动障碍、脊髓小脑型共济失调、认知和记忆疾病、类胆碱功能刺激也有有利作用；用于治疗脑血管和心血管疾病；治疗神经性耳聋和耳鸣；其它如对延缓衰老，提高学习效果和记忆力等也有一定疗效，也可用于治疗抑郁症。
胞二磷胆碱生产主要采取三种方法：化学合成法、全细胞生物催化合成法酶催化。全细胞催化法由于原材料价格适中，且催化反应收率较高，国内外工业化生产胞二磷胆碱一般均采用此法。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种利用酵母全细胞催化合成胞二磷胆碱的方法。
发明思路：CMP和糖酵解再生的ATP在反应前期转化成CTP(胞苷三磷酸)，导致了CTP的积累。CTP的积累会抑制胆碱的磷酸化，胞二磷胆碱就不能有效持续合成，而添加醛类化合物和醇类化合物可有效抑制CTP的积累。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种利用酵母全细胞催化合成胞二磷胆碱的方法，在催化合成的过程中，向培养基中添加醛类化合物和醇类化合物。
其中，所述的醛类化合物为甲醛、乙醛、丙醛、丁醛、乙二醛和丙二醛中的任意一种或几种组合，优选甲醛和乙醛。
其中，所述的醇类化合物为甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、乙二醇和丙三醇中的任意一种或几种组合，优选丙三醇和乙二醇，更优选丙三醇。
其中，所述的培养基中，醛类化合物的浓度为0.1～20g/L，优选1～10g/L，更优选4～10g/L。
其中，所述的培养基中，醇类化合物的浓度为0.1～20g/L，优选1～15g/L，更优选6～12g/L。
更优选地，醛类化合物与醇类化合物的质量比为2:3。
其中，所述的培养基还包括如下组分：葡萄糖0.5～50g/L，胞苷酸5～15g/L，氯化胆碱10～30g/L，磷酸二氢钾0.1～20g/L，磷酸氢二钾0.1～20g/L，氯化镁0.1～20g/L，溶剂为水，pH5.0～8.0。
优选地，所述的培养包括如下组分：葡萄糖0.5～50g/L，胞苷酸5～15g/L，氯化胆碱10～30g/L，磷酸二氢钾0.1～20g/L，磷酸氢二钾0.1～20g/L，氯化镁0.1～20g/L，醛类化合物0.1～20g/L，醇类化合物0.1～20g/L，溶剂为水，pH5.0～8.0。
更优选地，所述的培养基包括如下组分：葡萄糖30g/L，胞苷酸12g/L，氯化胆碱20g/L，磷酸二氢钾15g/L，磷酸氢二钾15g/L，氯化镁10g/L，醛类化合物1～10g/L，醇类化合物1～15g/L，溶剂为水，pH5.0～8.0。
其中，所述的利用酵母全细胞催化合成胞二磷胆碱的方法包括如下步骤：直接将酵母接种到培养基中，催化合成培养，即得到含有胞二磷胆碱的液体。
其中，所述的酵母为酿酒酵母；其中现有技术中的酿酒酵母菌能应用于本发明，优选为公司保藏酿酒酵母保藏编号CGMCC No.7522，已公开于中国专利CN201410057913.7：一种用于发酵生产核糖核酸的酿酒酵母菌及其应用。
其中，酿酒酵母的接种量为10～30g/L培养基，优选20g/L培养基。
其中，所述的催化合成培养的温度为30℃，时间为24h。
上述方法制备得到的含有胞二磷胆碱的液体中，胞二磷胆碱的产量达到12～15g/L；同时，催化合成的时间也缩短至24h。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：
本发明通过添加醛类化合物、醇类化合物类物质进行催化合成，单批催化合成时间由48h缩短至24h，产量由6g/L提高至12～15g/mL。该方法可以显著的缩短催化合成工时提高催化合成产量，所用的催化合成促进剂添加量少，成本低，操作简单，效果明显，减少生产成本。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
以下实施例中所用的酵母为酿酒酵母(公司保藏酿酒酵母保藏编号CGMCCNo.7522)。
实施例1
催化合成培养基的配制：葡萄糖30g/L，胞苷酸12g/L，氯化胆碱20g/L，磷酸二氢钾15g/L，磷酸氢二钾15g/L，氯化镁10g/L，乙醛8g/L，丙三醇12g/L，溶剂为水，pH7.0。
催化合成：10L搅拌罐中装入6L培养基，接入酿酒酵母20g/L进行催化合成培养，在催化合成罐中温度为30℃的条件下催化合成24小时后产量稳定在15g/L左右，过程中CTP浓度维持在3.5g/L。停止催化合成。
对比例1.1
催化合成培养基的配制：葡萄糖30g/L，胞苷酸12g/L，氯化胆碱20g/L，磷酸二氢钾15g/L，磷酸氢二钾15g/L，氯化镁10g/L，溶剂为水，pH7.0。
催化合成同实施例1。用培养条件催化合成，但是催化合成培养基不加醛类化合物、醇类化合物，3h后CTP浓度达到14.4g/L，CDP-胆碱(胞二磷胆碱)24h后产量达到3.6g/L，48h后产量稳定至6g/L，停止催化合成。
对比例1.2
催化合成培养基的配制：葡萄糖30g/L，胞苷酸12g/L，氯化胆碱20g/L，磷酸二氢钾15g/L，磷酸氢二钾15g/L，氯化镁10g/L，乙醛8g/L，溶剂为水，pH7.0。
催化合成同实施例1。用培养条件催化合成，但是催化合成培养基不加醇类化合物，24h后产量达到7g/L，48h后产量稳定至12g/L，3h后CTP的浓度达到8.4g/L，停止催化合成。
对比例1.3
催化合成培养基的配制：葡萄糖30g/L，胞苷酸12g/L，氯化胆碱20g/L，磷酸二氢钾15g/L，磷酸氢二钾15g/L，氯化镁10g/L，丙三醇12g/L，溶剂为水，pH7.0。
批次催化合成同实施例1。用培养条件催化合成，但是催化合成培养基不加醛类化合物，3h后CTP浓度达到10.3g/L，CDP-胆碱(胞二磷胆碱)24h后产量达到8g/L，48h后产量稳定至9g/L，停止催化合成。
实施例2
催化合成培养基的配制：葡萄糖30g/L，胞苷酸12g/L，氯化胆碱20g/L，磷酸二氢钾15g/L，磷酸氢二钾15g/L，氯化镁10g/L，乙醛4g/L，丙三醇6g/L，溶剂为水，pH7.0。
催化合成：10L搅拌罐中装入6L培养基，接入酿酒酵母20g/L进行催化合成培养，在催化合成罐中温度为30℃的条件下催化合成24小时后产量稳定在12g/L左右，停止催化合成。
对比例2
催化合成培养基的配制：葡萄糖30g/L，胞苷酸12g/L，氯化胆碱20g/L，磷酸二氢钾15g/L，磷酸氢二钾15g/L，氯化镁10g/L，乙醛8g/L，乙醇12g/L，溶剂为水，pH7.0。
催化合成：10L搅拌罐中装入6L培养基，接入酿酒酵母20g/L进行催化合成培养，在催化合成罐中温度为30℃的条件下催化合成24小时后产量稳定在5g/L左右，停止催化合成。
实施例3
催化合成培养基的配制：葡萄糖30g/L，胞苷酸12g/L，氯化胆碱20g/L，磷酸二氢钾15g/L，磷酸氢二钾15g/L，氯化镁10g/L，丙二醛8g/L，丙三醇12g/L，溶剂为水，pH7.0。
催化合成：10L搅拌罐中装入6L培养基，接入酿酒酵母20g/L进行催化合成培养，在催化合成罐中温度为30℃的条件下催化合成24小时后产量稳定在8g/L左右，停止催化合成。
对比例3
催化合成培养基的配制：葡萄糖30g/L，胞苷酸12g/L，氯化胆碱20g/L，磷酸二氢钾15g/L，磷酸氢二钾15g/L，氯化镁10g/L，乙醛8g/L，乙二醇12g/L，溶剂为水，pH7.0。
催化合成：10L搅拌罐中装入6L培养基，接入酿酒酵母20g/L进行催化合成培养，在催化合成罐中温度为30℃的条件下催化合成24小时后产量稳定在10g/L左右，停止催化合成。
实施例4
催化合成培养基的配制：葡萄糖30g/L，胞苷酸12g/L，氯化胆碱20g/L，磷酸二氢钾15g/L，磷酸氢二钾15g/L，氯化镁10g/L，乙二醛8g/L，丙三醇12g/L，溶剂为水，pH7.0。
催化合成：10L搅拌罐中装入6L培养基，接入酿酒酵母20g/L进行催化合成培养，在催化合成罐中温度为30℃的条件下催化合成24小时后产量稳定在10g/L左右，停止催化合成。
实施例5
催化合成培养基的配制：葡萄糖30g/L，胞苷酸12g/L，氯化胆碱20g/L，磷酸二氢钾15g/L，磷酸氢二钾15g/L，氯化镁10g/L，甲醛8g/L，丙三醇12g/L，溶剂为水，pH7.0。
催化合成：10L搅拌罐中装入6L培养基，接入酿酒酵母20g/L进行催化合成培养，在催化合成罐中温度为30℃的条件下催化合成24小时后产量稳定在15g/L左右，停止催化合成。
对比例5
催化合成培养基的配制：葡萄糖30g/L，胞苷酸12g/L，氯化胆碱20g/L，磷酸二氢钾15g/L，磷酸氢二钾15g/L，氯化镁10g/L，甲醛8g/L，甲醇12g/L，溶剂为水，pH7.0。
催化合成：10L搅拌罐中装入6L培养基，接入酿酒酵母20g/L进行催化合成培养，在催化合成罐中温度为30℃的条件下催化合成48小时后产量稳定在6g/L左右，停止催化合成。
实施例6
催化合成培养基的配制：葡萄糖50g/L，胞苷酸15g/L，氯化胆碱25g/L，磷酸二氢钾20g/L，磷酸氢二钾20g/L，氯化镁15g/L，乙醛10g/L，丙三醇15g/L，溶剂为水，pH7.0。
催化合成同实施例1。在催化合成罐中温度为30℃的条件下催化合成24小时后产量稳定在15g/L左右，停止催化合成。
实施例7：
催化合成培养基的配制：葡萄糖10g/L，胞苷酸10g/L，氯化胆碱10g/L，磷酸二氢钾3.1g/L，磷酸氢二钾3.6g/L，氯化镁0.9g/L，乙醛0.52g/L，丙三醇0.37g/L，溶剂为水，pH7.0。
催化合成同实施例1。在催化合成罐中温度为30℃的条件下催化合成24小时后产量稳定在8g/L左右，停止催化合成。
实施例8：
催化合成培养基的配制：葡萄糖30g/L，胞苷酸12g/L，氯化胆碱20g/L，磷酸二氢钾15g/L，磷酸氢二钾15g/L，氯化镁10g/L，乙醛8g/L，丙三醇12g/L，溶剂为水，pH7.0。
催化合成同实施例1。在催化合成罐中温度为30℃的条件下催化合成24小时后产量稳定在12g/L左右，停止催化合成。
从实施例1～8与对比例1～5的结果可以看出，本发明通过添加醛类化合物、醇类化合物类物质进行催化合成，单批催化合成时间由40h缩短至24h，产量由6g/L提高至15g/L。且该方法可以显著的缩短催化合成工时提高催化合成产量，所用的促进剂添加量少，成本低，操作简单，效果明显，减少生产成本。
本发明提供了一种利用酵母全细胞催化合成胞二磷胆碱的方法的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

Claims (1)

1.一种利用酵母全细胞催化合成胞二磷胆碱的方法，其特征在于，将酵母以20g/L接种到培养基中，30℃的条件下催化合成培养，即得到含有胞二磷胆碱的液体；
其中，所述酵母为酿酒酵母，保藏编号CGMCC No.7522；
其中，所述培养基选自第一培养基、第二培养基或第三培养基；
所述第一培养基为葡萄糖30g/L，胞苷酸12g/L，氯化胆碱20g/L，磷酸二氢钾15g/L，磷酸氢二钾15g/L，氯化镁10g/L，乙醛8g/L，丙三醇12g/L，溶剂为水，pH7.0；
所述第二培养基为：葡萄糖30g/L，胞苷酸12g/L，氯化胆碱20g/L，磷酸二氢钾15g/L，磷酸氢二钾15g/L，氯化镁10g/L，甲醛8g/L，丙三醇12g/L，溶剂为水，pH7.0；
所述第三培养基为：葡萄糖50g/L，胞苷酸15g/L，氯化胆碱25g/L，磷酸二氢钾20g/L，磷酸氢二钾20g/L，氯化镁15g/L，乙醛10g/L，丙三醇15g/L，溶剂为水，pH7.0。
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