CN116355776A - 羟基红景天苷的合成及其重组质粒组合物、工程菌与应用 - Google Patents
羟基红景天苷的合成及其重组质粒组合物、工程菌与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于工业微生物及发酵技术领域,具体涉及一种羟基红景天苷的合成及其重组质粒组合物、工程菌与应用。该重组质粒组合物由重组质粒PDWS1121和重组质粒PDWS0874组成。本发明将raip基因与kivD基因构建为质粒PDWS1121,与含有葡萄糖基转移酶UGT基因的质粒PDWS0874一同引入酿酒酵母PLVC中,获得一株产羟基红景天苷的重组酿酒酵母菌株RSL101,进而实现羟基红景天苷的高效生产。利用该方法生产羟基红景天苷,简单可行,且产物合成能力较强,可以大大降低生产成本,提高经济效益。
Description
技术领域
本发明属于工业微生物及发酵技术领域,具体涉及一种羟基红景天苷的合成及其重组质粒组合物、工程菌与应用。
背景技术
羟基红景天苷(Hydroxysalidroside),化学式为C14H20O8,属于羟基酪醇的糖苷化物,同时也是红景天苷的羟基化产物。红景天苷具有降血糖、抗氧化应激、抑制血管平滑肌增殖等多种调节机制,使得红景天在各种疾病的治疗中越来越受欢迎。而羟基酪醇基于其多羟基结构,在抗氧化,肿瘤预防/治疗、抗疲劳,抗衰老等多种领域具有广泛的应用前景。羟基红景天苷作为红景天苷与羟基酪醇的衍生物,与红景天苷有着相似的药理活性,甚至因为额外增加的羟基基团表现更佳,但具体效用仍有待探索。已有研究表明其具有抗乳腺癌的活性,能有效减少乳腺癌细胞增殖。与此同时,羟基红景天苷的苷元羟基酪醇是一种天然的多酚类化合物,具有很强的抗氧化活性,主要以酯类的形式存在于橄榄的果实和枝叶中。羟基酪醇苯环上连接有两个羟基,是其主要的抗氧化活性基团,因其固有的抗氧化活性可预防多种疾病的发生。除此之外,羟基酪醇还可消除体内自由基,恢复人体脏腑器官的健康状态,防止脑衰,延缓衰老。研究羟基红景天苷可通过发展热门药物分子的下游产物,进一步拓宽该药物一系列的衍生物库,有助于在药物使用和药品研发方面提供新的思路。
对于羟基红景天苷的制备,常见方法包括化学合成法和生物合成技术。生物合成羟基红景天苷是利用细菌、真菌等微生物,以葡萄糖或者生物质水解液为碳源,经微生物发酵生产的方法。相较于化学合成的方法,生物合成的最大优势是原料便宜、易得,同时也是环境友好,符合绿色制造的方法。发酵菌株是羟基红景天苷生物合成的关键点之一,虽然目前关于相关菌株鲜有报导,但红景天苷与羟基酪醇的生物合成的技术研究已比较成熟。
现有技术中,专利号/申请号为ZL201410115011.4、ZL201610395330.4、ZL201610408741.2、ZL201610361309.2、ZL201711479443.3、CN201811116170.0、CN201910911304.6、CN202011466963.2、CN202111307645.6的发明专利均公开了生产红景天苷的重组微生物和构建方法。使用的菌株主要包括酿酒酵母和大肠杆菌,冠突散囊菌(Eurotiumcristatum)等。其中酿酒酵母由于其真核细胞的特性,已经成为目前红景天苷等糖苷类生物合成菌株的潜在菌株。但上述重组微生物的生产水平还难以达到产业化水平,尚需提高。同时上述专利均未记载如何进一步合成羟基红景天苷。
中国发明专利CN201510242626.8公开了一种大肠杆菌中过表达来源于大肠杆菌的单加氧酶基因簇HpaBC,以葡萄糖为底物从头开始合成羟基酪醇;该方案的不足之处在于羟基酪醇对菌体有毒性,还有就是外源蛋白HpaBC表达量较低;因此生产羟基酪醇的效率较难提高,不足以支持后续糖苷化的过程。与此同时,专利CN109295113A也公开了发酵酪氨酸产羟基酪醇的方法,以1mM L-多巴在大肠杆菌中生成0.74±0.088mM羟基酪醇。中国发明专利CN201711054680.5公开了异源代谢途径生产酪醇及羟基酪醇的方法。该方案在宿主中高效表达了氨基转移酶(Aminotransferase),酮酸脱羧酶(Ketoacid decarboxylase),醇脱氢酶(Alcohol dehydrogenase)来生产酪醇,再在4-羟基苯乙酸羟化酶的作用下来生产羟基酪醇。该方案的缺点是需要外加许多昂贵的辅酶磷酸吡哆醛(PLP)和还原型辅酶Ⅰ(NADH),而且在苯环上加羟基的效率明显降低,致使羟基酪醇的得率很低。
因此,基于目前各种方法的缺陷,亟需一种简单方便的生产羟基红景天苷的方法,可以高效合成羟基红景天苷,提高经济效益。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的之一在于提供一种用于高产羟基红景天苷的RSL101工程菌,该工程菌含有携带Raip基因、kivD基因的重组质粒PDWS1121和携带UGT基因的重组质粒PDWS0874,以基础酿酒酵母培养基为原料,在外加L-DOPA的情况下,能够高产羟基红景天苷。
为实现上述目的,本发明采用以下技术方案:
用于高产羟基红景天苷的RSL101工程菌,将重组质粒PDWS1121和重组质粒PDWS0874转入到起始菌中,制得所述RSL101工程菌;所述重组质粒PDWS1121携带Raip基因和kivD基因,所述重组质粒PDWS0874携带UGT基因;所述Raip基因、所述kivD基因和所述UGT基因的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3所示。
由于酶的底物宽泛性存在,本申请发现raip作为L-赖氨酸α-氧化酶不仅具有氧化赖氨酸的催化效果,同时对于左旋多巴L-DOPA也具有氧化活性,与α-酮酸脱羧酶kivD同时作用可实现L-DOPA到羟基酪醇的合成路径(详见图1)。本发明进一步结合葡萄糖基转移酶UGT实现了羟基红景天苷的生物合成。
优选地,所述重组质粒PDWS1121为携带完整的包含Raip基因与kivD基因编码序列的载体。
优选地,所述重组质粒PDWS0874为携带完整的包含UGT基因编码序列的载体。
进一步,所述重组质粒PDWS0874携带的是定向突变后的UGT基因。
进一步,所述起始菌为酿酒酵母菌INVSc1,购自葆光生物。
进一步,所述重组质粒PDWS1121的构建方法为:
1)设计引物raiP-F和raiP-R,以Raip基因为模板进行扩增,获得序列如SEQ IDNO.1所示的Raip基因片段,其长度为1488bp;将载体pESC和所述Raip基因片段分别用XbaI与XhoI双酶切,将所述Raip基因片段插入到载体酶切位点之间,得到所述重组质粒pESC-raip;
2)设计引物kivD-F和kivD-R,以kivD基因为模板进行扩增,获得序列如SEQ IDNO.2所示的kivD基因片段,其长度为1954bp;
3)将步骤1)制得的质粒pESC-raip和步骤2)制得的kivD基因片段分别用BamHI与HindIII双酶切,将kivD基因片段插入到载体酶切位点之间,构建所述重组质粒PDWS1121;
所述引物raiP-F、raiP-R、kivD-F和kivD-R的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.4-SEQID NO.7所示。
进一步,所述重组质粒PDWS0874的构建方法为:
1)设计引物UGT-F和UGT-R,以UGT基因为模板进行扩增,获得序列如SEQ ID NO.3所示的UGT基因片段,其长度为1426bp;
2)将载体pESC-LEU和UGT基因片段分别用BamHI与HindIII双酶切,将所述UGT基因片段插入到载体酶切位点之间,构建所述重组质粒PDWS0874;
所述引物UGT-F和UGT-R的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.8-SEQ ID NO.9所示。
进一步,经测序表明序列如SEQ ID NO.1所示的Raip基因片段确为Raip基因,与NCBI基因库中MG423617.1基因符合。
进一步,经测序证实序列如SEQ ID NO.2所示的kivD基因片段确为kivD基因,与NCBI基因库中AJ746364.1基因符合。
本发明的目的之二在于提供一种利用所述RSL101工程菌发酵L-DOPA来生产羟基红景天苷的方法,该方法简单方便,可行性高,能够实现羟基红景天苷的高效生产。
为实现上述目的,本发明采用以下技术方案:
利用所述RSL101工程菌发酵L-DOPA来生产羟基红景天苷的方法,将所述RSL101工程菌在催化培养基中进行培养,培养8h后加入乳糖诱导外源基因表达,10h后通入O2,同时加入L-DOPA,发酵制得所述羟基红景天苷。
进一步,所述培养为:在250RPM,30℃条件下培养8h。
进一步,所述发酵的条件为:发酵温度为30℃,pH=6,发酵时间为72h-96h。
作为优选,发酵时间为96h。
进一步,所述L-DOPA的浓度为5-10g/L。
作为优选,底物L-DOPA的浓度为10g/L。
本发明的目的之三在于提供一种所述RSL101工程菌在制备羟基红景天苷和/或用于基因工程发酵生产羟基红景天苷的生物产品中的应用。
本发明的目的之四在于提供一种raip基因在羟基酪醇和/或羟基红景天苷的合成中的应用。
本发明的技术方案如下:以购自葆光生物的酿酒酵母菌INVSc1为出发菌株PLVC。通过共表达L-α-氧化酶(raip)、α-酮酸脱羧酶(kivD)基因后,得到一株能够在合成培养基中可以L-DOPA为底物,高产羟基酪醇的重组型酿酒酵母菌;进一步引入源自红景天苷的酪醇糖苷化酶UGT,其特征是经过定向突变后对羟基酪醇高效具有催化活性,由此得到一株具有可以基础酿酒酵母培养基为原料,在外加L-DOPA的情况下,能够产羟基红景天苷的重组型酿酒酵母菌株。
本发明的技术构思是:将L-赖氨酸α-氧化酶(raip)基因与α-酮酸脱羧酶(kivD)基因构建为质粒PDWS1121,与含有葡萄糖基转移酶UGT基因的质粒PDWS0874一同引入酿酒酵母PLVC中,获得一株产羟基红景天苷的重组酿酒酵母菌株RSL101,从而达到产羟基红景天苷的目的。
本发明的有益效果在于:
本发明技术的菌株和质粒能在不影响菌株生长的同时,将L-酪氨酸转化为羟基红景天苷。实验结果证明,重组菌株在添加有左旋多巴的合成培养基中生长并高产羟基红景天苷,摇瓶发酵96h,消耗10g/L的左旋多巴,产生8.64g/L的羟基红景天苷,产率达到86.4%。与目前发表的其他技术路径相比,本发明所述路径中使用的Raip酶为首次用于羟基酪醇合成,同时,所产生的羟基酪醇效果优于目前所发表的其他技术路线。所述UGT葡萄糖糖基转移酶经过了基因突变,产量提升了20.5%。
附图说明
图1为羟基红景天苷的生产路径示意图;
图2为PDWS1121质粒的构建示意图;
图3为PDWS0874质粒的构建示意图;
图4为生长曲线对比图;
图5为不同浓度L-DOPA作为底物的羟基红景天苷产量对比图;
图6为不同发酵时间下羟基红景天苷产量和L-DOPA残余量曲线图;
图7为不同pH对羟基红景天苷的产量影响的线状图。
具体实施方式
下面将结合具体的实施例对本发明的技术方案进行更进一步地清楚、完整地描述。显然,所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例,而不是全部实施例。因此,基于本发明中的实施例,本领域技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的其他所有实施例都属于本发明的保护范围。
本发明实施例中,如无特殊说明,所有化学品均购自阿拉丁,限制性内切酶均购自Takara有限公司。
本发明实施例中,培养基的配制方法如下:
(1)LB培养基:每升水中含有5g酵母粉、10g胰蛋白胨和10g NaCl。固体培养基为液体培养基中加入1.5%的琼脂粉。为了增加培养基的选择性,氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)的使用浓度是100μg/mL。
(2)酵母双抗培养基:LEU-URA培养基粉末SD(购于普因特),平板筛选时另加入2%的琼脂粉。L-DOPA于半乳糖诱导时加入,半乳糖加入量为3%。
(3)催化培养基:20%的葡萄糖、10%蛋白胨、0.50%酵母粉、0.05%硫酸镁、0.05%甘氨酸。L-DOPA于半乳糖诱导时加入,半乳糖加入量为3%。
本发明实施例中,实施例1构建成功的质粒PDWS1121和质粒PDWS0874送至北京擎科生物科技有限公司测序验证核苷酸序列的正确性。
本发明实施例中,出发菌株酿酒酵母菌INVSc1购自普因特生物有限公司。
实施例1
按照如图1所示的羟基红景天苷的生产路径合成羟基红景天苷,具体包括以下步骤:
1.构建重组质粒PDWS1121
质粒PDWS1121的构建示意图如图2所示,将L-赖氨酸α-氧化酶(raip)基因与α-酮酸脱羧酶(kivD)基因构建为质粒PDWS1121,具体包括以下步骤:
1)设计如下引物:
raip-F:5′-GGAATTCCATATGGAGCACCTGGCAGACTGTCTGG-3′;
raip-R:5′-CCGCTCGAGCAGTTCGTCCTTGGTATG-3′。
以raip基因为模板进行扩增,得到一个长度为1488bp的片段,其序列如SEQ IDNO.1所示,用于构建所述质粒PDWS1121;经测序表明该片段确为raip基因,与NCBI基因库中MG423617.1基因符合;然后将载体pESC-URA和raip基因片段分别用XbaI与XhoI双酶切,将raip基因片段插入到载体酶切位点之间,得到重组质粒pESC-raip。
2)设计如下引物:
kivD-F:5′-CGCGGATCCGCGCTAGAGTTTTCTTTAGTCAT-3′
kivD-R:5′-CCCAAGCTTGGGTAGGAGCATAGGATA-3′
以kivD基因为模板进行扩增,得到一个长度为1954bp的片段,其序列如SEQ IDNO.2所示,用于构建所述质粒PDWS1121;经测序表明该片段确为kivD基因,与NCBI基因库中AJ746364.1基因符合;然后将质粒pESC-raip和kivD基因片段分别用BamHI与HindIII双酶切,将kivD基因片段插入到载体酶切位点之间,构建所述重组质粒PDWS1121。
2.重组质粒PDWS1121的酶切分析
1)采用碱裂解法提取质粒DNA。扩增raip基因,用XbaI与XhoI双酶切,37℃反应3小时。酶切反应体系如表1所示。
表1.酶切反应体系
组分 | 体积 |
raip基因片段 | 28μL |
10×CutSmart Buffer | 5μL |
限制酶XbaI | 1μL |
限制酶XhoI | 1μL |
ddH2O | 15μL |
总体积 | 50μL |
2)连接pESC-URA和raip。将酶切后的raip基因和pESC-URA载体连接,22℃反应1h,连接反应体系如表2所示。
表2.连接反应体系
3)双酶切反应pESC-raip。将步骤2)得到的含有raip基因的质粒pESC-raip,用BamHI与HindIII进行双酶切。37℃反应3小时。酶切反应体系如表3所示。
表3.酶切反应体系
组分 | 体积 |
ddH2O | 13μL |
pESC-raip | 30μL |
10×CutSmart Buffer | 5μL |
限制酶BamHI | 1μL |
限制酶HindIII | 1μL |
总体积 | 50μL |
4)双酶切基因kivD。扩增kivD基因,用BamHI与HindIII双酶切。37℃反应3小时。反应体系如表4所示。
表4.反应体系
组分 | 体积 |
kivD基因片段 | 28μL |
10×CutSmart Buffer | 5μL |
限制酶BamHI | 1μL |
限制酶HindIII | 1μL |
ddH2O | 15μL |
总体积 | 50μL |
5)连接pESC-raip和kivD。将酶切后的kivD基因和pESC-raip载体连接,22℃反应1小时,得到工程质粒PDWS1121,连接反应体系如表5所示。
表5.连接反应体系
组分 | 体积 |
pESC-raip | 12μL |
kivD片段 | 5μL |
T4 10×DNA ligase buffer | 2μL |
T4DNA ligase | 1μL |
总体积 | 20μL |
6)PDWS1121阳性克隆筛选
步骤5)连接反应结束,进行PDWS1121转化,挑取转化后平板上长出的单菌落,接种于带有卡那霉素抗性的LB液体培养基中,37℃,250rpm摇床培养10h-12h,提取质粒,用BamHI和HindⅢ双酶切,酶切得到两条清晰的条带,一条为pESC-raip,一条为kivD基因。胶回收pESC-raip载体,回收后继续用XhoI和XbaI双酶切,得到两条清晰的条带,一条为pESC载体,一条为raip基因,即初步验证PDWS1121克隆成功。
3.构建重组质粒PDWS0874
质粒PDWS0874的构建示意图如图3所示,包括以下步骤:
1)设计引物:
UGT-F:5′-GCGGATCCGCCAAATTCCTCAGAGGGTGA-3′;
UGT-R:5′-CCAAGCTTGGGAGATAACAGATAAT-3′。
以实验室突变后的UGT基因为模板进行扩增,得到一个长度为1426bp的片段,其序列如SEQ ID NO.3所示,用于构建所述质粒PDWS0874;然后将载体pESC-LEU和UGT基因片段分别用BamHI与HindIII双酶切,将UGT基因片段插入到载体酶切位点之间,构建所述重组质粒PDWS0874。
4.重组质粒PDWS0874的酶切分析
1)用碱裂解法提取质粒DNA。扩增UGT基因,用BamHI和HindⅢ双酶切。37℃反应3小时。酶切反应体系如表6所示。
表6.酶切反应体系
组分 | 体积 |
UGT基因 | 35μL |
10×CutSmart Buffer | 5μL |
限制酶BamHI | 1μL |
限制酶HindⅢ | 1μL |
ddH2O | 8μL |
总体积 | 50μL |
酶切反应37℃进行3小时后,电泳检验酶切程度。用DNA回收试剂盒回收酶切后的质粒。酶切完毕后上样电泳检验确认。
2)双酶切基因UGT。取35μL UGT 3基因片段,用BamHI和HindⅢ双酶切。混合均匀,稍稍离心使溶液聚集到管底。37℃反应3小时。酶切反应体系如表7所示。
表7.酶切反应体系
3)连接pESC-LEU和UGT。UGT片段与处理好的pESC-LEU载体按如下体系混和后进行连接反应,连接反应体系如表8所示。连接反应在22℃进行1h,完成后即得工程质粒PDWS0874,用于转化反应。
表8.连接反应体系
组分 | 体积 |
pESC-LEU | 10μL |
UGT片段 | 7μL |
T4 10×DNA ligase buffer | 2μL |
T4DNA ligase | 1μL |
总体积 | 20μL |
(4)PDWS0874阳性克隆筛选。将DNA连接产物的进行转化,转化实验步骤同上述“6)PDWS1121阳性克隆筛选”,挑取单菌落培养后按质粒提取试剂盒小量提取质粒,用BamHI和HindⅢ双酶切分析,将酶切验证正确的重组质粒测序,保证克隆基因序列正确。
5.转化
(1)取100μL冰上融化的INVSc1感受态细胞,依次加入预冷的目的质粒2μL,Carrier DNA(98℃,5min,快速冰浴,重复一次)10μL,PEG/LiAc 500μL并吸打几次混匀,30℃水浴30min(15min时翻转6-8次混匀)。
(2)将管放42℃水浴15min(7.5min时翻转6-8次混匀)。
(3)5000rpm离心40s弃上清,ddH2O 400μL重悬,离心30s弃上清。
(4)ddH2O 50μL重悬,涂质粒筛选用,29℃培养48h-96h。
(5)取100μL菌液均匀涂布在含有终浓度为100μg/mL的Ampicillin平板上。将平板倒置,于37℃过夜培养。用无菌的枪头或牙签将单个菌落挑至20μL LB培养基中混匀,直接取1μL作为PCR模板。将PCR阳性菌落的剩余菌液接种至含有适当抗生素的LB培养基中培养过夜,提取质粒做后续的鉴定。
6.重组菌的生长特征及稳定性分析
取100μL双质粒转化菌液均匀涂布在酵母双抗培养基平板上,倒置,于37℃过夜培养。挑取30个这样的菌落接种于双抗性的筛选平板上,在该平板上没有质粒的菌则不能生长。原始菌INVSc1不具有抗性,本基因工程菌能在双抗性的筛选平板上正常生长,表明重组质粒已经转入原始菌株中。结果经过24h的培养,平板上长出了26个菌落,说明该菌在没有任何选择压力的条件下仍然十分稳定,稳定性达87%左右。
7.重组菌RSL101的生长速率分析
挑取平板培养的RSL101单菌落,接入20mL的加有尿嘧啶终浓度为100μg/mL的催化培养基中。30℃,250rpm培养12小时,再按1%的接种量将其接入200mL的加有100μg/mL尿嘧啶的催化培养基,培养12小时,接种于1L发酵罐中,每隔6小时取样测定菌体的OD600值,详见图4。可以看出在10h后,菌体正处于对数增长期,菌体的生长速率很快,菌体生物量增多,30h后菌的OD600值达到最大值150。
8.发酵条件的优化
为探索最佳发酵条件,探索了发酵温度、pH、底物浓度对发酵羟基红景天苷的产量的影响。结果如图5-图7所示,在现有条件下的最佳发酵条件为温度30℃,pH=6,发酵时间96h,在采用底物L-DOPA浓度为5g/L时,相比优化前的产量3.68g/L,产量上升到4.02g/L,产量有所提升。
9.工业应用探索
为进一步探索产量提升,将5OD600的工程菌株RSL101种子加入5L催化培养基中,在10L反应器中,在250RPM,30℃培养8h后加入乳糖诱导外源基因表达,10h后通入O2,同时加入10g/L L-DOPA,并取此时的样品为0h样,根据时间产量图,选取了72h内的产量进行分析。至发酵终点,羟基红景天苷的产量达到8.64g/L。
Claims (10)
1.用于高产羟基红景天苷的RSL101工程菌,其特征在于,将重组质粒PDWS1121和重组质粒PDWS0874转入到起始菌中,制得所述RSL101工程菌;所述重组质粒PDWS1121携带Raip基因和kivD基因,所述重组质粒PDWS0874携带UGT基因;所述Raip基因、所述kivD基因和所述UGT基因的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的RSL101工程菌,其特征在于,所述起始菌为酿酒酵母菌INVSc1。
3.根据权利要求1所述的RSL101工程菌,其特征在于,所述重组质粒PDWS1121的构建方法为:
1)设计引物raiP-F和raiP-R,以Raip基因为模板进行扩增,获得序列如SEQ ID NO.1所示的Raip基因片段,其长度为1488bp;将载体pESC和所述Raip基因片段分别用XbaI与XhoI双酶切,将所述Raip基因片段插入到载体酶切位点之间,得到所述重组质粒pESC-raip;
2)设计引物kivD-F和kivD-R,以kivD基因为模板进行扩增,获得序列如SEQ ID NO.2所示的kivD基因片段,其长度为1954bp;
3)将步骤1)制得的质粒pESC-raip和步骤2)制得的kivD基因片段分别用BamHI与HindIII双酶切,将kivD基因片段插入到载体酶切位点之间,构建所述重组质粒PDWS1121;
所述引物raiP-F、raiP-R、kivD-F和kivD-R的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.4-SEQ IDNO.7所示。
4.根据权利要求1所述的RSL101工程菌,其特征在于,所述重组质粒PDWS0874的构建方法为:
1)设计引物UGT-F和UGT-R,以UGT基因为模板进行扩增,获得序列如SEQ ID NO.3所示的UGT基因片段,其长度为1426bp;
2)将载体pESC-LEU和UGT基因片段分别用BamHI与HindIII双酶切,将所述UGT基因片段插入到载体酶切位点之间,构建所述重组质粒PDWS0874;
所述引物UGT-F和UGT-R的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.8-SEQ ID NO.9所示。
5.利用权利要求1-4任一项所述的RSL101工程菌发酵L-DOPA来生产羟基红景天苷的方法,其特征在于,将所述RSL101工程菌在催化培养基中进行培养,培养8h后加入乳糖诱导外源基因表达;10h后通入O2,同时加入L-DOPA,发酵制得所述羟基红景天苷。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述培养为:在250RPM,30℃条件下培养8h。
7.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述发酵的条件为:发酵温度为30℃,pH=6,发酵时间为72h-96h。
8.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述L-DOPA的浓度为5-10g/L。
9.权利要求1-4任一项所述的RSL101工程菌在制备羟基红景天苷和/或用于基因工程发酵生产羟基红景天苷的生物产品中的应用。
10.权利要求1中所述的raip基因在羟基酪醇和/或羟基红景天苷的合成中的应用。
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