CN118109430A - 一种醇脱氢酶突变体及在4-羟基-2-丁酮合成中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种醇脱氢酶突变体及在4‑羟基‑2‑丁酮合成中的应用，属于酶工程技术领域。本发明以醇脱氢酶为基础，选择其第246位和第296位进行的氨基酸进行定点突变，将第246位谷氨酸突变为脯氨酸，第296位苏氨酸突变为脯氨酸。所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，在60℃下孵育48h后其残余酶活为初始酶活的40.27％左右，约为野生型的5.75倍。与来自鼠李糖乳杆菌的NADH氧化酶突变型LrNoxL179S偶联合成4‑羟基‑2‑丁酮，配合底物流加策略最终4‑羟基‑2‑丁酮积累量为2.2g/L，为后续进行高效生物合成4‑羟基‑2‑丁酮及其衍生物生物的研究奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种醇脱氢酶突变体及在4-羟基-2-丁酮合成中的应用，属于酶技术领域。
背景技术
4-羟基-2丁酮(4H2B)及其衍生物3-丁烯-2-酮是合成类固醇、农药、抗癌药物和喜树碱等药物的重要中间体，可以和齐格勒-纳塔催化剂(Ziegler-Natta catalyst)构成复合物用于丁二烯立体专一性聚合的催化剂及有机体合成中间体，是合成香料覆盆子酮、茴香基丙酮的中间体，也可用于合成抗HIV药物度鲁特韦重要手性中间体(R)-3-氨基丁醇。目前，工业上4H2B的生成方法主要以化学法为主，但是具有反应步骤繁琐、副产物较多，会产生有毒化合物等缺点，目前对于生物法合成4H2B的报道较少，因此，迫切需要一种具有良好活性的环境友好型生物催化剂来生产4H2B。
醇脱氢酶催化醛(酮)醇之间的可逆反应，通常的反应温度为30-65℃，但是，在此温度下，醇脱氢酶热稳定性有限，易失活，因此，在工业生产中酶的热稳定性具有重要意义。甲烷八叠球菌来源的醇脱氢酶最适温度为60℃，在此温度下孵育4h其残余酶活仅为初始酶活的50％左右，在37℃下孵育12h即达到了该酶的半衰期，不利于工业化生产。因此，亟需提高的醇脱氢酶的热稳定性，以提高其催化效率，促进工业应用。
发明内容
技术问题：为解决上述技术问题，本发明提供了一种醇脱氢酶突变体及其在4-羟基-2-丁酮生产中的应用。
技术方案：本发明提供了以甲烷八叠球菌的醇脱氢酶为亲本醇脱氢酶突变体、包含醇脱氢酶突变体的重组菌及应用，本发明的醇脱氢酶突变体的热稳定性有所提高，将其构建到大肠杆菌中，能够进行长时间酶转化合成4H2B，为后续进行高效生物合成4H2B及其衍生物的研究奠定了基础。
本发明提供了一种醇脱氢酶突变体，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的醇脱氢酶的第246位谷氨酸突变为脯氨酸，命名为MeADHE246P。
本发明提供了一种醇脱氢酶突变体，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的醇脱氢酶酶的第296位苏氨酸突变为脯氨酸，MeADHT296P。
本发明提供了一种醇脱氢酶突变体，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的醇脱氢酶的第246位谷氨酸突变为脯氨酸，同时将氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的醇脱氢酶的第296位苏氨酸突变为脯氨酸,命名为MeADHE246P/T296P；所述醇脱氢酶突变体MeADHE246P/T296P氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；编码所述醇脱氢酶突变体MeADHE246P/T296P的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明的一种实施方式中，编码所述醇脱氢酶亲本酶的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。
本发明还提供了编码上述醇脱氢酶突变体的基因。
本发明还提供了携带上述基因的重组载体。
在本发明的一种实施方式中，所述重组表达载体以pET28a作为表达载体。
本发明还提供了表达上述二肽酶突变体，或携带上述基因，或携带上述重组载体的重组细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞是以细菌或真菌为表达宿主。
在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞是以大肠杆菌为表达宿主。
在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞是以大肠杆菌BL21(DE3)作为宿主菌株。
本发明还提供了一种4H2B的制备方法，所述方法为，采用上述突变体或上述重组细胞或所述重组细胞表达的重组醇脱氢酶酶为催化剂，以1,3-丁二醇为底物，同时引入来自鼠李糖乳杆菌的NADH氧化酶突变型LrNoxL179S构建NADP+辅酶循环体系，反应制备4H2B。
在本发明的一种实施方式中，所述LrNoxL179S的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，编码所述LrNoxL179S的碱基序列如SEQ ID NO.6所示。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体或重组醇脱氢酶酶的添加量为：5～10U。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体或所述重组醇脱氢酶的添加量为：10U
在本发明的一种实施方式中，反应条件为：37℃下反应24～48h。
在本发明的一种实施方式中，反应条件为：37℃下反应48h。
本发明还提供了上述突变体，或上述基因，或上述重组载体，或上述重组细胞，或上述制备方法在制备4H2B及其衍生物中的应用。
有益效果：
(1)本发明通过将序列为SEQ ID NO.3中的第246位谷氨酸替换成脯氨酸和第296位苏氨酸替换成脯氨酸，得到的突变体中，所述突变体MeADHE246P/T296P在60℃孵育48h之后其残余酶活为初始酶活的40.27％左右，约为野生型的5.36倍，更适合于工业生产。
(2)本发明的醇脱氢酶突变体MeADHE246P/T296P的热稳定性与野生型相比有明显的提高，并且将其应用于合成4H2B，经过酶转化条件优化和底物流加策略最终4-羟基-2-丁酮合成量达到2.2g/L,为后续进行高效生物合成4-羟基-2-丁酮及其衍生物生物的研究奠定了基础。
附图说明
图1为野生型和突变体SDS-PAGE图，泳道1：蛋白质Marker；泳道2：E.coli BL21/pET-28a空载细胞破碎上清对照；泳道3：E.coli BL21/pET28a-MeADH细胞破碎上清；泳道4：E.coli BL21/pET28a-MeADHE246P细胞破碎上清；泳道5：E.coli BL21/pET28a-MeADHG222D细胞破碎上清；泳道6：E.coli BL21/pET28a-MeADHT310K细胞破碎上清；泳道7：E.coli BL21/pET28a-MeADHA307R细胞破碎上清；泳道8：E.coli BL21/pET28a-MeADHG292T细胞破碎上清；泳道9：E.coli BL21/pET28a-MeADHN117D细胞破碎上清；泳道10：E.coli BL21/pET28a-MeADHK201P细胞破碎上清；泳道11：E.coli BL21/pET28a-MeADHD51P细胞破碎上清；泳道12：E.coli BL21/pET28a-MeADHD97R细胞破碎上清；泳道13：E.coli BL21/pET28a-MeADHI156F细胞破碎上清；泳道14：E.coli BL21/pET28a-MeADH Q157M细胞破碎上清；泳道15：E.coliBL21/pET28a-MeADH S187R细胞破碎上清；泳道16：E.coli BL21/pET28a-MeADHK234Q细胞破碎上清；泳道17：E.coli BL21/pET28a-MeADHT295M细胞破碎上清；泳道18：E.coli BL21/pET28a-MeADHT296P细胞破碎上清。
图2：野生型与突变体酶活力对比。
图3：野生型与突变体热稳定性对比。
图4：野生型与突变体在37℃条件下孵育24h热稳定性对比。
图5：双酶体系条件优化结果。
图6：底物流加策略下4H2B合成结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
下述实施例中涉及的培养基如下：
LB液体培养基：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L。
LB固体培养基：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、琼脂20g/L。
下述实施例中所涉及的检测方法如下：
醇脱氢酶活的检测：反应体系：反应液为0.1mol/L Gly-NaOH缓冲液(pH10)，其中含有浓度为200mmol/L 1,3-丁二醇(1,3-BDO)溶液和浓度1mmol/LNADP+，加入20μL适量稀释的待测酶液，使用紫外分光光度计在340nm出检测吸光度的变化。
定义酶活单位(U)为：1分钟催化消耗1μmol NADP+所需要的酶的量为1个酶活力单位(U)。
比酶活为1mg湿细胞的酶活，单位为U/mg。
醇脱氢酶热稳定性的检测：在60℃水浴锅中孵育24h，每隔一定时间进行取样。在最适反应条件下，测定孵育一定时间后的残余酶活。以初始酶活为100％，计算处理后各样品的相对酶活力。考察醇脱氢酶的温度稳定性。
4-羟基-2-丁酮和1,3-丁二醇的检测方法：4-羟基-2-丁酮和1,3丁二醇均需要使用气相色谱进行检测且检测方法相同。检测前用乙酸乙酯进行萃取，加入无水硫酸钠除水后过滤，将处理后的样品通过气相色谱法进行检测，色谱柱型号为HP-Innowax(60m×0.25mm×0.5μm)色谱柱。检测条件设置为：初始温度50℃，保持1min，以10℃/min的速度升温至230℃，保持12min。进样口温度：250℃。载气：氦气(纯度≥99.999％)，流速1mL/min。进样方式：脉冲不分流进样；进样脉冲压力：5kPa；时间2.00min；进样量1μL。
实施例1：野生型醇脱氢酶的构建及表达
具体步骤如下：
(1)化学合成核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的醇脱氢酶基因MeADH。
(2)利用限制性内切酶BamH I/EcoR I对表达质粒pET28a进行酶切处理以获得线性化载体，将用同样方法酶切的基因MeADH和线性化pET28a连接后获得重组质粒pET28a-MeADH；
(3)将重组质粒pET28a-MeADH用化学转化法转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布于含卡那霉素抗性的LB平板，37℃下培养过夜，随机挑取克隆进行菌落PCR鉴定和测序验证，结果表明重组质粒pET28a-MeADH已成功转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，经测序验证突变成功的菌液提取重组质粒保存于-20℃冰箱。测序工作由生工(上海)生物工程股份有限公司完成。
(4)将制备得到的重组菌株E.coli BL21/pET28a-MeADH接种至10mL LB液体培养基中，37℃、200r/min培养10h后，制备得到种子液；将制备得到的种子液按1％(v/v)的接种量转接到50ml LB液体培养基中，并在37℃、200r/min培养2h，当OD600＝0.6左右时添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)使其终浓度为0.5mM，于16℃、200r/min进行醇脱氢酶表达，培养12h后，收集菌液，使用PBS溶液洗涤细胞，离心后收集细胞。将细胞使用PBS稀释至OD600＝15后，进行超声破碎：破1s停3s，15min，破碎后4℃，12000rpm离心20min，将破壁上清、破壁沉淀分离。上清液即为粗酶液，粗酶液酶活为6.94U±3.6。
(5)使用Ni-NTA亲和层析纯化粗酶，得到野生型醇脱氢酶MeADH的纯酶液。纯酶的比酶活为1.87U/mg±2.7。
实施例2：醇脱氢酶突变体的构建及表达
具体步骤如下：
设计突变引物，用于构建MeADH单一突变型重组质粒，相关引物和功能如表1所示。
以实施例1构建的质粒pET28a-MeADH为模板，利用表1所述引物构建单突变体质粒。以表达单突变体T296P质粒的构建为例，以野生型质粒pET28a-MeADH为模板，以P23/P24为引物，PCR构建表达单突变体T296P的质粒pET28a-MeADHT296P。
在此基础上，以单一突变型重组质粒为模板，利用表1所述引物进一步构建双突变体质粒和三突变体质粒。以表达双突变体T296P/E246P质粒的构建为例，以表达单一突变体的突变质粒pET28a-MeADHT296P为模板，以P19/P20为引物，PCR构建表达双突变体T296P/E246P的质粒pET28a-MeADHT296P/E246P。
表1：突变引物及其功能
按照实施例1相同的方法将上述构建的突变重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，即得到相应的突变重组菌。表达双突变体T296P/E246P的重组菌命名为E.coli BL21/pET28a-MeADHT296P/E246P。
分别按照实施例1的方法，将上述各突变重组菌株接种至10mL LB培养基中，37℃、200r/min培养10h后，制备得到种子液。将制备得到的种子液按1％(v/v)的接种量转接到50ml LB培养基中，并在37℃、200r/min培养2h，添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)使其终浓度为0.5mM，于16℃、200r/min进行醇脱氢酶表达，培养12h后，收集菌液，使用PBS溶液洗涤细胞，离心后收集细胞。将细胞使用PBS稀释至OD600＝15，进行超声破碎：破1s停3s，15min，破碎后4℃，12000rpm离心20min，将破壁上清、破壁沉淀分离；上清液即为粗酶液。
对野生型和突变型粗酶进行SDS-PAGE验证，结果如图1所示，结果显示：野生型和突变体均能成功表达。
实施例3：野生酶和突变酶的热稳定性比较
具体步骤如下：
1、各突变体的酶活比较
分别将实施例2所得粗酶添加10％的甘油于4℃贮存备用；首先对突变体进行初步筛选，实验测定了醇脱氢酶野生型及其突变体的细胞在OD600＝15条件下破碎得到的粗酶液在60℃，pH10.0条件下，与1,3-丁二醇反应时酶活力对比，排除与野生型相比显著降低的突变体。结果如图2所示。
表2野生型与突变体酶活性质比较
| 野生型/突变体 | 酶活U | 比酶活U/mg |
| 野生型 | 6.94±3.6 | 1.87±2.7 |
| MeADHD51P | 5.54±1.2 | 1.49±0.92 |
| MeADHD97R | 5.52±2.9 | 1.52±2.2 |
| MeADHN117D | 7.29±3.8 | 1.96±2.5 |
| MeADHI156F | 6.04±3.1 | 1.63±2.3 |
| MeADHQ157M | 6.17±3.2 | 1.66±2.6 |
| MeADHS187R | 6.11±3.2 | 1.65±2.5 |
| MeADHK201P | 5.21±2.7 | 1.40±0.88 |
| MeADHG222D | 5.41±2.8 | 1.46±0.89 |
| MeADHK234Q | 4.93±2.5 | 1.33±0.76 |
| MeADHE246P | 6.18±3.3 | 1.84±2.4 |
| MeADHG292T | 4.72±2.4 | 1.27±0.55 |
| MeADHT295M | 2.77±1.4 | 0.75±0.22 |
| MeADHT296P | 5.01±2.6 | 1.35±0.78 |
| MeADHA307R | 6.31±3.3 | 1.71±1.7 |
| MeADHT310K | 5.27±2.7 | 1.42±0.82 |
| MeADHT296P/E246P | 4.33±2.7 | 1.17±0.35 |
| MeADHT296P/G292T | 2.08±1.1 | 0.56±0.12 |
| MeADHE246P/G292T | 2.77±1.4 | 0.75±0.24 |
| MeADHT296P/E246P/G292T | 2.43±1.3 | 0.65±0.23 |
2、热稳定性比较
60℃热稳定性：
在60℃的条件下孵育48h后，比较各个突变体的残余酶活与初始酶活，结果如图3所示，结果显示：突变体MeADHE246P、MeADHG292T、MeADHT296P均比野生型的残余酶活高，其中，突变体MeADHT296P在60℃条件下孵育48h后残余34.55％的酶活；突变体MeADHE246P/T296P在60℃孵育48h后仍残余40.27％的酶活，与野生型(残余7.51％的酶活)相比，突变体MeADHE246P/T296P的残余酶活提高了5.36倍。
37℃热稳定性：
野生型与突变体MeADHE246P/T296P在37℃孵育24h热稳定性变化如图4所示。结果显示：野生型在37℃条件下孵育24h后，其残余酶活约为初始酶活的61.22％，突变型MeADHE246P/T296P在37℃条件下孵育24h后其残余酶活约为初始酶活的74.55％。
实施例4：E.coli BL21/pET28a-MeADHT296P/E246P偶联NADH氧化酶突变型LrNoxL179S合成4-羟基-2-丁酮
将实施例2中的E.coli BL21/pET28a-MeADHE246P/T296P表达的突变酶偶联LrNoxL179S合成4-羟基-2-丁酮，反应体系如下：
(1)E.coli BL21/pET28a-MeADHT296P/E246P突变酶催化剂的制备
参考实施例1所述方法培养重组菌E.coli BL21/pET28a-MeADH和E.coli BL21/pET28a-MeADHT296P/E246P，并破碎细胞，获得粗酶液。
(2)LrNoxL179S突变酶催化剂的制备
参照文献《Switching the substrate specificity from NADH to NADPH by asingle mutation ofNADH oxidase from Lactobacillus rhamnosus》中的方法，制备LrNoxL179S突变酶，具体方法为：将基因LrNoxL179S插入pET-28a质粒的BamHI和EcoRI位点中，构建重组质粒pET28a-LrNoxL179S。所述LrNoxL179S的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，编码所述LrNoxL179S的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，SEQ ID NO.7为包含酶切位点(下划线加粗所示)的LrNoxL179S核苷酸序列。
SEQ ID NO.7：
GGATCCATGAAAATCCTGGTTATCGGTGCGACCCACGCGGGTACCTTTGCAACCCAGCAGATCCTGACTGATCACCCGGATGCTGAAGTGACCGTTTATGAACGTAACAACAACCTGTCTTTCCTGTCTTGCGGTATTGCCCTGTGGGTTGGTGATCACGTTAGCGATCCGGATAAAATGTTCTACAGCTCTCCGGAAGCGCTGGCAAAACTGGGTGCTAACATGCAGATGGAACACGATGTTCTGAACATCGATCCGGCAACCAAAACCGTTGAAGTGAAAGATCTGAAAACCGGTACCGTGACTACCGATACCTACGATAAACTGGTTTACACCACCGGCTCCACCCCGATCATCCCGAACATCCCAGGTATCCACGATTCTAACGTTTATCTGTGCAAAAACTGGTCTGATGCGAAAACCCTGAAAGATCTGGCGCCGTCTATCAAATCCGCGATCGTTATCGGCGCGGGCTACATTGGCGCGGAACTGGCGGAACAGTTCGCTCTGACCGATAAAGAAGTTACCCTGATCGATGGCAGCCCGCGTGTTCTGGCGAAAAACTTCGATGCGACCATCACCGATCGTGTTGAAAAACTGTACACCGATCACGGTGTTCACCTGGCGCTGAACGAAATGGTTACCGAATTTGCGCAGGCAGATCAGGGTATCAAAGTGACCACCAACAAAGGTGATTACACCGCGGATATCGCAATCCTGTGCACCGGTTTCCGCCCGAACACCGATCTGCTGAAAGACCACCTGGATACCCTGCCGAACGGTGCGGTTATTACCAACGCGTACATGCAGACCAGCGATCCGGACATCTTCGCAGCGGGTGATACCGCGACCGTTCACTACAACCCGACCGGCAAAAACGACTACATCCCGCTGGCGACCAACGCAGTTCGTCAGGGTATCCTGGTTGGTAAAAACATCATGACCCCGACTGAAAAATACCTGGGCACCCAGAGCAGCAGCGCAGTTGAACTGTTCGATCACGCGATCGCGGCGAGCGGTCTGACTGTTGAAGGTGCGCACACCCGTGGTCTGGAACTGGATTCTGTGACCATTGAACAGGATTATCGTCCGGATTTTATGCTGACCACCACCCCGGTTCTGTGCAGCCTGACCTGGGACCCGAAAACCCACGAAGTTAAAGGTGGTGCGTTCTTCTCTAAACACGATATCAGCCAGTCTGCAAACGTGATCTCTCTGGCGATCCAGACCCACATGACCATTGAAACCCTGGCGATGGTTGATATGCTGTTCCAGCCGAACTTCGATCAGCCGATCAACTGGGTTAACGCTGTTGCGATGGCAGCAGTTGATAAAGCTAAGAAAAAACCGACCACCCCGGTTGCAGAATTC。
将构建好的pET28a-LrNoxL179S使用化学转化法导入E.coli BL21感受态中构建E.coli BL21/pET28a-LrNoxL179S重组菌，按照实施例1的方法获得粗酶液。使用Ni-NTA亲和层析纯化后，得到的LrNoxL179S突变酶发酵液的酶活为3.02U，比酶活为6.3U/mg±1.8。
(3)双酶体系反应制备4H2B
以终浓度4g/L的1,3-丁二醇为底物，在100mL的体系(1,3-丁二醇：4g/L，NADP+：1mM，FAD：0.1mM，DTT：1mM，缓冲液pH8.0：Tris-HCl)中控制温度在30～60℃，pH7.0～10.0，以MeADHT296P/E246P与LrNoxL179S的酶活力添加比为2:3(反应体系中，MeADHT296P/E246P酶活为10U，LrNoxL179S酶活为15U)进行转化实验，探究双酶体系的最适反应条件，反应96h后，检测反应体系中的相对产物浓度，结果如图5所示：选择突变体MeADHE246P/T296P偶联LrNoxL179S合成4-羟基-2-丁酮的转化条件优化后，其最适温度为37℃，最适pH为pH8.0。
(4)4H2B的制备
以终浓度4g/L的1,3-丁二醇为底物，在100mL的体系(1,3-丁二醇：4g/L，NADP+：1mM，FAD：0.1mM，DTT：1mM，缓冲液pH8.0：Tris-HCl)中控制温度在37℃，pH8.0进行转化实验，以MeADHT296P/E246P与LrNoxL179S的酶活力添加比为2:3进行转化(反应体系中，MeADHT296P/E246P酶活为10U，LrNoxL179S酶活为15U)，每12h补加终浓度2g/L的1,3-丁二醇和与初始添加量相等的混合酶，两种酶活力比例仍为2:3使反应继续进行，所添加的酶总体积为20mL，反应96h，最终得到2.2g/L的4H2B，产物的积累过程如图6所示。
结果表明该突变酶的热稳定性有明显的提升，并为生物合成4-羟基-2-丁酮及其衍生物的研究提供了基础。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种醇脱氢酶酶突变体，其特征在于，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的醇脱氢酶酶的第296位苏氨酸突变为脯氨酸；
或，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的醇脱氢酶酶的第246位谷氨酸突变为脯氨酸，并将氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的二肽酶的第296位苏氨酸突变为脯氨酸。
2.编码权利要求1所述醇脱氢酶突变体的基因。
3.携带权利要求2所述基因的重组载体。
4.表达权利要求1所述的醇脱氢酶突变体，或携带权利要求2所述基因，或携带权利要求3所述重组载体的重组细胞。
5.根据权利要求4所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞是以细菌或真菌为表达宿主。
6.根据权利要求5所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞是以大肠杆菌为表达宿主。
7.一种制备4-羟基-2-丁酮的方法，其特征在于，所述方法为，采用权利要求1所述的突变体或权利要求4～6任一所述的重组细胞为催化剂，以1,3-丁二醇为底物，反应制备4-羟基-2-丁酮。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述突变体的添加量为：5-10U。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，反应条件为：25-60℃下反应至少24h。
10.权利要求1所述的突变体，或权利要求2所述的基因，或权利要求3所述的重组载体，或权利要求4～6任一所述的重组细胞在制备4羟基-2-丁酮或手性药物中间体中的应用。
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