CN108588162A - 一种采用工程菌规模化发酵培养制备人工熊胆粉的工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种基于工程菌株BL21*‑α1β2规模化发酵培养来获取人工熊胆粉的制备工艺，属于生物技术领域。该制备工艺简单可控，制备成品品质合格，原料廉价易得，是通过生物技术手段制备人工熊胆粉的一项突破。

Description

一种采用工程菌规模化发酵培养制备人工熊胆粉的工艺
技术领域
本发明涉及一种重组工程菌的规模化发酵培养制备人工熊胆粉的工艺。具体说，是采用重组工程菌在发酵罐内进行规模化发酵培养、并纯化制备人工熊胆粉的工艺，并对该工艺生产制备的人工熊胆粉进行品质评价，属于生物技术领域。
背景技术
熊胆粉是熊科动物黑熊或棕熊胆囊的粉末制品，具有清热、平肝、明目、利胆、解痉、溶石等功效。临床常用于小儿热盛惊风、癫痫、抽搐、黄疸；外用治痈肿、痔疮、目赤云翳等。熊胆粉主要含有胆汁酸，其主要有效成分为牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)，中国药典规定TUDCA含量不低于23％。
目前，国内医药市场的熊胆粉主要依靠进口和“活熊取胆”的方法自制。化学合成的方法制备TUDCA因步骤繁琐成本高且环境污染大未得到广泛应用。采用生物技术将来源广泛的家禽胆汁制品生物转化成与天然熊胆粉的替代资源，既解决熊胆粉资源紧缺，又有利于推动中药技术现代化进程。
家禽胆汁与熊胆汁在化学组成上的主要差别在于：家禽胆汁不含有TUDCA而是以牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)为主要成分。TUDCA与TCDCA结构上是7位羟基的差向异构体。研究表明，TCDCA可以经过7α-羟基类固醇脱氢酶(7α-HSDH)和7β-羟基类固醇脱氢酶(7β-HSDH)的催化转变成TUDCA。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于优化重组工程菌使用发酵罐进行规模化发酵培养，以价廉并易于获得的家禽胆汁制品为发酵底物，将底物中牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)成分部分地原位转化为牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)，并对发酵液中主要成分进行分离纯化的制备工艺。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种采用重组工程菌BL21*-α1β2规模化发酵培养制备人工熊胆粉的工艺，其特征在于：重组工程菌在发酵罐中进行的高密度发酵的工艺优化，包括菌种预培养条件的优化、工程菌诱导培养条件的优化、发酵培养基的优化、发酵培养过程底物转化时间与发酵工艺过程的优化、以及产物制备。
所述工程菌BL21*-α1β2为我们构建的同时表达7α-HSDH和7β-HSDH基因的大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)BL21*-α1β2(专利申请号201610191921.X)；
所述底物为家禽胆汁制品，包括精制品和粗制品；如精制鸡胆粉和粗制鸡胆粉，如精制鸭胆粉和粗制鸭胆粉，如精制鹅胆粉和粗制鹅胆粉。
本发明所述的重组工程菌规模化发酵培养制备人工熊胆粉的工艺，其特征在于，包括如下具体步骤：
A.重组工程菌的培养
①.将工程菌从-80℃冰箱中取出，在附加有50～100mg/L(优选80～100mg/L)氨苄青霉素(Amp+)LB固体平板培养基中划线接种化，于20～40℃(优选25～37℃)活化培养9～36小时(优选10～16小时)(优选25～37℃,优选37℃)；
②一级种子：从LB固体平板培养基上挑取单菌落，接种于附加50～100mg/L(优选80～100mg/L)氨苄青霉素(Amp+)LB液体培养基中，在75～225rpm(优选180～225rpm)、20～40℃(优选25～37℃)下预培养8～24小时(优选8～16小时)；
③二级种子：将上述培养物按1:20比例接种到附加50～100mg/L(优选80～100mg/L)氨苄青霉素(Amp+)2-YT液体培养基中，在75～225rpm(优选180～225rpm)、20～37℃(优选25～37℃)下震荡培养3～12小时(优选3～9小时)；
④将二级种子按1:20比例接种到附加50～100mg/L(优选80～100mg/L)氨苄青霉素(Amp+)M9-GY优化培养基中，通气量1～6L/min(优选2～4L/min)，分批阶段pH值保持在5.0～8.0(优选6.0～7.0)，温度20～37℃(优选30～37℃),搅拌速率400～800rpm(优选600～800rpm),培养3-8小时(优选4-6小时)至OD600为3.0～7.0(优选4.0～6.0)，添加异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.1～2mM(优选0.1～1mM)进行诱导培养：诱导培养阶段通过流加氨水和正磷酸使pH值保持在5.0～8.0(优选6.0～7.0)，温度20～37℃(优化25～30℃)，培养2～6小时(优选3～5小时)。
a)底物发酵转化
①往M9-GY优化培养基中添加适当质量粗/精制鸡胆粉，温度20～37℃(优选20～25℃)，通过流加氨水和正磷酸使pH值保持在5.0～8.0(优选6.0～7.0)，通气量0～6L/min(优选0～4L/min)，搅拌速率400～800rpm(优选400～600rpm)培养1小时～10小时(优选1～5小时)，停止通气，不调节pH值，不搅拌，16℃～37℃下静置5～18h。
b)发酵液转化产物分析
①发酵过程结束，收集发酵液，12000rpm离心1.5min，取上清并按1:5的比例加入用水饱和的正丁醇对其进行萃取，混匀分层后，取出上层清液并用氮气吹干(或是70℃挥干)，加入与离心后取的上清液等体积的HPLC级甲醇重新溶解，过0.22μm滤膜，反向色谱柱Agilent Poroshell 120 EC-C18 column(2.7μm，4.6mm×150mm)，使用CAD检测器对转化产物进行分析。
c)人工熊胆粉的制备
收集发酵液8000rpm离心20min取上层清液，过D101大孔树脂，一次上样量与树脂等体积，流速控制在成滴下落不连成线。先用H2O冲至洗脱液无色，再用95％乙醇冲至洗脱液无色并收集该部分洗脱液。50℃减压旋蒸，浓缩液过0.45μm有机滤膜，滤液水浴挥至浸膏状，50℃真空干燥箱干燥至恒重，取出捣碎即得人工熊胆粉。
所述的采用工程菌规模化发酵培养制备人工熊胆粉的工艺，其特征在于：所述的LB固体培养基的组成如下：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L，酵母提取物(Yeast Extract)5g/L，氯化钠(NaCl)10g/L，琼脂糖15.0g/L。
所述的采用工程菌规模化发酵培养制备人工熊胆粉的工艺，其特征在于，所述的LB液体培养基的组成如下：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠1g/L。
所述的采用工程菌规模化发酵培养制备人工熊胆粉的工艺，其特征在于：所述的2-YT液体培养基的组成如下：蛋白胨16g/L，酵母粉10g/L，NaCl 5g/L。
所述的采用工程菌规模化发酵培养制备人工熊胆粉的工艺，其特征在于：所述的M9-GY优化培养基配制方法如下：5～8g/L Na2HPO4，2～5g/L KH2PO4，2～5g/L(NH4)2HPO4，0.1～1.0g/L NaCl，1～3g/L NH4Cl，10～30ml/L甘油，10～30g/L酵母提取物，1.0～3.0mMMgSO4，0.1～1.0mM CaCl2
所述的采用工程菌规模化发酵培养制备人工熊胆粉的工艺，其特征在于：步骤e)中的底物以粉末形式加入。
所述的采用工程菌规模化发酵培养制备人工熊胆粉的工艺，其特征在于：所述底物浓度为2～20g/L，使底物中牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)终浓度为2～20g/L(优选2～10g/L)。
所述的采用工程菌规模化发酵培养制备人工熊胆粉的工艺，其特征在于：步骤a)中一级种子在50～100mg/L(优选80～100mg/L)氨苄青霉素(Amp+)LB液体培养基中培养9～24小时(优选9～16小时)，二级种子培养在50～100mg/L(优选80～100mg/L)氨苄青霉素(Amp+)2-YT液体培养基中培养3～12小时(优选4～9小时)。
所述的采用工程菌规模化发酵培养制备人工熊胆粉的工艺，其特征在于：步骤a)中一级种子按1:20接种后培养3～6小时(优选3～5小时)至二级种子OD600＝2～5；
所述的采用工程菌规模化发酵培养制备人工熊胆粉的工艺，其特征在于：步骤a)中加入IPTG前培养温度为20～37℃(优选25～37℃)，时间为3～6小时(优选3～4小时)至OD600＝1.5～7；
所述的采用工程菌规模化发酵培养制备人工熊胆粉的工艺，其特征在于：步骤a)中加入IPTG浓度为0.1～2mM(优选0.1～0.5mM)；诱导培养温度为20～37℃(优选25～35℃)，诱导培养时间为2～6小时(优选2～4小时)；
所述的采用工程菌规模化发酵培养制备人工熊胆粉的工艺，其特征在于：步骤b)中直接将粗/精制鸡胆粉加入液体培养的工程菌液中；发酵温度为16～37℃(优选20～28℃)，搅拌速率400～800rpm(优选400～600rpm)，通过流加氨水和正磷酸使pH值保持在5.0～8.0(优选6.0～7.0)，通气量0～6L/min(优选0～4L/min)培养1小时～10小时(优选1～5小时)，然后停止通气，不调节pH值，不搅拌，16℃～37℃下静置5～18h；
所述的采用工程菌规模化发酵培养制备人工熊胆粉的工艺，其特征在于：步骤c)中去除菌体的发酵液中TUDCA与TCDCA含量比例在1～1.5之间，且T-7K-LCA含量低于胆汁酸成分总量的8％；
所述的采用工程菌规模化发酵培养制备人工熊胆粉的工艺，其特征在于：步骤d)所用树脂为D101大孔树脂，一次上样量与树脂等体积，流速控制在成滴下落不连成线，先用H2O冲至洗脱液无色，再用95％乙醇冲至洗脱液无色并收集该部分洗脱液。
本发明涉及一种采用工程菌株规模化发酵培养制备人工熊胆粉的工艺。
本发明涉及一种采用工程菌株BL21*-α1β2规模化发酵培养制备人工熊胆粉的工艺，其特征在于:
工艺步骤如下：
A.工程菌株BL21*-α1β2种子液的预培养
①.将工程菌接种到附加有50～100mg/L氨苄青霉素的LB固体平板培养基中活化，于37℃活化培养12小时；
所述的LB固体培养基的组成如下：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂糖15.0g/L；
②.从LB固体平板培养基上挑取单菌落，接种于附加有100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中，在225rpm、37℃下震荡培养9～12小时；
所述的LB液体培养基的组成如下：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L；
③.将②中菌液按2～10％接种量接种至附加有100mg/L氨苄青霉素的2-YT液体培养基中，在225rpm、37℃下震荡培养3～12小时；
所述的2-YT液体培养基的组成如下：胰蛋白胨16g/L，酵母粉提取物10g/L，氯化钠5g/L；
B.粗/精制鸡胆粉的发酵罐发酵工艺；
①.将A中③所得菌液按2～10％接种量接种至M9-GY优化培养基中，通气量1～6L/min，37℃，pH值通过正磷酸和氨水维持在7.0，搅拌速率600rpm，培养3～6小时至OD600为1.5～6；
②.加入终浓度为0.3mmol/L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，通气量1～6L/min，温度降至30℃，pH值调为6.5，搅拌速率600rpm，诱导培养1～3小时；
③.加入适量粗/精制鸡胆粉，温度25℃，pH值保持在6.5，通气量1～6L/min，搅拌速率600rpm条件下发酵1～5小时后，停止通气，温度仍为25℃，不调节pH值，不搅拌，16℃～37℃下静置5～18h；
C.发酵液中各种胆汁酸含量的监控
①.对发酵液进行采样，12000rpm离心1.5min，取上清并按1:5的比例加入用水饱和的正丁醇对其进行萃取，混匀分层后，取出上层清液并用氮气吹干(或是70℃挥干)，加入与离心后取的上清液等体积的HPLC级甲醇重新溶解，过0.22μm滤膜；
②.用反向色谱柱Agilent Poroshell 120EC-C18column，2.7μm，4.6mm×150mm，使用CAD检测器，流速为0.6ml/min，进样量为1μl，柱温40℃，采集频率10Hz，雾化温度45℃，流动相为乙腈和0.3％甲酸的5mmol/L醋酸铵水溶液，进行梯度洗脱；
时间(min) 流速(mL/min) 乙腈 0.3％甲酸的5mmol/L醋酸铵水溶液
0 0.6 20 80
15 0.6 27 73
25 0.6 35 65
35 0.6 37 63
45 0.6 90 10
D.发酵液中胆汁酸的分离纯化及制备
收集发酵液8000rpm离心20min取上层清液，过D101大孔树脂，一次上样量与树脂等体积，流速控制在成滴下落不连成线。先用H2O冲至洗脱液无色，再用95％乙醇冲至洗脱液无色并收集该部分洗脱液。50℃减压旋蒸，浓缩液过0.45μm有机滤膜，滤液水浴挥至浸膏状，50℃真空干燥箱干燥至恒重，取出捣碎即得人工熊胆粉。
本发明涉及一种采用工程菌株规模化发酵培养制备人工熊胆粉的工艺，其特征在于：步骤B中①用到的M9-GY优化培养基为：6.78g/L Na2HPO4，3g/L KH2PO4，3.3g/L(NH4)2HPO4，0.5g/L NaCl，1g/L NH4Cl，28ml/L甘油，10～30g/L酵母提取物，2mM MgSO4，0.1mMCaCl2。
本发明涉及一种采用工程菌株规模化发酵培养制备人工熊胆粉的工艺，其特征在于：步骤B中③若加入粗制鸡胆粉发酵工艺为温度25℃，pH值保持在6.5，通气量1～6L/min，搅拌速率600rpm条件下发酵1～5小时后，停止通气，温度仍为25℃，不调节pH值，不搅拌，16℃下静置5～18h；若加入精制鸡胆粉发酵工艺为温度25℃，pH值保持在6.5，通气量1～6L/min，搅拌速率600rpm条件下发酵5小时后，停止通气，温度仍为25℃，不调节pH值，不搅拌，25℃下静置5～18h。
本发明涉及一种采用工程菌株规模化发酵培养制备人工熊胆粉的工艺，其特征在于：步骤D中所得人工熊胆粉用步骤C中方法检测，TUDCA含量不低于23％，且TUDCA与TCDCA比例在1～1.5之间，中间产物T-7-KLCA含量低于5％，水分含量低于6％，内毒素的含量低于0.015EU/ml。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1)选用的非致病性大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)BL21star(DE3)作为工程菌宿主菌，易于培养，发酵过程易于控制。
2)M9-GY优化培养基营养丰富有利于菌体生长和蛋白表达，发酵过程简单，易于实现工业化生产。
3)规模化发酵培养时间短，工艺过程控制简单、方便、经济。
4)底物中牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)转化速度快，可在较短时间内得到可控比例的TUDCA，且制备的人工熊胆粉中TUDCA含量不低于23％，TUDCA与TCDCA比例在1～1.5之间，中间产物T-7-KLCA含量低于5％。
5)发酵过程无污染，发酵液后处理及产品制备工艺简便，产物得率高，制备的人工熊胆粉质量稳定，使规模化生产人工熊胆粉成为可能，对人工熊胆粉的理论研究及药用价值的广泛利用具有重要贡献。
附图说明
图1.诱导条件优化培养结果图(a.IPTG浓度对转化率的影响；b.诱导条件组合优化)
图2.软件优化培养基结果图
图3.本发明主要胆汁酸标准品的HPLC图谱(1为TUCA，2为TUDCA，3为TCA，4为T-7-KLCA，5为TCDCA)
图4.本发明所用底物精制、粗制鸡胆粉的HPLC图谱(a.精制鸡胆粉HPLC图谱；b.粗制鸡胆粉HPLC图谱)(3为TCA，5为TCDCA)
图5.不同发酵条件下所得样品的HPLC图谱(a.以精制鸡胆粉为底物优化发酵条件后发酵液的HPLC图谱；b.以精制鸡胆粉为底物制备的人工熊胆粉成品的HPLC图谱；c.以粗制鸡胆粉为底物优化发酵条件后发酵液的HPLC图谱；d.以粗制鸡胆粉为底物制备的人工熊胆粉成品的HPLC图谱)
(1为TUCA，2为TUDCA，3为TCA，4为T-7-KLCA，5为TCDCA)
图6.本发明发酵工艺中静置阶段及静置阶段温度考察结果(a.静置对转化率的影响；b.静置温度对精制鸡胆粉转化情况考察；c.静置温度对粗制鸡胆粉转化情况考察)
图7.采用本发明所述工艺制备的人工熊胆粉成品图(a.以精制鸡胆粉为底物制备的人工熊胆粉成品图；b.以粗制鸡胆粉为底物制备的人工熊胆粉成品图)
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细地说明，这些实例和附图仅起说明性作用，并不因此限制本发明的内容。因此，凡不违背本发明精神所做的修改及变形，均应包括在本发明范围内。
实施例1
1二级种子培养基对生长曲线的影响
1)将-80℃冰箱保存的工程菌用划线法涂布到含有100mg/L氨苄青霉素的LB固体平板培养基中，于37℃活化培养12个小时；
所述的LB固体培养基的组成如下：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂糖15.0g/L。
2)从LB固体平板培养基上挑取单菌落，接种于附加100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中，在225rpm、37℃震荡培养9小时即得到一级种子；
所述的LB液体培养基的组成如下：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L；
3)将上述培养物按1:20比例分别接种到2-YT液体培养基和与2)中所述一致的LB液体培养基中，在225rpm/min、37℃下震荡培养，分别测两者生长曲线；
所述的2-YT液体培养基的组成如下：胰蛋白胨16g/L，酵母提取物10g/L，氯化钠5g/L；
2种子接种量对生长曲线的影响
按1中1)和2)操作进行得到一级种子，将一级种子分别按1:10、1:20、1:50比例接种到2-YT液体培养基中，在225rpm、37℃下震荡培养，分别测三者生长曲线；
3二级种子培养时间对接种后生长曲线的影响按1中1)和2)操作进行得到一级种子，将一级种子分别按1:20比例接种到2-YT液体培养基中，在225rpm、37℃下震荡培养，分别于2h(对数前期)、5h(对数中期)、9h(对数后期)按1:20比例接种到M9液体培养基中，在225rpm、37℃下震荡培养，分别测三者生长曲线；
实施例2
M9-GY优化培养基的优化实验
1)应用Design-Expert.V8.0.6.1软件中Box-Behnken Design的设计方法，以M9基本培养基组成成分为基础，设计以葡萄糖、甘油、酵母提取物和胰蛋白胨为四因素的试验，葡萄糖、酵母提取物、胰蛋白胨均选择0、10、20g/L三水平，甘油选择0、15、30ml/L三水平，以OD600和转化率同时作为考察指标，软件设计出的29组方案及其结果如下表：
2)具体的发酵过程如下：按实施例1中操作获得一级种子，将一级种子按1:20比例接种到液体2-YT培养基，在225rpm、37℃下震荡培养4小时即得二级种子；将二级种子按1:20比例接种到上述各种液体培养基中，液体培养基均以M9基本培养基配方为基础按上述表格配方添加剩余四种成分，一式三份，在225rpm、37℃下震荡培养5小时；加入IPTG至终浓度为0.3mM，在225rpm、30℃下震荡培养3小时；按终浓度为5g/L添加精制鸡胆粉为底物，在225rpm、25℃下震荡培养6小时进行发酵，收取样品，测OD600和底物转化率。
M9基本培养基组成如下：6.78g/L Na2HPO4，3g/L KH2PO4，0.5g/L NaCl，1g/LNH4Cl，2mM MgSO4，0.1mM CaCl2。
经Design-Expert.V8.0.6.1软件计算并综合之前得到的PBS-M9优化培养基配方与常规发酵过程补液阶段的液体组成，得出最佳培养基即M9-GY优化培养基，其配方如下：6.78g/L Na2HPO4，3g/L KH2PO4，0.5g/L NaCl，1g/L NH4Cl，2mM MgSO4，0.1mM CaCl2，4g/L(NH4)2HPO4，20g/L酵母提取物，28ml/L甘油。软件优化培养基结果如附图2所示。
实施例3
诱导培养阶段的优化
1 IPTG浓度对转化率的影响
1)按实施例1中操作获得一级种子，将一级种子按1:20比例接种到液体2-YT培养基，在225rpm、37℃下震荡培养4小时即得二级种子；
2)将二级种子按1:20比例接种到M9-GY优化培养基液体培养基中，一式三份，在225rpm、37℃下震荡培养5小时；
3)加入IPTG至终浓度分别为0.1、0.3、0.6、0.8、1.0mM，在225rpm、30℃下震荡培养3小时；按终浓度为5g/L添加精制鸡胆粉为底物，在225rpm、25℃下震荡培养6小时进行发酵；结果如图1a所示：
2诱导条件组合优化
分别选取重组工程菌在M9-GY优化培养基中生长曲线的对数前期(4小时)、对数中期(5.5小时)、对数后期(7.5小时)作为添加IPTG的时间点，诱导时长选择3h、4h、5h两两组合，九组实验方案如下表所示，结果如图1b所示：
Std IPTG added time(h) Induction duration(h)
1 4 3
2 4 4
3 4 5
4 5.5 3
5 5.5 4
6 5.5 5
7 7.5 3
8 7.5 4
9 7.5 5
实施例4
5升发酵罐高密度发酵
1)按实施例1中操作得一级种子，将一级种子按1:20比例接种到液体2-YT培养基，在225rpm、37℃下震荡培养4小时即得二级种子；
2)按实施例2中M9-GY优化培养基配方配制3升液体培养基(不加MgSO4和CaCl2)装至上海保兴生物5升离位灭菌发酵罐，灭菌锅内灭菌后再添加氨苄青霉素至终浓度为100mg/L和按配方中浓度添加MgSO4和CaCl2；
3)将二级种子按1:20比例接种到发酵罐中，通气量2L/min，搅拌速率600rpm，通过流加氨水和正磷酸使pH值保持在7.0，温度37℃培养4小时；
4)添加IPTG至终浓度0.3mM，通气量2L/min，搅拌速率600rpm，pH值保持在6.5，温度30℃培养3小时；
5)按终浓度10g/L称取精制鸡胆粉为底物加入发酵罐，通气量2L/min，搅拌速率600rpm，通过流加氨水和正磷酸使pH值保持在6.5，温度25℃培养5小时后，停止通气，不调节pH值，不搅拌，25℃下静置12h后按实施例5所述方法检测，HPLC图谱如附图5a所示；
6)按终浓度11.5g/L称取粗制鸡胆粉为底物加入发酵罐，通气量2L/min，搅拌速率600rpm，pH值保持在6.5，温度25℃培养3.5小时后，停止通气，不调节pH值，不搅拌，16℃下静置12h后按实施例5所述方法检测，HPLC图谱如附图5c所示；
实施例5
产物的HPLC检测分析
1)色谱柱：Agilent Poroshell 120EC-C18column(2.7μm，4.6mm×150mm)
Thermo LPG-3400SD高效液相色谱仪，Corona Veo Charged Aerosol Detector电喷雾检测器；
柱温40℃，采集频率10Hz，雾化温度45℃柱温：40℃；流速：0.6ml/min；进样量1μl；
流动相：A-乙腈；B-含0.3％甲酸的5mmol/L醋酸铵水溶液
梯度条件：
时间(min) 流速(mL/min) 乙腈 0.3％甲酸的5mmol/L醋酸铵水溶液
0 0.6 20 80
15 0.6 27 73
25 0.6 35 65
35 0.6 37 63
45 0.6 90 10
发酵液样品12000rpm离心1.5min，用500ul水饱和的正丁醇萃取100ul发酵液离心后的上清液，分层后上清液全部转移至另一离心管，氮气吹干后重溶于HPLC级甲醇溶液，用0.22μm滤膜过滤即为待测样品的处理。
2)胆汁酸标准品的HPLC图谱如附图3所示
3)精/粗制鸡胆粉的HPLC图谱如附图4所示。
实施例6
发酵工艺过程中静置是否有利于转化的考察
1)按实施例1中操作得一级种子，将一级种子按1:20比例接种到液体2-YT培养基，在225rpm、37℃下震荡培养4小时即得二级种子；
2)按实施例2中M9-GY优化培养基配方配制3升液体培养基(不加MgSO4和CaCl2)装至上海保兴生物5升离位灭菌发酵罐，灭菌锅内灭菌后再添加氨苄青霉素至终浓度为100mg/L和按配方中浓度添加MgSO4和CaCl2；
3)将二级种子按1:20比例接种到发酵罐中，通气量2L/min，搅拌速率600rpm，通过流加氨水和正磷酸使pH值保持在7.0，温度37℃培养4小时；
4)添加IPTG至终浓度0.3mM，通气量2L/min，搅拌速率600rpm，pH值保持在6.5，温度30℃培养3小时；
5)按终浓度10g/L称取精制鸡胆粉为底物加入发酵罐，通气量2L/min，搅拌速率600rpm，通过流加氨水和正磷酸使pH值保持在6.5，温度25℃培养，分别于加入底物后0h，6h，17h取出9ml发酵液装于15ml离心管(模拟发酵罐中的体积比例)中于25℃培养箱中静置29h，23h，12h后同时按实施例5所述方法检测，结果如附图6a所示。
实施例7
精制鸡胆粉静置过程最佳温度的考察
1)按实施例1中操作得一级种子，将一级种子按1:20比例接种到液体2-YT培养基，在225rpm、37℃下震荡培养4小时即得二级种子；；
2)按实施例2中M9-GY优化培养基配方配制3升液体培养基(不加MgSO4和CaCl2)装至上海保兴生物5升离位灭菌发酵罐，灭菌锅内灭菌后再添加氨苄青霉素至终浓度为100mg/L和按配方中浓度添加MgSO4和CaCl2；
3)将二级种子按1:20比例接种到发酵罐中，通气量2L/min，搅拌速率600rpm，通过流加氨水和正磷酸使pH值保持在7.0，温度37℃培养4小时；
4)添加IPTG至终浓度0.3mM，通气量2L/min，搅拌速率600rpm，通过流加氨水和正磷酸使pH值保持在6.5，温度30℃培养3小时；
5)按终浓度10g/L称取精制鸡胆粉为底物加入发酵罐，通气量2L/min，搅拌速率600rpm，通过流加氨水和正磷酸使pH值保持在6.5，温度25℃培养5小时后，停止通气，不调节pH值，不搅拌，分别于16℃，25℃，37℃下静置12h后按实施例5所述方法检测，HPLC图谱如附图5a所示。
实施例8
粗制鸡胆粉静置过程最佳温度的考察
1)按实施例1中操作得一级种子，将一级种子按1:20比例接种到液体2-YT培养基，在225rpm、37℃下震荡培养4小时即得二级种子；；
2)按实施例2中M9-GY优化培养基配方配制3升液体培养基(不加MgSO4和CaCl2)装至上海保兴生物5升离位灭菌发酵罐，灭菌锅内灭菌后再添加氨苄青霉素至终浓度为100mg/L和按配方中浓度添加MgSO4和CaCl2；
3)将二级种子按1:20比例接种到发酵罐中，通气量2L/min，搅拌速率600rpm，通过流加氨水和正磷酸使pH值保持在7.0，温度37℃培养4小时；
4)添加IPTG至终浓度0.3mM，通气量2L/min，搅拌速率600rpm，通过流加氨水和正磷酸使pH值保持在6.5，温度30℃培养3小时；
5)按终浓度11.5g/L称取粗制鸡胆粉为底物加入发酵罐，通气量2L/min，搅拌速率600rpm，通过流加氨水和正磷酸使pH值保持在6.5，温度25℃培养3.5小时后，停止通气，不调节pH值，不搅拌，分别于16℃、25℃、37℃下静置12h后按实施例5所述方法检测，HPLC图谱如附图5c所示。
实施例9
发酵产物的制备与纯化
1)收集发酵液5000xg离心20min，收集上层清液。
2)上层清液过D101大孔树脂，一次上样量与树脂等体积，流速控制在成滴下落不连成线。先用H2O冲至洗脱液无色，再用95％乙醇冲至洗脱液无色并收集该部分洗脱液。
3)50℃减压旋蒸，浓缩液过0.45μm有机滤膜，滤液水浴挥至浸膏状。
4)50℃真空干燥箱干燥至恒重，取出捣碎即得人工熊胆粉。所得成品如附图7所示。成品按照实施例5所述方法，根据已建立的标准曲线产物，测定发酵产物中TUDCA、TCDCA和T-7K-LCA含量。人工熊胆粉成品典型的HPLC图谱如附图5b、5d所示。
实施例10
人工熊胆粉中水分含量测定
1)称量瓶在105℃烘箱烘1小时后取出放在干燥器中干燥半小时后称重，记为m1，105℃烘箱继续烘1小时，干燥器干燥半小时后称重，记为m2，两次称重之间误差不超过0.3mg即为恒重。
2)恒重后，取出约300mg样品称重，记为m3，105℃烘箱烘5小时后干燥器干燥半小时称量m4。
3)105℃烘箱继续烘1小时，干燥器干燥半小时后称重m5，两次称重之间误差不超过0.3mg即为恒重。
4)
实施例11
人工熊胆粉中内毒素含量测定
利用显色基质鲎试剂盒(厦门市鲎试剂实验厂有限公司)测试采用本本发明所述制备的人工熊胆粉中内毒素的含量。
1)细菌内毒素标准溶液的配制：以1.0EU/ml的内毒素溶液为母液按下表稀释成0.01，0.025，0.05，0.1EU/ml的浓度梯度；
2)试剂的准备：鲎试剂、显色基质、偶氮化试剂1-3均按说明书所示配置好；
3)内毒素的测定：取无热原试管，分别加入100μl细菌内毒素检查用水、内毒素标准溶液，人工熊胆粉供试品；再加入100μl鲎试剂溶液，混匀，37℃温育8分钟；温育结束，加入100μl显色基质溶液，混匀，37℃温育6分钟；温育结束，加入500μl偶氮化试剂1溶液，混匀，加入500μl偶氮化试剂2溶液，混匀，加入500μl偶氮化试剂3溶液，混匀，静置5分钟，于545nm波长处读取吸光度值。
4)内毒素标准曲线为y＝1.2578x+0.0295，R2＝0.9966。采用本发明所述制备的人工熊胆粉中内毒素的含量低于0.015EU/ml。

Claims (3)

1.一种采用工程菌株规模化发酵培养制备人工熊胆粉的工艺。
2.根据权利要求1的一种采用工程菌株BL21*-α1β2规模化发酵培养制备人工熊胆粉的工艺，其特征在于：
工艺步骤如下：
A.工程菌株BL21*-α1β2种子液的预培养
①.将工程菌接种到附加有50～100mg/L氨苄青霉素的LB固体平板培养基中活化，于37℃活化培养12小时；
所述的LB固体培养基的组成如下：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂糖15.0g/L；
②.从LB固体平板培养基上挑取单菌落，接种于附加有100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中，在225rpm、37℃下震荡培养9～12小时；
所述的LB液体培养基的组成如下：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L；
③.将②中菌液按2～10％接种量接种至附加有100mg/L氨苄青霉素的2-YT液体培养基中，在225rpm、37℃下震荡培养3～12小时；
所述的2-YT液体培养基的组成如下：胰蛋白胨16g/L，酵母粉提取物10g/L，氯化钠5g/L；
B.粗/精制鸡胆粉的发酵罐发酵工艺；
①.将A中③所得菌液按2～10％接种量接种至M9-GY优化培养基，通气量1～6L/min，37℃，pH值通过正磷酸和氨水维持在7.0，搅拌速率600rpm，培养3～6小时至OD600为1.5～6；
②.加入终浓度为0.3mmol/L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，通气量1～6L/min，温度降至30℃，pH值调为6.5，搅拌速率600rpm，诱导培养1～3小时；
③.加入适量粗/精制鸡胆粉，温度25℃，pH值保持在6.5，通气量1～6L/min，搅拌速率600rpm条件下发酵1～5小时后，停止通气，温度仍为25℃，不调节pH值，不搅拌，16℃～37℃下静置5～18h；
步骤B中①用到的M9-GY优化培养基为：6.78g/L Na2HPO4，3g/L KH2PO4，3.3g/L(NH4)2HPO4，0.5g/L NaCl，1g/L NH4Cl，28.6ml/L甘油，10～30g/L酵母提取物，2mM MgSO4，0.1mMCaCl2。
3.根据权利要求1的一种采用工程菌株规模化发酵培养制备人工熊胆粉的工艺，其特征在于：
步骤B中③若加入粗制鸡胆粉发酵工艺为温度25℃，pH值保持在6.5，通气量1～6L/min，搅拌速率600rpm条件下发酵1～5小时后，停止通气，温度仍为25℃，不调节pH值，不搅拌，16℃下静置5～18h；
若加入精制鸡胆粉发酵工艺为温度25℃，pH值保持在6.5，通气量1～6L/min，搅拌速率600rpm条件下发酵5小时后，停止通气，温度仍为25℃，不调节pH值，不搅拌，25℃下静置5～18h。
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