JP6097907B2 - イソフタル酸輸送タンパク質を保有する微生物及びその利用 - Google Patents
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していることが報告されているが、確実な証明はなされていない〔非特許文献1〕。このTTTファミリーに属する輸送タンパク質の場合、微生物を用いて細胞内でイソフタル酸を取り込ませるには、3種類のタンパク質が必要であることがわかっているが、1種類のタンパク質で効率よくイソフタル酸を取り込める輸送タンパク質の利用が望ましいが、TTTファミリー以外のイソフタル酸輸送タンパク質を同定したという報告はなされていない。
取したコンポストからテレフタル酸を炭素源とする集積培養法により単離したロドコッカス(Rhodococcus)属細菌HAL1831株のゲノム配列を決定することにより、メジャー・ファシリテーター・スーパーファミリー(Major facilitator superfamily)に属する新規タ
ンパク質を同定し、該タンパク質を大腸菌に発現させたところ、該タンパク質がイソフタル酸輸送能を有することを発見した。次に、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)K-12 JM109株にコマモナス・テストステロニ(Comamonas testosteroni)72W2株由来のイ
ソフタル酸3,4−ジオキシゲナーゼのオキシゲナーゼ・コンポーネント・タンパク質およびレダクターゼ・コンポーネント・タンパク質ならびにイソフタル酸3,4−シス−ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼを発現させ、さらに該イソフタル酸輸送タンパク質を発現させると、イソフタル酸の取り込み能が増強され、その結果、プロトカテク酸の生成量が増加することを見出した。また、該イソフタル酸輸送タンパク質を発現する該菌株をテレフタル酸にイソフタル酸が混合した水性媒体中に入れると、該水性媒体中のイソフタル酸の濃度が大きく減少することを見出し、本発明を完成するに至った。
[1] 以下の(a)、(b)、(c)または(d)に示すDNAを保有する微生物。
(a)配列番号2に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA。
(b)配列番号2に示されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および/または付加された配列を含み、かつイソフタル酸の該細胞内への取り込み機能を有するタンパク質をコードするDNA。
(c)配列番号1に示される塩基配列からなるDNA。
(d)配列番号1に示される塩基配列の全部もしくは一部の配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソフタル酸の該細胞内への取り込み機能を有するタンパク質をコードするDNA。
[2] 前記DNAで形質転換され、非改変株と比較してイソフタル酸の細胞内への取り込み機能が高められた、[1]に記載の微生物。
[3] 前記微生物がエシェリヒア・コリである、[2]に記載の微生物。
[4] [1]〜[3]のいずれかに記載の微生物を用いて、細胞内に取り込まれたイソフタル酸をイソフタル酸代謝物に転換し、これを採取することを特徴とする、イソフタル酸代謝物の製造方法。
[5] 前記微生物がさらにイソフタル酸3,4−ジオキシゲナーゼのオキシゲナーゼ・コンポーネントおよびレダクターゼ・コンポーネントならびにイソフタル酸3,4−シス−ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼを保有する微生物であり、前記イソフタル酸代謝物がプロトカテク酸である、[4]に記載のイソフタル酸代謝物の製造法。
[6] [1]〜[3]のいずれかに記載の微生物を用いることを特徴とする、イソフタル酸を微生物の細胞内に取り込ませる方法。
[7] [1]〜[3]のいずれかに記載の微生物または該培養物の処理物を、イソフタル酸が成分として含まれる水性媒体に添加することを特徴とする、水性媒体中のイソフタル酸を減少させる方法。
[8] 前記イソフタル酸は、ポリエステル繊維またはポリエステル樹脂の分解によって得られる、[7]に記載の方法。
た、本発明で用いられるイソフタル酸輸送タンパク質としては、配列番号2のアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつイソフタル酸の細胞内への取り込み機能を有するタンパク質をあげることができる。また、該タンパク質として、配列番号2のアミノ酸配列と75%以上の同一性、好ましくは90%以上、特に好ましくは95%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイソフタル酸の細胞内への取り込み機能を有するタンパク質をあげることができる。
Spring Harbor Laboratory Press (1989)(以下、モレキュラー・クローニング第2版と略す)、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)(
以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す)、Nucleic Acids Res., 10, 6487 (1982)、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 6409 (1982)、Gene, 34, 315 (1985)、Nucleic Acids Res., 13, 4431 (1985)、Proc.Natl. Acad. Sci., USA, 82, 488 (1985)等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号2で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質において特定の位置に欠失、置換もしくは付加が導入されるように、それぞれコードする配列番号1に表わされるDNAに部位特異的変異を導入することにより取得することができる。欠失、置換または付加される1または数個というアミノ酸の数は、イソフタル酸の細胞内輸送能が維持される限り特に限定されないが、1〜20個が好ましく、1〜10個がより好ましく、1〜5個が特に好ましい。
溶液(1倍濃度のSSC溶液の組成は、150 mM NaCl 、15 mM クエン酸ナトリウムである)の中、65℃でフィルターを洗浄することにより同定できるDNAを意味する。なお、ハ
イブリダイゼーションの実験法は、モレキュラー・クローニング:ア・ラボラトリー・マニュアル(Molecular Cloning, A laboratory manual)、第2版〔サンブルック(Sambrook)、フリッチ(Fritsch) 、マニアチス(Maniatis)編集、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press) 、1989年刊〕に記載されている。
菌HAL1831株は、2012年8月7日に独立行政法人製品評価技術基盤機構 NITE特許微生物
寄託センター(〒292-0818 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8)に受託番号NITE P-1400として寄託されており、分譲を受けることができる。
知の方法により培養する。培養後、公知の方法(例えば、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーに記載の方法)により、該微生物の染色体DNAを単離・精製する。この染色体DNAから合成DNAを用いて、ハイブリダイゼイション法またはPCR法などにより、本発明のイソフタル酸輸送タンパク質をコードするDNAを含む断片を取得することができる。
シュ・ダイアグノスティクス社製)、ZAP Express〔ストラタジーン社製、Strategies, 5, 58 (1992)〕、pBluescript II SK(+)〔ストラタジーン社製、Nucleic Acids Res., 17,
9494 (1989)〕、pUC118(タカラバイオ社製)等を用いることができる。
シェリヒア・コリJM105〔Gene, 38, 275 (1985)〕、エシェリヒア・コリJM109、エシェリヒア・コリBL21等をあげることができる。
等の塩基配列分析装置を用いることができる。
ネバクテリウム(Corynebacterium)属、コマモナス(Comamonas)属、バチルス(Bacillus)属、マイコバクテリウム(Mycobacterium)属、ノボスフィンゴビウム(Novosphigobium)属またはバークホルデリア(Burkholderia)属の細菌をあげることができる。さら
に好ましくは、エシェリヒア・コリをあげることができ、具体的にはエシェリヒア・コリ
K-12株をあげることができる。
たとえば、イソフタル酸の3位と4位に酸素原子を添加することによりイソフタル酸3,4−シス−ジヒドロジオールを生成するイソフタル酸3,4−ジオキシゲナーゼが挙げられる。これまで報告されているイソフタル酸3,4−ジオキシゲナーゼはオキシゲナーゼ・コンポーネントとレダクターゼ・コンポーネントの2種類のタンパク質からなることが知られており、これにより、イソフタル酸からイソフタル酸3,4−シス−ジヒドロジオールが生成する。
さらに、イソフタル酸3,4−ジオキシゲナーゼはオキシゲナーゼ・コンポーネントとレダクターゼ・コンポーネントに加えてイソフタル酸3,4−シス−ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼが共存すると、イソフタル酸からイソフタル酸3,4−シス−ジヒドロジオールを経てプロトカテク酸が生成する。
したがって、イソフタル酸代謝酵素とは、1種類のタンパク質である必要はなく、イソフタル酸3,4−ジオキシゲナーゼ・オキシゲナーゼ・コンポーネントおよびレダクターゼ・コンポーネントならびにイソフタル酸3,4−シス−ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼの3種類のタンパク質から構成されるものであってもよい。
(e)配列番号4に示されるアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするDNA。
(f)配列番号4に示されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および/または付加された配列を含み、かつイソフタル酸3,4−ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ・コンポーネントとともに、イソフタル酸からイソフタル酸3,4−シス−ジヒドロジオールを生成する活性を有する蛋白質をコードするDNA。
(g)配列番号3に示される塩基配列からなるDNA。
(h)配列番号3に示される塩基配列の全部もしくは一部の配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソフタル酸3,4−ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ・コンポーネントとともに、イソフタル酸からイソフタル酸3,4−シス−ジヒドロジオールを生成する活性を有する蛋白質をコードするDNA。
(i)配列番号6に示されるアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするDNA。
(j)配列番号6に示されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および/または付加された配列を含み、かつイソフタル酸3,4−ジオキシゲナーゼ・オキシゲナーゼ・コンポーネントとともに、イソフタル酸からイソフタル酸3,4−シス−ジヒドロジオールを生成する活性を有する蛋白質をコードするDNA。
(k)配列番号5に示される塩基配列からなるDNA。
(l)配列番号5に示される塩基配列の全部もしくは一部の配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソフタル酸3,4−ジオ
キシゲナーゼ・オキシゲナーゼ・コンポーネントとともに、イソフタル酸からイソフタル酸3,4−シス−ジヒドロジオールを生成する活性を有する蛋白質をコードするDNA。
(m)配列番号8に示されるアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするDNA。
(n)配列番号8に示されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および/または付加された配列を含み、かつイソフタル酸3,4−シス−ジヒドロジオールからプロトカテク酸を生成する活性を有する蛋白質をコードするDNA。
(o)配列番号7に示される塩基配列からなるDNA。
(p)配列番号7に示される塩基配列の全部もしくは一部の配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソフタル酸3,4−シス−ジヒドロジオールからプロトカテク酸を生成する活性を有する蛋白質をコードするDNA。
プライマー)を用いて、ハイブリダイゼイション法やPCR法により得ることができる。なお、本菌株は独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター(NPMD)(〒292-0818 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8)に受託番号NITE BP-1209として国
際寄託されており、分譲を受けることができる。
えばpUC系のプラスミドやpBR322系のプラスミドあるいはその誘導体が挙げられる。ここ
で、「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、挿入、付加および/または逆位などによってプラスミドに改変を施したものを意味する。なお、ここでいう改変とは、変異剤やUV照射などによる変異処理、あるいは自然変異などによる改変をも含む。より具体的には、ベクターとしては、例えば、pUC19〔Gene, 33, 103 (1985)〕、pUC18、pBR322、pHelix1(ロ
シュ・ダイアグノスティクス社製)、pKK233-2(アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製)、pSE280(インビトロジェン社製)、pGEMEX-1(プロメガ社製)、pQE-8(キアゲ
ン社製)、pET-3(ノバジェン社製)pBluescriptII SK(+)、pBluescript II KS(+)(ストラタジーン社製)、pSTV28(タカラバイオ社製)、pUC118(タカラバイオ社製)等を用いることができる。
ンパク質により制御されるPmプロモーターを用いることができる。
本発明の組換えDNAにおいては、本発明のDNAの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
また、イソフタル酸輸送タンパク質の発現に加えて、組換えDNA技術などを用いて、上記のイソフタル酸代謝酵素の発現量を増強した微生物を作製し、イソフタル酸代謝物の生産量を向上させることもできる。
具体的には、上記イソフタル酸輸送タンパク質遺伝子または上記のイソフタル酸代謝酵素遺伝子を発現させるためのプロモーターとして天然のプロモーターよりも転写活性が強いプロモーターを用いる、あるいは該タンパク質をコードする遺伝子の転写を終結するためのターミネーターとして天然のターミネーターよりも転写終結活性が強いターミネーターを用いる、あるいは発現ベクターとして高コピー数ベクターを利用すること、相同組換えで染色体上に組み込むことなどがあげられる。
培養し、培養物中にイソフタル酸代謝物を生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、プロトカテク酸などのイソフタル酸代謝物を製造することができる。また、本発明のイソフタル酸輸送タンパク質を発現するイソフタル酸代謝物生産微生物を培養した後、イソフタル酸を含む水性媒体中に、該微生物の培養物もしくは該培養物の処理物を加えることにより、該媒体中にイソフタル酸代謝物を生成、蓄積させ、該媒体からイソフタル酸代謝物を採取することもできる。
イソフタル酸代謝物として没食子酸を製造する場合は、イソフタル酸代謝酵素として、イソフタル酸3,4−ジオキシゲナーゼ・オキシゲナーゼ・コンポーネントおよびレダク
ターゼ・コンポーネントならびにイソフタル酸3,4−シス−ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼに加えて、プロトカテク酸の5位を酸化する酵素を用いることが好ましい(特開2009-065839および特開2009-213392)。
度のリン酸緩衝液(pH6〜10)等で洗浄された菌体を使用することができる。菌体の固定
化は、それ自体既知の通常用いられている方法に従い、アクリルアミドモノマー、アルギン酸、またはカラギーナン等の適当な担体に菌体等を固定化させる方法により行うことができる。
性媒体における酵素反応温度およびpHは特に限定されないが、通常10〜60℃、好ましくは15〜50℃が適当であり、反応液中のpHは5〜10、好ましくは6〜9付近とすることができ
る。また、pHの調整は、酸またはアルカリを添加して行うことができる。
%(W/V)、好ましくは0.005〜0.02%である。
溶剤によって抽出することにより単離・精製することができる。また、必要に応じて遠心分離等により該培養液から菌体等の不溶成分を除いた後、例えば、活性炭を用いる方法、イオン交換樹脂を用いる方法、結晶化法、沈殿法等の方法を単独でまたは組み合わせることによってイソフタル酸代謝物を採取することができる。
1.イソフタル酸輸送タンパク質候補をコードする遺伝子の同定
ロドコッカス属細菌HAL1831株のゲノムDNA配列をもとに、翻訳領域予測プログラム
であるGeneLook〔Gene 346, 115 (2005)〕を用いて翻訳領域を予測した。続いて、予測された翻訳領域に対してBLAST相同性解析を用いて既存のタンパク質のアミノ酸配列との相
同性解析を行った。その結果、配列番号2に示されるアミノ酸配列を有するメジャー・ファシリテーター・スーパーファミリーに属する輸送タンパク質(MFS2タンパク質と命名)をコードするDNA(配列番号1)をイソフタル酸輸送タンパク質候補として同定した。なお、ロドコッカス属細菌HAL1831株のMFS2タンパク質をコードする遺伝子をmfs2遺伝子
と名付ける。
(1)遺伝子クローニング用のPCRプライマーの設計と合成
上記で同定したMFS2タンパク質をコードするmfs2遺伝子のDNA配列情報をもとに、PCR法を用いてmfs2遺伝子のDNAをクローニングするためのPCRプライマーを設計し、合成した。PCRプライマーの塩基配列は配列番号9と10に示した。なお、プライマーの合成は株式会社グライナー・ジャパンに外注した。
上記(2)で得た染色体DNAを鋳型にし、配列番号9と10に示されるPCRプライマーを用いて、添付の説明書に従ってPrimeSTAR DNAポリメラーゼ(タカラバイオから購入)を用いてmfs2遺伝子を増幅した。
低コピー発現ベクターpRTCPmc8は、プラスミドベクターpREP4(インビトロジェン社か
ら製品番号V004-50として入手)をもとに下記の手順で造成した。pREP4を制限酵素HindIIIで切断した後、平滑末端にし、再結合することによりpREP4DHを造成した。さらにpREP4DHを制限酵素XbaIで切断した後、平滑末端にし、再結合することによりpREP4DHXを造成し
た。pREP4DHXを鋳型として、配列番号11と12で表わされる1組の合成DNAを用いるP
CR法により、制限酵素SfiI部位を導入したPCR増幅断片を得た。得られたPCR増幅断片を制限酵素BamHIで消化し、連結することにより、プラスミドpRTC_SfiIを造成した。続いて、プラスミドベクターpRTC_SfiIのSfiIサイトに配列番号13に示す配列を有する
合成DNA由来の2本鎖DNAを挿入することにより、低コピー発現ベクターpRTCPmc8を造成した。なお、配列番号13に示したDNAの配列は、その両末端にpRTC_SfiI由来のSfiIサイトの配列も含んでいる。目的遺伝子の挿入に利用する制限酵素PacI部位と制限酵
素NotI部位は、配列番号13に示す配列においては、それぞれ塩基番号199と塩基番号217
に存在する。
上記(2)で得られたMFS2タンパク質をコードするDNAを精製した。精製した目的DNAを制限酵素PacIと制限酵素NotIで消化した後、上記(3)で造成した低コピー発現ベクターpRTCPmc8の制限酵素PacI-NotI部位に組み込むことによりプラスミドpRTCPmc8_MFS
を造成した。
(1)mfs2遺伝子のクローニング用PCRプライマーの設計と合成
細胞内に取り込まれたイソフタル酸をイソフタル酸3,4−ジオキシゲナーゼのオキシゲナーゼ・コンポーネント・タンパク質およびレダクターゼ・コンポーネント・タンパク質ならびにイソフタル酸3,4−シス−ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼ・タンパク質によりプロトカテク酸に転換することにより、MFS2タンパク質によるイソフタル酸の細胞内への取り込みとイソフタル酸代謝物の生産を下記のようにして調べた。
コードする遺伝子(以下、イソフタル酸代謝遺伝子群という)を保有していることから、両菌株のゲノムDNA配列を、ナショナル・センター・フォア・バイオテクノロジー・インフォメーション(以下、NCBIと略記する)のジェンバンク(GenBank;GBと略記
する)のデータベースからGBアクセッション番号AB501291ならびにGBアクセッション番号AY923836として得た。また、これらイソフタル酸代謝遺伝子群と高い相同性を示すDNA配列として、コマモナス・テストステロニ KF-1株のゲノムDNA配列(GBアクセ
ッション番号NZ_AAUJ02000001)から塩基番号2321357〜2325424の塩基配列を得た。
5'プライマー(配列番号14と18)にはSwaI認識部位を付加した。また、全ての3'プライマー(配列番号15と17と19)にはPmeI認識部位とNotI認識部位を付加した。
テレフタル酸またはイソフタル酸を唯一炭素源として生育できるコマモナス・テストステロニ 72W2株を10 mM テレフタル酸を含有する5 mlのW液体培地に接種し、30℃で24時
間振とう培養を行った後、菌体を集菌し、ゲノムDNA調製キット(QIAGEN社製Gentra Puregene Yeast/Bactキット)を用いて72W2株の染色体DNAを調製した。コマモナス・テストステロニ 72W2株は独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター(NPMD)(〒292-0818 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8)に受託番号NITE BP-1209として寄託されており、分譲を受けることができる。W液体培地の組成は、リン酸二水素カリウム0.85 g/L、リン酸水素二ナトリウム4.9 g/L、硫酸アンモニウム0.5 g/L、硫酸マグネシウム七水和物9.5 mg/L、硫酸鉄(II)七水和物9.5 mg/L、酸化マグネシウム10.75 mg/L、炭酸カルシウム2 mg/L、硫酸亜鉛 七水和物4.5 mg/ml、硫酸マンガン(II) 四水和物1.12mg/L、硫酸銅(II)五水和物0.25 mg/L、硫酸コバルト(II)七水和物0.28 g/L、ホウ酸0.
06 mg/Lである。
上記(2)で得た72W2株の染色体DNAを鋳型にし、配列番号14と15、配列番号16と17、ならびに配列番号18と19で表わされるPCRプライマーを用いて、添付の説明書に従ってPrimeSTAR DNAポリメラーゼを用いてイソフタル酸代謝遺伝子群のDNAを増幅した。
上記(3)で増幅した72W2株のiphA遺伝子のDNA、iphB遺伝子のDNAおよびiphD遺伝子のDNAをTaq DNAポリメラーゼによって各DNA断片の3'末端にA残基を付加した後、各DNA断片をゲル電気泳動法により精製し、pT7Blue(Novagen社製)由来のTベクターに組み込むことにより、それぞれの遺伝子を運ぶプラスミドpT7Blue_iphA、pT7Blue_iphBおよびpT7Blue_iphDを造成した。
上記(4)でクローニングした72W2株のiphA遺伝子、iphB遺伝子およびiphD遺伝子の塩基配列情報を得るため、ジデオキシヌクレオチド酵素法(dideoxychain termination法)〔Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 74, 5463 (1977)〕により塩基配列の決定を行い、それぞれのプラスミドが目的の遺伝子を含むことを確認した。なお、塩基配列の決定は株式会社マクロジェンジャパンに外注した。
エシェリヒア・コリMG1655株、JM109株、JM109(DE3)株およびBL21(DE3)株を用いて上記遺伝子を効率よく発現させるために、目的遺伝子の転写は疑似遺伝子に依存し、疑似遺伝子の翻訳効率を維持した状態で目的遺伝子も翻訳される発現系の構築を行った。
列番号20〜25で表わされる6本の合成DNAを合成した。これら合成DNAをpUC19
のKpnI部位とEcoRI部位の間に挿入することによりプラスミドpUC1LT1を構築した。次いで、pUC1LT1のPvuII部位とHindIII部位の間を削除したpULTDL1を構築した。pULTDL1にT7プ
ロモーター配列ならびに疑似遺伝子および目的遺伝子を連結するための制限酵素PacI部位を挿入するために、配列番号26〜31で表わされる6本の合成DNAを合成した。これら合成DNAをpULTDL1のSpHI部位とSalI部位の間に挿入することにより発現プラスミドpUTPELT19を構築した。次いで、pUTPELT19のBglII部位とPacI部位の間を配列番号32で表わされる配列にPCR法を用いて変換した発現プラスミドpUTPEaLT19を構築した。
ず、XylS-Pmプロモーター領域は国立遺伝学研究所から入手したプラスミドpJB866を鋳型
として、1組のDNAプライマー(配列番号33と34)を用いて、XylS-Pmプロモータ
ーの全領域をPrimeSTAR DNAポリメラーゼを用いたPCR反応により増幅した。Taq DNAポリメラーゼによって増幅DNA断片の3’末端にA残基を付加した後、増幅DNA断片をゲル電気泳動法により精製し、pT7Blue由来のTベクターに組み込むことにより、XylS-Pmプロモーターの全領域を保持するプラスミドpT7-xylS_Pmを構築した。pT7-xylS_Pmから制限酵素SbfIと制限酵素BamHIによりXylS-Pmプロモーター領域を切り出し、pUTPEaLT19のSbfI部位とBglII部位の間に組み込むことにより、pUXPEaLT19を造成した。
iphD遺伝子の内部に存在するNotI部位を破壊するために、配列番号35と36に示す1組の合成DNAを用いたPCR法によりNotI部位を破壊したプラスミドpT7Blue_iphDdNを
造成した。次いで、pT7Blue_iphDdNから遺伝子内部のNotI部位が破壊されたiphD遺伝子を制限酵素PacIと制限酵素NotIにより切り出し、上記(6)で造成した発現ベクターpUXPEaLT19のNotI部位とPacI部位の間に挿入することにより、iphD遺伝子発現プラスミドpUXPEaLT_iphDdNを造成した。さらに、配列番号16と37、配列番号38と39、ならびに配
列番号17と40で表わされる3組の合成DNAを用いたPCR法により、iphD遺伝子内部に存在する大腸菌のレアコドン(AGG)の連続部位の配列を改変した。得られた3種類のPCA増幅断片をそれぞれ制限酵素SacIと制限酵素MluI、制限酵素MluIと制限酵素NsiI、ならびに制限酵素NsiIと制限酵素BsrGIで処理した後、これら3種類の断片をpUXPEaLT_iphDdNのSacI部位とBsrGi部位の間に挿入することにより、iphD遺伝子のレアコドンの
連続部位を改変したプラスミドpUXPEaLT_iphDdNR12を造成した。
上記のようにして構築したプラスミドにおいては、iphA遺伝子とiphB遺伝子は、それぞれ翻訳開始コドンの上流にSwaI部位を、終止コドン下流にPmeI部位とNotI部位を有している。したがって、各遺伝子は制限酵素SwaIと制限酵素NotIにより切り出すことができ、各遺伝子の終止コドン下流の制限酵素PmeIとNotIに挿入することができる。上記(7)で造成したpUXPEaLT_iphDdNR12のPmeI部位とNotI部位の間にiphA遺伝子を挿入することによりpUXPEaLT_iphDdNR12Aを造成した。続いて、造成したpUXPEaLT_iphDdNR12AのPmeI部位とNotI部位の間にiphB遺伝子を挿入することにより、iphD遺伝子、iphA遺伝子およびiphB遺伝子を発現するプラスミドpUXPEaLT_iphDdNR12ABを造成した。続いて、プラスミドpUXPEaLT_iphDdNR12ABをエシェリヒア・コリ JM109株に導入した菌株を造成し、本菌株をJM109-MFS2株と命名した。
イソフタル酸の取り込みとは関係のない遺伝子であるエシェリヒア・コリMG1655株のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子(以下、lacZ遺伝子と略記する)を対照実験に用いることにし
た。lacZ遺伝子の塩基配列としてはNCBIのGBデータベースからGBアクセッション番号JF300162の塩基番号1〜3075の配列を得て、この配列をもとにlacZ遺伝子をクローニ
ングするためにPCRプライマー(配列番号41と42)を設計した。各PCRプライマーの合成は株式会社グライナー(ファスマック)に外注した。該プライマーのうち、lacZ遺伝子の5'プライマー(配列番号41)にはPacI部位を付加し、lacZ遺伝子3'プライマー(配列番号42)にはPmeI部位とNotI部位を付加した。
国立遺伝学研究所・ナショナルバイオリソースプロジェクト大腸菌より入手したエッシェリヒア・コリMG1655株をLB液体培地に接種し、37℃で一晩振とう培養を行った。集菌した菌体をもとに、染色体DNA調製キット(QIAGEN社製Gentra Puregene Yeast/Bact Kit)用いて染色体DNAを調製した。
PrimeSTAR DNAポリメラーゼを用いて、上記(10)で得た染色体DNAを鋳型にし、PCRプライマー(配列番号41と42)を用いて、添付の説明書に従ってlacZ遺伝子を増幅させた。
上記(11)で得たPCR増幅産物を精製し、制限酵素PacIと制限酵素NotIで消化した後、上記(3)で造成した低コピー発現ベクターpRTCPmc8のPacI部位とNotI部位の間に組み込むことによりプラスミドpRTCPmc8_lacZを造成した。続いて、プラスミドpRTCPmc8_lacZをエシェリヒア・コリ JM109株に導入した菌株を造成し、本菌株をJM109-lacZ株と命名した。
実施例1(4)で造成したpRTCPmc8_MFSと実施例2(6)で造成したpUXPEaLT19を保持するJM109-MFS2株を用いて、MFS2タンパク質がイソフタル酸の細胞内輸送を促進するかどうかを次のようにして調べた。JM109-MFS2株の対照としては、JM109-lacZ株を用いた。それぞれの菌株を100 mg/lのアンピシリンと50 mg/lのカナマイシンを含むLB液体培地〔10 g/l トリプトン(Difco社製)、5 g/l 乾燥酵母エキス(Difco社製)、10 g/l 塩化ナ
トリウム〕1 mlで一晩培養した後、培養液を100 mg/lのアンピシリンと50 mg/lのカナマ
イシンを含むLB液体培地20 mlに2%接種し、37℃で培養を行った。対数増殖期にm−
トルイル酸を終濃度1 mMになるように添加した後、30℃で3時間を続けることにより、MFS2タンパク質とLacZタンパク質を誘導発現させた。
ン株式会社より購入)の100 mM水溶液を2μlだけ添加し、30℃、1000 rpmの条件で1時間
反応させた。反応後、菌体を50 mM リン酸カリウム緩衝液(pH 7.0)で5回洗浄した。洗
浄後、50 mM リン酸カリウム緩衝液(pH 7.0)100μlに懸濁し、酢酸エチル500μl−1N
塩酸 10μlを加えた。遠心分離後、上清を450μlとり、新しい1.5 mlチューブに移した。減圧乾燥器で乾固した後、4μlのアセトニトリルと196μlの水を加えた後、チューブの底にある残留物をアセトニトリル−水に懸濁した。この懸濁液を孔径0.2μmのフィルターで濾過した後、表1に示す高速液体クロマトグラフィー(HPLC)の分離条件でLC−TOF型質量分析計(Waters社、LCT Premier XE)による分析を行った。イソフタル酸とプロトカテク酸の同定は、標品のイソフタル酸(シグマアルドリッチジャパン株式会社より購入)とプロトカテク酸(和光純薬工業株式会社より購入)と比較して、HPLCの保持時間と質量分析計からの精密質量値を合わせて行った。
以下のようにして、JM109-mfs2株を用いて細胞内に取り込まれたイソフタル酸がイソフタル酸代謝酵素遺伝子群のタンパク質によってプロトカテク酸に変換できるかどうかを調べた。
接種し、37℃で培養を行った。次に、対数増殖期にm−トルイル酸を終濃度1 mMになるように添加して30℃で3時間培養を続けた。MFS2タンパク質またはlacZタンパク質、ならびにイソフタル酸代謝酵素遺伝子群のタンパク質を発現させた菌体を集菌し、1%グルコースを含む50 mM リン酸カリウム緩衝液(pH 7.0)で洗浄した後、菌体を吸光度600 nmで10.0になるように50 mM リン酸カリウム緩衝液に懸濁した。この菌体懸濁液に対してイソフタル酸を終濃度で5 mMになるように添加した後、1000 rpmの振とう条件で30℃、2時間反
応させた。反応開始後0時間目、1時間目、2時間目に反応液を採取した。それぞれの反応
液2 μlに対して8 μlのアセトニトリルを加えて激しく懸濁した後、遠心にかけた。上清を10 μlとり、新しい1.5 mlチューブに移し、390 μlの水を加えた後、懸濁した。孔径0.2 μmのフィルターで濾過した後、表1に示す高速液体クロマトグラフィー(HPLC)の分離条件でLC−TOF型質量分析計(Waters社、LCT Premier XE)による分析を行った。なお、イソフタル酸とプロトカテク酸の同定は、標品のイソフタル酸(シグマアルドリッチジャパン株式会社より購入)とプロトカテク酸(和光純薬工業株式会社より購入)と比較して、HPLCの保持時間と質量分析計からの精密質量値を合わせて行った。分析結果を図1のグラフに示す。
実施例2(9)で造成したMFS2タンパク質を発現するエッシェリヒアJM109-mfs2株を用いて、イソフタル酸を低濃度で含むテレフタル酸水溶液からイソフタル酸を選択的に取り込んで、該水溶液中のイソフタル酸濃度を減少させることができるかどうかを調べた。JM109-mfs2株の対照としては、JM109-lacZ株を用いた。
JM109-mfs2株とJM109-lacZ株を、それぞれ1 mlのLB液体培地で一晩培養した後、培養液を3 mlのF6.6W培地に吸光度600 nmで0.1になるように接種した。なお、F6.6W/P10/G2培地とは、リン酸二水素カリウム1.36 g/L、クエン酸一水和物 2.1 g/L、硫安 9.9 g/L、硫酸鉄(II)七水和物 1.703 g/L、グルコース 20 g/L、硫酸マグネシウム七水和物 246 mg/ml、塩化カルシウム二水和物 12.9 mg/L、チアミン 10 mg/L、酸化マグネシウム 10.75 mg/L、炭酸カルシウム 2 mg/L、硫酸亜鉛七水和物 4.5 mg/ml、硫酸マンガン四水和物 1.12 mg/L、硫酸銅五水和物 0.2 5mg/L、硫酸コバルト七水和物 0.28 g/L、ホウ酸 0.06 mg/Lを含む水溶液である。
るように添加した後、さらに3時間培養を続けた。培養液を1.185 mlずつ2本の試験管に分注した。一方の試験管には、0.3 ml の0.5 Mテレフタル酸水溶液と15 μl の0.5 Mイソ
フタル酸水溶液を添加することにより、5 mM イソフタル酸を含む100 mMテレフタル酸水
溶液に細胞を懸濁した反応液を調製した。もう一方の試験管には、0.3 ml の滅菌水と15 μl の0.5 Mイソフタル酸水溶液を添加することにより、5 mM イソフタル酸水溶液に細胞を懸濁した反応液を調製した。
取り込み反応とイソフタル酸のプロトカテク酸への転換反応を行った。反応開始後0時間
目、1時間目、2時間目に反応液を採取した。それぞれの反応液10 μlに対して40μlの水
を加えた後、2μlを分注し、8 μlのアセトニトリルを加えて激しく懸濁した後、遠心にかけた。上清を10μlとり、新しい1.5 mlチューブに移し、390μlの水を加え、懸濁した
。孔径0.2μmのフィルターで濾過した後、LC−TOF型質量分析計を用いて、表1に示すHPLC分離条件で代謝産物の分析を行った。なお、テレフタル酸の同定は、標品のテレフタル酸(シグマアルドリッチジャパン株式会社より購入)と比較して、HPLCの保持時間と質量分析計からの精密質量値を合わせて行った。その分析結果を図2に示す。
定したところ、反応時間によってテレフタル酸の濃度はほとんど変わらなかった。これらの結果から、MFS2タンパク質を発現させると、イソフタル酸を低濃度で含むテレフタル酸水溶液からイソフタル酸を選択的に取り込み、さらに取り込まれたプロトカテク酸はプロトカテク酸に転換されることが明らかになった。
Claims (8)
- 以下の(a)、(b)、(c)または(d)に示すDNAを保有する微生物。
(a)配列番号2に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA。
(b)配列番号2に示されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および/または付加された配列を含み、かつイソフタル酸の該細胞内への取り込み機能を有するタンパク質をコードするDNA。
(c)配列番号1に示される塩基配列からなるDNA。
(d)配列番号1に示される塩基配列の全部の配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソフタル酸の該細胞内への取り込み機能を有するタンパク質をコードするDNA。 - 前記DNAで形質転換され、非改変株と比較してイソフタル酸の細胞内への取り込み機能が高められた、請求項1に記載の微生物。
- 前記微生物がエシェリヒア・コリである、請求項2に記載の微生物。
- 請求項1〜3のいずれかに記載の微生物を用いて、細胞内に取り込まれたイソフタル酸をイソフタル酸代謝物に転換し、これを採取することを特徴とする、イソフタル酸代謝物の製造方法。
- 前記微生物がさらにイソフタル酸3,4−ジオキシゲナーゼのオキシゲナーゼ・コンポーネントおよびレダクターゼ・コンポーネントならびにイソフタル酸3,4−シス−ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼを保有する微生物であり、前記イソフタル酸代謝物がプロトカテク酸である、請求項4に記載のイソフタル酸代謝物の製造法。
- 請求項1〜3のいずれかに記載の微生物を用いることを特徴とする、イソフタル酸を微生物の細胞内に取り込ませる方法。
- 請求項1〜3のいずれかに記載の微生物または該培養物の処理物を、イソフタル酸が成分として含まれる水性媒体に添加することを特徴とする、水性媒体中のイソフタル酸を減少させる方法。
- 前記イソフタル酸は、ポリエステル繊維またはポリエステル樹脂の分解によって得られる、請求項7に記載の方法。
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