JP2003506090A - リボフラビンを製造するための単細胞生物または多細胞生物 - Google Patents

リボフラビンを製造するための単細胞生物または多細胞生物

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    • C12P25/00—Preparation of compounds containing alloxazine or isoalloxazine nucleus, e.g. riboflavin

Abstract

(57)【要約】 本願発明はＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−形成に関する酵素活性が、アシビヤ・ゴシピイ種の野生型ＡＴＣＣ１０８９５のＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−形成に関する酵素活性より高い、リボフラビンを生物工学的に製造するための単細胞または多細胞生物、特に微生物に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明はリボフラビンを製造するための単細胞または多細胞の生物に関する。
【０００２】 リボフラビンとも称されるビタミンＢ２は、ヒトおよび動物にとって必須であ
る。ビタミンＢ２欠乏時には、口腔−および咽喉粘膜の炎症、口もとの亀裂、皮
膚皺中の掻痒刺激および炎症、特に皮膚障害、結膜炎、視力低下および角膜の濁
りが現れる。哺乳動物および子供では、成長停止および体重減少が現れることが
ありうる。従って、ビタミンＢ２は、特にビタミン不足時のビタミン調剤として
、かつ飼料添加剤として経済的重要性を有する。更に、これは、食品色素として
、例えばマヨネーズ、アイスクリーム、プッデイング等中に使用される。
【０００３】 リボフラビンの製造は、化学的または微生物学的に行われる。化学的製造法で
は、通常、リボフラビンは多工程法で純粋な最終製品として取得されるが、この
際には、比較的高価な出発物質、例えばＤ−リボースを使用しなければならない
。
【０００４】 リボフラビンの化学的合成のためのもう一つの別な方法は、この物質を微生物
により製造することである。リボフラビンの微生物による製造は、この物質の高
い純度が必要でない場合に特に好適である。このことは例えば、特にリボフラビ
ンを飼料製品の添加物として使用すべき時である。この物質を１工程で得ること
ができる場合には、リボフラビンの微生物による製造が好適である。更に、微生
物による合成のための出発物質としては、再生性の原料、例えば植物油を使用す
ることができる。
【０００５】 真菌、例えば、アシビア・ゴシピイ（Ashbya gossypii）またはエレモテシウ
ム・アシビイ（Elemothecium ashbyi）の発酵によるリボフラビンの製造が公知
である（The Merck Index, Windholz et al ., Merck & Co., 発行、1183頁、198
3, A. Bacher, F. Lingens, Augen. Chem. 1969, p393)が、同様に酵母類、例え
ばカンジダまたはサッカロマイセスおよび細菌類、例えば、クロストリジウム、
バシラスおよびコリネバクテリウムが、リボフラビン生産のために好適である。
【０００６】 更に、酵母カンジダ・ファマタ（Candida famata）を用いる方法が、ＵＳ０５
２３１００７中に記載されている。
【０００７】 リボフラビン過剰生産バクテリア株は例えばＥＰ４０５３７０中に記載されて
おり、この際この菌株はバシラス・ズブチリス（Bacillus subtilis）からのリ
ボフラビン生合成遺伝子の形質転換により得られた。しかしながら、この原核遺
伝子は真核生物、例えばサッカロマイセス・セレビシア（Saccharomyces cerevi
siae）またはアシビア・ゴシピイを用いる組換えリボフラビン製造法のためには
好適ではなかった。従って、ＷＯ９３／０３１８３により、真核生産微生物中で
のリボフラビンの組換え製造法を確立するために、リボフラビン生合成に特異的
な遺伝子が真核生物、すなわちサッカロマイセス・セレビシアから単離された。
しかしながら、リボフラビン生合成に特異的に関与する酵素のための基質の製造
が不十分である場合、この種の組換え製造法はリボフラビン生産にとって全く成
果をもたらさないか、または非常に限られた成果をあげるに過ぎない。
【０００８】 ハンソン（Hanson AM,1967,in Microbial Technology,Peppler,HJ,pp222-250
New York）は１９６７年に、アミノ酸グリシンの添加が、アシビア・ゴシピイの
リボフラビン形成を上昇させることを見いだした。しかしながら、この種の方法
は、グリシンが非常に高価な原料であるという欠点を有する。この理由から、変
異体を製造することにより、リボフラビン生産の最適化を図ることが必要とされ
た。
【０００９】 ドイツ特許公開公報１９５４５４６８.５−Ａ１には、リボフラビン生産微生
物のイソクエン酸リアーゼ活性またはイソクエン酸リアーゼ−遺伝子発現が高め
られた、リボフラビンの微生物による製法が記載されている。更に、ＤＥ１９８
４０７０９Ａ１からはリボフラビンの生物工学的製造のための単細胞または多細
胞生物、特に微生物が公知である。この微生物は、そのリボフラビン合成能が、
グリシンの外からの添加なしに少なくともアシビヤ・ゴシピイ種の野生型ＡＴＣ
Ｃ１０８９２のリボフラビン合成能と同じであるように変化したグリシン物質代
謝を示すことにより優れている。
【００１０】 しかしながら、この方法に比較しても、リボフラビン製造の更なる最適化に対
する要求がある。
【００１１】 従って、本発明の課題は、リボフラビン形成の更なる最適化を可能にする単細
胞または多細胞の生物、有利に微生物をリボフラビンの生物工学的製造のために
提供することである。特に、従来技術に対して経済的である生産を可能にする生
物を提供するべきである。特に、この生物は従来の生物に比較して上昇したリボ
フラビン形成を可能とすべきである。
【００１２】 この課題は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−形成に関する酵素活性が、アシビヤ・ゴシピイ
種の野生型ＡＴＣＣ１０８９５のＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−形成に関する酵素活性より高
い単細胞または多細胞生物により解決する。
【００１３】 促進した細胞内ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−供給の目的は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−形成性酵素
の活性の上昇により、もしくはＮＡＤ（Ｐ）Ｈを消費する酵素の活性の低下によ
り、もしくは特異性の変化により達成することができる。このことは生物の株改
良の公知法で達成することができる。すなわち、最も簡単な場合、相当する株を
微生物学において常用のスクリーニングによる選択により製造することができる
。同様に、突然変異および引き続く選択を使用することも可能である。この際、
突然変異は化学的突然変異誘発によっても、物理的突然変異誘発によっても実施
することができる。更なる方法は選択および突然変異、および引き続く組換えで
ある。最後に、本発明による生物を遺伝子操作により製造することができる。
【００１４】 本発明により、生物を、この生物が細胞内ＮＡＤ（Ｐ）Ｈをその代謝を維持す
るための要求より多量に生産するように変える。細胞内ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−生成の
この上昇は、本発明によりイソクエン酸デヒドロゲナーゼの酵素活性が上昇して
いる生物を製造することにより達成することができる。このことは、例えば触媒
中心を変化させることにより、基質変換率が上昇することにより、またはその際
酵素阻害物質の作用が消失することにより、達せられる。イソクエン酸デヒドロ
ゲナーゼの酵素活性の上昇は酵素合成を高めることにより、例えば遺伝子操作に
よりまたは酵素生合成を抑制する因子を遮断することにより、惹起することがで
きる。
【００１５】 イソクエン酸デヒドロゲナーゼ活性は本発明により有利にはイソクエン酸デヒ
ドロゲナーゼ遺伝子の突然変異により上昇させることができる。この種の突然変
異はクラシカルな方法でランダムに、例えばＵＶ−照射によりまたは突然変異誘
発化学薬品により、または特異的に遺伝子操作法で、例えば欠失、挿入および／
またはヌクレオチド置換により誘発することができる。
【００１６】 イソクエン酸デヒドロゲナーゼ−遺伝子発現はイソクエン酸デヒドロゲナーゼ
遺伝子コピーの組込により、および／またはイソクエン酸デヒドロゲナーゼ遺伝
子発現にプラスに影響を与える調節因子を強化することにより達成することがで
きる。調節要素の強化は有利に転写の時点で行われ、その際特に転写シグナルが
上昇する。その他に、翻訳の強化も可能であり、その際例えばｍ−ＲＮＡの安定
性が改良される。
【００１７】 遺伝子コピー数の上昇のために、例えばイソクエン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子
を、有利にイソクエン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子に付いている（zugeordnete）
調節遺伝子配列、特に遺伝子発現を強化する調節遺伝子を含有する、遺伝子構成
体中にもしくはベクター中に構築することができる。引き続き、イソクエン酸デ
ヒドロゲナーゼ遺伝子を含有する遺伝子構造体で、リボフラビン生産性の微生物
を形質転換する。
【００１８】 本発明により、イソクエン酸デヒドロゲナーゼの過剰発現をプロモータの交換
により達成することができる。この際、別の方法として、高い酵素活性を遺伝子
コピーを組み込むことによりまたはプロモータの交換により達成することも可能
である。しかしながら、同様にしてプロモーターの交換および遺伝子コピーの組
込を同時に行うことにより酵素活性の所望の変化を達成することも可能である。
【００１９】 イソクエン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を変化させることは促進したＮＡＤ（Ｐ
）Ｈ−形成に導き、同時に従来達成することができなかったほど、意想外に高い
リボフラビン形成の上昇に導く。
【００２０】 イソクエン酸デヒドロゲナーゼを有利に微生物、特に有利に真菌から単離する
。その際、アシビヤ属の真菌がやはり有利である。最も有利であるのは、アシビ
ヤ・ゴシピイ種である。
【００２１】 しかし、遺伝子の単離のためには、細胞がイソクエン酸デヒドロゲナーゼの形
成のための配列を有している全てのその他の生物、すなわち植物および動物細胞
、を挙げることができる。遺伝子の単離はイソクエン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子
中で欠失する突然変異体の相同および非相同相補性により、または非相同プロー
ビングまたは非相同プライマーを用いるＰＣＲによっても行われる。サブクロー
ニングのためには相補性プラスミドのインサートを引き続き制限酵素での好適な
工程により最少の大きさにすることができる。推定の遺伝子の配列決定および同
定の後、ＰＣＲによる完全に適合するサブクローニングを行う。そのようにして
得られるフラグメントをインサートとして有するプラスミドをイソクエン酸デヒ
ドロゲナーゼ遺伝子欠失突然変異体中に組み込み、これをイソクエン酸デヒドロ
ゲナーゼ遺伝子の機能に関して試験する。最後に、機能性構造体をリボフラビン
生産体の形質転換のために使用する。
【００２２】 単離および配列決定の後、記載したアミノ酸配列またはそのアレル変異体をコ
ードするヌクレオチド配列を有するイソクエン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が得ら
れる。アレル変異体とは特に相応する配列からヌクレオチドの欠失、挿入および
置換により得られる誘導体を包含し、この際イソクエン酸デヒドロゲナーゼ活性
はそのまま保持されている。相応する配列は図２ｂ中に記載されており、ヌクレ
オチド１〜１２６２である。
【００２３】 イソクエン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は特に図１１によるヌクレオチド−６６
１〜−１のヌクレオチド配列のプロモータ、または実質的に同じ作用のＤＮＡ−
配列を上流に有している。こうして、プロモータの機能もしくは効果が影響を受
けることなく、１つまたは複数のヌクレオチド置換により、挿入および／または
欠失により前記ヌクレオチドを有するプロモータとは異なるプロモータが例えば
この遺伝子の上流に存在していてよい。更に、このプロモータをその配列の変化
によりその効果を上昇させることもまたは有効なプロモータに完全に交換するこ
ともできる。
【００２４】 イソクエン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子に、特にイソクエン酸デヒドロゲナーゼ
遺伝子活性を上昇させる、その他の調節遺伝子配列もしくは調節遺伝子が付いて
いてもよい。こうしてイソクエン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子に例えばいわゆる“
エンハンサー”が付いていてもいてもよく、このエンハンサーはＲＮＡ−ポリメ
ラーゼおよびＤＮＡの間の改良された相互作用を介して上昇したイソクエン酸デ
ヒドロゲナーゼ発現に作用する。
【００２５】 上流にプロモータを有しているかまたは有していない、もしくは調節遺伝子を
有しているかまたは有していないイソクエン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子に、１つ
または複数のＤＮＡ−配列を上流におよび／または下流に有していてもよく、こ
うしてこの遺伝子は遺伝子構造体中に含有されている。イソクエン酸デヒドロゲ
ナーゼ遺伝子のクローニングによりイソクエン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含有
しかつリボフラビン生産体の形質転換に好適であるプラスミドもしくはベクター
が得られる。形質転換により得られる細胞は遺伝子を複製可能な形で、すなわち
付加的なコピーで染色体上に（この際遺伝子コピーはゲノムの任意の位置に相同
組換えにより挿入され）および／またはプラスミドもしくはベクター上に有する
。
【００２６】 本発明により得られる単細胞または多細胞生物は、生物工学的方法に任意に使
用可能な細胞であってよい。このためには、例えば、真菌、酵母、細菌並びに植
物および動物細胞を挙げることができる。本発明において有利であるのは、真菌
からの、特に有利にアシビヤ属の真菌からの形質転換した細胞である。この際、
アシビヤ・ゴシピイ種が特に有利である。
【００２７】 以下に、本願を実施例につき詳細に説明するが、本願はこの実施例により限定
されるものではない： イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＤＰ３）の遺伝子をＰＣＲによりクローニ
ングし、次いで配列決定する（配列は図１１参照）。遺伝子工学的に実施したゲ
ネティシン耐性−遺伝子での交換突然変異誘発による遺伝子の部分欠失（図１）
はサザンブロットにより確認された（図２）。この破壊（disruption）、すなわ
ち真菌のゲノム中の遺伝子の分解は、この遺伝子によりコードされているイソク
エン酸デヒドロゲナーゼを真菌がもはや形成することができないように導く。図
３は野生型ＡＴＣＣ１０８９５に比べて破壊株ＡｇΔＤＰ３ｂ中での酵素活性の
減少を示す。ペルオキシソームの製造において、この酵素がオルガネラ中に局在
している（図１０）ことを示すことができた。野生型−ペルオキシソーム中での
酵素活性は明らかに測定可能であり、一方破壊株のペルオキシソームには全く活
性が見られない。
【００２８】 遺伝子の破壊は、親株と比較してビタミン形成の明らかな減少に導く（図４）
。これに対して遺伝子を付加的なコピー中でかつプラスミド（図６）上の強力な
ＴＥＦ−プロモータの制御下にアシビヤ細胞中に挿入する場合、酵素活性および
リボフラビン形成において明らかな上昇が測定可能である（図５）。
【００２９】 図７は不飽和脂肪酸の物質代謝においてＮＡＤＰＨが、選択可能な３つの反応
経路中の２つにおいて還元剤として必要とされることを示している。その中で含
まれる２,４−ジエノイル−ＣｏＡ−レダクターゼはアシビヤの細胞中で同様に
ペルオキシソーム中に局在する（図８）。ＩＤＰ３−遺伝子の破壊はリノール酸
またはリノレン酸に関する細胞の成長を低下させる。このことは測定することも
できる（図９）。細胞の物質代謝に関するＩＤＰ３の意味はＮＡＤＰＨ−形成に
あることが示されている。
【００３０】 配列に関して： アシビヤ・ゴシピイからのペルオキシソームのＮＡＤＰ−特異的イソシトレー
ト−デヒドロゲナーゼをコードするＡｇＩＤＰ３−遺伝子のヌクレオチド配列お
よびこれから誘導されるアミノ酸配列。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 Ｇ418Ｒ−遺伝子の欠失および挿入により不活性化した遺伝子コピーに対する
染色体ＡｇＩＤＰ３−遺伝子の遺伝子交換のためのベクターｐＩＤＰｋａｎの構
造体を示す図。
【図２】 部分欠失、および同時のＡｇＩＤＰ−遺伝子座へのゲネティシン耐性−カセッ
トの挿入のサザンブロット−分析による試験。ゲノムのＳｐｈＩ−切断ＤＮＡと
ジゴキシゲニン標識プローブとのハイブリダイゼーション。
【図３】 アシビヤ野生型、突然変異体Ａ.ｇ.ΔＩＤＰ３ｂ、およびＡｇＩＤＰ−過剰発
現体であるＡ.ｇ.ｐＡＧＩＤＰ３ａおよびＡ.ｇ.ｐＡＧＩＤＰ３ｂのＮＡＤＰ−
特異的ＩＣＤＨのグルコース完全培地上での成長に関する酵素活性の比較。
【図４】 アシビヤ野生型および突然変異体Ａ.ｇ.ΔＩＤＰ３ｂの大豆油完全培地での成
長およびリボフラビン形成の比較。
【図５】 大豆油完全培地上での培養における、アシビヤ野生型、およびＡｇＩＤＰ３−
過剰発現体であるＡ.ｇ.ｐＡＧＩＤＰ３ａおよびＡ.ｇ.ｐＡＧＩＤＰ３ｂの成長
、リボフラビン形成、およびＮＡＤＰ−特異的ＩＣＤＨの比較。
【図６】 ＴＥＦ−プロモータおよびＴＥＦ−ターミネータの制御下でのＡｇＩＤＰ３−
遺伝子の過剰発現のためのプラスミド。 ＳｐｈＩ−切断部位の導入のためには第２のアミノ酸をコードするヌクレオチ
ドの変更が必要である。アミノ酸グリシンのロイシンへの保存的置換が実施され
た。
【図７】 ペルオキシソーム中の偶数（Ａ）および奇数（Ｂ、Ｃ）のＣ原子に二重結合を
有する不飽和脂肪酸のＨｅｎｋｅ等（１９９８）による分解経路。
【図８】 Ｐｅｒｃｏｌｌ−濃度傾斜におけるアシビヤ−野生型から単離されたオルガネ
ラの分離： マーカー酵素カタラーゼ（ペルオキシソーム）およびフマラーゼ（ミトコンド
リア）、ＮＡＤ−およびＮＡＤＰ−特異的ＩＣＤＨおよび不飽和脂肪酸の分解の
ために必要な２,４−ジエノイル−ＣｏＡ−レダクターゼおよびΔ３、Δ２−エ
ノイル−ＣｏＡ−イソメラーゼの活性［Ｕ／ｍｌ］。
【図９】 種々の脂肪酸上での、アシビヤ野生型、突然変異体Ａ.ｇ.ΔＩＤＰ３ａおよび
Ａ.ｇ.ΔＩＤＰ３ｂおよび過剰発現体であるＡ.ｇ.ｐＡＧＩＤＰ３ａおよびＡ.
ｇ.ｐＡＧＩＤＰ３ｂの放射状成長の比較（Ａ：１８：１ｃｉｓ９；ｂ：１８：
２ｃｉｓ９,１２；Ｃ：１８：３ｃｉｓ９,１２,１５）。
【図１０】 野生型（Ａ）および突然変異体Ａ.ｇ.ΔＩＤＰ３ｂ（Ｂ）の菌糸体からのオル
ガネラの遠心分離によるＰｅｒｃｏｌｌ−濃度傾斜における酵素カタラーゼおよ
びＩＣＤＨの分布。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年９月１３日（２００１．９．１３）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:645 Ｃ１２Ｐ 25/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｐ 25/00 5/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:645） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ヘニング アルトヘーファー ドイツ連邦共和国 リンブルガーホーフ マインシュトラーセ 12 (72)発明者 オスカー ツェルダー ドイツ連邦共和国 シュパイアー ロスマ ルクトシュトラーセ 27 (72)発明者 ホセ エレ レヴエルタ ドヴァル スペイン国 サラマンカ グリリョ 11 ４エ (72)発明者 マリア アンヘレス サントス ガルシア スペイン国 サラマンカ セ／エスクエラ ス １−５ (72)発明者 ヘルマン ザーム ドイツ連邦共和国 ユーリッヒ ヴェンデ リヌスシュトラーセ 71 (72)発明者 クラウス−ペーター シュターマン ドイツ連邦共和国 ユーリッヒ ヴィルヘ ルムシュトラーセ 20 (72)発明者 イーネス メーティング ドイツ連邦共和国 ユーリッヒ ヴィーゼ ンシュトラーセ ３ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA03 AA05 BA08 BA80 CA02 DA11 FA01 FA02 FA13 GA25 HA01 4B064 AH02 CA05 CA19 CC24 DA01 DA10 4B065 AA58X AA58Y AB01 AC14 BA02 BA16 BD50 CA28 CA41 CA44

Claims (21)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−形成に関する酵素活性が、アシビヤ・ゴシ
    ピイ種の野生型ＡＴＣＣ１０８９５のＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−形成に関する酵素活性よ
    り高いことを特徴とする、リボフラビンを生物工学的に製造するための単細胞ま
    たは多細胞生物、特に微生物。
  2. 【請求項２】 高められたイソクエン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する、請
    求項１記載の単細胞または多細胞生物。
  3. 【請求項３】 真菌である、請求項１または２記載の単細胞または多細胞生
    物。
  4. 【請求項４】 アシビヤ属の真菌である請求項１から３までのいずれか１項
    記載の単細胞または多細胞生物。
  5. 【請求項５】 アシビヤ・ゴシピイ種の真菌である請求項１から４までのい
    ずれか１項記載の単細胞または多細胞生物。
  6. 【請求項６】 図１１に記載されたアミノ酸配列およびそのアレル変異体を
    コードするヌクレオチド配列を有するイソクエン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子。
  7. 【請求項７】 図１１によるヌクレオチド１〜１２６２のヌクレオチド配列
    または本質的に同様に作用するＤＮＡ配列を有する請求項６記載のイソクエン酸
    デヒドロゲナーゼ遺伝子。
  8. 【請求項８】 図１１によるヌクレオチド−６６１〜−１を有するヌクレオ
    チド配列の上流プロモータまたは実質的に同様な作用を有するＤＮＡ−配列を有
    する請求項６または７記載のイソクエン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子。
  9. 【請求項９】 これに付いている調節遺伝子配列を有する請求項６から８ま
    でのいずれか１項記載のイソクエン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子。
  10. 【請求項１０】 請求項６から９までのいずれか１項記載のイソクエン酸デ
    ヒドロゲナーゼ遺伝子を含有する遺伝子構造体。
  11. 【請求項１１】 請求項６から９までのいずれか１項記載のイソクエン酸デ
    ヒドロゲナーゼ遺伝子または請求項１０記載の遺伝子構造体を含有するベクター
    。
  12. 【請求項１２】 請求項６から９までのいずれか１項記載のイソクエン酸デ
    ヒドロゲナーゼ遺伝子または請求項１０記載の遺伝子構造体を複製可能な形で含
    有する、リボフラビンを製造するための形質転換生物。
  13. 【請求項１３】 請求項１１記載のベクターを含有する請求項１２記載の形
    質転換生物。
  14. 【請求項１４】 請求項１から５までのいずれか１項記載の生物を使用する
    ことを特徴とする、リボフラビンの製法。
  15. 【請求項１５】 そのＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−形成に関する酵素活性が、アシビヤ
    ・ゴシピイ種の野生型ＡＴＣＣ１０８９５のＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−形成に関する酵素
    活性より高くなるように、変化させることを特徴とする、リボフラビンを生産す
    る単細胞または多細胞生物の製法。
  16. 【請求項１６】 遺伝子工学的な方法で生物を変化させる請求項１５記載の
    製法。
  17. 【請求項１７】 プロモータの置換および／または遺伝子コピー数の上昇に
    より生物を変化させる請求項１５または１６記載の製法。
  18. 【請求項１８】 内生イソクエン酸デヒドロゲナーゼ−遺伝子の変化により
    上昇した活性を有する酵素を生成する請求項１５から１７までのいずれか１項記
    載の製法。
  19. 【請求項１９】 リボフラビンを製造するための請求項１から５および１２
    および１３のいずれか１項記載の生物の使用。
  20. 【請求項２０】 請求項１から５および１２および１３のいずれか１項記載
    の生物を製造するための、請求項６から９までのいずれか１項記載のイソクエン
    酸デヒドロゲナーゼ遺伝子および請求項１０記載の遺伝子構造体の使用。
  21. 【請求項２１】 請求項１から５および１２および１３のいずれか１項記載
    の生物を製造するための請求項１１記載のベクターの使用。
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