PT2164975E - Processo para a produção de uma solução aquosa de glicose - Google Patents

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DESCRIÇÃO "PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE UMA SOLUÇÃO AQUOSA DE GLICOSE" A presente invenção é relativa a um processo para a produção de uma solução aquosa concentrada de glicose de milho ou de grãos de milho. A glicose, em particular as soluções de glicose aquosas, constitui uma fonte de carbono de base para muitos processos químicos e de fermentação para a produção de produtos orgânicos. A título de exemplo, ocorre na fermentação a metabolização das moléculas de glicose pelos microrganismos utilizados e ocorre assim a sua transformação no produto de valor orgânico pretendido. A gama de produtos orgânicos produzidos deste modo abrange, por exemplo, os compostos voláteis de baixo peso molecular, como etanol, ácidos carboxílicos alifáticos, aminoácidos, vitaminas, carotinóides, álcoois de açúcar, ácidos de açúcar e polióis, mas também enzimas e polímeros orgânicos.

Nestes processos de fermentação geralmente conhecidos utiliza-se, em função das condições processuais e dos produtos a ser produzidos, diferentes fontes de carbono. Estas vão da sacarose pura, passando por melaço de cana-de-açúcar e de beterraba, glicose de hidrolisados de amido, até à glicerina.

Na produção convencional de glicose de amido, obtém-se primeiro o amido de uma fonte de amido natural, como batata, mandioca, cereais, por exemplo, trigo, milho, cevada, centeio, triticale ou arroz, e procede-se em seguida à sua hidrólise, normalmente através de uma 2 liquefação enzimática, seguida de uma sacarificação enzimática.

Na produção de glicose através da liquefação e da sacarificação de amido, parte-se normalmente de um amido pré-purifiçado, ou seja, as fontes de amido naturais, como batata, mandioca e cereais, por exemplo, trigo, milho, cevada, centeio, triticale ou arroz, são separadas nos componentes de amido e nos componentes que não são amido.

No caso dos cereais, em particular do milho, a obtenção do amido pré-purifiçado ocorre por uma moagem a húmido em várias etapas. Neste intuito, os grãos de cereais são numa primeira etapa inchados em água. Os grãos inchados são fragmentados numa segunda etapa com a adição de água, sendo o gérmen em seguida separado. Após a separação do gérmen, ocorre uma moagem fina dos restantes componentes, ou seja, amido, glúten e farelo (componentes fibrosos). Noutras etapas, a separação do farelo e do glúten ocorre de modo a que ao fim se obtenha uma suspensão aquosa de amido, que é introduzida a seguir numa liquefação/sacarificação para a produção da glicose. Deste modo, obtém-se uma glicose muito pura. A moagem a húmido dos grãos de cereais é contudo relativamente cara. Dado que é necessário amolecer primeiro os grãos de cereais com água, tem-se de secar os produtos secundários ou residuais da obtenção do amido, tais como proteínas (glúten), componentes de gérmen e componentes fibrosos, antes da continuação do processamento ou da depuração, o que está associado a um considerável consumo energético. Além disso, o custos com equipamento são elevados e as respetivas instalações requerem assim um grande investimento de capital. Dado que, por outro lado, 3 os cereais e sobretudo o milho são fontes importantes de amido, houve muitas tentativas de arranjar alternativas mais favoráveis para a obtenção de glicose a partir destas fontes de amido.

Um método barato de aproveitamento dos componentes de amido dos cereais, em particular do milho, é representado pela moagem a seco dos grãos de cereais. Nesse sentido, mói-se os grãos de cereais, eventualmente após humidificação com pequenas quantidades de água, para melhorar a maleabilidade do gérmen, e introduz-se o produto de moagem obtido como um todo numa liquefação/sacarificação enzimática. Deste modo, obtém-se uma glicose aquosa, que contém grandes quantidades de sólidos insolúveis, que resultam dos componentes que não são amido do cereal, nomeadamente fibras das cascas, óleo do gérmen e proteínas, ou seja, glúten. Os processos para a produção da glicose através da moagem a seco de cereais, com posterior liquefação/sacarificação são conhecidos e encontram-se descritos, por exemplo, in "The Alcohol Textbook - A reference for the beverage, fuel and industrial alcohol industries", Jaques et al. (ed.), Nottingham Univ. Press 1995, ISBN 1-8977676-735, Capítulo 2, pág. 7 a 23, e in McAloon et al., "Determining the cost of producing ethanol from corn starch and lignocellulosic feedstocks", NREL/TP-580-28893, National Renewable Energy Laboratory, outubro 2000. A glicose obtida por processos de moagem a seco é utilizada até à data em termos técnicos apenas na produção do bioetanol. O motivo disto reside em várias desvantagens inerentes a este processo: por um lado, o grande teor de componentes insolúveis na glicose aquosa assim produzida tem por consequência a solução de glicose aquosa ter já uma grande viscosidade com baixas concentrações de glicose, e a 4 solução de glicose aquosa ser além disso de estrutura viscosa. Por conseguinte, a concentração máxima de glicose numa glicose aquosa produzida deste modo encontra-se normalmente limitada a de 30 a 33% em peso. Enquanto grandes concentrações de glicose não são necessárias para a produção do bioetanol por fermentação, ou são até problemáticas devido à toxicidade do etanol produzido na fermentação, uma baixa concentração de glicose leva, na produção de outros produtos químicos, a um aumento indesejado do fluxo volumétrico. Além disso, os componentes insolúveis podem ter um efeito negativo na fermentação, por exemplo, ao nível das transferências de oxigénio ou do consumo de oxigénio dos microrganismos empregues na fermentação. Além disso, estes sólidos podem dificultar de forma considerável o posterior acabamento e o isolamento do produto produzido por fermentação. Estes problemas desempenham um papel apenas secundário na produção do bioetanol através da fermentação anaeróbica, seguida de separação por destilação.

Em tempos mais recentes, houve diferentes relatos acerca da utilização de uma glicose produzida por um processo de moagem a seco, na produção por fermentação de produtos químicos finos (ver WO 2005/116228 e WO 2007/028804) . O processo, descrito nestes pedidos, de moagem a seco com posterior liquefação/sacarificação permite a produção de uma glicose aquosa com um aumento da concentração de açúcar, sem necessidade de uma separação dos sólidos insolúveis contidos na fonte de amido. A utilização de uma glicose produzida deste modo leva contudo, nalguns casos, a uma inibição ou a uma retardação da proliferação dos microrganismos. 5

Como já acima referido, a glicose aquosa produzida por um processo de moagem a seco com posterior liquefação/sacarificação contém, a par dos componentes de açúcar fermentáveis, grandes quantidades de sólidos insolúveis, os quais não são passíveis de fermentação. No caso da utilização de uma glicose aquosa deste tipo numa fermentação, seja na produção do bioetanol seja na produção de produtos químicos finos, estes sólidos são canalizados pelo processo de fermentação e aumentam assim o fluxo volumétrico. Após a separação do produto de fermentação, permanecem como sólido que terá de ser depurado, ou que em todo o caso pode ser utilizado como ração animal. Dado que os componentes não fermentáveis podem, por seu lado, representar em certa medida materiais, houve diversos relatos relativamente a separar uma parte ou todos estes componentes antes da fermentação.

Assim, no âmbito da produção do bioetanol, por exemplo, o US 2005/0233030 e o US 2005/0239181 e N. Jakel in Biofuels Journal (http://www.renessen.com/news_release/Renessen_ethanol_art. pdf) descrevem uma moagem a seco do milho, na qual se separa o produto de moagem numa fração de endosperma rica em amido e numa fração fibrosa/de gérmen pobre em amido, e na qual se introduz essencialmente apenas a fração de endosperma numa liquefação/sacarificação. Deste modo, é possível reduzir a quantidade do produto de acoplamento que se precipita na produção por fermentação do etanol. Além disso, é possível utilizar a fração de gérmen/fibras na produção de óleo vegetal.

No US 4,287,304, é feita a descrição de um processo para a produção de uma solução aquosa de glicose a partir de milho moído seco. Neste processo, ocorre primeiro na moagem a 6 seco a separação numa fração de gérmen/de fibras e numa fração de endosperma rica em amido, contendo ainda, a par do amido, componentes proteicos (glúten) e partes do óleo contido nos grãos. A fração de endosperma é depois introduzida numa liquefação. A partir do hidrolisado parcial de amido aquoso ai obtido, separa-se os componentes insolúveis, ou seja, a proteína e os componentes oleicos. Depois, introduz-se o amido liquefeito, portanto o hidrolisado parcial de amido aquoso, numa sacarificação. Experiências próprias da autora do pedido de patente mostraram que a separação dos componentes insolúveis é problemática e cara ao nível do amido liquefeito e que está associada a perdas de glicose. Além disso, obtém-se deste modo uma glicose aquosa com uma concentração relativamente baixa de glicose.

No CN 1173541, é feita a descrição de um processo para a produção do ácido láctico através de fermentação, em que se utiliza uma glicose obtida a partir do milho ou do arroz como fonte de açúcar. No processo aí descrito, mói-se milho ou arroz a seco e introduz-se primeiro o produto de moagem obtido numa liquefação. 0 mosto aí obtido é separado numa fase líquida, que contém os componentes de amido semi-hidrolisados, e numa fase sólida, que contém os componentes sólidos não fermentáveis insolúveis do produto de moagem. A fase líquida é em seguida levada para uma sacarificação. Este processo tem desvantagens semelhantes ao processo descrito no US 4,287,304. A separação dos componentes sólidos não fermentáveis antes da fermentação serve para que sejam aproveitados como ração animal.

As patentes WO 2006/004748 A (GRAINVALUE, LLC, 12 de j aneiro de 2006) e US 4 448 881 A (MULLER, W. C. & MILLER, F. D., 15 de maio de 1984) revelam processos para a 7 produção de soluções aquosas de glicose de milho, compreendendo: a) moagem a seco de fracionamento de grãos de milho, separando-se os grãos de milho numa fração de endosperma contendo amido de milho e numa fração de gérmen rica em óleo e, eventualmente, numa fração de farelo, b) liquefação e sacarificação enzimáticas de uma parte do amido de milho numa suspensão aquosa da fração de endosperma, obtendo-se uma solução de glicose aquosa contendo glúten de milho, c) empobrecimento do glúten de milho e do farelo eventualmente existente a partir da solução de glicose aquosa, estando determinadas as soluções de glicose para a fermentação do etanol. A patente WO 2005/116228 A (BASF AKTIENGESELLSCHAFT, 8 de dezembro de 2005) revela um processo para a produção de uma solução de glicose aquosa concentrada, com um teor de monossacáridos superior a 20% em peso de milho, compreendendo: a) moagem a seco de grãos de milho b) liquefação e sacarificação enzimáticas do amido de milho numa suspensão aquosa, obtendo-se uma solução aquosa de glicose contendo glúten de milho, estando determinada a solução de glicose para a produção por fermentação de produtos químicos finos. A presente invenção teve assim por objetivo arranjar um processo para a produção de uma solução aquosa de glicose de milho, que não apresentasse as desvantagens do estado da técnica. Em particular, a glicose desse modo obtida deverá 8 ser adequada não apenas à produção do bioetanol, mas também à produção dos diferentes produtos químicos finos do mesmo.

Este objetivo é atingido pelo processo seguidamente descrito. Assim, a presente invenção é relativa a um processo para a produção de uma solução aquosa de glicose de milho, compreendendo a) a moagem a seco de fracionamento de grãos de milho, separando-se os grãos de milho numa fração de endosperma contendo amido de milho e numa fração de gérmen rica em óleo e, eventualmente, numa fração de farelo; b) liquefação e sacarificação enzimáticas do amido de milho numa suspensão aquosa da fração de endosperma, obtendo-se uma solução de glicose aquosa contendo glúten de milho; e c) empobrecimento do glúten de milho e do farelo eventualmente existente a partir da solução aquosa de glicose, utilizando-se na etapa b) uma suspensão aquosa da farinha de milho obtida na etapa a), contendo a fração de endosperma e eventualmente a fração de farelo, escolhendo-se a quantidade de farinha de milho de modo a que a suspensão aquosa contenha 30 a 45% em peso de amido, em relação ao peso total da suspensão. O processo de acordo com a invenção está associado a uma série de vantagens. Por um lado, os custos com equipamento, mas também o consumo de energia, para a produção de uma solução aquosa de glicose pelo processo de acordo com a 9 invenção, são muito mais baixos do que com o processo convencional da moagem a húmido. Além disso, a glicose que pode ser obtida pelo processo de acordo com a invenção adequa-se em particular como fonte de carbono aos processos de fermentação para a produção de produtos químicos. A sua adequação não é apenas claramente melhor do que de uma solução de glicose que pode ser obtida pela liquefação/pela sacarificação de uma farinha de milho produzida por moagem a seco, levando em vez, em comparação com uma glicose pura ou com uma glicose obtida num processo de moagem a húmido, no caso de uma série de microrganismos, a um melhor crescimento desses microrganismos utilizados na fermentação e/ou a maiores rendimentos, em relação à glicose empregue. Além disso, é possível produzir com o processo de acordo com a invenção soluções de glicose com uma maior concentração de glicose. As propriedades de viscosidade de uma glicose, que pode ser obtida de acordo com a invenção, são claramente superiores às de uma glicose produzida pela liquefação/pela sacarificação de uma moagem a seco convencional sem fracionamento da farinha de milho produzida. 0 conceito "farelo" ou "casca" é relativo ao revestimento exterior duro do grão de milho, o pericárpio (normalmente < 2% em peso do grão de milho). Os "componentes do farelo" ou os "componentes da casca" são fragmentos ou partes do mesmo/a. A "fração de farelo" ou a "fração de casca" consiste em teores substanciais do farelo ou da casca, podendo também conter outros componentes do grão de milho, em particular partes do endosperma. 0 conceito "gérmen" é relativo ao embrião do grão de milho (perfaz normalmente de 8 a 10% em peso do grão de milho) . Os "componentes de gérmen" são fragmentos ou partes do 10 mesmo. A "fração de gérmen" consiste essencialmente em teores do gérmen, mas pode conter igualmente componentes do grão de milho, como, por exemplo, partes do endosperma ou do farelo. O conceito "endosperma" é relativo à parte contendo primariamente amido do grão de milho (normalmente de 80 a 85% em peso do grão de milho) . A "fração de endosperma" consiste em partes substanciais de endosperma, mas pode conter igualmente outros componentes, como, por exemplo, partes do gérmen ou do farelo.

As soluções de glicose produzidas pelo processo de acordo com a invenção apresentam uma composição caracteristica, não apresentada pelas soluções de glicose produzidas por outras vias.

Além disso, o componente proteico, glúten de milho, originado na etapa c) do processo de acordo com a invenção, distingue-se por uma qualidade particular, que é distinta dos outros componentes de glúten originados noutros processos de preparação do milho, fazendo com que seja apropriado para uma série de aplicações.

Etapa a):

Na Etapa a) do processo de acordo com a invenção, os grãos de milho são sujeitos a uma moagem a seco de fracionamento. A moagem de fracionamento serve para fragmentar os grãos de milho e para separar o grão de milho nos seus componentes, nomeadamente gérmen, endosperma e componentes da casca (seguidamente também denominados componentes do farelo) .

Em conformidade com a invenção, separa-se nesta etapa a quantidade principal, ou seja, pelo menos 70% em peso, em 11 particular pelo menos 80% em peso, do gérmen contido nos grãos de milho ou dos componentes de gérmen como fração de gérmen rica em óleo, dos demais componentes do grão de milho, ou seja, endosperma e componentes da casca. Normalmente, ocorre na moagem a seco de fracionamento também uma separação numa fração de endosperma, contendo essencialmente os componentes de amido e proteicos dos grãos de milho, assim como numa fração de farelo, contendo essencialmente, ou seja, pelo menos 60% em peso, em particular pelo menos 80% em peso dos componentes de casca contidos nos grãos de milho.

Para evitar perdas de amido, é contudo possível introduzir uma parte ou toda a quantidade, por exemplo, de 10 a 100% em peso, da fração de farelo juntamente com a fração de endosperma, na liquefação e na sacarificação da Etapa b) . Em alternativa, é possível levar a fração de farelo para outra utilização e introduzir, na liquefação/na sacarificação da etapa b), apenas a fração de endosperma e, eventualmente, reduzidas quantidades de farelo, ou seja, menos de 20% em peso, em relação aos componentes de farelo contidos nos grãos de milho.

Para a moagem a seco de fracionamento dos grãos de milho, os grãos de milho podem ser utilizados tal como fornecidos. Preferencialmente, emprega-se contudo grãos de milho purificados. Na purificação, separa-se tanto as impurezas grosseiras, como, por exemplo, pedaços de madeira, partes de plantas, como caules ou folhas, pedras, fragmentos de vidro, parafusos, etc., como também impurezas finas, tais como grãos de milho partidos, sementes estranhas, pedras de reduzidas dimensões, areia, dos grãos de milho. A separação pode ser realizada de forma conhecida, através, por exemplo, de peneiração, de crivagem ou de combinações 12 destas medidas. Normalmente, procede-se neste caso de modo a separar primeiro as partículas grosseiras dos grãos de milho e das impurezas finas e, depois, realizar uma separação das partículas finas dos grãos de milho. As partículas grosseiras são aquelas cuja granulometria se encontra pelo menos acima de um limite de 15 a 20 mm. As partículas finas são aquelas cuja granulometria máxima não excede um valor de 5 a 6, 5 mm.

Dado que as impurezas finas contêm ainda, além de areia e de elementos de pó, grãos de milho partidos, constitui uma vantagem sujeitar as impurezas finas a um novo fracionamento. Nesse intuito, separa-se as impurezas finas numa primeira fração com uma granulometria máxima de 3,5 a 4,5 mm, contendo essencialmente areia e outro material em pó, e numa fração algo mais grosseira com granulometrias de pelo menos 3,5 a 4,5 mm, contendo fundamentalmente grãos de milho pequenos ou partidos. A última fração pode voltar a ser introduzida no milho purificado para uma redução das perdas de amido. A primeira fração pode ser adicionada à fração de farelo originada no fracionamento. O milho assim purificado é depois sujeito à moagem a seco de fracionamento. A moagem por fracionamento é realizada de forma de si conhecida. Normalmente, a moagem a seco é dividida numa primeira etapa de moagem, na qual se remove o gérmen ou na qual se realiza uma separação numa fração de endosperma, numa fração de gérmen e numa fração de farelo, e numa segunda etapa de moagem, na qual a fração de endosperma é moída para a granulometria pretendida. O especialista depreende que a separação não é normalmente completa, sendo em vez apenas realizada até se atingir a pureza pretendida das frações, ou seja, a fração de endosperma contém, após a separação do gérmen, normalmente 13 ainda até 30% em peso, preferencialmente não mais de 20% em peso, dos elementos de gérmen contidos no grão de milho e, após a separação dos componentes de farelo, até 40% em peso, preferencialmente não mais de 20% em peso, dos componentes de casca contidos no grão de milho.

Na primeira etapa, também com frequência denominada desgerminação do milho, os grãos de milho são fragmentados, através, por exemplo, de moinhos de cilindros, como os fornecidos, por exemplo, pela empresa Biihler AG ou pela Ocrim spa, desgerminadores especiais, por exemplo, equipamentos com um ou mais rotores de cilindros, envoltos por um tambor perfurado estruturado, ou também através de combinações destes equipamentos. É possível realizar o processo numa etapa e o mesmo é preferencialmente realizado em várias etapas de moagem. A seguir a um ciclo de moagem, separa-se depois o produto de moagem de forma de si conhecida numa fração de endosperma, numa fração de gérmen e numa fração de farelo. Neste caso, procede-se normalmente de modo a realizar primeiro uma separação numa fração de endosperma e numa fração de farelo e de gérmen, e a separar essa fração separada de farelo e de gérmen numa segunda etapa nos seus componentes. Visto que os componentes do endosperma do produto de moagem apresentam normalmente menores granulometrias do que as partículas da fração de gérmen e de farelo do produto de moagem, a primeira separação pode ocorrer de forma simples através de um processo de peneiração. A separação da fração de gérmen e de farelo do produto de moagem pode ser realizada através, por exemplo, de crivagem. Obviamente, as diferentes etapas de separação podem compreender combinações destas medidas.

Numa desgerminação do milho em várias etapas, a fração de endosperma de uma etapa prévia continua a ser fragmentada 14 numa etapa posterior e é acabada em analogia com o procedimento acima descrito. Típicos são processos de 2 a 4 etapas. As várias etapas levam a maiores níveis de pureza das diferentes frações e a um maior rendimento de amido por parte da fração de endosperma.

No caso da utilização de desgerminadores, é possível gerar na primeira etapa partículas particularmente pequenas, que deixam de poder ser separadas através de peneiração ou de crivagem nas três frações pretendidas endosperma, gérmen e farelo. Normalmente, estas partículas são adicionadas à fração de farelo, podendo constituir uma vantagem, para se obter um elevado rendimento de amido, adicionar estas partículas à fração de endosperma antes ou durante a moagem fina.

Para a desgerminação do milho, deu mostras de ser favorável que o milho apresente uma certa humidade, na gama dos 5 a 30% em peso e, em particular, de 12 a 20% em peso. Em conformidade com isso, mistura-se o milho, que não apresente a humidade pretendida, com uma reduzida quantidade de água antes ou durante a desgerminação do milho. Após a adição de água, armazena-se o milho antes da continuação do processamento preferencialmente durante um período de 0,5 a 24 h, podendo a humidade que adere à superfície difundir-se para o interior do grão de milho, em especial para o gérmen de milho. Normalmente, realiza-se por isso a moagem da Etapa a) na presença de 5 a 30% em peso de água, em relação à massa dos grãos de milho utilizados. Preferencialmente, a quantidade de água é de 10 a 25% em peso e, em particular, de 12 a 20% em peso. A água é preferencialmente adicionada antes da desgerminação do milho, podendo no entanto também ser adicionada durante a desgerminação do milho. No caso de uma desgerminação em 15 várias etapas, é possível voltar a ajustar o teor de água entre as respetivas etapas de desgerminação. Também é possível adicionar a água eventualmente na forma de vapor. Através da análise dos grãos de milho empregues, mas também do produto de moagem contido na respetiva etapa, o especialista consegue determinar facilmente o teor de água e determinar facilmente as quantidades necessárias de água adicional.

Normalmente, ocorre depois pelo menos outra moagem da fração de endosperma, que também pode consistir numa ou em várias etapas de moagem. Neste caso, ajusta-se a fração de endosperma para a granulometria mais favorável para a liquefação/sacarificação. Esta etapa é com frequência também denominada moagem fina. Na moagem fina, a fração de endosperma é em regra moída para uma granulometria média de 0,05 a 1,5 mm e, preferencialmente, para uma granulometria de 0,1 a 1 mm e, em especial, de 0,25 a 0,8 mm. A granulometria média das partículas tem a ver com a massa e é determinada de forma conhecida do especialista, preferencialmente por meio de análise granulométrica. Em particular, deu mostras de ser favorável que pelo menos 80% em peso, em particular pelo menos 90% em peso e, em especial, pelo menos 95% em peso, das partículas apresentem um diâmetro não superior a 0,4 mm. No caso de uma realização em várias etapas da moagem fina, ocorre preferencialmente, após cada operação de moagem, uma separação em partículas cuja granulometria se encontra acima do tamanho máximo pretendido, e em partículas cuja granulometria não ultrapassa o limite superior pretendido. Apenas as partículas demasiado grandes são depois introduzidas noutra operação de moagem. 16

Como já acima descrito, para impedir perdas de amido, é possível reconduzir uma parte ou toda a quantidade da fração de farelo para a fração de endosperma. Esta recondução ocorre preferencialmente antes ou durante a moagem fina. Preferencialmente, não se verifica porém uma recondução da fração de farelo para a fração de endosperma.

As frações assim separadas apresentam tipicamente as seguintes composições: 0 componente de farelo apresenta tipicamente os seguintes componentes nas seguintes quantidades (em relação à massa seca total): 1 a 20% em peso, preferencialmente 5 a 1 a 30% em peso, preferencialmente 5 a 1 a 40% em peso, preferencialmente 5 a 0 a 20% em peso, preferencialmente 0,5 0 a 10% em peso, preferencialmente 0,1

Proteína bruta: 15% em peso

Amido: 20% em peso Fibra bruta: 20% em peso Gordura bruta: a 15% em peso Cinza bruta: a 5% em peso A humidade do farelo encontra-se tipicamente entre 8 e 20% em peso, preferencialmente entre 10 e 17% em peso. O farelo de milho é um material semelhante à gluma, composto preponderantemente por partículas chatas. O diâmetro médio destas partículas chatas encontra-se entre 0,5 mm e 8 mm, preferencialmente entre 0,6 mm e 5 mm. A altura média das partículas chatas encontra-se entre 0,01 mm e 4 mm, preferencialmente entre 0,05 mm e 2 mm. 17 A fração de gérmen apresenta tipicamente os seguintes componentes nas seguintes quantidades (em relação à massa seca total) : 1 a 30% em peso, preferencialmente 5 a 1 a 60% em peso, preferencialmente 5 a 1 a 20% em peso, preferencialmente 2 a 8 a 40% em peso, preferencialmente 10 a 0 a 15% em peso, preferencialmente 0,1

Proteína bruta: 20% em peso Amido: 50% em peso Fibra bruta: 12% em peso Gordura bruta: 35% em peso Cinza bruta: a 10% em peso A humidade do gérmen de milho encontra-se tipicamente entre 8 e 20% em peso, preferencialmente entre 10 e 15% em peso. O gérmen de milho tem aproximadamente a forma de gota. O diâmetro médio destas partículas encontra-se entre 0,1 mm e 5 mm, preferencialmente entre 1 mm e 4 mm. A altura média das partículas encontra-se entre 2 mm e 10 mm, preferencialmente entre 3 mm e 8 mm. A fração de endosperma apresenta tipicamente os seguintes componentes nas seguintes quantidades (em relação à massa seca total):

Proteína bruta: 1 a 30% em peso, preferencialmente 5 a 15% em peso

Amido: 40 a 95% em peso, preferencialmente 60 a 90% em peso 18 18 0 a 20% em peso, preferencialmente 0,2 0,2 a 10% em peso, preferencialmente 0 a 15% em peso, preferencialmente 0,1

Fibra bruta: a 12% em peso Gordura bruta: 0,5 a 5% em peso Cinza bruta: a 3% em peso A humidade do endosperma encontra-se tipicamente entre 8 e 20% em peso, preferencialmente entre 8 e 15% em peso.

Para o gérmen, o farelo e a fração de endosperma, encontram-se apenas indicados os elementos relevantes para a ração animal, resultantes de uma análise típica para este fim. Neste caso, o valor indicado para a proteína bruta abrange todo o nitrogénio de acordo com Kjeldahl, multiplicado por 6,25, portanto, a par de proteínas, por exemplo, também outros aminoácidos livres, ácidos nucleicos, assim como nitrogénio inorgânico. O valor indicado para a fibra bruta abrange, como componente principal, a celulose e as hemiceluloses, sendo também contabilizadas substâncias incrustadas como a lignina. Do para a gordura bruta, são contabilizadas todas as substâncias que, como, por exemplo, os triglicéridos, ácidos gordos livres e fosfolípidos, se dissolvam em solventes de gorduras, como, o éter de petróleo ou o hexano. A cinza bruta abrange todos os componentes não orgânicos, que permaneçam durante um maior período de tempo após o aquecimento para os 550°C. Essencialmente, trata-se neste caso de minerais na forma de óxidos e de sais. A par do amido analisado em separado, não são contabilizados ou são-no apenas de forma imprecisa na análise selecionada os polissacáridos que não sejam amido, como, por exemplo, os pentosanos. 19

As denominações aqui utilizadas proteína bruta, componentes de fibra bruta, gordura bruta e cinza bruta são familiares ao especialista e encontram-se definidas, por exemplo, in Naumann, C., Bassler, R., 1976. VDLUFA-Methodenbuch, Volume 3, Die chemische Untersuchung von Futtermitteln (coleção de folhetos com complementos de 1983, 1988, 1993, 1997 e 2004), VDLUFA-Verlag, Darmstadt, Alemanha [compilação de todos os parâmetros/métodos relevantes na avaliação da ração animal na Alemanha].

Etapa b) A farinha de milho assim obtida, contendo essencialmente a fração de endosperma e, eventualmente, a fração de farelo, é depois sujeita a uma liquefação enzimática e a uma sacarificação enzimática, sendo os componentes de amido da fração de endosperma hidrolisados em glicose. Numa primeira etapa b.l), realiza-se uma liquefação da farinha de milho obtida na Etapa a) , sendo os componentes de amido da farinha de milho tipicamente decompostos ou hidrolisados em cadeias de açúcar com 4 a 20 e, em particular, 8 a 12, unidades de glicose. Esta etapa é seguidamente também denominada liquefação. A liquefação pode dar-se de forma usual através da adição de enzimas. Os processos para este fim são conhecidos do estado da técnica citado no início, por exemplo, do "The Alcohol Textbook - A reference for the beverage, fuel and industrial alcohol industries", capítulo 2, pág. 7 a 23, citado no início.

Neste intuito, mistura-se primeiro a farinha de milho obtida na etapa a) com um líquido aquoso, por exemplo, água fresca, água processual reconduzida, por exemplo, proveniente de uma fermentação ou de uma concentração por 20 evaporação seguinte, ou com uma mistura destes líquidos, obtendo-se uma suspensão aquosa. Esta operação é com frequência também denominada de esmagamento.

Escolhe-se a quantidade de farinha de modo a que a suspensão contenha de 30 a 45% em peso e, preferencialmente, de 32 a 38% em peso de amido, em relação ao peso total da suspensão (mosto). Visto que 1 kg de amido numa liquefação/numa sacarificação fornece normalmente 1,0 a 1,1 kg de monossacáridos, dissacáridos e oligossacáridos, a concentração total de monossacáridos, de dissacáridos e/ou de oligossacáridos na solução de glicose obtida encontra-se em conformidade, após a sacarificação, entre 300 e 495 g/kg e, em particular, entre 320 e 410 g/kg. Neste caso, a glicose perfaz normalmente pelo menos 80% em peso, em particular pelo menos 90% em peso, em relação à quantidade total de monossacáridos, dissacáridos e/ou de oligossacáridos.

Escolhe-se a temperatura da água utilizada normalmente de modo a que a suspensão apresente uma temperatura de 30 a 60°C, preferencialmente de 40 a 58°C e, com total preferência, de 50 a 55°C. Uma temperatura de 60°C não deverá preferencialmente ser ultrapassada, de modo a impedir uma aglutinação indesejada do amido.

Na liquefação do teor de amido na farinha de milho, é em princípio possível utilizar todas as enzimas que liquefazem o amido, sobretudo as α-amilases (classe enzimática EC 3.2.1.1), por exemplo, as α-amilases obtidas das Bacillus lichenformis ou das Bacillus staerothermorphilus, e, entre outras, as utilizadas na liquefação de materiais obtidos por processos de moagem a seco no âmbito da produção do bioetanol. As α-amilases apropriadas para a liquefação 21 também podem ser obtidas no mercado, por exemplo, da Novozymes com a denominação Termamyl 120 L, tipo L; ou da Genencor com a denominação Spezyme. Também é possível utilizar uma combinação de diferentes α-amilases na liquefação. A concentração da enzima no mosto, em relação ao teor de amido, é normalmente de 0,01 a 0,2% em peso, com especial preferência de 0,02 a 0,1% em peso e, com total preferência, de 0,04 a 0,08% em peso.

Com vantagem, escolhe-se as quantidades de enzima liquefatora de amido e de farinha de milho, de modo a que a viscosidade durante a operação de gelificação seja suficientemente reduzida, com vista a permitir uma boa mistura efetiva da suspensão, através, por exemplo, de agitação. Preferencialmente, a viscosidade da mistura de reação é, durante a gelificação, de 20 Pas no máximo, com especial preferência de 15 Pas no máximo e, com total preferência, de 8 Pas no máximo. A medição da viscosidade ocorre normalmente com um viscosímetro Haake, tipo Roto Visko RV2 0 com o sistema de medição M5 e com o medidor MVDIN, a uma temperatura de 50°C e com uma velocidade de cisalhamento de 200 s_1.

Com frequência, a liquefação é levada a cabo na presença de pelo menos um sal de cálcio. A concentração de cálcio no mosto é depois ajustada através da adição de um sal de cálcio para, em regra, de 10 a 200 ppm, preferencialmente de 15 a 100 ppm e, com total preferência, de 20 a 60 ppm. A presença de iões de cálcio não é contudo forçosa, e conhece-se uma série de enzimas liquefatoras para a liquefação e para a sacarificação, que também fornecem boas transformações e bons rendimento na ausência de cálcio, podendo-se nestes casos renunciar à adição de sais de cálcio. 22

Com vista a um efeito ótimo da enzima liquefatora de amido, realiza-se a liquefação preferencialmente pelo menos temporariamente no ótimo de pH da enzima liquefatora, com frequência com um valor de pH pouco ácido, normalmente de 4,0 a 7,0, preferencialmente de 5,0 a 6,5, com especial preferência de 5,3 a 6,0. Usualmente, antes da liquefação ou no seu inicio, realiza-se um ajuste do pH; normalmente este valor de pH é controlado durante a liquefação e é, eventualmente, ajustado a posteriori. O ajuste do valor de pH é preferencialmente realizado com ácidos minerais diluídos, como HC1, HNO3, H2SO4 ou H3PO4, com ácidos orgânicos, como o ácido acético, com hidróxidos de metais alcalinos como NaOH ou KOH, ou hidróxidos de metais alcalinoterrosos, como hidróxido de magnésio ou hidróxido de cálcio. Preferencialmente, o ajuste do valor de pH é com hidróxido de cálcio e/ou ácido sulfúrico. É possível produzir a suspensão de farinha de milho em descontínuo ou em contínuo, misturando-se previamente os eventuais meios para o ajuste do valor de pH, como o hidróxido de cálcio e/ou o ácido sulfúrico, e a enzima liquefatora com a água ou podendo ser eventualmente adicionados de forma individual à mistura de farinha de milho/água. A sequência da adição é neste caso opcional. Na produção em descontínuo da suspensão de farinha de milho, é possível utilizar todos os tipos de reatores de mistura. Na produção em contínuo, utiliza-se em regra misturadores contínuos lentos ou rápidos. A suspensão assim apresentada (mosto) é depois preferencialmente aquecida para uma temperatura acima da temperatura de gelificação do amido utilizado. Normalmente, escolhe-se uma temperatura de 80 a 120°C, preferencialmente 23 de 90 a 115°C e, com especial preferência, de 95 a 110°C, encontrando-se a temperatura preferencialmente pelo menos 5 K, em particular 10 K e, com especial preferência, pelo menos 20 K, por exemplo, de 10 a 80 K, em particular de 20 a 60 K, acima da temperatura de gelificação (temperatura de aglutinação). Também se pode realizar a liquefação abaixo da temperatura de aglutinação, por exemplo, mediante a utilização das enzimas ou das combinações enzimáticas descritas no WO 2004/113551.

Numa forma de execução preferida da liquefação do teor de amido, aquece-se o mosto primeiro ao levar o vapor direto para uma temperatura acima da temperatura de aglutinação do amido. Tipicamente, aquece-se para uma temperatura que se encontra pelo menos 10 K e, em particular, pelo menos 20 K, por exemplo, de 10 a 80 K, em particular de 20 a 60 K, acima da respetiva temperatura de aglutinação. Preferencialmente, aquece-se a suspensão para temperaturas de 80 a 120°C, em particular de 90 a 115°C e, em especial, de 95 a 110°C. 0 vapor direto utilizado no aquecimento é tipicamente um vapor de água sobreaquecido, apresentado uma temperatura de pelo menos 105°C, em particular de pelo menos 110°C, por exemplo, de 110 a 210°C. A utilização de vapor saturado é contudo também possível. Preferencialmente, aplica-se o vapor na suspensão com sobrepressão. Em conformidade com isso, o vapor apresenta preferencialmente uma pressão de pelo menos 1,5 bar, por exemplo, de 1,5 a 16 bar, em particular de 2 a 12 bar. A aplicação de vapor direto na suspensão é normalmente realizada de modo a introduzir-se o vapor com sobrepressão, preferencialmente com uma sobrepressão de 1 a 10 ou 11 bar, 24 em particular de 1,5 a 5 bar e, preferencialmente, a maior velocidade na suspensão. Através da introdução do vapor, a suspensão aquece momentaneamente para temperaturas acima dos 90°C, portanto para temperaturas acima da temperatura de aglutinação.

Preferencialmente, o aquecimento é realizado com vapor direto num equipamento de funcionamento em continuo, no qual se deita o mosto em continuo com uma determinada pressão de fluxo, a qual resulta da viscosidade da suspensão, da velocidade de fluxo e da geometria do equipamento, e no qual se alimenta, na área da alimentação da suspensão, o vapor quente a sobrepressão, em relação à pressão de fluxo, através de um injetor regulável. Através da alimentação do vapor com sobrepressão, não só a suspensão aquece como também é introduzida energia mecânica no sistema, a qual leva a outra mistura intensiva das partículas da farinha de milho, leva a uma entrada de energia particularmente uniforme e, com isso, a uma aglutinação particularmente uniforme dos grânulos de partículas de amido na farinha de milho. Tipicamente, estes equipamentos têm uma geometria tubular. Preferencialmente, introduz-se o vapor na direção do eixo longitudinal do equipamento tubular. Introduz-se normalmente a suspensão num ângulo plano em relação ao fluxo de vapor, que em regra não ultrapassa os 50°. O injetor regulável apresenta tipicamente uma geometria cónica, que afunila na direção do fluxo do vapor. Neste injetor, encontra-se uma agulha ou um cone disposto numa haste deslocável na direção longitudinal. A agulha ou o cone forma com o cone do injetor uma fenda. Através do deslocamento da agulha ou da haste na direção longitudinal, é possível ajustar de forma simples o tamanho da fenda e, com isso, da secção da 25 abertura do injetor, sendo assim possível regular de modo simples a velocidade da entrada de vapor.

Tipicamente, estes equipamentos apresentam ainda um tubo de mistura, no qual a suspensão é transportada após a introdução de vapor, sendo a mesma aplicada a partir do equipamento. Este tubo de mistura encontra-se usualmente na direção da entrada de vapor. 0 tubo de mistura forma tipicamente com o injetor uma fenda, através da qual a suspensão é transportada. Através desta fenda, atuam forças de cisalhamento adicionais no transporte sobre a suspensão e aumentam assim a introdução de energia mecânica na suspensão. 0 tubo de mistura pode ser deslocável na direção longitudinal. Através do deslocamento do tubo de mistura, é possível ajustar de forma simples o tamanho da abertura da fenda e, com isso, a queda de pressão no equipamento.

Os equipamentos deste tipo são conhecidos do estado da técnica com a designação de jet cooker, como, por exemplo, o equipamento representado in "The Alcohol Textbook" capítulo 2, loc. cit., Figura 13 e disponível no mercado, com a denominação, por exemplo, HYDROHEATER® ou JetCooker® da Hydro Thermal Corp. Waukesha WI, EUA. 0 mosto aquecido com vapor direto é normalmente transferido em seguida para uma zona de pós-reação, de modo a continuar com a gelificação dos componentes de amido. Ao mesmo tempo, a enzima liquefatora começa a hidrolisar o amido. Na zona de pós-reação predomina tipicamente uma sobrepressão, tipicamente uma pressão absoluta de 2 a 8 bar. As temperaturas na zona de pós-reação encontram-se tipicamente entre 80 e 120°C, em particular entre 90 e 115°C. O tempo de permanência nesta zona de pós-reação pode, em função da temperatura da suspensão, ser de 1 a 30 min, com frequência 26 de 2 a 20 min e, em particular, de 5 a 10 min. As zonas de pós-reação apresentam tipicamente uma geometria tubular ou de coluna. Numa forma de execução, a zona de pós-reação apresenta a geometria de uma coluna disposta na perpendicular. A suspensão é neste caso aplicada, após deixar o equipamento para o tratamento com vapor, na zona superior da coluna e é retirada na zona inferior. Noutra forma de execução da invenção, a zona de pós-reação apresenta uma geometria tubular.

Após deixar a zona de pós-reação, a suspensão é normalmente arrefecida e realiza-se depois uma segunda liquefação. Este arrefecimento pode ocorrer através de descompressão da solução sob pressão. Preferencialmente, realiza-se a descompressão como evaporação flash, de modo a arrefecer a suspensão, preferencialmente a temperaturas inferiores a 110°C, em particular inferiores a 105°C, por exemplo, entre 80 e 110°C, preferencialmente entre 90 e 105°C e, com total preferência, entre 95 e 100°C. Normalmente, ocorre depois uma liquefação do amido assim decomposto num recipiente de reação separado. Eventualmente, poderá ser conveniente adicionar, antes ou durante o aquecimento, em vez de toda a quantidade da enzima liquefatora, uma quantidade parcial da mesma após o ajuste da temperatura, à segunda liquefação. Esta quantidade parcial pode ser de 0 a 80%, preferencialmente de 10 a 60% e, com total preferência, de 15 a 40% da quantidade total de enzima liquefatora. A segunda liquefação pode levar de 30 a 240 min, com preferência de 45 a 180 min e, com total preferência, de 60 a 120 min. A segunda liquefação pode ter lugar num tubo de passagem continuo, de forma continua numa cascata de caldeiras de agitação ou em caldeiras de agitação descontinuas. No caso da utilização de caldeiras de agitação, constitui uma vantagem prever um número 27 suficiente de caleiras de agitação, que permita a limpeza de caldeiras de agitação individuais, com o funcionamento em paralelo, sem perder capacidade.

Para uma decomposição completa do amido em dextrinas, mantém-se a mistura de reação na temperatura ajustada ou aquece-se eventualmente mais a mesma, até a deteção de amido com iodo ou, eventualmente, com outro teste de deteção do amido, dar negativo ou pelo menos praticamente negativo. Eventualmente, é possível adicionar neste caso ainda outra ou outras quantidades parciais de a-amilase, por exemplo, de 0,001 a 0,5% em peso e, preferencialmente, de 0, 002 a 0,2% em peso, em relação à quantidade total da fonte de amido utilizada, à mistura de reação.

Em vez do aquecimento do mosto através de vapor direto, também é possível o seu aquecimento indireto com um meio de aquecimento, por exemplo, vapor, nos permutadores de calor denominados de "wide gap" para a temperatura pretendida, evitando-se desse modo uma diluição da suspensão de farinha de milho através do vapor aplicado. Também neste caso se realiza normalmente uma pós-reação e uma segunda liquefação, como descrito para o aquecimento com vapor direto. Em termos das medidas aí tomadas, aplica-se em analogia o anteriormente referido.

Deste modo, obtém-se um hidrolisado parcial de amido aquoso, contendo o teor de amido liquefeito proveniente da farinha de milho, tipicamente dextrinas e, eventualmente, outros oligossacáridos e monossacáridos ou dissacáridos, assim como os componentes proteicos e, eventualmente, os componentes de farelo da farinha de milho. 28

Depois de terminada a liquefação do amido, ocorre uma sacarificação das dextrinas contidas no hidrolisado parcial de amido aquoso, ou seja, a sua decomposição em glicose ou em sacarose. A sacarificação pode ser realizada em contínuo ou em descontinuo de forma de si conhecida. A sacarificação das dextrinas (ou seja, oligossacáridos) na solução de amido liquefeita ocorre normalmente por via enzimática, ou seja, recorrendo a pelo menos uma enzima que sacarifica as dextrinas. Nesse intuito, é possível utilizar em princípio todas as glicoamilases (classe enzimática EC 3.2.1.3), em particular as glicoamilases, obtidas de Aspergillus e em especial as utilizadas na sacarificação de materiais obtidos por processos de moagem a seco no âmbito da produção do bioetanol. As glicoamilases adequadas à sacarificação também podem ser obtidas no mercado, por exemplo, da Novozymes com a denominação Dextrozyme GA; ou da Genencor com a denominação Optidex. Também é possível utilizar uma combinação de diversas glicoamilases. A pelo menos uma enzima sacarificante, em particular pelo menos uma glicoamilase, é adicionada ao meio líquido contendo dextrinas, obtido após a liquefação, usualmente numa quantidade de 0,001 a 5,0% em peso, preferencialmente de 0, 005 a 3,0% em peso e, com especial preferência, de 0,01 a 1,0% em peso, em relação à quantidade total da fonte de amido empregue.

Normalmente, a solução de amido liquefeita é arrefecida ou temperada para o ótimo de temperatura da enzima sacarificante ou ligeiramente abaixo, por exemplo, para os 40 a 70°C, preferencialmente 50 a 65°C e, em particular, 60 a 63°C, e é misturada em seguida com a enzima sacarificante. Preferencialmente, o hidrolisado parcial de 29 amido aquoso é logo sujeito a uma sacarificação a seguir à liquefação. 0 hidrolisado parcial de amido aquoso quente é depois arrefecido para as temperaturas acima referidas, antes de a enzima sacarificante ser adicionada. Este arrefecimento ocorre com vantagem num permutador de calor, podendo a energia libertada ser aproveitada no pré-aquecimento de outros fluxos processuais.

Em termos vantajosos, a sacarificação ocorre com um valor de pH na gama de atuação ótima da enzima empregue, preferencialmente com um valor de pH entre 3,0 e 5,5, em particular entre 4,0 e 5,0 e, com especial preferência, entre 4,2 e 4,8. Preferencialmente, ajusta-se o valor de pH antes da adição da enzima sacarificante, em particular da glicoamilase, para o valor pretendido. A sacarificação pode ser realizada em descontinuo em reatores de agitação ou em contínuo num tubo de fluxo e, com especial preferência, numa cascata de caldeiras de agitação. No caso da utilização de caldeiras de agitação, constitui uma vantagem prever um número suficiente de caldeiras de agitação, que permita limpar caldeiras de agitação individuais em paralelo com o funcionamento, sem perder capacidade.

Após a adição da enzima sacarificante, mantém-se a suspensão contendo dextrinas, preferencialmente durante um período de, por exemplo, 8 a 72 horas ou mais, se necessário, com frequência de 12 a 60 h, preferencialmente de 24 a 54 h e, com especial preferência, de 36 a 48 h, na temperatura ajustada, sendo as dextrinas sacarifiçadas na forma de monossacáridos e de dissacáridos. A evolução da sacarificação pode ser seguida com os métodos conhecidos do especialista, como, por exemplo, HPLC, testes enzimáticos 30 ou tiras de teste da glicose. A sacarificação termina quando a concentração dos monossacáridos deixa praticamente de aumentar ou até decai.

Etapa c):

Através da sacarificação, obtém-se uma solução de glicose aquosa, contendo ainda, além de glicose, os componentes não hidrolisados da farinha de milho como sólidos na forma suspensa. Estes sólidos são em primeira linha um sólido ricamente proteico, denominado aqui e seguidamente glúten de milho, e contendo componentes de farelo, se for realizada uma recondução do farelo na moagem,. Estes componentes são empobrecidos na Etapa c) do processo de acordo com a invenção, a partir da solução de glicose.

Neste caso, pode proceder-se de modo a sujeitar a quantidade total da solução de glicose contendo glúten de milho, produzida na Etapa b) , a uma separação de sólidos. No entanto, também é possível sujeitar apenas um fluxo parcial da solução de glicose contendo glúten de milho, produzida na etapa b), a uma separação de sólidos e conduzir a glicose contendo glúten de milho permanecente para outra utilização, por exemplo, para a produção do bioetanol.

Normalmente, o empobrecimento ocorre pela separação de pelo menos 80% em peso, preferencialmente de pelo menos 90% em peso e, em particular, de pelo menos 95% em peso, dos componentes de glúten ou componentes de farelo contidos na solução de glicose. É possível realizar a separação do glúten de milho e eventualmente do farelo existente por meio de qualquer separação de sólido/líquido conhecida, preferindo-se 31 processos mecânicos, tais como centrifugação, decantação e filtração, inclusive combinações destas medidas.

Para a separação dos sólidos da solução de glicose, deu mostras de ser favorável que a solução de glicose introduzida na separação apresente uma temperatura de 60 a 100°C, em particular de 70 a 90°C e, com particular preferência, de 75 a 85°C. Neste intuito, aquece-se normalmente a solução de glicose, obtida na Etapa b), antes do empobrecimento dos componentes sólidos glúten e farelo, para a temperatura pretendida. O aquecimento é realizado com vantagem num permutador de calor, podendo ser aproveitada a energia necessária ao arrefecimento de outros fluxos processuais.

Além disso, deu mostras de ser vantajoso que o valor de pH da solução de glicose seja ajustado antes do empobrecimento dos sólidos para um valor de 4,0 a 6,5, em particular de 4,5 a 6,0 e, com particular preferência, de 5,0 a 5,5. Para ajustar o valor de pH, é possível utilizar uma base opcional, mas preferencialmente um hidróxido de metal alcalino, por exemplo, lixívia de soda cáustica, ou amoníaco.

No empobrecimento, obtém-se uma solução de glicose pobre em sólidos e uma fração rica em sólidos, contendo glúten de milho e eventualmente componentes de farelo e apresentando um baixo teor de glicose, como a solução de glicose pobre em sólidos. A solução de glicose pobre em sólidos pode ainda conter baixas quantidades de sólido não dissolvido, não ultrapassando essa quantidade normalmente 15% de vol., em particular 10% de vol. e, em especial, 5% de vol, em 32 relação ao volume total da solução de glicose aquosa, e encontrando-se com frequência compreendida entre 0,001 e 15% de vol., em particular entre 0,01 e 10% de vol. e, com especial preferência, entre 0,02 e 5% de vol., em relação ao volume total da solução de glicose aquosa. Determina-se o sólido não dissolvido por meio de centrifugação da solução de glicose em tubos de centrifugação graduados com 1.650 g durante 15 min, e posterior leitura da quantidade de sólido não dissolvido.

Para se atingir um elevado rendimento de glicose, constitui uma vantagem ressuspender em água a fração rica em sólidos, obtida na separação de sólido/liquido, e voltar a sujeita-la a uma separação de sólido/liquido. A quantidade de água encontra-se tipicamente entre 3 e 15 L/Kg de sólido suspenso, calculado na forma de substância seca, ou de 3 a 20 L por L de sólido separado húmido. Através desta segunda separação de sólido/liquido, obtém-se uma fase liquida, contendo partes da glicose contida na fase sólida da primeira separação de sólido/liquido. A fase liquida é depois sujeita à fase liquida da primeira separação de sólido/liquido. Para um maior aumento do rendimento da glicose, é possível repetir esta operação, ou seja, a ressuspensão do sólido obtido em água e a posterior separação de sólido/liquido, uma ou mais vezes, sendo assim as soluções de glicose aquosas obtidas sujeitas à solução de glicose obtida na primeira separação de sólido/liquido. A temperatura, à qual se realiza a segunda separação e eventualmente outra ou outras separações de sólido/liquido, encontra-se tipicamente compreendida entre 60 e 100°C, preferencialmente entre 70 e 90°C e, com especial preferência, entre 75 e 85°C. Relativamente ao valor de pH, 33 aplica-se o referido anteriormente para a primeira separação de liquido/sólido. A água, que é utilizada na ressuspensão da fração rica em sólidos da primeira e das outras separações de sólido/liquido, pode ser água fresca. Com frequência, utiliza-se contudo na ressuspensão a solução de glicose aquosa de uma anterior separação de sólido/liquido, de modo a, por um lado, reduzir a diluição das soluções de glicose pobres em sólidos cointroduzidas das diferentes etapas de separação de sólido/liquido com água fresca e, por outro, de modo a reduzir no total a necessidade de água fresca. Por exemplo, utiliza-se em três separações de sólido/liquido sucessivas a fase liquida da terceira separação de sólido/liquido para a ressuspensão da fase sólida da segunda separação de sólido/liquido, e utiliza-se a fase liquida da segunda separação de sólido/liquido para ressuspensão da fase rica em sólidos da primeira separação de sólido/liquido. A par da água fresca, também é contudo possível utilizar água processual, originada, por exemplo, na posterior concentração por evaporação da solução de glicose como condensado, ou originada aquando da secagem dos produtos secundários (por exemplo, glúten de milho ou biomassa).

Para uma maior redução dos sólidos nas soluções aquosas de glicose assim obtidas, poderá constituir uma vantagem sujeita-las a uma denominada etapa de polimento, de modo a empobrecer outros sólidos aí contidos. A continuação do empobrecimento pode ser realizada por qualquer tipo de separação de liquido/sólido conhecida, como, por exemplo, filtração de membrana, inclusive microfiltração e ultrafiltração, filtração convencional, flutuação, centrifugação, decantação ou separação. Também são 34 concebíveis formas de execução em várias etapas, que resultem de uma ligação opcional dos processos referidos no presente documento. A solução de glicose pobre em sólidos, que pode ser obtida após empobrecimento do glúten de milho e, eventualmente, do farelo existente a partir da glicose aquosa obtida na Etapa b), é nova e adequa-se em particular à produção de produtos químicos. 0 teor de massa seca é a quantidade total de sólidos dissolvidos e não dissolvidos na solução de glicose aquosa. É possível a sua determinação através da concentração por evaporação da solução de glicose de forma de si conhecida. Para esse fim, concentra-se por evaporação uma determinada quantidade da respetiva solução de glicose na estufa de secagem nos 80°C até ao estado seco. A pesagem final do resíduo seco fornece o teor de massa seca. Em alternativa, é possível utilizar balanças a seco, como as comercializadas, por exemplo, pela PCE Deutschland,

Meschede, para este fim.

Em relação aos sólidos contidos na solução de glicose aquosa, a solução de glicose aquosa apresenta os seguintes componentes característicos: a) 80 a 98% em peso, preferencialmente 93 a 97% em peso, de açúcar na forma de glicose e, eventualmente, dissacáridos como sacarose, maltose e isomaltose, b) 1 a 7% em peso, com frequência 2 a 7% em peso, preferencialmente 2,5 a 5% em peso de proteína bruta, 35 c) 0,001 a 0,1% em peso, com frequência 0,01 a 0,1% em peso de fibra bruta, d) 200 a 1.500 mg/kg, preferencialmente 600 a 1.200 mg/kg, de aminoácidos livres e e) 0,01 a 1% em peso de componentes de cinza bruta.

Além disso, a solução de glicose pode ainda conter baixas quantidades de óleo/gordura da fração de gérmen. No entanto, separa-se normalmente a quantidade principal de eventuais componentes de óleo/gordura em conjunto com o glúten na etapa c). O mesmo se aplica a eventuais componentes de farelo, que não tenham sido separados antes da sacarificação.

No processo de acordo com a invenção, a quantidade é de 4 a 40% em peso, em particular de 8 a 30% em peso, em relação à massa seca do milho utilizado. O glúten de milho apresenta normalmente a seguinte composição bruta, sendo os dados por sua vez relativos à massa seca total do glúten de milho. a) 10 a 60% em peso, em particular 20 a 55% em peso, de proteína bruta; b) la 60% em peso, em particular 2 a 45% em peso, de componentes de açúcar; c) até 20% em peso, com frequência de 0,5 a 10% em peso de gordura bruta, de gorduras vegetais e/ou de óleos vegetais; d) até 20% em peso, em particular de 1 a 12% em peso, de componentes de fibra bruta; e e) até 15% em peso, por exemplo, de 0,1 a 10% em peso, de componentes sólidos diferentes desses, também denominados cinza bruta. 36 0 glúten de milho separado na Etapa c) é um sólido de partículas finas, que apresenta, após a separação, normalmente uma humidade de 50 a 85% em peso e, em particular, de 55 a 75% em peso, em relação à massa total do glúten de milho separado. O glúten de milho pode ser seco de forma de si conhecida na forma de um pó fino, não pulverulento ou pouco pulverulento e não adesivo. A humidade encontra-se tipicamente abaixo dos 50% em peso, normalmente abaixo dos 30% em peso e, em especial, abaixo dos 15% em peso. Um glúten de milho húmido com um teor de massa seca de 35% em peso ou com um teor de água de 185%, em relação ao glúten de milho seco, comporta-se como um sólido. A granulometria média das partículas de glúten de milho (média ponderada, determinada por difusão da luz ou por análise granulométrica) encontra-se tipicamente entre 50 e 600 pm e, em particular, entre 100 e 500 pm. O glúten de milho tem um elevado poder de absorção de água e é capaz de absorver até 185% em peso de água, em relação ao seu peso seco, sem se tornar adesivo. Adequa-se assim em particular como auxiliar de formulação, em especial para a produção de formulações sólidas de substâncias húmidas ou pastosas, que, por seu lado, tendem a colar. Em particular, o glúten de milho adequa-se à formulação de uma biomassa, como a originada numa fermentação. Deste modo, obtém-se uma biomassa não adesivante e o produto contendo glúten de milho, que pode ser empregue, por exemplo, como ração ou como componente para ração. O glúten de milho distingue-se ainda por um elevado poder de absorção de óleos e de substâncias oleicas, em particular de óleos vegetais. Por conseguinte, adequa-se em 37 particular à produção de formulações sólidas de óleos vegetais de elevada qualidade ou de componentes de óleos vegetais ou de substâncias com propriedades equiparáveis, como os tocoferóis. A glicose aquosa obtida após a separação ou as separações de sólido/liquido pode ser eventualmente concentrada numa concentração por evaporação de uma ou várias etapas, até se atingir a concentração pretendida de glicose. Nesse intuito, concentra-se a solução de glicose aquosa a temperaturas de 50 a 100°C, preferencialmente de 70 a 95°C e, com especial preferência, de 80 a 90°C, preferencialmente com a aplicação de baixa pressão. Preferencialmente, procede-se com a concentração até se atingir uma concentração de glicose de pelo menos 40% em peso, em particular de pelo menos 50% em peso e, com especial preferência, de pelo menos 55% em peso, por exemplo, de 40 a 80% em peso, preferencialmente de 50 a 70% em peso e, com total preferência, de 55 a 65% em peso.

Utilização da glicose na produção de substâncias orgânicas É possível utilizar em seguida a solução de glicose assim obtida como fonte de carbono na produção de substâncias orgânicas, ou seja, de produtos químicos. O conceito produtos químicos é amplo no presente contexto e abrange todas as substâncias orgânicas, ou seja, compostos definidos, mas também oligómeros, polímeros, inclusive enzimas, mas também biomassa, como, por exemplo, leveduras ou proteínas de organismos unicelulares, produzidas ou que podem ser produzidas a partir de glicose. A produção das substâncias orgânicas pode realizar-se tanto através de fermentação como de vias não fermentativas. O processo proporciona vantagens sobretudo na produção de produtos 38 químicos diferentes do etanol, visto existirem normalmente neste caso grandes requisitos em termos da qualidade da glicose.

Os exemplos de substâncias orgânicas, que podem ser produzidas por vias não fermentativas a partir da glicose, compreendem 5-hidroximetilfurfural, ácido levúlico, ácido glucónico, ácido glucorónico, ácido 2-cetoglucónico, ácido glutárico, sorbitol, isossorbida e alquilpoliglucósidos, polióis como etilenoglicol, propilenoglicol e HFCS (High-Fructose-Corn Syrup).

Os exemplos de substâncias orgânicas, que podem ser produzidas a partir da glicose por vias fermentativas são: ácidos monocarboxílicos, dicarboxílicos e tricarboxílicos tendo eventualmente grupos hidroxilo, com 2 a 10 átomos de C, por exemplo, ácido tartárico, ácido itacónico, ácido succínico, ácido acético, ácido propiónico, ácido láctico, ácido 3-hidroxipropiónico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido 2,5-furanodicarboxílico, ácido glutárico, ácido levúlico, ácido glucónico, ácido aconítico, ácido diaminopimélico e ácido cítrico; aminoácidos proteinogénicos e não proteinogénicos, por exemplo, lisina, glutamato, metionina, fenilalanina, ácido aspárgico, triptofano e treonina; bases purina e bases pirimidina; nucleósidos e nucleótidos, por exemplo, dinucleótido de nicotinamida-adenina (NAD) e adenosina 5'- monofosfato (AMP); lípidos; ácidos gordos saturados e insaturados com, preferencialmente, 10 a 22 átomos de C, como, por 39 exemplo, ácido γ-linolénico, ácido di-homo-γ- linolénico, ácido araquidónico, ácido eicosapentanóico e ácido docosa-hexanóico; dióis com 3 a 10 átomos de C, por exemplo, propanodiol e butanodiol; álcoois polivalentes com 3 ou mais grupos hidroxilo, por exemplo, com 3, 4, 5 ou 6 grupos OH, como, por exemplo, glicerina, sorbitol, manitol, xilitol e arabinitol; álcoois de cadeia longa com pelo menos 4 átomos de C, por exemplo, com 4 a 22 átomos de C, por exemplo, butanol; hidratos de carbono, por exemplo, ácido hialurónico e trealose; hidratos de carbono; aminas alifáticas, em particular diaminas alifáticas, com 3 a 10 átomos de C, como a 1,5-pentanodiamina; compostos aromáticos, como, por exemplo, aminas aromáticas, vanilina e índigo; vitaminas e provitaminas, por exemplo, ácido ascórbico, vitamina B6, vitamina B12 e riboflavina; cofatores e nutracêuticos; proteínas, por exemplo, enzimas, como amilases, pectinases, celulases ácidas, híbridas ou neutras, esterases como lipases, pancreases, proteases, xilanases e oxidorredutases como lacase, catalase e peroxidase, glucanases e fitases; leveduras, por exemplo, leveduras de panificação e leveduras de cerveja; carotenoides, por exemplo, licopina, β-carotina, astaxantina, zeaxantina e cantaxantina; cetonas com 3 a 10 átomos de C, por exemplo, acetona e acetoína; lactonas, por exemplo, γ-butirolactona; 40 poli-hidroxialcanoatos, por exemplo, poli- hidroxiacetato; polilactidas; polissacáridos, por exemplo, glucano, manano, galactano; poli-isoprenóides; poliamidas e ciclodextrinas. O conceito "cofator" abrange os compostos não proteicos, necessários ao aparecimento de uma atividade enzimática normal. Estes compostos podem ser orgânicos ou inorgânicos; as moléculas de cofatores são preferencialmente orgânicas. Os exemplos destas moléculas são NAD e fosfato de dinucleótido de nicotinamida-adenina (NADP); o precursor destes cofatores é a niacina. O conceito "nutracêutico" abrange todos os aditivos alimentares, que promovam a saúde nas plantas e nos animais, sobretudo nos humanos. Os exemplos destas moléculas são vitaminas, antioxidantes e determinados lipidos, como, por exemplo, ácidos gordos poli-insaturados.

Utilização da glicose numa fermentação É revelada a utilização da solução de glicose, que pode ser obtida de acordo com a invenção, como fonte de glicose na produção por fermentação de uma substância orgânica, como acima definido. É revelado um processo para a produção de uma substância orgânica através de fermentação, abrangendo as seguintes etapas: 41 i. preparação de uma solução aquosa de glicose, por exemplo, através da produção de uma solução de glicose de acordo com o processo de acordo com a invenção e ii. adição da solução de glicose a um meio de fermentação, que contém um microrganismo, capaz da sobreprodução da substância orgânica. É possível realizar a fermentação da forma usual conhecida do especialista. Nesse sentido, cultiva-se normalmente o respetivo microrganismo pretendido com a utilização de uma glicose aquosa produzida de acordo com a invenção. 0 processo de fermentação pode ser realizado tanto em descontínuo (processo descontínuo ou batch) como no processo semicontínuo (processo fed-batch, inclusive o processo semicontínuo com recolha intermédia), sendo dada preferência ao procedimento semicontínuo. A título de exemplo, é possível inocular a solução de glicose aquosa, obtida pelo processo de acordo com a invenção - eventualmente em conjunto com uma fonte de açúcar convencional, ou seja, monossacáridos, dissacáridos e/ou oligossacáridos metabolizáveis ou a composição contendo monossacáridos, dissacáridos e/ou oligossacáridos metabolizáveis numa concentração de pelo menos 45% em peso e que tipicamente está isenta de sólidos insolúveis na água, como, por exemplo, um melaço de baixa qualidade com 45 a 50% em peso de açúcar - eventualmente após a diluição com água e a adição de componentes mediadores usuais, tais como tampões, sais nutritivos, fontes de nitrogénio como sulfato de amónio, ureia, etc., elementos de meios alimentares complexos, contendo aminoácidos, como extratos de levedura, peptonas, CSL e outros do género, com o 42 microrganismo pretendido e que o multiplicam sob condições de fermentação, até a concentração do microrganismo ter atingido o estado estacionário pretendido para a fermentação. Neste caso, metaboliza-se os açúcares contidos na solução de glicose e forma-se o produto de qualidade pretendido (o denominado processo descontinuo ou fase descontinua ou batch) .

Com base no grande teor de aminoácidos livres na glicose, é possível renunciar de forma surpreendente à adição de outros componentes alimentares complexos ou reduzir drasticamente a sua quantidade, o que constitui outra vantagem da solução de glicose.

No processo de fed-batch, consegue-se continuar com o processo de fermentação através da adição da glicose que pode ser obtida de acordo com a invenção. Neste caso, o produto metabólico sobreproduzido pelo microrganismo concentra-se no licor de fermentação, podendo o produto metabólico estar presente tanto nas células do microrganismo como também na fase aquosa do meio de fermentação.

Preferencialmente, realiza-se a fermentação de forma semicontínua, ou seja, como fed-batch. Neste caso, procede-se de modo a que o microrganismo primeiro se multiplique mediante a utilização de uma solução de glicose e/ou de outra fonte de açúcar, até se ter atingido a concentração pretendida de microrganismos no fermentador. Em seguida, introduz-se a glicose aquosa no fermentador. Deste modo, mantém-se o processo de fermentação e o produto metabólico sobreproduzido pelo microrganismo concentra-se no licor de fermentação (ver acima). Sobretudo através da velocidade de alimentação da glicose aquosa, é possível regular o teor de 43 açúcar do licor de fermentação. Normalmente, ajusta-se a velocidade de alimentação de modo a que a concentração de glicose no licor de fermentação se encontre entre > 0% em peso e cerca de 5% em peso e, sobretudo, não ultrapasse um valor de 3% em peso. A glicose pode ser eventualmente esterilizada antes da fermentação, sendo os microrganismos contaminantes usualmente mortos por processos térmicos. Nesse intuito, aquece-se o meio liquido contendo açúcar usualmente para temperaturas acima dos 80°C. A morte ou a lise dos contaminantes pode ocorrer mesmo antes da fermentação. Para isso, introduz-se todo o meio liquido contendo açúcar na esterilização. É revelado um processo para a produção de compostos orgânicos não voláteis, com pelo menos 3 átomos de C ou com pelo menos 2 átomos de C e pelo menos 1 átomo de N. Neste caso, os compostos orgânicos não voláteis são os compostos que podem ser obtidos por destilação com decomposição a partir do licor de fermentação. Estes compostos apresentam normalmente um ponto de ebulição acima do ponto de ebulição da água, com frequência acima dos 150°C e, em particular, acima dos 200°C, à pressão normal. Em regra, são compostos que se encontram no estado sólido sob condições normais (298 K, 101,3 kPa) .

No entanto, também é possível utilizar meio líquido contendo açúcar numa fermentação para a produção de produtos metabólicos não voláteis, que apresentem à pressão normal um ponto de fusão abaixo do ponto de ebulição da água e/ou uma consistência oleosa. 44

Em particular, o processo adequa-se à produção de enzimas, aminoácidos, vitaminas, nucleótidos, dissacáridos, oligossacáridos e polissacáridos, ácidos monocarboxílicos e dicarboxilicos alifáticos com 3 a 10 átomos de C, ácidos hidroxicarboxilicos alifáticos com 3 a 10 átomos de C, cetonas com 3 a 10 átomos de C, alcanóis com 4 a 10 átomos de C e alcanodióis com 3 a 10 e, em particular, 3 a 8 átomos de C, e aminas, em particular diaminas alifáticas com 3 a 10 átomos de C. O especialista entende que os compostos produzidos desta forma por fermentação são por sua vez obtidos na forma enantiomérica produzida pelos microrganismos utilizados (desde que existam diferentes enantiómeros). Assim, obtém-se, por exemplo, dos aminoácidos normalmente o respetivo L-enantiómero.

Os microrganismos utilizados na fermentação têm a ver de forma de si conhecida com os respetivos produtos metabólicos, como abaixo descrito em detalhe. Os mesmos podem ser de origem natural ou ser manipulados por engenharia genética. Os exemplos de microrganismos e de processos de fermentação adequados encontram-se indicados, por exemplo, na Tabela A.

Tabela A:

Substância Microrganismos Referência Ácido tartárico Lactobacíllí, (por exemplo, Lactobacillus delbrueckii) Rehm, H.-J.: Biotechnology, Weinheim, VCH, 1980 e 1993 - 1995; Gutcho, Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation (1973) Ácido itacónico Aspergillus terreus, Aspergillus itaconicus Jakubowska, in Smith e Pateman (ed.), Genetics and Physiology of Aspergillus, London: Academic Press 1977; Miall, in Rose (ed.), Economic Microbiology, vol. 2, pág. 45 47 - 119, London: Academic Press 1978; US 3044941 (1962). Ácido succinico Actínobacíllus sp. 130Z, Anaerobio-spirillum succiniproducens, Actínobacíllus succinogenes, E. coli Int. J. Syst. Bacteríol. 26, 498 -504 (1976); EP 249773 (1987), Inv. : Lemme e Datta; US 5504004 (1996), Inv.: Guettler, Jain e Soni; Arch. Mirobiol. 167, 332 - 342 (1997); Guettler MV, Rumler D, Jain MK., Actínobacíllus succinogenes sp nov., a novel succinic-acid-producíng straín from the bovíne rumen. Int J Syst Bacteríol. 1999 Jan; 49 Pt 1: 207-16; US5723322, US5573931, US5521075, WO99/06532, US5869301, US 5770435 Ácido hidroxi- propiónico Lactobacillus delbru ckii , L. leichmannii ou Sporolacto-bacíllus ínulinus RÕMPP Online Version 2.2 Ácido propiónico Propíonibacterium, por exemplo, P. arablnosum, P. schermaníí, P. freudenreíchíí, Clostridium propionicum Rehm, H.-J.: Bíotechnology, Weinheim, VCH, 1980 e 1993 - 1995; Gutcho, Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation (1973), Ácido diamino- pimélico Corynebacterium glutamlcum Rehm, H.-J.: Bíotechnology, Weinheim, VCH, 1980 e 1993 - 1995; Gutcho, Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation (1973), Ácido cítrico Aspergillus niger, Aspergillus wentíí Crít. Rev. Biotechnol. 3, 331 - 373 (1986); Food Biotechnol. 7, 221 -234 (1993); 10, 13 - 27 (1996). Ácido aconítico Aspergillus niger, Aspergillus wentii Crít. Rev. Biotechnol. 3, 331 - 373 (1986) ; Food Biotechnol. 7, 221 -234 (1993); 10, 13 - 27 (1996).; Rehm, H.-J.: Bíotechnology, Weinheim, VCH, 1980 e 1993 - 1995; Ácido málico Aspergilli, por exemplo, Aspergillus US 3063910 46 flavus, A. niger, A. Oryzae, Corynebacteri um Ácido glucónico Aspergilli, por exemplo, A. niger Gutcho, Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation (1973), Ácido butirico Clostridium (por exemplo, Clostridium acetobutylicum, C. butyricum) Rehm, H.-J.: Biotechnology, Weinheim, VCH, 1980 e 1993 - 1995; Ácido láctico Lactobacíllus, por exemplo, L. delbruckii, L. leichmannii, Rehm, H.-J.: Biotechnology, Weinheim, VCH, 1980 e 1993 - 1995; Lisina Corynebacteri um glutamicum Ikeda, M.: Amino Acid Production Process (2003), Adv. Biochem. Engin/Biotechnol 79, 1-35. Glutamato Corynebacterium glutamicum Ikeda, M.: Amino Acid Production Process (2003), Adv. Biochem. Engin/Biotechnol 79, 1-35. Metionina Corynebacterium glutamicum Ikeda, M.: Amino Acid Production Process (2003), Adv. Biochem. Engin/Biotechnol 79, 1 - 35. Fenil- alanina Corynebacteríum glutamicum, E. coli Trends Biotechnol. 3, 64 - 68 (1985); J. Ferment. Bioeng. 70, 253 - 260 (1990) Treonina E. coli Ikeda, M.: Amino Acid Production Process (2003), Adv. Biochem. Engin/Biotechnol 79, 1-35. Ácido aspártico E. coli Ikeda, M.: Amino Acid Production Process (2003), Adv. Biochem. Engin/Biotechnol 79, 1 - 35 + literatura ai citada., Gutcho, Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation (1973) Bases purina e pirimidina Bacillus subtilis Rehm, H.-J.: Biotechnology, Weinheim, VCH, 1980 e 1993 - 1995; Gutcho, Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation (1973), di- nucleótido Bacillus subtilis Rehm, H.-J.: Biotechnology, Weinheim, VCH, 1980 e 1993 - 1995; 47 de nico-tinamida-adenina (NAD) Gutcho, Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation (1973), Adenosina 5' -mono-fosfato (AMP) Bacíllus subtilis Rehm, H.-J.: Bíotechnology, Weinheim, VCH, 1980 e 1993 - 1995; Gutcho, Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation (1973), Ácido γ-linolénico Mucor, Mortiella, Aspergillus spp. Gill, I., Rao V.: Polyunsaturated fatty acíds, part 1: occurrence, biological activities and applications (1997). Trends in Bíotechnology 15 (10), 401 - 409; Zhu, H. : Utilization of Rice Bran by Pythium irregulare for Lipid Production. Master Thesis Louisiana State University, 31.10.2002 (URN etd-1111102-205855). Ácido di-homo-γ- linolénico Mortiella, Conidiobolus, Saprolegnia spp. Gill, I., Rao, V. : Polyunsaturated fatty acíds, part 1: occurrence, biological activities and applications (1997). Trends in Bíotechnology 15 (10). 401 - 409; Zhu, H. : Utilization of Rice Bran by Pythium irregulare for Lipid Production. Master Thesis Louisiana State University, 31.10.2002 (URN etd-1111102-205855). Ácido ara-quidónico Mortiella, Phytíum spp. Gill, I., Rao, V.: Polyunsaturated fatty acíds, part 1: occurrence, biological activities and applications (1997). Trends in Bíotechnology 15 (10), 401 - 409; Zhu, H.: Utilization of Rice Bran by Pythium irregulare for Lipid Production. Master Thesis Louisiana State University, 31.10.2002 (URN etd-1111102-205855). Ácido eicosa- pentanóico Mortiella, Phytíum spp. , Rhodopseudomonas, Gill, I., Rao, V.: Polyunsaturated fatty acíds, part 1: occurrence, biological activities and 48

Schewanella spp. applications (1997). Trends in Biotechnology 15 (10). 401 - 409; (Zhu, H.: Utilization of Rice Bran by Pythium irregulare for Lipid Production. Master Thesis Louisiana State University, 31.10.2002 (URN etd-1111102-205855). Ácido docosa- hexanóico Thraustochytrium, Entomophthora spp. , Rhodopseudomonas, Shewanella spp. Gill, I., Rao, V.: Polyunsaturated fatty acids, part 1: occurrence, biological activities and applications (1997). Trends in Biotechnology 15 (10). 401 - 409; Zhu, H.: Utilization of Rice Bran by Pythium irregulare for Lipid Production. Master Thesis Louisiana State University, 31.10.2002 (URN etd-1111102-205855). Propano- diol E. coli DE 3924423, US 440379, WO 9635799, US 5164309 Butanodiol Enterobacter aerogenes, Bacillus subtilis, Klebsiella oxytoca Rehm, H.-J.: Biotechnology. Weinheim, VCH, 1980 e 1993 - 1995; Gutcho, Chemicals by Fermentatíon, Noyes Data Corporation (1973); H. G. SCHLEGEL e H. W. JANNASCH, 1981; Afschar et al.: Mikrobielle Produktion von 2,3-Butandiol. CIT 64 (6), 2004, 570 - 571 Butanol Clostridium (por exemplo, Clostridium acetobutylicum, C. propionicum) Rehm, H.-J.: Biotechnology, Weinheim, VCH, 1980 e 1993 - 1995; Gutcho, Chemicals by Fermentatíon, Noyes Data Corporation (1973), Glicerina levedura, Saccharomyces rouxii Gutcho, Chemicals by Fermentatíon, Noyes Data Corporation (1973), Manitol Aspergillus candida, Torulopsis mannitofaciens Gutcho, Chemicals by Fermentatíon, Noyes Data Corporation (1973), Arabitol Saccharomyces rouxii, S. mellis, Sclerotium glucanicum, Pichia ohmeri Gutcho, Chemicals by Fermentatíon, Noyes Data Corporation (1973), 49

Xilitol Saccharomyces cerevisiae Gutcho, Chemicals by Fermentatíon, Noyes Data Corporation (1973), Ácido hialu- rónico Streptococcus sp. Rehm, H.-J.: Bíotechnology, Weinheim, VCH, 1980 e 1993 - 1995; Trealose Brevibacterium, Corynebacterium, Mi crobacterium, Arthrobacter spp. , Pleurotus genus, Filobasidium flori forme JP 05099974, JP 06311891, FR 267 1099, EP 0555540, JP 3053791, Miyazaki, J.-I., Miyagawa, K.-I., Sugiyama, Y.: Trehalose Accumulation by Basidiomycotinous Yeast, Filobasidium flori forme. Journal of Fermentatíon and Bíoengíneeríng 81, (1996) 4, 315 -319. Ácido ascórbico Gluconobacter melanogenes RÕMPP Online Version 2.2 Vitamina Bl2 Propionibacterium spp. , Pseudomonas denitrifícans Chem. Ber. 1994, 923 - 927; RÕMPP Online Version 2.2 Ribo- flavina Bacillus subtilis, Ashbya gossypii WO 01/011052, DE 19840709, WO 98/29539, EP 1186664; Fujioka, K. : New bíotechnology for ríboflavín (vitamin B2) and character of thís ríboflavín. Fragrance Journal (2003), 31 (3), 44 - 48. Vitamina B6 Rhizobium tropici, R. meliloti EP0765939 Enzimas Aspergíllí (por exemplo, Aspergillus níger A. oryzae) Tríchoderma, E. coli, Hansenula ou Píchía (por exemplo, Píchía pastorius, Bacillus (por exemplo, Bacillus licheniformis, B. subtilis) entre outros Rehm, H.-J.: Bíotechnology, Weinheim, VCH, 1980 e 1993 - 1995; Gutcho, Chemicals by Fermentatíon, Noyes Data Corporation (1973), Zeaxantina Dunaliella salina Jin et al (2003) Biotech. Bioeng. 50 81: 115 - 124 Canta- xantina Brevibacteríum Nelis et al (1991) J Appl Bacteríol 70: 181 - 191 Licopina Blakeslea trispora, Candida utílís WO 03/056028, EP 01/201762, WO 01/12832, WO 00/77234, Miura et al (1998) Appl Environ Microbiol 64: 1226 - 1229 β-carotina Blakeslea trispora, Candida utílís Kim S., Seo W., Park Y., Enhanced production of betacarotene from Blakeslea trispora wíth Span 20, Biotechnology Letters, Vol. 19, N.° 6, 1997, 561 - 562; Mantouridou F., Roukas T.: Effect of the aeratíon rate and agitation speed on betacarotene production and morphology of Blakeslea trispora in a stírred tank reator: mathematical modelling, Bíochemical Engíneeríng Journal 10 (2002), 123 - 135; WO 93/20183; WO 98/03480, Miura et al (1998) Appl Environ Microbiol 64: 1226 - 1229 Asta- xantina Phaffía rhodozyma; candida utílís US 5,599,711; WO 91/02060, Miura et al (1998) Appl Environ Microbiol 64: 1226 - 1229 Poli-hidroxi-alcanoatos , poli-ésteres Escherichia colí, Alcaligenes latus, entre outros S. Y. Lee, Plastíc Bactéria, Progress and Prospects for polyhydroxyalkanoate production in bactéria, Tibtech, vol. 14, (1996), pág. 431 - 438., Steinbuchel, 2003; Steinbuchel (ed.), Biopolymers, l.a ed., 2003, Wiley-VCH, Weinheim e literatura ai citada Polis- sacáridos Leuconostoc mesenteroídes, L. dextranícum, Xanthomonas campestris, entre outros Rehm, H.—J.: Biotechnology, Weinheim, VCH, 1980 e 1993 - 1995; Gutcho, Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation (1973), Poli-iso- prenóides Lactarius sp. , Hygrophorus sp. , Steinbuchel (ed.), Biopolymers, l.a ed., 2003, Wiley-VCH, Weinheim e 51

Russula sp. literatura aí citada Acetona Clostridium (por exemplo, Clostridium acetobutylicum, C. propionicum) Rehm, H.—J.: Bíotechnology, Weinheim, VCH, 1980 e 1993 - 1995; Gutcho, Chemicals by Fermentatíon, Noyes Data Corporation (1973), Acetoína Enterobacter aerogenes, Clostridium acetobutylicum, Lactococcus lactis Lengeler, J. W., Drews, G., Schlegel, H. G.: ed., Biology of the Procaryotes, Thieme, Estugarda (1999), pág. 307; RÕMPP Online-Edition Vanilina Pseudomonas putída, Amycolatopsis sp. Priefert, H., Rabenhorst, J., Seinbuchel, A. Biotechnological productíon of vaníllín. Appl. Microbiol. Biotechnol. 56, 296 -314 (2001) Turigensin a Bacillus thurigiensis Jian-Zhong Jong et al.: Fed-batch culture of Bacillus thuríngíensís for thuríngensín productíon in a tower type bioreactor. Bíotechnology and Bíoengíneeríng 48 (3) (2004), 207 - 213. Poli- cetídeos Streptomyces fradiea, Sorangium cellulosum Kirst: Fermentation-derived compounds as a source for new products. Pure & Appl. Chem. 70 (2), (1998), 335 - 338; Zirkle et al.: Heterologous productíon of the antifungai polyketide antibiotic soraphen A of Sorangium cellulosum So ce26 in Streptomyces lividans. Mícrobíology 150 (8), (2004), 2761-74. Ácido giberélico Gibberella fujikuroi Hollmann et al.: Extraktiv— Fermentatíon von Gibberellinsaure mit Gibberella fujikuroi. CIT 7 (1995), 892 - 895. índigo Escherichia coli JB 102 Berry, A., Dodge, T. C., Pepsin, M., Weyler, W.: Application of metabolic engineering to improve both the productíon and use of bíotech índigo. Journal of 52 52 Industrial Microbiology & Biotechnology 28 (2002), 127 - 133. O composto orgânico produzido é selecionado dentre ácidos monocarboxílicos, dicarboxilicos e tricarboxilicos tendo eventualmente grupos hidroxilo, com 3 a 10 átomos de C, aminoácidos proteinogénicos e não proteinogénicos, bases purina, bases pirimidina; nucleósidos, nucleótidos, lípidos; ácidos gordos saturados e insaturados; dióis com 4 a 10 átomos de C, álcoois polivalentes com 3 ou mais grupos hidroxilo, álcoois de cadeia longa com pelo menos 4 átomos de C, hidratos de carbono, em particular dissacáridos, oligossacáridos e polissacáridos, compostos aromáticos, vitaminas, provitaminas, cofatores, nutracêuticos, proteínas, carotenoides, cetonas, com 3 a 10 átomos de C, lactonas, aminas, biopolímeros e ciclodextrinas. É revelada a utilização do meio líquido contendo açúcar na produção por fermentação de enzimas, como fitases, xilanases ou glucanases. É revelada a utilização do meio líquido contendo açúcar numa produção por fermentação de aminoácidos, como lisina, metionina, treonina ou glutamato. É revelada a utilização do meio líquido contendo açúcar numa produção por fermentação de vitaminas, como o ácido pantoténico e a riboflavina, precursores e os produtos subsequentes dos mesmos. É revelada a utilização do meio líquido contendo açúcar numa produção por fermentação de ácidos monocarboxílicos, dicarboxilicos e tricarboxilicos, em particular de ácidos 53 monocarboxílicos e dicarboxílicos alifáticos com 2 a 10 átomos de C, tais como ácido acético, ácido propiónico, ácido fumárico e ácido succínico; ácidos hidroxicarboxilicos alifáticos com 3 a 10 átomos de C, como o ácido láctico; alcanóis de cadeia longa como anteriormente referidos, em particular alcanóis com 4 a 10 átomos de C como o butanol; dióis como anteriormente referidos, em particular alcanodióis com 3 a 10 e, em particular, 3 a 8 átomos de C, como o propanodiol; cetonas como anteriormente referidas, em particular cetonas com 3 a 10 átomos de C, como a acetona; aminas, em particular diaminas alifáticas com 3 a 10 átomos de C, como o 1,5-diaminopentano; nucleótidos como o 5'-IMP e o 5'-GMP, e hidratos de carbono, como anteriormente referidos, em particular dissacáridos como trealose, oligossacáridos e polissacáridos como o glucano. O produto metabólico produzido pelos microrganismos na fermentação trata-se de poli-hidroxialcanoatos, como o poli-3-hidroxibutirato e copoliésteres com outros ácidos hidroxicarboxilicos orgânicos, como o ácido 3-hidroxivaleriânico, ácido 4-hidroxibutírico e outros descritos in Steinbiichel (1. c.), por exemplo, também ácidos hidroxicarboxilicos de cadeia longa (também denominados de maior cadeia), como o ácido 3- hidroxioctanóico, ácido 3-hidroxidecanóico e ácido 3-hidroxitetradecanóico, assim como misturas destes. Para realizar a fermentação, é possível aplicar neste caso condições e procedimentos análogos aos descritos para outras fontes de carbono, por exemplo, in S. Y. Lee, Plastic Bactéria Progress and prospects for 54 polyhydroxyalkanoate production in bactéria, Tibtech, vol. 14, (1996), Pág. 431 - 438.

Por conseguinte, os microrganismos utilizados na fermentação são selecionados dentre microrganismos naturais ou recombinantes, que sobreproduzem pelo menos um dos seguintes produtos metabólicos: enzimas, como fitases, xilanases ou glucanases; aminoácidos como lisina, treonina, glutamato ou metionina; vitaminas, como o ácido pantoténico e riboflavina; precursores e/ou os respetivos produtos subsequentes; dissacáridos como a trealose; polissacáridos como o glucano; ácidos monocarboxilicos e dicarboxilicos alifáticos com 3 a 10 átomos de C, como o ácido propiónico, o ácido fumárico e o ácido succínico; ácidos hidroxicarboxilicos alifáticos com 3 a 10 átomos de C, como o ácido láctico; poli-hidroxialcanoatos como o poli-3-hidroxibutirato e copoliésteres do ácido 3-hidroxibutirico; cetonas com 3 a 10 átomos de C, como a acetona; aminas, em particular diaminas alifáticas com 3 a 10 átomos de C, como o 1,5-diaminopentano; alcanóis com 4 a 10 átomos de C, como o butanol; e alcanodióis com 3 a 8 átomos de C, como o propanodiol.

Os microrganismos apropriados são usualmente selecionados dos géneros Corynebacteriumr Brevibacteríum, Bacillus, Ashbya, Escherichiar Aspergillus, Alcaligenes,

Actinobacillus, Anaerobiospirillum, Lactobacillusr propionibacterium, Rhizopus, Clostridium, Schizophyllum e Sclerotium, em particular das estirpes das Corynebacterium 55 glutamicum, Corynebacterium sp AJ-1526, Brevibacterium ammoniagenes, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Ashbya gossypíí, Escherichia coli, Aspergillus niger, Aspergillus terreus, Aspergillus itaconicus, Alcaligenes latus, Anaerobiospirillum succíníproducens, Actinobacillus succinogenes, Lactobacillus delbruckii, Lactobacillus leichmannii, Propíoníbacteríum arabinosum, Propioníbacteríum schermanii, Propionibacterium freudenreichii, Clostridium propionicum, Clostridium formicoaceticum, Clostridium acetobutylicum, Rhizopus arrhizus r Rhizopus oryzae, Schizophyllum commune e Sclerotium rolflsii. 0 microrganismo empregue na fermentação consiste numa estirpe do género Corynebacterium, em particular numa estirpe da Corynebacterium glutamicum. Consiste sobretudo numa estirpe do género Corynebacterium, em especial da Corynebacterium glutamicum, que sobreproduz um aminoácido, em especial lisina, metionina ou glutamato. 0 microrganismo empregue na fermentação consiste numa estirpe do género Escherichia, em particular numa estirpe de Escherichia coli. Consiste sobretudo numa estirpe do género Escherichia, em especial da Escherichia coli, que sobreproduz um aminoácido, em especial lisina, metionina ou treonina. 0 produto metabólico produzido pelos microrganismos na fermentação é a lisina. Para realizar a fermentação, é possível aplicar aqui condições e procedimentos análogos aos descritos para outras fontes de carbono, como, por exemplo, in Pfefferle et al., 1. c., e no US 3,708,395. Em princípio, tem-se em consideração tanto um processo 56 continuo como um processo descontínuo (batch ou fed-batch), preferindo-se o procedimento fed-batch. 0 produto metabólico produzido pelos microrganismos na fermentação é a metionina. Para realizar a fermentação, é possível aplicar aqui condições e procedimentos análogos aos descritos para outras fontes de carbono, como, por exemplo, no WO 03/087386 e no WO 03/100072. No caso da produção da lisina, produz-se para este fim, a partir da solução de glicose obtida na Etapa c), em conjunto com sais nutritivos e elementos alimentares complexos, por exemplo, melaço, um meio para a fermentação da lisina. É possível esterilizar este meio através de vapor, de forma direta ou indireta. Após esterilização, utiliza-se o meio numa fermentação para a produção da lisina com microrganismos usuais, por exemplo, Corynebacterium glutamicum. Após terminada a fermentação, o licor de fermentação conterá além da lisina também microrganismos (biomassa) , componentes dissolvidos do meio nutritivo e, eventualmente, também componentes sólidos que não contêm amido da fonte de amido, que não podem ser totalmente separados através da separação de sólido/líquido (ver o capítulo 2.2.3). É possível obter a lisina de forma usual e a sua descrição encontra-se em maior detalhe abaixo. 0 produto metabólico produzido pelos microrganismos na fermentação é o ácido pantoténico. Para realizar a fermentação, é possível aplicar aqui condições e procedimentos análogos aos descritos para outras fontes de carbono, como, por exemplo, no WO 01/021772. 0 produto metabólico produzido pelos microrganismos na fermentação é a riboflavina. Para realizar a fermentação, é possível aplicar aqui condições e procedimentos análogos 57 aos descritos para outras fontes de carbono, como, por exemplo, nos WO 01/011052, DE 19840709, WO 98/29539, EP 1186664 e Fujioka, K. : New biotechnology for riboflavin (vitamin B2) and character of this riboflavin. Fragrance Journal (2003), 31(3), 44 - 48. O produto metabólico produzido pelos microrganismos na fermentação é o ácido fumárico. Para realizar a fermentação, é possível aplicar aqui condições e procedimentos análogos aos descritos para outras fontes de carbono, como, por exemplo, in Rhodes et al., Production of

Fumaric Acid in 20-L Fermentors, Applied Microbiology, 1962, 10(1), 9 - 15. O produto metabólico produzido pelos microrganismos na fermentação é o ácido láctico. Para realizar a fermentação, é possível aplicar aqui condições e procedimentos análogos aos descritos para outras fontes de carbono, como, por exemplo, in Narayanan et al., Electronic J. Biotechnol. 2 0 04, 7, http://vww.ejbiotechnologyJnfo/corítent/vo!7/issue2/fu!l/7/pdf. 0 produto metabólico produzido pelos microrganismos na fermentação é o ácido succínico. Para realizar a fermentação, é possível aplicar aqui condições e

procedimentos análogos aos descritos para outras fontes de carbono, como, por exemplo, in Int. J. Syst. Bacteriol. 26, 498 - 504 (1976); EP 249773 (1987), Inv.: Lemme e Datta; US 5,504,004 (1996), Inv.: Guettler, Jain e Soni; Arch, Microbiol. 167, 332 - 342 (1997); Guettler MV, Rumler D, Jain MK, Actinobacillus succinogenes sp nov., a novel succinic-acid-producing strain from the bovine rumen. Int J Syst Bacteriol. 1999 Jan; 49 Pt 1: 207-16; no US 5,723,322, US 5,573,931, US 5,521,075, WO99/06532, US 5,869,301 ou US 5,770,435. 58 0 produto metabólico produzido pelos microrganismos na fermentação é o ácido itacónico. Para realizar a fermentação, é possível aplicar aqui condições e procedimentos análogos aos descritos para outras fontes de carbono, como, por exemplo, in Kautola, H., Appl. Microb. Biotechnol., 1990, 33,7 e Willke et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 2001, 56, 289. O produto metabólico produzido pelos microrganismos na fermentação é uma fitase. Para realizar a fermentação, é possível aplicar aqui condições e procedimentos análogos aos descritos para outras fontes de carbono, como, por exemplo, no WO 98/55599. O produto metabólico produzido pelos microrganismos na fermentação é o glucano. Para realizar a fermentação, é possível aplicar aqui condições e procedimentos análogos aos descritos para outras fontes de carbono, como, por exemplo, in Schilling et al.: Repression of oxalic acid biosynthesis in the unsterile scleroglucan production process with Sclerotium rolfsii ATCC 15205, Bioprocess Engineering 22 (2000), 51 - 55 ou Rau et al. : Oxygen controlled batch cultivations of Schizophyllum commune for enhanced production of branched β-l,3-glucans, Bioprocess Engineering 11 (1994), 161 - 165.

Os produtos metabólicos produzidos pelos microrganismos na fermentação são nucleótidos, como o 5'-IMP e o 5'-GMP. Para realizar as fermentações, é possível aplicar aqui condições e procedimentos análogos aos descritos para outras fontes de carbono, como, por exemplo, in Sato et al., Accumulation of Guanosine Polyphosphates by Brevibacterium ammoniagenes: Isolation and Identification of the Products. Agr. Biol. 59

Chem. 40 (3), 1976, 465 - 474; Mori et al.: A novel process of inosine 5'-monophosphate production using overexpressed guanoslne/inosine kinase. Appl. Mlcroblol. Biotechnol. (1997) 48: 693 - 698, ou no GB 01188885. O produto metabólico produzido pelos microrganismos na fermentação é o glutamato. Para realizar a fermentação, é possível aplicar aqui condições e procedimentos análogos aos descritos para outras fontes de carbono, como, por exemplo, in E. Kimura, L-Glutamate Production, in: Handbook of Corynebacterium glutamicum, CRC press, Boca Raton, FI, 439 - 464. O produto metabólico produzido pelos microrganismos na fermentação é o 1,5-diaminopetano. Para realizar a fermentação, é possível aplicar aqui condições e procedimentos análogos aos descritos para outras fontes de carbono, como, por exemplo, no JP 2004222569. O produto metabólico produzido pelos microrganismos na fermentação é o ácido 5-cetoglucónico. Para realizar a fermentação, é possível aplicar aqui condições e procedimentos análogos aos descritos para outras fontes de carbono, como, por exemplo, in Elfari, M. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005, 66,668, e Herrmann U., et ai., Appl. Microbial. Biotechnol. 2004, 64, 86. O produto metabólico produzido pelos microrganismos na fermentação é o ácido 2,5-dicetoglucónico. Para realizar a fermentação, é possível aplicar aqui condições e procedimentos análogos aos descritos para outras fontes de carbono, como, por exemplo, in Roper, H., Starch-Starke 1990, 42, 342 ou Zelic, B. et al., Chem. Biochem. Eng. Q. 2002, 16,7. 60

Acabamento da fermentação

No processo para a produção de uma substância orgânica através de fermentação, tem-se por resultado um licor de fermentação que contém, a par do produto metabólico pretendido, essencialmente a biomassa produzida durante a fermentação e os açúcares não aproveitados, assim como os sais tampão e os sais nutritivos não aproveitados. Normalmente, segue-se por conseguinte à fermentação uma continuação do processamento do licor de fermentação, de modo a obter o produto de valor, ou seja, a substância orgânica produzida pelo processo de fermentação, e a passa-la a uma forma manipulável ou comercial, assim como a depurar os produtos secundários originados na fermentação, como a biomassa e os componentes aquosos, ou a conduzi-los para outra utilização. 0 tipo de acabamento e as etapas a ele necessárias dependem de forma de si conhecida das propriedades das substâncias do licor de fermentação e, sobretudo, do tipo de produto metabólico produzido.

Tipicamente, os processos de acabamento apresentam uma ou mais das seguintes etapas, as quais podem ser encadeadas numa sequência e com uma ocorrência opcionais: desativação do microrganismo, através, por exemplo, de esterilização da forma acima descrita; separação da biomassa do licor de fermentação; isolamento do produto metabólico não volátil do licor de fermentação, que ainda contém biomassa ou do qual a biomassa já foi separada; purificação do produto metabólico pretendido; concentração do produto metabólico; 61 concentração da biomassa.

Neste caso, não é forçoso que todas as etapas façam parte do processo de acabamento. Por exemplo, é possível prescindir de uma purificação adicional do produto ou dos produtos metabólicos, se não forem feitas grandes exigências em termos da pureza do produto. A separação da biomassa do licor de fermentação ocorre por processos usuais da separação de fase sólida/líquida (por exemplo, descrita in Belter, P. A., Bioseparatíons: Downstream Processing for Biotechnology, John Wiley & Sons (1988), e Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 5.a edição em CD-ROM, Wiley-VCH) e tem normalmente lugar por processos mecânicos, tais como decantação, separação, flutuação, centrifugação, sedimentação, filtração ou processos de membrana. Neste caso, também são concebíveis ligações de várias etapas de um processo ou de combinações de diferentes processos, como, por exemplo, decantação e separação. Além disso, também é possível utilizar água de lavagem de modo a aumentar o rendimento do produto metabólico não volátil na separação da biomassa. Preferencialmente, utiliza-se os processos acima referidos, se o produto metabólico for uma substância que se encontre em solução no licor de fermentação. No caso de produtos metabólicos oleosos ou sólidos, convém normalmente uma separação mecânica por meio de decantação, separação, flutuação, centrifugação, sedimentação se houver diferenças de densidade entre a biomassa e o produto metabólico. Caso contrário, também entram em consideração sobretudo processos cromatográficos, processos de destilação ou processos de extração. 62 0 isolamento ou o empobrecimento do produto de valor do licor de fermentação ocorre normalmente de modo a que se empobreça ou se isole pelo menos um produto de valor do licor de fermentação, de forma a que o teor desse produto de valor no licor de fermentação permanecente seja de 20% em peso no máximo, em particular de 10% em peso no máximo, em especial de 5% em peso no máximo e, muito em especial, de 2,5% em peso no máximo, por sua vez em relação ao peso total do licor de fermentação permanecente. O isolamento ou o empobrecimento do produto de valor do licor de fermentação pode ter lugar numa ou em várias etapas.

No isolamento de um produto de valor dissolvido no licor de fermentação, procede-se com vantagem de modo a remover primeiro a biomassa e outros componentes não dissolvidos do licor de fermentação, através, por exemplo, de centrifugação ou de filtração, e a isolar depois o produto de valor da fase liquida, através, por exemplo, de cristalização, precipitação, adsorção, destilação, cromatografia, extração, permuta iónica, processos de membrana (preferencialmente diálise de difusão, eletrodiálise, nanofiltração). Em alternativa, também é possível isolar o produto de valor diretamente do licor de fermentação através, por exemplo, da utilização de processos cromatográficos, processos de extração, processos de membrana, processos de adsorção e destilação. Como processo cromatográfico, é de referir sobretudo a cromatografia de permuta iónica, na qual é possível isolar o produto de valor de forma seletiva da coluna cromatográfica.

Para separar o produto de valor, poderá ser conveniente modificar quimicamente o produto de valor numa primeira etapa no licor de fermentação, através, por exemplo, de 63 esterificação ou da salinificação, de modo a melhorar assim a capacidade de separação. A cristalização é um processo que permite tanto uma separação do produto de valor do licor de fermentação, como também outra purificação do produto de valor. É assim preferencialmente aplicada em combinação com uma separação mecânica, como já acima referido, na qual os cristais podem ser separados da solução-mãe.

No caso dos compostos voláteis ou oleosos, é normalmente necessário um controlo das temperaturas máximas durante o acabamento, sobretudo durante a secagem. Com vantagem, também é possível isolar estes compostos de modo a serem formulados na forma quase sólida (forma pseudossólida) em adsorventes. Os adsorventes adequados a este fim encontram-se indicados, por exemplo, no WO 2005/116228 da autora do pedido, por exemplo, carvões ativos, óxidos de alumínio, sílica géis, ácido silícico, argila, negros de carbono, zeólitos, sais de metais alcalinos e de metais alcalinoterrosos inorgânicos, tais como hidróxidos, carbonatos, silicatos, sulfatos, fosfatos de sódio, de potássio, de magnésio e de cálcio, sobretudo os saios de magnésio e de cálcio, como, por exemplo, Mg(OH)2, MgCCh, MgSiCg, CaSCg, CaCC>3, óxidos de metais alcalinoterrosos, por exemplo, MgO e CaO, outros fosfatos e sulfatos inorgânicos, por exemplo, ZnSCg, sais de ácidos orgânicos, em particular os respetivos sais de metais alcalinos e de metais alcalinoterrosos e, em especial, os respetivos sais de sódio e de potássio, por exemplo, acetato, formiato, hidrogenoformiatos e citrato de sódio e de potássio, suportes orgânicos de elevado peso molecular, como os amidos eventualmente modificados, celulose, lignina, os materiais de suporte referidos mais abaixo em ligação com a 64 formulação do produto, assim como o glúten de milho. Os exemplos de produtos de valor, que podem com vantagem ser isolados deste modo, são o ácido γ-linolénico, ácido di-homo-Y-linolénico, ácido araquidónico, ácido eicosapentanóico e ácido docosa-hexaenóico, ainda ácido propiónico, ácido láctico, propanodiol, butanol e acetona. Estes compostos também são entendidos na formulação pseudossólida como produtos metabólicos não voláteis ou produtos de valor no estado sólido.

As etapas processuais acima referidas do acabamento podem requerer em parte a utilização de aditivos (por exemplo, para a regeneração do permutador iónico, o solvente para a extração, etc.) e/ou podem em parte originar um fluxo de substâncias secundárias (por exemplo, solução-mãe da cristalização, eluato do permutador iónico). Estes fluxos de substâncias secundárias, que podem em certa medida conter ainda o produto de valor, a biomassa, componentes sólidos não contendo amido do milho utilizado como fonte de amido e teores dos aditivos, podem ser sujeitos a outro acabamento, ser em certa medida reconduzidos para qualquer etapa processual do processo global, ser depurados ou ser reaproveitados. 0 conjunto dos fluxos acima referidos, preferencialmente os fluxos contendo biomassa, os fluxos contendo produto de valor e os fluxos de produto, contém, em certas circunstâncias, grandes concentrações de água (condicionadas pela fermentação ou pela água de lavagem no acabamento) e pode ser concentrado (redução do teor de água) . Isto pode dar-se por via térmica, por exemplo, por meio de concentração por evaporação, secagem ou de forma mecânica por meio de processos de membrana, filtração, etc. A água pode ser depurada ou pode ser reconduzida como água 65 processual e ser utilizada, por exemplo, no esmagamento da fração de endosperma ou no esmagamento do sólido separado na separação de várias etapas do glúten de milho. É revelado um processo, no qual os componentes voláteis do licor de fermentação podem ser removidos na totalidade ou em grande medida sem um isolamento ou um empobrecimento prévio do produto de valor e, eventualmente, sem uma separação prévia da biomassa, obtendo-se uma formulação sólida do produto de valor. Uma descrição mais precisa para a realização de um processo deste tipo encontra-se no WO 2007/028804 da autora do pedido, a que é feita aqui referência.

Através da adição de auxiliares de formulação, tais como materiais de suporte e materiais de revestimento, ligantes e outros aditivos, é possível ajustar de forma de si conhecida as propriedades do produto de valor seco e que se encontra em conjunto com os componentes sólidos da fermentação, de forma dirigida em termos de diversos parâmetros, tais como teor de substâncias ativas, granulometria, forma das partículas, tendência pulverulenta, higroscopicidade, estabilidade, sobretudo estabilidade de armazenamento, cor, odor, fluidez, tendência de aglomeração, carga eletrostática, fotossensibilidade e termossensibilidade, estabilidade mecânica e redispersabilidade. estabilizadores

Aos auxiliares de formulação usualmente utilizados pertencem, por exemplo, ligantes, materiais de suporte, auxiliares de controlo da fluidez/de pó, ainda pigmentos coloridos, biocidas, dispersores, antiespumantes, reguladores da viscosidade, ácidos, lixívias, antioxidantes, estabilizadores enzimáticos, inibidores 66 enzimáticos, adsorvatos, gorduras, ácidos gordos, óleos ou misturas destes. Os auxiliares de formulação deste tipo são com vantagem sobretudo utilizados em processos de formulação e de secagem, tais como secagem por pulverização, secagem de leito fluidizado e liofilização como auxiliares sicativos. Relativamente a outros detalhes, ver o WO 2007/028804. 0 teor dos aditivos acima referidos e eventualmente de outros aditivos, como os materiais de revestimento, pode variar fortemente em função dos requisitos especiais do respetivo produto de valor e em função das propriedades dos aditivos empregues e encontra-se, por exemplo, entre 0,1 e 80% em peso e, em particular, entre 1 e 30% em peso, por sua vez em relação ao peso total do produto formulado acabado ou da mistura de substâncias.

Os auxiliares de formulação podem ser adicionados antes, durante ou após o acabamento do licor de fermentação (também denominado formulação do produto ou conceção de sólidos) e sobretudo durante a secagem. Poderá convir em particular uma adição dos auxiliares de formulação antes do acabamento do licor de fermentação ou do produto de valor, de modo a melhorar a processabilidade das substâncias ou dos produtos a ser acabados. Os auxiliares de formulação podem ser adicionados tanto ao produto de valor obtido no estado sólido como a uma solução ou a uma suspensão que o contenha, por exemplo, após terminada a fermentação diretamente ao licor de fermentação ou a uma solução ou suspensão obtida no decorrer do acabamento antes da etapa de secagem terminal.

Assim, as substâncias auxiliares podem ser introduzidas por mistura, por exemplo, numa suspensão do produto de valor; 67 uma suspensão deste tipo também pode ser deitada num material de suporte, através, por exemplo, de pulverização ou de incorporação por mistura. A adição de auxiliares de formulação durante a secagem pode, por exemplo, desempenhar um papel, se uma solução ou suspensão contendo o produto de valor for pulverizada. Em particular, após a secagem ocorre uma adição de auxiliares de formulação, por exemplo, com a aplicação de revestimentos ou de coberturas/camadas de revestimento sobre partículas secas. Tanto após a secagem como após uma eventual etapa de revestimento, é possível adicionar outros auxiliares ao produto.

Remove-se os componentes voláteis do licor de fermentação de forma de si conhecida através de processos usuais, com vista a separar as fases sólidas das fases líquidas, inclusive processos de filtração e processos para a evaporação dos componentes voláteis das fases líquidas. Os processos deste género, que também podem compreender etapas para a limpeza das partes grosseiras dos materiais, e etapas para a confeção, encontram-se descritos, por exemplo, in Belter, P. A. Bioseparations: Downstream Processing for Biotechnology, John Wiley & Sons (1988), e Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 5.a edição em CD-ROM, Wiley-VCH. Os processos, equipamentos, substâncias auxiliares ou os exemplos gerais e especiais, conhecidos do especialista, que podem ser utilizados no âmbito da formulação do produto ou do acabamento após terminada a fermentação, encontram-se ainda descritos nos EP 1038 527, EP 0648 076, EP 835613, EP 0219 276, EP 0394 022, EP 0547 422, EP 1088 486, WO 98/55599, EP 0758 018 e WO 92/12645.

Numa primeira variante, transfere-se o produto de valor não volátil, desde que se encontre dissolvido na fase líquida, 68 da fase liquida para a fase sólida, através, por exemplo, de cristalização ou de precipitação. Em seguida, ocorre uma separação dos componentes sólidos não voláteis, inclusive do produto de valor, através, por exemplo, de centrifugação, decantação ou filtração. De forma semelhante, também é possível separar produtos de valor oleosos, passando-se os respetivos produtos de fermentação oleosos por meio da adição de adsorventes, por exemplo, ácido silícico, sílica géis, barro, argila e carvões ativos, a um estado sólido.

Numa segunda variante, remove-se os componentes voláteis através de evaporação. A evaporação pode ser realizada de forma de si conhecida. Os exemplos de processos adequados para a evaporação dos componentes voláteis são secagem por pulverização, secagem de leito fluidizado ou aglomeração de leito fluidizado, liofilização, secagem em secadores de fluxo e de contacto, assim como secagem de extrusão. Também se pode combinar os processos anteriormente mencionados com processos de moldagem, tais como extrusão, peletização ou compressão. No caso deste processo por último referido, utiliza-se preferencialmente misturas de substâncias contendo produto de valor, pré-secas em certa ou em grande medida. A remoção dos componentes voláteis do licor de fermentação compreende um processo para a secagem por pulverização ou um processo de secagem de leito fluidizado, inclusive granulação de leito fluidizado. Nesse sentido, o licor de fermentação é reconduzido, eventualmente após uma separação prévia para remover as partículas sólidas de maiores dimensões, não contendo teores ou contendo apenas baixos teores de produto de valor não volátil, para um ou mais equipamentos de secagem por pulverização ou de secagem de 69 leito fluidizado. Realiza-se o transporte ou a recondução do licor de fermentação carregado de sólidos de forma favorável, por meio de equipamentos de transporte usuais para líquidos contendo sólidos, por exemplo, bombas como as bombas com parafuso excêntrico (por exemplo, da empresa Delasco PCM) ou bombas de alta pressão (por exemplo, da LEWA Herbert Ott GmbH).

No caso especial da produção de lisina, o processo de acabamento compreende uma separação da biomassa através de separadores. A fração contendo biomassa é depois seca em secadores de tambor ou secadores de feixes tubulares. Eventualmente, adiciona-se por mistura, antes da secagem, um resíduo da fermentação da vitamina B2, os denominados "BFR" (Vitamin B2 Fermentation Residues) à fração contendo biomassa. A fração pobre em sólidos é acidulada e passa por um permutador iónico. A lisina é ligada a este permutador iónico. 0 licor de fermentação empobrecido de lisina, que deixa o permutador iónico, é concentrado por evaporação da água; os sólidos aí recristalizados são separados e secos. 0 produto neste caso originado é denominado "fertilizer" e pode ser reconduzido para o processo ou ser utilizado como fertilizante e/ou noutras aplicações. A solução-mãe da cristalização é conduzida como "CMS" (Condensed Molasses Solubles) para a continuação do processamento. A lisina ligada ao permutador iónico é eluída com água amoniacal e é concentrada por evaporação da água. Deste licor concentrado, é possível retirar lisina como base livre na forma de uma formulação líquida. Na etapa processual seguinte, a lisina é recristalizada através da adição de ácido clorídrico na forma de hidrocloreto de lisina. Os cristais são separados por centrifugação e são secos. A solução-mãe da cristalização é reconduzida para o eluato do 70 permutador iónico ou pode ser retirada como lisina na formulação liquida.

Em alternativa ao acabamento descrito, o licor de fermentação contendo lisina é diretamente seco por pulverização após a fermentação. Opcionalmente, é possível adicionar o resíduo de fermentação à produção da vitamina B2. Uma possível evaporação prévia de uma ou mais etapas do licor de fermentação pode levar a uma redução dos custos com energia e de investimento.

Utilização da glicose numa transformação não fermentativa É revelada a utilização da solução de glicose, que pode ser obtida de acordo com a invenção, como fonte de glicose para a produção não fermentativa de uma substância orgânica, como acima definido. É revelado um processo para a produção de uma substância orgânica através da transformação não fermentativa, compreendendo as seguintes etapas: i. preparação de uma solução de glicose aquosa, através, por exemplo, da produção da solução de glicose em conformidade com o processo de acordo com a invenção e ii. utilização da solução de glicose ou de uma glicose essencialmente anidra, obtida por concentração da solução (teor de água < 10% em peso) , numa transformação não fermentativa para a produção da substância orgânica pretendida. A transformação não fermentativa pode ser realizada de forma conhecida do especialista. Nesse sentido, transforma- 71 se normalmente a glicose aquosa, produzida de acordo com a invenção, eventualmente mediante a utilização de um catalisador. A substância orgânica, que pode ser produzida por via não fermentativa a partir de glicose, é o 5-hidroximetilfurfural. Na realização da reação, é possível aplicar as condições e os procedimentos análogos aos descritos para outras fontes de carbono, como, por exemplo, in Cottier et al., Trends Heterocycl. Chem. 1991, 2, 233; Lewkowski, J., Arkivoc 2001, 2, 17; Kuster, B. F. M. et al., Carbohydr. Res. 1977, 54, 159, no EP 0230250, FR 2464260 ou DE 3601281. A substância orgânica, que pode ser produzida por via não fermentativa a partir de glicose, é o ácido levúlico. Na realização da reação, é possível aplicar as condições e os procedimentos análogos aos descritos para outras fontes de carbono, como, por exemplo, in Horvat et al., Tetrahedron Lett. 1985, 26, 2111 ou no US 3258481. A substância orgânica, que pode ser produzida por via não fermentativa a partir de glicose, é o ácido glucónico. Na realização da reação, é possível aplicar as condições e os procedimentos análogos aos descritos para outras fontes de carbono, como, por exemplo, in Lichtenthaler, F. W., Acc. Chem. Res. 2002, 35, 728, Besson, M. et al., J. Catai. 1995, 152, 116 ou no EP 233816. A substância orgânica, que pode ser produzida por via não fermentativa a partir de glicose, é o ácido glucurónico. Na realização da reação, é possível aplicar as condições e os procedimentos análogos aos descritos para outras fontes de carbono, como, por exemplo, in Corma, A. et al., Chemical 72

Routes for the Transformation of Biomass into Chemicals , Chem. Rev. 2007, 107, 2411 - 2502. A substância orgânica, que pode ser produzida por via não fermentativa a partir de glicose, é o ácido 2-cetoglucónico. Na realização da reação, é possível aplicar as condições e os procedimentos análogos aos descritos para outras fontes de carbono, como, por exemplo, no US 2002177198, WO 9915673 ou EP 867446. A substância orgânica, que pode ser produzida por via não fermentativa a partir de glicose, é o ácido glutárico. Na realização da reação, é possível aplicar as condições e os procedimentos análogos aos descritos para outras fontes de carbono, como, por exemplo, in Besson, M. et al., Red. Trav. Chim. Pys-Bas 1996, 115, 217 e Dirkx, J. Μ. H. et al., J. Catai. 1981, 67, 1. A substância orgânica, que pode ser produzida por via não fermentativa a partir de glicose, é o sorbitol. Na realização da reação, é possível aplicar as condições e os procedimentos análogos aos descritos para outras fontes de carbono, como, por exemplo, in Dechamp, N. et al., Catai. Today 1995, 24, 29 e Maranhao, L. C. A. et al., Ind. Eng. Chem. Res. 2005, 44, 9624, nos WO 02100537, WO 02100539 e WO 2004052813. A substância orgânica, que pode ser produzida por via não fermentativa a partir de glicose, é o isossorbida. Na realização da reação, é possível aplicar as condições e os procedimentos análogos aos descritos para outras fontes de carbono, como, por exemplo, nos WO 9804540, WO 9200947 e US 4297290. 73 A substância orgânica, que pode ser produzida por via não fermentativa a partir de glicose, trata-se de alquilpoliglucósidos. Na realização da reação, é possível aplicar as condições e os procedimentos análogos aos descritos para outras fontes de carbono, como, por exemplo, nos US 5480979 e US 5698684. A substância orgânica, que pode ser produzida por via não fermentativa a partir de glicose, é HFCS (High-Fructose-Corn-Syrup = xarope de glicose rico em frutose). Na realização da reação, é possível aplicar as condições e os procedimentos análogos aos descritos para outras fontes de carbono, como, por exemplo, in Marschall et al., Enzymatic Conversion of d-Glucose to d-Fructose 1957, Science 125 (3249), 648 e no US 4523960.

Formulação dos produtos secundários

Como já acima descrito, origina-se, tanto nas etapas a) e c) do processo de acordo com a invenção da produção de glicose, como também na continuação do processamento fermentativo da glicose em produtos de valor, uma série de fluxos de substâncias como produtos secundários ou como produtos acoplados. Normalmente, trata-se neste caso de um ou mais dos seguintes fluxos de substâncias, preferencialmente nas quantidades indicadas: teor fino em pó da purificação do milho, se existente, tipicamente numa quantidade de até 5% em peso, em particular de 0,1 a 3% em peso; farelo de milho, se existente, tipicamente numa quantidade de até 7% em peso, por exemplo, de 1 a 6% em peso; gérmen de milho, tipicamente numa quantidade de 2 a 16% em peso, preferencialmente de 4 a 12% em peso 74 glúten de milho, tipicamente numa quantidade de 4 a 40% em peso, preferencialmente de 8 a 30% em peso biomassa, tipicamente numa quantidade de 1 a 40% em peso, preferencialmente de 5 a 20% em peso e eventualmente fluxos de substâncias secundárias, que podem surgir no processo de acabamento do produto de valor, se existentes, tipicamente numa quantidade de até 100% em peso, preferencialmente de 0,2 a 50% em peso, com especial preferência de 0,3 a 20% em peso, sendo todas as % em peso relativas à massa total do milho empregue na produção da glicose. É possível processar estes fluxos de substâncias em separado ou conduzi-los para uma depuração. Também é possível misturar estes fluxos de substâncias, no âmbito de uma continuação do processamento de forma opcional, ou seja, parcial ou totalmente em combinação opcional uns com os outros (ou seja, juntar pelo menos dois fluxos de substâncias) . Normalmente, ocorre uma secagem antes da continuação do processamento, sendo os fluxos de substâncias a ser misturados entre si eventualmente secos antes da mistura ou após a mistura. Com frequência, procede-se de modo a aglomerar ou a moer em conjunto as partículas sólidas dos fluxos de substâncias pelo menos em parte libertos de água. É possível realizar e combinar as etapas processuais secagem, aglomeração e moagem opcionalmente e numa sequência opcional em relação à mistura de diferentes fluxos. Preferencialmente, procede-se de modo a obter um produto secundário aquando da mistura dos fluxos de substâncias, o qual seja preferencialmente apto a ser ração animal e contenha pelo menos uma parte dos fluxos de 75 substâncias do processamento do milho (ou da produção de açúcar) e contenha pelo menos um componente do acabamento do licor de fermentação (biomassa ou fluxos de substâncias secundárias).

Eventualmente é possível adicionar, aos produtos secundários assim produzidos, auxiliares de formulação, substâncias ativas ou uma ou mais biomassas ou um ou mais fluxos de substâncias secundárias de outros processos de fermentação, podendo esta adição ter lugar em qualquer ponto opcional do processo.

Os níveis de humidade residual destes produtos secundários perfazem, no estado não seco, de 10 a 90% em peso, preferencialmente de 40 a 80% em peso. No estado seco, os níveis de humidade residual dos produtos secundários vão de 1 a 20% em peso e, preferencialmente, de 3 a 18% em peso e, com especial preferência, de 5 a 15% em peso. A granulometria média das partículas do teor de sólidos dos produtos secundários encontra-se entre 50 pm e 8 mm, preferencialmente entre 100 pm e 5 mm e, com especial preferência, entre 150 pm e 3 mm.

Caso um produto secundário seja uma mistura de diversas frações de sólidos, antes da mistura selecionar-se-á ou ajustar-se-á normalmente as distribuições granulométricas das partículas dos diferentes fluxos de substâncias, pelos quais é composto o produto secundário, de modo a que não ocorra uma separação da mistura dos fluxos de substâncias ou que esta seja pelo menos mínima. Isto é normalmente garantido se os fluxos de substâncias a ser misturados apresentarem uma granulometria o mais semelhante possível, ou se o denominado valor SPAN da mistura de produtos 76 secundários for inferior a 4, preferencialmente inferior a 3, com particular preferência inferior a 2 e, em particular, inferior a 1,8. Neste caso, o valor SPAN da mistura de produtos secundários é definido por SPAN = (Dgo — Dio) / D50

Neste caso, o valor Ό50 é a granulometria média ponderada da mistura de produtos secundários, ou seja, em relação à massa o valor D50 indica a granulometria que 50% em peso das partículas ultrapassam e que 50% em peso não atingem. O valor D90 é o diâmetro que 90% em peso das partículas não atingem e 10% em peso ultrapassam. O valor Di0 é o diâmetro que 10% em peso das partículas não atingem ou 90% em peso ultrapassam. O valor span ou a granulometria das partículas e a sua distribuição podem ser determinados de forma de si conhecida através, por exemplo, de análise granulométrica ou por difusão da luz.

Caso se produza um produto secundário a partir de pelo menos um fluxo de substâncias seco e de pelo menos um fluxo líquido, é por um lado possível secar primeiro os fluxos de substâncias líquidos e depois trata-los como fluxos de substâncias sólidos (ver acima). Relativamente à mistura destes fluxos de substâncias, aplica-se o mesmo que para a mistura dos fluxos de substâncias originalmente já secos. Por outro lado, é igualmente possível misturar os fluxos de substâncias líquidos e os secos uns com os outros antes de uma secagem ou durante a secagem. Isto tem a vantagem de o sólido contido no fluxo de substâncias líquido ou na forma de suspensão ser bem misturado e distribuído nos fluxos de substâncias secos, ou de o fluxo de substâncias líquido ser aplicado como revestimento sobre os componentes sólidos dos fluxos de substâncias secos ou de se utilizar os fluxos de 77 substâncias líquidos para aglomerar ou ligar as partículas sólidas do fluxo de substâncias seco. 0 teor fino em pó é descartado e não é introduzido por mistura nos produtos secundários. 0 farelo de milho não é introduzido por mistura nos produtos secundários, sendo em vez utilizado como produto autónomo. 0 gérmen de milho não é introduzido por mistura nos produtos secundários, sendo em vez utilizado como produto autónomo, por exemplo, para obter o óleo de gérmen de milho. 0 glúten de milho não é introduzido por mistura nos produtos secundários, sendo utilizado em vez como produto autónomo. A biomassa não é introduzida por mistura nos produtos secundários, sendo em vez utilizada como produto autónomo.

Os fluxos de substâncias secundárias não são introduzidos por mistura nos produtos secundários, sendo em vez utilizados como produtos autónomos, ou sendo descartados ou depurados.

Um teor ou toda a quantidade do farelo de milho originada, por exemplo, de 10 a 100% em peso, em relação ao teor de massa seca de todo o farelo de milho originado, é misturado/a com pelo menos um fluxo de produto secundário, por exemplo, com 10 a 100% em peso, em relação ao respetivo fluxo de produto secundário, e é seco/a, de modo a obter assim um produto secundário contendo farelo de milho. 78

Opcionalmente, o farelo de milho pode ser moído antes da mistura, de modo a ajustar granulometrias médias de 150 a 1.400 μπι e, com especial preferência, de 200 pm a 800 pm. Outra opção consiste em adicionar, antes ou depois da moagem, um parte do teor fino em pó originado do milho, por exemplo, de 10 a 100% em peso, do farelo de milho.

Num processo para a produção por fermentação da lisina, origina-se, por exemplo, um fluxo de substâncias secundárias de CMS tipo xarope, com um teor de massa seca de 40 a 90% em peso, que pode ser misturado ou juntado com o farelo de milho, por exemplo, por meio de pulverização, e podendo depois ser realizada a sua secagem conjunta. Após a secagem, pode ocorrer opcionalmente um fracionamento dos aglomerados eventualmente originados. A composição (em relação à massa seca) do produto secundário obtido deste modo é normalmente a seguinte:

Proteína bruta: 50% em peso Amido: 40% em peso Fibra bruta: 10% em peso Gordura bruta: 10% em peso Cinza bruta: a 7% em peso Lisina: 5% em peso 5 a 60% em peso, preferencialmente 10 a 1 a 50% em peso, preferencialmente 5 a 1 a 20% em peso, preferencialmente 2 a 1 a 20% em peso, preferencialmente 1 a 0 a 15% em peso, preferencialmente 0,1 0 a 10% em peso, preferencialmente 0 a

Produz-se um produto secundário A ao misturar, por sua vez, de 0 a 100% em peso, preferencialmente de 30 a 100% em peso, com especial preferência a quantidade total do gérmen 79 de milho originado, de 10 a 100% em peso, preferencialmente de 30 a 100% em peso, com especial preferência toda a quantidade do glúten de milho originado, assim como de 10 a 100% em peso, preferencialmente de 30 a 100% em peso, com especial preferência a quantidade total da biomassa originada. Opcionalmente, este produto secundário pode conter um teor de 0 a 100% do farelo de milho originado e de 0 a 100% do teor fino.

Na produção deste produto secundário A, são possíveis as seguintes variantes processuais.

Numa primeira variante, mistura-se e seca-se todos os fluxos (gérmen de milho, glúten de milho, biomassa e opcionalmente farelo de milho e/ou teor fino). Eventualmente, é ainda possível moer o produto secundário seco ou os ingredientes secos gérmen de milho e farelo de milho, de modo a ser possível ajustar uma granulometria média e uma humidade residual, como acima descritas. Numa segunda variante, mistura-se primeiro apenas os fluxos húmidos do glúten de milho e da biomassa e depois os mesmos são secos em conjunto. Isto tem a vantagem de o gérmen de milho já seco e opcionalmente também o farelo de milho seco não terem desnecessariamente de passar pelo secador. Após a secagem dos componentes, é possível misturar diretamente todos os fluxos ou moer primeiro os fluxos individuais e mistura-los depois. Após a mistura, pode seguir-se de novo uma moagem. É possível ajustar uma granulometria média e uma humidade residual, como acima descritas. Numa terceira variante, primeiro seca-se em separado os dois fluxos húmidos de biomassa e de glúten de milho. Isto pode ter a vantagem de ser possível evitar ou reduzir as indesejadas reações de decomposição, como, por exemplo, uma reação de Maillard entre os componentes de açúcar e os componentes 80 proteicos, que podem estar contidos nos fluxos. Os fluxos secos do glúten de milho, da biomassa, do gérmen de milho e opcionalmente do farelo de milho podem ser opcionalmente moídos ou misturados, ou pode seguir-se opcionalmente à mistura uma moagem. É possível ajustar uma granulometria média e uma humidade residual, como acima descrito. Numa quarta variante, introduz-se pelo menos num fluxo a ser seco um teor de 10 a 100% de pelo menos um fluxo sólido originado durante ou antes da secagem. Isto tem a vantagem de poderem ser formados aglomerados pretendidos, de se melhorar a fluidez do produto e de se reduzir a tendência pulverulenta do produto. Assim, é possível misturar, por exemplo, o glúten de milho originado a húmido (ou teores do mesmo) com teores de farelo de milho (opcionalmente moídos), com teores de gérmen de milho (opcionalmente moídos) ou teores da parte fina ou combinações opcionais destes, antes ou durante a secagem. Do mesmo modo, existe a possibilidade de misturar a biomassa originada a húmido (ou teores da mesma) com teores de farelo de milho (opcionalmente moídos), com teores de gérmen de milho (opcionalmente moídos) ou teores da parte fina ou combinações opcionais dos mesmos, antes ou durante a secagem.

Na produção do produto secundário A, utiliza-se biomassa da fermentação da lisina. Os fluxos glúten de milho, gérmen de milho e biomassa são empregues numa quantidade, respetivamente, de 50 a 100% em peso, em relação à quantidade total do respetivo fluxo originado e são processados na forma de um produto secundário pelos processos acima descritos. A composição preferida (em relação à massa seca) do produto secundário é caracterizada como se segue: 81

Proteína bruta: 10 a 60% em peso, com especial preferência 20 , a 50 % em peso Açúcar total : 0,1 a 50% em peso, com especial preferência 5 a 45% em peso Fibra bruta: 0 a 10% em peso, com especial preferência 0 a 7% em peso Gordura bruta: 1 a 30% em peso, com especial preferência 5 a 20% em peso Cinza bruta: 0 a 15% em peso, com especial preferência 0, 1 a 7 % em peso Lisina: 0,1 a 20% em peso, com especial preferência 0,2 a 10% em peso

Na produção do produto secundário A, mistura-se as biomassas de diferentes fermentações. Assim, é possível voltar a secar as diferentes biomassas primeiro separadas entre si, ou mistura-las e depois seca-las em conjunto. É possível misturar as biomassas numa relação de mistura opcional entre si. Preferencialmente, mistura-se 30 a 100% e, com maior preferência, 50 a 100%, da biomassa originada de uma respetiva fermentação.

Adiciona-se pelo menos uma biomassa de outro processo de fermentação a um produto secundário (acima descrito) opcional num ponto opcional do processo de produção. Trata-se de um produto secundário, contendo biomassa de uma fermentação da lisina (como acima descrito) e biomassa de uma fermentação da B2 (BFR, como acima definido). Preferencialmente, mistura-se 30 a 100% e, com maior preferência, 50 a 100%, da biomassa originada de uma respetiva fermentação. Eventualmente, o produto secundário contém teores de 50 a 100% do gérmen de milho originado e/ou 50 a 100% do glúten de milho originado e/ou 50 a 100% 82 do farelo de milho originado, bem como 0 a 100% do teor fino originado.

Trata-se de um produto secundário, contendo tanto biomassa de uma fermentação de produtos químicos, como, por exemplo, uma fermentação de lisina ou uma fermentação de glutamato, como também biomassa de um fermentação do bioetanol.

Na mistura de pelo menos duas biomassas, as biomassas advêm de fermentações ativadas por um fluxo de glicose obtido da sacarificação do amido de milho de acordo com a invenção. Neste caso, é possível proceder de modo a que as duas fermentações sejam o mesmo fluxo de glicose. Além disso, utiliza-se por sua vez os fluxos de glicose obtidos de processos de acordo com a invenção, mas tratando-se de fluxos de glicose produzidos em separado, normalmente com niveis de pureza da glicose diferentes. Neste caso, os pelo menos 2 meios de glicose distinguem-se tipicamente pela concentração dos componentes sólidos não contendo amido. Em relação à massa seca, origina-se pelo menos um fluxo com um elevado teor e um fluxo com um baixo teor de componentes sólidos não contendo amido. Os diferentes níveis de pureza dos fluxos de glicose podem ser gerados com processos como decantação, separação, centrifugação, sedimentação, filtração ou processos de membrana. Neste caso, também são concebíveis ligações de várias etapas de um processo ou combinações de diferentes processos, como, por exemplo, decantação e separação.

As pelas menos duas fermentações também podem, contudo, dizer respeito a diferentes fontes de C, sendo pelo menos uma fonte de C uma glicose, que pode ser obtida pelo processo de acordo com a invenção. 83

Um produto secundário, que contém pelo menos a biomassa de duas fermentações diferentes, pode também conter pelo menos 2 produtos metabólicos diferentes.

Em analogia com o produto secundário A acima descrito, contendo glúten de milho, gérmen de milho e biomassa (opcionalmente farelo de milho), e com o processo de produção correspondente, também é possível produzir produtos secundários contendo, como componentes secos, apenas glúten de milho e biomassa (opcionalmente farelo de milho e/ou auxiliares de formulação) ou apenas gérmen de milho e biomassa (opcionalmente farelo de milho e/ou auxiliares de formulação) ou apenas glúten de milho e gérmen de milho (opcionalmente farelo de milho e/ou auxiliares de formulação). Os possíveis processos de produção são análogos aos acima referidos.

Todos os produtos secundários podem ainda conter auxiliares de formulação, fibras alimentares, substâncias de carga ou outras substâncias ativas, que são adicionadas a uma etapa processual opcional da produção. elétrica, estabilidade

Através da adição de auxiliares de formulação, como matérias de suporte e materiais de revestimento, ligantes e outros aditivos, é possível confecionar de forma de si conhecida as propriedades do produto secundário de forma dirigida em termos de diversos parâmetros, tais como granulometria, forma das partículas, tendência pulverulenta, higroscopicidade, estabilidade, sobretudo estabilidade no armazenamento, cor, odor, fluidez, tendência para aglomeração, carga fotossensibilidade e termossensibilidade, mecânica e redispersabilidade. 84

Aos auxiliares de formulação usualmente utilizados pertencem, por exemplo, ligantes, materiais de suporte, auxiliares de controlo da fluidez/de pó, ainda pigmentos coloridos, biocidas, dispersores, antiespumantes, reguladores da viscosidade, ácidos, lixívias, antioxidantes, estabilizadores enzimáticos, inibidores enzimáticos, adsorvatos, gorduras, ácidos gordos, óleos ou misturas destes. Os auxiliares de formulação deste tipo são com vantagem utilizados sobretudo no caso da aplicação de processos de formulação e de secagem, tais como secagem por pulverização, secagem de leito fluidizado e liofilização como auxiliares sicativos.

Os exemplos de ligantes são hidratos de carbono, em particular açúcar, como os monossacáridos, dissacáridos, oligossacáridos e polissacáridos, por exemplo, dextrinas, trealose, glicose, xarope de glicose, maltose, sacarose, frutose e lactose; substâncias coloidais, como as proteínas animais, por exemplo, gelatina, caseína, sobretudo caseínato de sódio, proteínas vegetais, por exemplo, proteína de soja, proteína de ervilha, proteína de feijão, lupina, zeína, proteína de trigo, proteína de milho e proteína de arroz, polímeros sintéticos, por exemplo, polietilenoglicol, álcool polivinílico e sobretudo as marcas Kollidon da BASF, biopolímeros eventualmente modificados, por exemplo, lignina, chitina, chitosano, polilactida e amidos modificados, por exemplo, anidrido de succinato de octenilo (OSA) ; gomas, por exemplo, goma de acácia; derivados de celulose, por exemplo, metilcelulose, etilcelulose, (hidroxietil)metilcelulose (HEMC), (hidroxipropil)metilcelulose (HPMC), carboximetilcelulose (CMC); farinhas, por exemplo, farinha de milho, farinha de trigo, farinha de centeio, farinha de cevada e farinha de arroz. 85

Os exemplos de materiais de suporte e de fibras alimentares ou de substâncias de carga são hidratos de carbono, em particular os açúcares anteriormente referidos como ligantes, assim como amidos, por exemplo, de milho, de arroz, de batata, de trigo e de mandioca; amidos modificados, por exemplo, anidrido de succinato de octenilo; celulose e celulose microcristalina; minerais inorgânicos ou barro, por exemplo, argila, carvão, diatomito, ácido silicico, sebo e caulina; sêmolas, por exemplo, sêmola de trigo, farelo, por exemplo, farelo de trigo, as farinhas anteriormente referidas como ligantes; sais, como sais metálicos, sobretudo os sais de metais alcalinos e os sais de metais alcalinoterrosos de ácidos orgânicos; por exemplo, citrato, acetato, formiato e hidrogenoformiatos de Mg, de Ca, de Zn, de Na, de K, sais inorgânicos, tais como, por exemplo, sulfatos, carbonatos, silicatos ou fosfatos de Mg, de Ca, de Zn, de Na, de K; óxidos de metais alcalinoterrosos, como CaO e MgO; tampões inorgânicos como os hidrogenofosfatos de metais alcalinos, sobretudo hidrogenofosfatos de sódio e de potássio, por exemplo, K2HPO4, KH2PO4 e Na2HP04; assim como, em geral, os adsorventes referidos em ligação com a produção dos produtos metabólicos com um baixo ponto de fusão ou com consistência oleosa. Outras substâncias de carga ou fibras alimentares também podem ser produtos contendo gordura, como, por exemplo, farinha de soja, soja triturada ou farinhas ou grãos triturados de milho, centeio, trigo, cevada, ervilhas...

Os exemplos de auxiliares de controlo da fluidez ou agentes de pó são diatomito, ácido silicico, por exemplo, as marcas Sipernat da Degussa; argila, terras argilosas, sepiolite, quenita, montmorilonite, zeólitos, carvão, sebo e caulina; 86 os amidos anteriormente referidos como materiais de suporte, amidos modificados, sais inorgânicos, sais de ácidos orgânicos e agentes de pó; celulose e celulose microcristalina.

Relativamente a outros aditivos é de se referir, a titulo de exemplo, pigmentos coloridos, como ο T1O2; biocidas; dispersores; antiespumantes; reguladores da viscosidade; ácidos inorgânicos como os ácidos fosfóricos, ácido nítrico, ácido clorídrico, ácido sulfúrico; ácidos orgânicos como os ácidos monocarboxílicos e os ácidos dicarboxílicos saturados e insaturados, por exemplo, ácido fórmico, ácido acético, ácido propiónico, ácido butírico, ácido valeriânico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido oxálico, ácido malónico, ácido succínico, ácido glutárico, ácido adípico, ácido pimélico, ácido maleico e ácido fumárico; lixívias como os hidróxidos de metais alcalinos, por exemplo, NaOH e KOH; antioxidantes; estabilizadores enzimáticos; inibidores enzimáticos; adsorvatos; gorduras; ácidos gordos e óleos. 0 teor dos aditivos acima referidos e, eventualmente, de outros aditivos, como os materiais de revestimento, pode variar fortemente em função dos requisitos especiais do respetivo produto secundário, e em função das propriedades dos aditivos utilizados e encontra-se, por exemplo, entre 0,1 e 80% em peso, em relação ao peso total do produto formulado acabado ou da mistura de substâncias. É possível realizar a adição dos auxiliares de formulação a uma etapa de produção opcional do produto secundário, sobretudo durante a secagem eventualmente necessária. Os auxiliares de formulação podem ser adicionados tanto ao produto secundário que se obtém na forma sólida, como 87 também a uma solução ou a uma suspensão que o contenha. Sobretudo após a secagem, ocorre uma adição de auxiliares de formulação, por exemplo, aquando da aplicação de revestimentos ou de coberturas/camadas de revestimento sobre as partículas secas. Tanto após a secagem como também após uma eventual etapa de revestimento, é possível adicionar ao produto outros agentes auxiliares.

Opcionalmente é possível adicionar, a par do respetivo produto metabólico da fermentação, ainda outras substâncias ativas aos produtos secundários, preferencialmente as substâncias ativas usuais na indústria da ração animal, a uma etapa opcional do processo de produção. As substâncias ativas são todas as vitaminas (preferencialmente, A, Bl, B2, B5, B6, C, D3 e E), carotenoides, enzimas (preferencialmente fitase, xilanase, glucanase, amilase, celulase, hemicelulase, protease, lipase, pectinase, fosfatases), probióticos (por exemplo, Enterococcus ssp. , Lactobacillus ssp. Bacillus spp., Pediococcus ssp.), antibióticos; ácidos orgânicos e aminoácidos (metionina, lisina, etc.). As substâncias ativas perfazem preferencialmente um teor de 0,001 a 20% em peso, com especial preferência de 0,01 a 5% em peso, do produto secundário (em relação à massa seca). O exemplo que se segue serve para explicar a invenção.

Como ingrediente das experiências para a moagem do milho, utilizou-se um milho com a especificação US Yellow Nr. 2 com uma humidade de 11,9% em peso. Em relação à massa seca, este milho continha 3,8% em peso de gordura bruta e 75,3% em peso de amido.

Exemplo 1: Produção de uma solução de glicose

Etapa a): Moagem de fracionamento do milho a.l. Pré-purificação do milho

Numa primeira etapa, separou-se por peneiração a fração A (granulometria > 12 mm; 0,0% em peso do milho utilizado) e a fração B (granulometria < 6,5 mm, 4,05% em peso do milho utilizado) da quantidade principal do fluxo de milho (fração C) . Noutra etapa, removeu-se os componentes leves através de crivagem (0,18% em peso), os quais foram descartados. Em seguida, libertou-se a fração C de pedras num separador densimétrico, tendo a fração ficado assim isenta de pedras.

Para otimizar o rendimento do amido de todo o processo, voltou-se a separar a fração B através de peneiração numa fração BI com granulometrias das partículas entre 6,5 e 4,0 mm (2,95% em peso do milho utilizado), numa fração B2 com granulometrias < 4,0 mm (0,98% do milho utilizado), e através de crivagem numa fração de componentes mais leves (0,13% de resíduos). A fração BI que vai para a moagem foi libertada de pedras num separador densimétrico, tendo sido separado um teor mínimo de pedras.

Com base no milho bruto utilizado, deitou-se ao todo 98,7% do material na moagem.

Com vista a uma melhor moagem, ajustou-se o milho através da adição de água para uma humidade de cerca de 15% em peso. Antes da continuação do processamento, deixou-se o milho durante cerca de 8 h em repouso. a.2. Moagem de fracionamento 89

Variante 1: Desgerminação num desgerminador de milho

Nesta variante processual, conduziu-se a fração C (> 6,5 mm) do milho pré-purifiçado para uma máquina de desgerminação do milho. A máquina de desgerminação do milho foi um equipamento que tinha um fuso de entrada e uma zona de processamento, compreendendo um rotor de cilindros e um tambor perfurado estruturando envolvendo como camisa o rotor de cilindros. 0 milho a ser processado foi conduzido por meio do fuso de entrada para a zona de processamento. Conseguiu-se a desgerminação através de um processamento intensivo entre o rotor de cilindros e o tambor perfurado, assim como através do respetivo ajuste da pressão dinâmica na saida. Neste caso, separou-se o gérmen da casca e da fração de endosperma. Após a passagem pela máquina, separa-se as frações originadas através de peneiração e de crivagem. Na peneiração, separou-se a denominada farinha de casca como a fração mais pequena. Através de crivagem, separou-se as cascas libertadas (fração de farelo). Visto que a separação do endosperma, casca e gérmen era incompleta na máquina de desgerminação do milho, a fração não separada por peneiração e crivagem foi deitada numa passagem do moinho de cilindros de três etapas. A fração de milho BI obtida na pré-purificação (granulometria entre 6,5 - 4 mm) foi também logo deitada na passagem do moinho de cilindros de várias etapas. Ao passar pelo moinho de cilindros, as partículas deitadas foram fragmentadas na passagem através de dois rolos com rotação a diferentes velocidades. Após cada passagem, as cascas e o gérmen libertados por crivagem e peneiração foram separados de uma fração de endosperma suficientemente fragmentada e também de uma fração de endosperma com componentes de gérmen e com componentes de casca eventualmente aderentes. Com vista a uma maior separação dos componentes de gérmen e dos 90 componentes de casca, esta fração de endosperma foi conduzida para a próxima passagem do moinho de cilindros.

Ao juntar as frações de endosperma (84% em peso do milho utilizado na moagem) , obteve-se uma farinha com um teor de amido de 84,4% em peso e com um teor de gordura de 1,28% em peso. A fração de gérmen originada (12,3% em peso do milho utilizado) tinha um teor de amido de 24,1% em peso e um teor de gordura de 20,8% em peso. A fração de casca (3,6% em peso do milho utilizado) tinha um teor de amido de 24,4% em peso e um teor de gordura de 1,9% em peso.

Variante 2: Desgerminação em moinhos de cilindros

Noutra variante processual, introduz-se as frações C (> 6,5 mm) e BI (6,5 a 4,0 mm) do milho pré-purifiçado diretamente num moinho de cilindros com 2 pares de cilindros, indo cada dois cilindros mover-se em direção contrária com rotação a diferentes velocidades. Neste moinho de cilindros, fragmentou-se os grãos de milho através de dois rolos com rotação a diferentes velocidades e separou-se em parte as cascas, o endosperma e o gérmen de milho através de cisalhamento. Depois desta primeira decomposição, seguiram-se três outras passagens pelo moinho de cilindros, voltando as partículas adicionadas a ser fragmentadas na passagem através de dois rolos com rotação a diferentes velocidades. Após cada passagem, separou-se através de peneiração e de crivagem as cascas e o gérmen libertados de uma fração de endosperma suficientemente fragmentada, assim como de uma fração de endosperma com componentes de gérmen e de casca eventualmente aderentes. Com vista a uma maior separação dos componentes de gérmen e de casca, conduziu-se esta fração de endosperma para a seguinte passagem no moinho de cilindros. 91

Ao juntar as frações de endosperma (85,3% em peso do milho utilizado na moagem), obteve-se uma farinha com um teor de amido de 84,6% em peso e com um teor de gordura de 1,74% em peso. A fração de gérmen originada (11% em peso do milho utilizado) tinha um teor de amido de 25,5% em peso e um teor de gordura de 19,0% em peso. A fração de casca ( = fração de farelo, 3,7% do milho utilizado) tinha um teor de amido de 24,3% em peso e um teor de sólidos de 2,7% em peso. a.3 Redução granulométrica

Com vista à redução granulométrica, moeu-se as três frações originadas (endosperma, gérmen e casca) em separado.

Realizou-se a moagem da fração de endosperma num moinho de cilindros. Neste caso, obteve-se uma farinha de trigo com a seguinte distribuição granulométrica.

Granulo-metria [μπι] > 905 > 410 > 310 > 200 > 132 < 132 Total Teor de massa [%] 0,1 1,9 11, 6 41, 3 23, 5 21, 6 100, 0

Moeu-se a fração de gérmen num moinho de martelos com um diâmetro do crivo de 3 mm. Com a moagem ajustou-se a seguinte distribuição granulométrica:

Granulo-metria [μπι] > 2.300 > 1.610 > 1.200 > 700 < 700 Total Teor de massa [%] 0,10 1,20 4,99 27,42 66, 30 100,00

Também se moeu a fração de casca num moinho de martelos com um diâmetro do crivo de 3 mm. Daqui resultou a seguinte distribuição granulométrica: 92

Granulo-metria [μπι] > 2.300 > 1.610 > 1.200 > 700 < 700 Total Teor de massa [%] 0,00 0,20 1,80 24,65 73,35 100,00

Etapa b) : Liquefação enzimática e sacarificação da farinha de milho

Instruções gerais bl:

Na realização das experiências, utilizou-se uma combinação de reatores de funcionamento em continuo e de forma descontinua. Primeiro esmagou-se a farinha de milho. Para isso, deitou-se em cada uma de 2 caldeiras de agitação 250 L de água e de farinha de milho e aqueceu-se com vapor direto para os 60°C. Em conformidade com a quantidade selecionada de farinha de milho, adicionou-se depois CaCl2 (0,006% em peso em relação à quantidade utilizada de farinha (substância seca)). Na etapa seguinte, ajustou-se o valor de pH com ácido sulfúrico a 10% em peso para um pH de 5,5 - 5,8 e adicionou-se α-amilase (Liquozyme Supra,

Novozyme A/S, 0,04% em relação à quantidade utilizada de farinha (TS)). O mosto produzido deste modo foi bombeado por meio de uma bomba com parafuso excêntrico através de um Jet Cooker (Hydroheater M101, Hydro-Thermal Corp.), tendo o mosto sido aquecido por vapor direto para os 109°C. Deste modo, aglutinou-se o amido contido na farinha de milho e a α-amilase empregue levou a uma separação das moléculas de amido. O fluxo que deixou o Jet Cooker foi conduzido para um reator tubular, que apresentava uma temperatura de 109°C, com 5 min de tempo de permanência. A mistura de reação que deixou o reator tubular foi descomprimida num recipiente de 30 L contra uma pressão ambiente, instalando-se temperaturas de 95 - 99°C. Sob estas condições, a mistura de reação foi depois bombeada para um segundo reator tubular com 120 min de tempo de permanência. A 93 partir deste segundo reator tubular, bombeou-se em seguida facultativamente a mistura liquefeita para uma caldeira de agitação de 250 L ou de 2.000 L.

Nas caldeiras de agitação, realizou-se por sua vez em descontínuo uma separação enzimática das dextrinas formadas na liquefação por separação das moléculas de amido em glicose. Para isso, baixou-se numa primeira etapa a temperatura da mistura liquefeita para os 63°C, ajustou-se o valor de pH com ácido sulfúrico a 10% para 4,3 (± 0,1) e adicionou-se depois glicoamilase (Dextrozyme DX 1.5X, Novozyme A/S, 0,06% em relação à quantidade utilizada de farinha (TS)) . Após a adição da glicoamilase, manteve-se depois a mistura de reação durante 48 h nos 63 - 65°C, antes de, através do aumento da temperatura para > 70°C, se ter interrompido a separação das dextrinas em glicose, por meio de desnaturação da glicoamilase.

Liquefez-se e sacarificou-se diversas farinhas de milho produzidas em analogia com a Etapa a) . Estas farinhas apresentavam as seguintes composições:

Humidade residual Amido” Proteína bruta* Gordura bruta* Cinza bruta Fibra bruta* [%] [%] [%] [%] [%] [%] Farinha 1 9,32 83,2 8,3 1,7 0,7 1,4 Farinha 2 9,44 83,1 7,7 1,5 0,6 1,3 Farinha 3 11,46 85,8 7,6 1,7 0, 3 0,7 teor de massa em relação ao teor de substância seca

As farinhas apresentavam a seguinte distribuição granulométrica das partículas:

Granulometria [ym] Teor de massa” > 850 > 600 > 425 > 300 > 250 < 250 94

Farinha 1 - - 2 30 10 58 Farinha 2 - - 2 50 6 42 Farinha 3 — - 2 22 11 64 *teor de massa em relação ao teor de substância seca

Todas as farinhas foram esmagadas e liquefeitas de acordo com as instruções gerais bl), tendo-se selecionado a relação de farinha e de água, de modo a que por sua vez resultasse um teor de amido de 31,0% em peso na liquefação e na sacarificação. Em conformidade com diferentes teores de amido das diferentes farinhas, utilizou-se assim teores de substância seca de 37,3% em peso (farinha 1, farinha 2) e de 36,1% em peso (farinha 3) na liquefação e na sacarificação. Passadas 48 h, formou-se através deste procedimento uma solução de açúcar (glicose bruta) com açúcares com diferentes comprimentos de cadeia. As glicoses assim obtidas apresentavam uma concentração de glicose (DPI) de 29,1 - 29,6% em peso. Os teores de glicose (DPI) e de oligoglicoses (DP2 a DP4) nas glicoses brutas obtidas encontram-se na seguinte tabela:

Grau de Farinha 1 Farinha 2 Farinha 3 polimerização DP 1 [%] 94,5 94,7 95, 5 DP 2 [%] 2,9 2,9 2,6 DP 3 [%] 1,5 1,5 1,0 DP 4 [%] 0,9 0,7 0, 8 > DP 4 [%] 0,3 0,2 0,2

Noutra experiência, utilizou-se a farinha 1 com um teor de amido de 34,7% em peso na liquefação e na sacarificação. Desse modo, teve-se por resultado um teor de substância seca de 41,7% em peso no mosto. Nesta experiência, reduziu-se a quantidade de glicoamilase para 0,06% (em relação à quantidade utilizada de farinha (TS)). Passadas 48 h, obteve-se neste procedimento uma glicose bruta com uma 95 concentração de glicose de 32,7% em peso. 94,2% do açúcar produzido tinham um grau de polimerização de 1.

Instruções gerais b2:

Em alternativa ao esmagamento descontinuo descrito em bl) da farinha de milho em caldeiras de agitação, realizou-se o esmagamento da farinha num misturador continuo (CoriMix K-TT, Lõdige-Drais). Para isso aqueceu-se, na caldeira de agitação prevista para a sacarificação com um volume de 2.500 L, ao todo 693 L de água para uma temperatura de 58,1°C e adicionou-se 69 g de Ca(OH)2 e 106 g de Liquozyme. A farinha de milho adicionada por mistura (11,4% em peso de humidade residual) tinha uma temperatura de 31°C. Num primeiro ponto de funcionamento, introduziu-se 109,2 kg/h da água em 82,8 kg/h de farinha de milho, tendo-se gerado ao todo 192 kg/h de uma suspensão de farinha de milho homogénea com 33,9% em peso do teor de amido e 38,2% em peso do teor de substância seca. A temperatura da mistura era de 42°C. Num segundo ponto de funcionamento, aumentou-se tanto as quantidades introduzidas de água como de farinha. A partir de 217,6 kg/h de farinha de milho e de 258,2 kg/h de água, produziu-se no misturador uma suspensão homogénea de farinha de milho de 475, 8 kg/h ao todo com 35,8% em peso de teor de amido e 40,5% em peso de teor de substância seca. A temperatura no segundo ponto de funcionamento também era de 42°C. A suspensão de farinha de milho assim obtida foi, em analogia com a forma indicada nas instruções gerais bl, numa conceção de jet cooker e de 2 reatores tubulares ligados em sequência, liquefeita e depois sacarificada em descontinuo. 96

Etapa c) :_Empobrecimento dos sólidos não hidrolisados da glicose bruta (glúten de milho e eventualmente componentes do farelo)

Separou-se os sólidos não hidrolisados da glicose bruta obtida na etapa b) num decantador (tipo Z23-4/401 s, da Flottweg). Um panorama das diferentes etapas processuais é fornecido pelo seguinte Esquema 1.

Esquema 1:

Solução de glicose coiitendo sólidos

Salda de sólidos 3 Solução de glicose coscentrada, pobre es> sólidos

Pelo processo descrito na Etapa b), produziu-se a partir da farinha 2 uma solução de glicose, que continha, com 28,6% em peso de teor de glicose e 0,8% em peso de teor de dissacáridos, um teor total de substância seca de 36,1% em peso. A densidade especifica da solução de glicose era de 1,15 g/cm3. 97

Em conformidade com o Esquema 1, deitou-se 440 kg desta solução de glicose contendo sólidos com um débito de 440 kg/h na primeira etapa de decantação e separou-se em duas frações (residuo 1 e saída de sólidos 1) . Deste modo, obteve-se 326 kg de resíduo (resíduo 1) com um teor de glicose de 30,3% em peso e um teor de dissacáridos de 0,9% em peso, um teor total de substância seca de 33,1% em peso e uma densidade do resíduo de 1,15 g/cm3. A saída de sólidos da primeira etapa de decantação (saída de sólidos 1) de 114 kg tinha um teor de glicose de 23,6% em peso e um teor de dissacáridos de 0,6% em peso. O teor total de substância seca da saída de sólidos 1 era de 44,6% em peso.

Na etapa seguinte, ressuspendeu-se a saída de sólidos 1 com 154 kg do resíduo da terceira etapa de decantação (resíduo 3) , tendo-se obtido 268 kg de uma solução de glicose contendo sólidos, com um teor de glicose de 11,9% em peso e um teor de dissacáridos de 0,4% em peso. O teor total de substância seca desta solução era de 23,2% em peso. Esta solução de glicose contendo sólidos foi depois deitada com um débito de 470 kg/h na segunda etapa de decantação e foi de novo separada em duas frações (resíduo 2 e saída de

sólidos 2) . Deste modo, obteve-se 169 kg do resíduo 2 com um teor de glicose de 13,2% em peso, e um teor de dissacáridos de 0,4% em peso, um teor total de substância seca de 14,1% em peso e uma densidade de 1,07 g/cm3. A saída de sólidos 2 foi originada numa quantidade de 99 kg e tinha um teor de glicose de 9,2% em peso e um teor de dissacáridos de 0,2% em peso. O teor total de substância seca da saída de sólidos 2 era de 38,6% em peso.

Na etapa seguinte, ressuspendeu-se a saída de sólidos 2 com 154 kg de condensado da concentração por evaporação da glicose, tendo-se obtido 253 kg de uma solução de glicose 98 contendo sólidos, com um teor de glicose de 3,8% em peso e um teor de dissacáridos de 0,2% em peso. 0 teor total de substância seca desta solução era de 16,1% em peso. Deitou-se depois esta solução de glicose contendo sólidos com um débito de 670 kg/h na terceira etapa de decantação e voltou-se a separar em duas frações (resíduo 3 e saída de sólidos 3) . Obteve-se 144 kg do resíduo 3 com um teor de glicose de 4,5% em peso e um teor de dissacáridos de 0,1% em peso. Com um teor total de substância seca de 4,4% em peso, a densidade do resíduo 3 era de 1,03 g/cm3. A saída de sólidos 3 foi originada numa quantidade de 109 kg, e tinha um teor de glicose de 3,1% em peso e um teor de dissacáridos de 0,1% em peso. O teor total de substância seca desta saída de sólidos 3 era de 31,6% em peso.

Os resíduos das duas primeiras etapas de decantação (resíduo 1 e resíduo 2) foram juntados. Deste modo, obteve-se 494 kg de uma glicose pobre em sólidos, que apresentava um teor volumétrico de sólidos de 1,0% de vol., determinado por centrifugação com 1.650 g. A mistura tinha um teor de glicose de 24,4% em peso e um teor de dissacáridos de 0,7% em peso. Com um teor total de substância seca de 26,6% em peso, a densidade da mistura era de 1,12 g/cm3. A solução de glicose assim produzida foi concentrada por evaporação num recipiente de agitação de parede dupla de 800 L. Para isso, sujeitou-se o recipiente de agitação a vapor a uma temperatura de 140°C. A temperatura da solução de glicose foi mantida nos 95°C através do ajuste de um ligeiro vácuo.

Ao fim da concentração por evaporação, ficaram 202 kg de solução de glicose no recipiente de agitação. Esta solução apresentava um teor de glicose de 60,5% em peso e um teor 99 de dissacáridos de 1,6% em peso. 0 teor total de substância seca da solução era de 65,0% em peso. 0 teor de proteína bruta era de 1,9% em peso, o teor de fibra bruta e o teor de cinza bruta eram de 0,01% em peso. A solução de glicose originada continha cerca de 580 mg/kg de proteína ou de aminoácidos com a seguinte distribuição de aminoácidos: 119 mg/kg de aspartato, 7 mg/kg de treonina, 15 mg/kg de serina, 55 mg/kg de glutamina, 16 mg/kg de glicina, 64 mg/kg de alanina, 5 mg/kg de cisteína, 15 mg/kg de valina, 3 mg/kg de metionina, 11 mg/kg de isoleucina, 9 mg/kg de leucina, 33 mg/kg de tirosina, 17 mg/kg de fenilalanina, 5 mg/kg de histidina, 10 mg/kg de lisina, 18 mg/kg de arginina e 190 mg/kg de prolina. O valor de pH da solução era de 4,4. A solução continha 0,12% em peso de S042~, 19 mg/kg de Cl~, 0,17% em peso de K+, 0,01% em peso de Ca2+, 42 mg/kg de Na+ e 0,12% em peso de P043'. A viscosidade da solução era de 84 cP nos 30°C.

Exemplo 2 não de acordo com a invenção: Produção de um pó de glúten de milho, através de secagem da fração de sólidos obtida no Exemplo 1, Etapa c)

Na produção do pó de glúten de milho, secou-se o sólido (saída de sólidos 3) separado no Exemplo 1, Etapa c) num Multicoil-Pilottrockner (da NLI). Este secador com 300 L de volume apresentava 3 serpentinas de aquecimento rotativas com uma superfície ao todo de 3 m2. Para operar o secador, deitou-se o material a ser seco, ajustou-se em seguida a pressão no secador para 600 mbar e aqueceu-se o secador por vapor a 6 bar nas serpentinas de aquecimento. Para isso, o secador foi operado com 13 rotações por minuto. No início das experiências, sujeitou-se 10 kg de material pré-seco proveniente de uma separação precedente de sólidos, de modo 100 a impedir aglutinações nas serpentinas de aquecimento. Após a adição de 10 kg do sólido húmido com 31,6% em peso de teor de substância seca (saída de sólidos 3 da Etapa c) do Exemplo 1), procedeu-se em seguida a secagem durante 45 min. Noutros intervalos, adicionou-se depois por sua vez mais sólido húmido (saída de sólidos 3 da Etapa c) do Exemplo 1), secou-se e determinou-se mais tarde no decorrer da secagem a humidade residual, respetivamente.

Tempo [min] 0 45 70 105 120 145 165 200 220 250 290 Sólido^ [kg] 10 Sol idOirú^cb [kg] 10 10 20 6 18 16 18 22 40 40 Humidade residual [% em peso] 24,0 22,8 25,6 10,4 15,3 19,2 10,1 O produto seco produzido deste modo tinha uma granulometria média das partículas de 369 pm e uma densidade aparente de 531 g/L. O produto seco consistia em 36,8% em peso de proteína bruta, 20,1% em peso de açúcar, 7,0% em peso de gordura bruta e 4,5% em peso de fibra bruta.

Exemplo 3 não de acordo com a invenção:Utilização da solução de glicose produzida numa fermentação

Utilizou-se uma solução de glicose, produzida de acordo com o Exemplo 1, em fermentações com a Corynebacterium glutamicum na produção da lisina. 3.1 Construção de uma estirpe da C. qlutamicum sobreprodutora de lisina ATCC13032 lysC£br 3.1.1

Construção do plasmídeo pCIS lysC 101

Numa primeira etapa da construção da estirpe, realizou-se uma troca de alelos do gene de tipo selvagem (lysC) que codifica a enzima aspartato cinase em C. glutamicum ATCC13032. Neste caso, realizou-se uma troca de nucleótidos no gene lysC, pelo que, na proteína resultante, o aminoácido Thr foi trocado na posição 311 por um Lie. A partir do ADN cromossómico da ATCC13032 como modelo para uma reação PCR, amplificou-se o lysC, com os primers oligonucleotídicos com o Pfu-Turbo PCR Systems (Stratagene, EUA) segundo as instruções do fabricante. O ADN cromossómico da C. glutamicum ATCC 13032 foi preparado de acordo com Tauch et al. (1995) Plasmid 33: 168 - 179 ou Eikmanns et ai. (1994) Microbiology 140: 1817 - 1828. O fragmento amplificado é flanqueado na sua extremidade 5' por uma interface de restrição Sall e na sua extremidade 3' por uma interface de restrição MluI. Antes da clonagem, o fragmento amplificado foi digerido por estas duas enzimas de restrição e foi purificado com o kit GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg).

Clonou-se o polinucleótido obtido através das interfaces de restrição Sall e MluI no pCLIK5 MCS integrativ SacB, seguidamente designado por pCIS, (SEQ ID NO: 3) e foi transformado em E. coli XL-1 blue. Conseguiu-se uma seleção das células tendo plasmideo através da colocação em placas em LB ágar tendo canamicina (20 pg/mL) (Lennox, 1955, Virology, 1 : 190). Isolou-se o plasmideo e confirmou-se a sequência nucleotidica esperada por sequenciamento. 102

Realizou-se a preparação do ADN plasmideo por métodos e com materiais da empresa Quiagen. Realizou-se as reações de sequenciamento de acordo com Sanger et ai. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74: 5463 - 5467. Separou-se e avaliou-se as reações de sequenciamento por meio do ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt). O plasmideo obtido foi denominado pCIS lysC (SEQ ID NO: 4). Ele compreende as seguintes áreas parciais fundamentais:

Posição Tipo de sequência Descrição 155 - 1.420 CDS lysC Complemento (3935..5356) CDS sacB\Bacíllus subtilis Complemento (5357..5819) Promotor Promotor\sacB Complemento (3913..3934) Região C sacB\área a jusante 1974..2765 CDS Resistência à canamicina Complemento (3032..3892) CDS Origem da replicação\ E. coli\ plasmideo pMB 3.1.2 Mutagénese do gene lysC da C. glutamicum A mutagénese dirigida do gene lysC da C. glutamicum foi realizada com o QuickChange Kit (Stratagene, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Realizou-se a mutagénese no plasmideo pCIS lysC (SEQ ID NO: 4). Para a troca do thr 311 pelo 311 ile com o método Quickchange (Stratagene) , sintetizou-se os seguintes primers oligonucleotidicos: S^CGGC ACC ACCG AC AT C AT CTTCACCTGCCCT CGTTCCG -3' (SEQ ID NQ:5) 5-CGGAACGAGGGCAGGTGAAGATGATGTCGGTGGTGCCG -3' (SEQ ID MO:6) 103 A utilização destes primers oligonucleotidicos na reação com o Quickchange leva no gene lysC (SEQ ID NO: 7) a uma troca do nucleótido na posição 932 (de C por T). A troca de aminoácidos resultante Thr311Ile no gene lysC foi confirmada após transformação em E. coii XLl-blue e preparação do plasmideo através de uma reação de sequenciamento. O plasmideo obteve a designação pCIS lysC thr311ile (SEQ ID NO: 8) . Compreende as seguintes áreas parciais fundamentais:

Posição Tipo de sequência Descrição 155 - 1.420 CDS LysC (thr311ile) Complemento (3935..5356) CDS sacB\Bacillus subtílis Complemento (5357..5819) Promotor Promotor\sacB Complemento (3913. .3934) Região C sacB\área a jusante 1974..2765 CDS Resistência à canamicina Complemento (3032 . .3892) CDS Origem da replicação\ E. coll\ plasmideo pMB 3.1.3 Transformação do pCIS lysC Thr311ile na C. glutamicum (estirpe ATCC13032) 0 plasmideo pCIS lysC Thr311ile foi transformado em C. glutamicum ATCC13032 por meio de eletroporação, como descrito in Liebl et al. FEMS Mícrobiology Letters 53: 299 - 303 (1989). Modificações do protocolo encontram-se descritas no DE 10046870. A disposição cromossómica do locus do lysC dos diferentes transformandos foi comprovada por métodos padrão através de Southern blot e de hibridação, como descrito in Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor (1989). 104

Garantiu-se assim que os transformandos são aqueles que integraram o plasmideo transformado através de recombinação homóloga no locus do lysC. Após o crescimento destas colónias durante a noite em meios sem antibiótico, coloca-se as células em placas de meio de sacarose-CM-ágar (10% de sacarose) e incuba-se durante 24 horas nos 30°C.

Dado que o gene sacB contido no vetor pCIS lysC thr311ile transforma a sacarose num produto tóxico, só podem crescer as colónias que deletaram o gene sacB através de uma segunda etapa de recombinação homóloga entre o gene do tipo selvagem lysC e o gene lysC thr311ile mutado. Durante a recombinação homóloga, é possível deletar o gene de tipo selvagem ou o gene mutado juntamente com o gene sacB. Se o gene sacB for removido em conjunto com o gene de tipo selvagem, tem-se por resultado um transformante mutado.

Foram selecionadas as colónias de crescimento e foram analisadas relativamente a um fenótipo sensível à canamicina. Os clones com o gene SacB deletado têm de mostrar ao mesmo tempo um comportamento de crescimento sensível à canamicina. Analisou-se estes clones sensíveis à canamicina num balão de agitação em termos da sua produtividade de lisina. Para fins comparativos, fez-se a cultura da C. glutamicum ATCC13032 não tratada. Selecionou-se os clones com uma maior produção de lisina relativamente ao controlo, obteve-se o ADN cromossómico e amplificou-se e sequenciou-se a respetiva área do gene lysC por meio de uma reação PCR (Pfu-Turbo PCR Systems; Stratagene, EUA) de acordo com as instruções do fabricante (de acordo com Sanger et al., 1. c.) . Um clone deste tipo com a propriedade de uma maior síntese da lisina e com uma mutação detetada no lysC na posição 932 recebeu a designação ATCC13032 lysCfbr. 105 3.2 Produção dos meios de fermentação 3.2.1 Pré-cultura 1:

Realizou-se a pré-cultura 1 num fermentador de 5 L. 0 volume de trabalho no fermentador era de 3 L. A composição do meio de pré-cultura encontra-se na seguinte tabela.

Componente do meio Concentração Sacarose 4,75% Sulfato de amónio 1,00% MgS04 0, 05% KH2P04 0,20% Ureia 0,25% Água da fonte de milho 5, 00% Proteína de soja hidrolisada 4,00% Ácido nicotínico 4,95 mg/L Tiamina*HCl 1 mg/L d-biotina 1,5 mg/L β-alanina 10 mg/L FeS04 10 mg/L MnS04 10 mg/L cuso4 1 mg/L An tiespumante 0,1 g/L

Dissolveu-se o açúcar diretamente no fermentador em água e esterilizou-se in situ. Esterilizou-se as fontes de nitrogénio em separado dos açúcares e adicionou-se em seguida. A solução de vitamina e de sal residual também foi produzida em separado e foi deitada através de um filtro estéril de 0,2 pm no fermentador após a esterilização. Após a adição de todos os componentes do meio, ajusta-se o valor de pH através de NaOH para 7. 106 3.2.2 Pré-cultura 2:

Realizou-se a pré-cultura num fermentador de 50 L. 0 volume de trabalho do fermentador era de 30 L. A composição do segundo meio de pré-cultura encontra-se representada na seguinte tabela.

Componente do meio Concentração Low Quality Molasses 3, 50% Sacarose 3,50% Água da fonte de milho 3,63% Sulfato de amónio 0,70% Ureia 0,25% H3PO4 0,25% Ácido nicotinico 7 mg/mL Tiamina*HCl 2,5 mg/L d-biotina 0,05 mg/L β-alanina 5 mg/L MnS04 7 mg/L CuS04 1,5 mg/L Antiespumante 0,25 g/L Betaínas 97% 0, 07%

Como no caso do meio de pré-cultura 1, dissolveu-se diretamente as fontes de açúcar no fermentador em água e esterilizou-se in situ. Adicionou-se as fontes de nitrogénio em separado dos açúcares e adicionou-se em seguida. A solução de vitamina e de sal residual também foi produzida em separado e foi adicionada através de um filtro estéril de 0,2 pm ao fermentador após a esterilização. Após a adição de todos os componentes do meio, ajusta-se o valor de pH através de NaOH para 7. 3.2.3. Cultura principal:

Introduziu-se a cultura principal como processo de alimentação, tendo-se utilizado, a par do meio inicial, ainda um meio de alimentação. Utilizou-se um fermentador com uma capacidade nominal de 300 L, tendo o volume de trabalho máximo sido de 190 L. 107

No início de cada fermentação principal, deitou-se 110 L do meio inicial representado na seguinte tabela no fermentador. Deitou-se de novo a fonte de açúcar com água no fermentador e esterilizou-se in situ. Esterilizou-se as fontes de nitrogénio em separado dos açucares. Também se produziu a solução de vitamina e de sal residual em separado e deitou-se através de um filtro estéril de 0,2 pm no fermentador após a esterilização. Depois da adição de todos os componentes do meio, ajusta-se o valor de pH através de NaOH para 7.

Componente do meio Concentração Low Qualíty Molasses 3, 00% Água da fonte de milho 1,49% Sulfato de amónio 5, 00% Antiespumante 0,1 g/L Betaína 97% 0, 07% H3PO4 0,063% Ácido nicotinico 2,5 mg/L Tiamina*HCl 2,5 mg/L d-biotina 0,3 mg/L MnS04 1 mg/L A composição do meio de alimentação encontra-se representada na tabela que se segue. Produziu-se a glicose utilizada com o processo representado no Exemplo 1. O tanque esterilizado vazio para o meio de alimentação foi enchido gradualmente através de um permutador de calor em espiral ( 140°C, 90 s de tempo de permanência) com as soluções de vitamina, de sal e de sulfato de amónio preparadas em separado As soluções de açúcar foram conduzidas para uma segunda etapa e também foram esterilizadas através do permutador de calor. 108 108 Componente do meio Concentração Low Quality Molasses 3,10% Glicose* 41,90% Sulfato de amónio 5,50% Antiespumante 1,0 g/L Betaina 97% 0,07% H3PO4 0,05% Ácido nicotinico 0,00045% Tiamina*HCl 0,000038% d-biotina 0,000125% *de solução de glicose correspondendo ao Exemplo 4 3.3 Fermentação

Produziu-se o inoculo para a pré-cultura 1 em balões de agitação de 2 L com um volume de trabalho de 300 mL (meio de pré-cultura 1) . A partir de tubos de ágar inclinados, inoculou-se os balões de agitação e agitou-se nos 29°C e com 120 rotações por minuto, durante 19 a 24 h, até a um teor volumétrico de biomassa de 3% de vol. O fermentador preparado de acordo com a secção 3.2.1 para a pré-cultura 1 foi inoculado com um balão de agitação e foi fermentado durante 24 h nos 30°C, com uma potência especifica de 5 kW/m3 e 1 vvm de arejamento. O critério de interrupção da fermentação foi um teor de biomassa de 3% de vol. . A seguir, inoculou-se o fermentador preparado de acordo com a secção 3.2.2 para a pré-cultura 2 com a pré-cultura 1. Adicionou-se uma quantidade correspondente da pré-cultura 1, de modo a atingir ao início um teor volumétrico de biomassa de 0,5% de vol. A fermentação foi realizada nos 30°C, com um arejamento de 0,7 vvm e com uma potência de 2 kW/m3. O controlo do pH foi feito através de amoníaco gasoso nos valores de 6,8 a 7,0. A duração típica da 109 fermentação, até se atingir o critério de interrupção de um teor volumétrico de 10% de vol., foi de 14 a 18 h.

Na etapa seguinte, inoculou-se o fermentador principal preparado com o meio inicial de acordo com a secção 3.2.3, tendo todo o conteúdo da pré-cultura 2 sido bombeado para o fermentado principal. Realizou-se a fermentação principal nos 33°C, com 0,5 vvm de arejamento e com uma potência especifica de 0,5 kW/m3. Regulou-se o valor de pH durante a fermentação por meio de amoníaco gasoso para um valor de pH de 6,8 a 7,0. Em intervalos de 2 horas, adicionou-se por sua vez uma quantidade parcial do meio de alimentação preparado, tendo a quantidade adicionada sido orientada em função do efetivo consumo de açúcar. De modo a evitar uma acumulação ou um empobrecimento de açúcar, adicionou-se a quantidade de açúcar igual à previsivelmente consumida no intervalo seguinte. Logo que o volume dos ingredientes no fermentador tenha excedido um valor de 210 L, retirou-se uma quantidade parcial do fermentador, de modo a que não transbordasse. Passadas 48 h, terminou-se a fermentação e esvaziou-se o fermentador. As quantidades parciais retiradas durante a fermentação foram juntadas ao conteúdo do fermentador no fim da fermentação e foram acabadas em conj unto.

Com a estirpe referida na secção 3.1 da Corynebacterium glutamicum, produziu-se, pelo procedimento descrito na fermentação principal, 21,6 kg de lisina ao todo. A concentração de lisina ao fim da fermentação era de 98 g/L. O teor de biomassa nos 293 kg de licor de fermentação produzido era de 38 g/L. 3.4 Acabamento do licor de fermentação através de separação e de secagem da biomassa 110

Para separar a biomassa, passou-se o licor de fermentação contendo biomassa com 300 L/h através de um decantador CA 225 (da Westfalia) . Ao todo, obteve-se com este procedimento 48,3 kg de uma fração contendo biomassa com 23% em peso de biomassa seca, e 244,7 kg de um resíduo sem biomassa. Retirou-se uma quantidade parcial da fração contendo biomassa e secou-se em chapas numa estufa de secagem nos 90°C. A humidade residual da biomassa seca era de 5,2% em peso. Em relação à massa seca, a biomassa consistia em 62,0% em peso de proteína bruta, 0,3% em peso de fibra bruta, 5,6% em peso de gordura bruta, 5,9% em peso de açúcar e 3,2% em peso de cinza bruta.

Exemplo 4 não de acordo com a invenção: Produção e análise de uma composição de ração animal para leitões, mediante a utilização do glúten do Exemplo 2

Analisou-se amostras da fração de gérmen obtida no Exemplo 1 (número de amostras n = 1), amostras do glúten seco obtido no Exemplo 2 (número de amostras n = 2) e amostras da biomassa originada no Exemplo 3 (número de amostras n = 16) relativamente à sua composição e à sua característica sólida. A análise das amostras deu origem à composição representada na seguinte tabela. A granulometria média do glúten nas amostras analisadas era de 270 pm, da biomassa era entre 400 e 500 pm, e da fração de gérmen moída era entre 872 e 1.194 pm.

Parâmetros Gérmen Glúten Biomassa Humidade residual [%] 9,65 5,90 7,24 Proteína bruta [%]" 18,82 32,74 67,30 Açúcar total [%]" 18,09 27,80 5,62 Lisina [%]" 0, 00 0, 03 9,09 Fibra bruta [%] 5, 90 6,25 0,11 Gordura bruta [%] 19,73 2,60 6, 94 Cinza bruta [%] 2,35 0, 83 2,75 111

Amónio-N [%] " 0,18 0,38 0,53 N total [%] ' 3,01 5,24 10,77 Sulfato [%] " 0,09 0,13 4,71 NDF* [%]' 26, 77 34,13 11,77 em relação à massa seca # non-digestible fiber (fibra não digerível)

Na produção de uma composição de ração, misturou-se os diferentes componentes na relação de 21% de biomassa : 22% de fração de gérmen : 57% de glúten, de modo a obter assim uma composição de ração com a seguinte composição. Produziu-se ao todo 16 amostras. Em média, a composição de ração assim obtida tinha uma densidade aparente entre 550 e 700 g/L com uma granulometria média das partículas de 590 pm.

Parâmetro Composição da ração Humidade residual [%] 9,32 Proteína bruta [%]” 36, 98 Açúcar total [%]” 27,05 Lisina [%]" 2,65 Fibra bruta [%] " 4,72 Gordura bruta [%]" 10,13 Cinza bruta [%] " 2,67 Amónio-N [%] ” 0, 30 N total [%] " 5,90 Sulfato [%] " 1,26 NDF* [%]" 27,66 em relação à massa seca ^ non-digestible fiber (fibra não digerível) A composição de ração assim obtida apresentava um teor proteico elevado, em especial um elevado teor de lisina, e tinha um grande teor energético devido aos elevados teores de gordura e de açúcar.

Em experiências de ração com leitões, testou-se as composições de ração animal assim obtidas em termos da sua 112 adequação como ração ou como aditivo para ração. A partir de uma dieta de soja e milho, adicionou-se 5% da composição de ração obtida. A quantidade adicionada foi compensada em conformidade com a composição da mistura de ração, através de redução de farinha de soja (75%), milho (20%) e óleo de soja (7%). Através de outros ajustes nos aminoácidos livres e nos minerais, elaborou-se assim dietas com o mesmo teor energético e nutritivo. Ao fim, peletizou-se as dietas. A dieta contendo a mistura de ração foi dada aos animais, em comparação com a dieta de milho-soja, em 12 boxes com leitões com 4-6 semanas. Neste caso, os leitões mostraram um aumento médio do peso de 2 61 g/dia, uma taxa de consumo da ração de 471 g/dia e um índice de conversão de 1,87 kg de ração por kg de aumento de peso. Resultados equiparáveis foram obtidos com uma ração com uma dieta convencional de milho-soja, que foi enriquecida com aminoácidos para gerar o teor nutritivo pretendido.

Os exemplos mostram que as composições de ração podem ser utilizadas em vez das dietas convencionais ou em conjunto com elas, sem com isso prejudicar a qualidade da ração. De facto, é possível prescindir da adição de aminoácidos. As rações adequam-se, por conseguinte, diferentemente dos sólidos originados na produção do bioetanol, como substituto de grande qualidade do milho e da soja em dietas dos monogástricos.

Exemplo 5 não de acordo com a invenção: Produção de composições de ração para pintos, mediante a utilização de glúten que pode ser obtido em analogia com o Exemplo 2

Analisou-se amostras das frações produzidas em conformidade com os Exemplos anteriores 1 a 3 biomassa, glúten e gérmen, em termos da sua composição. A farinha de soja serviu de referência. 113

Em analogia com o Exemplo 4, produziu-se uma composição de ração através da mistura de biomassa, glúten e gérmen na relação de 26 : 47 : 27 e procedeu-se à sua análise em alguns componentes principais. Calculou-se a composição dos outros componentes a partir da composição dos componentes individuais desta mistura. Com este procedimento, originou-se a seguinte composição das diversas amostras:

Parâmetro Gérmen Glúten Biomassa CR5’ Farinha de soja Teor de substância seca [g/kg] 912 966 931 937 911 Cinza bruta [g/kg] 56 7 28 3 65 Proteína bruta [g/kg] 160 292 642 349 452 Outros extratos [g/kg] 226 66 85 111 25 Amido [g/kg] 200 19 < 6 63’ 53 Açúcar [g/kg] 98 384 11 209’ 89 Fibra bruta [g/kg] 53 37 4 32^ 69 Teor energético ME [MJ/kg]2 14,8 12,1 13,0 13,0’ 9,9 Ca [g/kg] < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5’ 3 P [g/kg] 2 2 4,4 2,6’ 3 Na [g/kg] 0,3 0,3 3,2 1,1’ 3 K [g/kg] 1,2 1,2 6,1 2,5’ 3 Cl [g/kg] < 0,6 < 0,6 1,9 0,9’ 3

Análise de aminoácidos it.

Avaliação através de fórmula de regressão correspondendo aos resultados de análise 3 não analisado 4 calculado a partir dos componentes individuais da formulação da ração composição da ração 5 114

Na produção de uma ração, produziu-se uma dieta basal com a seguinte composição: a composição da dieta basal encontra-se representada na seguinte tabela:

Componente [g/kg] Milho 677,1 Farinha de soja de elevada proteína 211,0 L-lisina HC1 7,8 D,L-metionina 5,4 L-treonina 3,5 L-triptofano 0,9 L-arginina 3,8 L-isoleucina 3,1 L-leucina 0,9 L-valina 2,9 L-fenilalanina 0,9 L-cistina 1,7 Óleo e soja 27,5 Fosfato de monocálcio 220,6 Carbonato de cálcio 19,1 Cloreto de sódio 5,4 Pré-mistura de vitamina 5,5 Cloreto de colina (50%) 1,4 Pré-mistura de oligoelementos 1,4

Nas experiências de ração seguidamente descritas, utilizou-se a dieta basal como referência, assim como 3 outras rações, nas quais 35% em peso da dieta foram substituídos por glúten do Exemplo 2, pela composição de ração ou por farinha de soja (comparação). N. ° Composição Cl Dieta basal 100% 2 Dieta basal + glúten 65% + 35% 3 Dieta basal + composição de ração 65% + 35% C4 Dieta basal + farinha de soja 65% + 35% C: comparação 115

Para garantir a homogeneidade, produziu-se uma mistura base conjunta desta dieta basal. A esta mistura base, adicionou-se depois por mistura as respetivas amostras. Em seguida, comprimiu-se as misturas através de uma lingoteira de 3 mm na forma de peletes.

Para preparar as experiências de ração, usou-se pintos macho com um dia de idade (Ross 308) em gaiolas colocadas no chão, com uma dieta inicial comercial. Destes pintos, retirou-se e realojou-se no dia 8 animais para as experiências de ração.

Nas experiências de ração realizou-se, por amostra, por sua vez 6 experiências paralelas com 8 pintos respetivamente em gaiolas. Até ao dia 13, estes pintos foram alimentados com a dieta inicial comercial. No dia 13, pesou-se os pintos e os mesmos foram alimentados durante 9 dias com a dieta experimental, antes de se ter voltado a determinar o peso. Neste procedimento, determinou-se os seguintes dados diários de peso, consumo da ração e os índices de conversão (massa aumento de peso/ massa consumo de ração):

Ração N.s Cl 2 3 C4 Aumento do peso [g/dia] 57,5 52,0 39, 9 61,5 Consumo de ração [g/dia] 85,5 85,1 76,5 87,8 índice de conversão ±J 1,49 1, 64 1, 92 1,43 g aumento de peso / g consumo de ração

As dietas com o glúten ou com as composições de ração levaram a um melhor índice de conversão da ração

Lisboa, 27 de Fevereiro de 2012

Claims (6)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Processo para a produção de uma solução aquosa de glicose de milho, caracterizado por compreender: a) a moagem a seco de fracionamento de grãos de milho, separando-se os grãos de milho numa fração de endosperma contendo amido de milho e numa fração de gérmen rica em óleo e, eventualmente, numa fração de farelo; b) a liquefação e a sacarificação enzimáticas do amido de milho numa suspensão aquosa da fração de endosperma, obtendo-se uma solução de glicose aquosa contendo glúten de milho; e c) o empobrecimento do glúten de milho e, eventualmente, do farelo existente a partir da solução de glicose aquosa, utilizando-se na etapa b) uma suspensão aquosa da farinha de milho obtida na etapa a) , que contém a fração de endosperma e, eventualmente, a fração de farelo, escolhendo-se a quantidade de farinha de milho de modo a que a suspensão aquosa contenha de 30 a 45% em peso de amido, em relação ao peso total da suspensão.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se realizar a moagem na etapa a) na presença de 1 a 30% em peso de água, em relação à massa de grãos de milho empregues.

3. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por se separar, na Etapa a) , essencialmente apenas a fração de gérmen e a fração de farelo da fração de endosperma. 2

4. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por se separar, na Etapa a) , a fração de farelo e a fração de gérmen da fração de endosperma e por se reconduzir uma parte da fração de farelo para a fração de endosperma.

5. Processo de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizado por se separar o glúten de milho da solução de glicose aquosa em pelo menos 90%, em relação a todos os componentes de glúten contidos na solução de glicose.

6. Processo de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizado por se realizar o empobrecimento do glúten de milho e, eventualmente, dos componentes de farelo existentes, de modo a que a solução de glicose obtida após o empobrecimento contenha menos de 10% de vol. de sólidos. Lisboa, 27 de Fevereiro de 2012