CN106367465A - 一种采用工程菌发酵生产人工熊胆粉的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及由工程菌经优化的发酵工艺生产制备人工熊胆粉的方法，属于生物技术领域，采用同时表达7α‑羟基类固醇脱氢酶(7α‑HSDH)和7β‑羟基类固醇脱氢酶(7β‑HSDH)基因的大肠杆菌进行液体发酵，直接将家禽胆汁制品如鸡胆粉中牛磺鹅去氧胆酸转化为一定比例的牛磺熊去氧胆酸，发酵过程简单、快捷，条件温和，无污染；发酵结果稳定、可控，转化率高，中间产物少。对熊胆粉替代资源的生物技术生产具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种采用工程菌优化发酵生产人工熊胆粉的方法，具体说，是涉及一种通过遗传改造的非致病性微生物进行的将家禽胆汁制品中牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)成分原位转化为一定比例的牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)的方法，属于生物技术领域。
背景技术
熊胆粉是熊科动物黑熊Selenaretos thibetanus Cuvier经胆囊手术引流胆汁而得的干燥品，具有清热解毒、明目、止痉、利胆、保肝、溶石等功效。临床常用于小儿热盛惊风，癫痫，抽搐，黄疸；外用治痈肿，痔疮，目赤云翳等。熊胆粉主要含有胆汁酸，其主要有效成分为牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)，中国药典规定TUDCA含量不低于23％。
目前，国内熊胆粉主要来自于“活熊引流取胆”，因其获取方式而备受争议。也有通过化学合成方法生产其有效成分TUDCA的报道，也因步骤繁琐，且生产过程需使用大量有机溶剂，不利于环境保护。因此，采用生物技术将来源广泛的家禽胆汁制品如鸡胆粉经工程菌发酵，制备成与熊胆粉化学组成等值的替代资源，对于合理利用自然资源，解决药用熊胆粉来源，推动中药的现代化具有重要意义。
家禽胆汁与熊胆汁在化学成分组成上的主要差别在于：家禽胆汁以牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)为主要成分，且不含有TUDCA。TUDCA与TCDCA结构上是7位羟基的差向异构，生物体内，TUDCA可由TCDCA经由五步化学反应生成。有研究表明，在体外，TCDCA也可以依次经过7α-羟基类固醇脱氢酶(7α-HSDH)和7β-羟基类固醇脱氢酶(7β-HSDH)的催化转变成TUDCA。其反应方程式如下图所示：
发明内容
本发明要解决的技术问题在于采用基因工程方法遗传改造的大肠杆菌，以家禽胆汁制品为发酵底物，通过优化的微生物发酵工艺，将底物中牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)成分部分地原位转化为牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)的方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种采用工程菌发酵生产人工熊胆粉的方法其特征在于：为工程菌直接发酵转化法，包括7α-HSDH和7β-HSDH基因密码子优化、工程菌的构建、工程菌培养、底物的添加、发酵工艺优化及产物制备。所述工程菌为同时表达7α-HSDH和7β-HSDH基因的大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)BL21star(DE3)；
所述底物为家禽胆汁制品，包括精制品和粗制品；
如精制鸡胆粉和粗制鸡胆粉，如精制鸭胆粉和粗制鸭胆粉，如精制鹅胆粉和粗制鹅胆粉。
7α-HSDH和7β-HSDH分别为7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶；
7α-HSDH分别来源于：撒丁岛梭菌(Clostridium sardiniense strain DSM599,GenBank登录号：JN191345.1)和大肠杆菌(Escherichia coli strain TW14359,GenBank登录号：CU928163.2)；
7β-HSDH基因分别来源于：撒丁岛梭菌(Clostridium sardiniense strainDSM599,GenBank登录号：JN191345.1)和活泼瘤胃球菌(Ruminococcus gnavus strainN53,GenBank登录号：KF052988.1)；
分别采用http://www.jcat.de/在线软件以大肠杆菌为宿主菌，根据密码子偏好性，对全基因序列进行密码子优化，并进行全基因合成，分别记为α1、α2、β1、β2。
本发明所述的工程菌发酵生产人工熊胆粉的方法，其特征在于，包括如下具体步骤：
a)双基因表达载体的构建
①两个7α-HSDH和两个7β-HSDH的编码区(ORF)分别进行密码子优化，5’和3’段增加酶切位点，并进行全基因合成，分别记为α1、α2、β1、β2；
②合成的四个基因分别进行双酶切并分别连接入pETM6载体的多克隆位点，使每个基因均带有独立的启动子、核糖体结合位点(RBS)和终止子元件，得pETM6-α1、pETM6-α2、pETM6-β1、pETM6-β2；
③将pETM6-α1、pETM6-α2分别酶切作为载体片段；将pETM6-β1、pETM6-β2分别进行酶切，得到“启动子-RBS-β1-终止子”和“启动子-RBS-β2-终止子”的表达盒作为插入子片段；顺次连接，得到pETM6-α1β1、pETM6-α1β2、pETM6-α2β1、pETM6-α2β2。
b)多基因表达载体构建
将pETM6-α1β1、pETM6-α1β2、pETM6-α2β1、pETM6-α2β2重组载体再次进行双酶切，作为载体片段；与③中得到的“启动子-RBS-β1-终止子”和“启动子-RBS-β2-终止子”片段进行连接，得到pETM6-α1β1β1、pETM6-α1β1β2、pETM6-α1β2β2、pETM6-α2β1β1、pETM6-α2β1β2、pETM6-α2β2β2。
c)工程菌的构建
①将pETM6-α1β1、pETM6-α1β2、pETM6-α2β1、pETM6-α2β2分别转入大肠杆菌，得到四个带有双基因表达载体的工程菌E.coli BL21star-pETM6-α1β1、E.coli BL21star-pETM6-α1β2、E.coli BL21star-pETM6-α2β1、E.coli BL21star-pETM6-α2β2。
pETM6空载体转入大肠杆菌，得到E.coli BL21star-pETM6，作为载体对照工程菌。
②将pETM6-α1β1β1、pETM6-α1β1β2、pETM6-α1β2β2、pETM6-α2β1β1、pETM6-α2β1β2、pETM6-α2β2β2分别转入大肠杆菌，又得到六个带有多基因表达载体的工程菌：E.coliBL21star-pETM6-α1β1β1、E.coli BL21star-pETM6-α1β1β2、E.coli BL21star-pETM6-α1β1β2、E.coli BL21star-pETM6-α2β1β1、E.coli BL21star-pETM6-α2β1β2、E.coliBL21star-pETM6-α2β2β2。
所述的采用工程菌发酵生产人工熊胆粉的方法，其特征在于，包括如下具体步骤：
d)工程菌的培养
①将工程菌从-80℃冰箱中取出，在附加有50～100mg/L(优选80～100mg/L)氨苄青霉素(Amp+)LB固体平板培养基中划线接种化，于20～40℃(优选25～37℃)活化培养9～36小时(优选10～16小时)；
②从LB固体平板培养基上挑取单菌落，接种于附加50～100mg/L(优选80～100mg/L)氨苄青霉素(Amp+)LB液体培养基中，在75～225rpm(优选180～225rpm)、20～40℃(优选25～37℃)下预培养9～24小时(优选10～16小时)；
③将上述培养物按1:50比例接种到1XM9液体培养基中，在75～225rpm(优选180～225rpm)、20～37℃(优选25～37℃)下震荡培养3～6小时(优选3～5小时)至OD600＝0.6～0.8，加入0.1～2mM(优选0.5～1mM)的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，温度20～37℃(优选25～30℃)，诱导培养2～5小时(优选3～4小时)；
e)底物发酵转化
①配制1XM9-PBS液体培养基，添加50～100mg/L(优选80～100mg/L)氨苄青霉素和0.1～2mM(优选0.5～1mM)的IPTG；再称取适当质量家禽胆汁制品，加入培养基中，充分溶解并混匀，0.22μm无菌滤器抽滤除菌，作为发酵培养基；
②将d)中工程菌培养物离心，收集菌体，以5～20(优选10～20)倍浓缩至发酵培养基中，于75～225rpm(优选180～225rpm)、16～37℃(优选20～28℃)下震荡培养1小时～24小时(优选1～12小时)，进行发酵培养。
f)发酵液转化产物分析
①发酵过程结束，收集发酵液，离心或用0.22μm无菌滤器抽滤去除菌体，收集上清液或滤过液。
②取少量上清液或滤过液，用0.22μm滤膜过滤，用XBridgeTM C18 5μm色谱柱，对转化产物进行分析。
g)人工熊胆粉的制备
①对步骤f)中收集的上清液或滤过液，用等体积的正丁醇分三次反复萃取，合并萃取液，减压浓缩挥干正丁醇。
②所得残渣用乙醇溶解后，再次减压浓缩挥干，所得干燥物即为以牛磺熊去氧胆酸为主要成分的人工熊胆粉制品。
所述的采用工程菌发酵生产人工熊胆粉的方法，其特征在于：所述的LB固体培养基的组成如下：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L，酵母提取物(Yeast Extract)5g/L，氯化钠(NaCl)10g/L，琼脂糖15.0g/L。
所述的采用工程菌发酵生产人工熊胆粉的方法，其特征在于，所述的LB液体培养基的组成如下：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L，酵母提取物(Yeast Extract)5g/L，氯化钠(NaCl)1g/L。
所述的采用工程菌发酵生产人工熊胆粉的方法，其特征在于：所述的1XM9液体 培养基的组成如下：Na2HPO4：6.78g/L，KH2PO4：3g/L，NaCl：0.5g/L，NH4Cl：1g/L，2mM MgSO4，0.1mM CaCl2，0.04～20％D-葡萄糖(优选0.4％)。
所述的采用工程菌发酵生产人工熊胆粉的方法，其特征在于：所述的1XM9-PBS液体培养基配制方法如下：首先分别配制5XM9基本培养基(12.8g/L磷酸氢二钠，15g/L磷酸二氢钾，2.5g/L氯化钠，5.0/Lg氯化铵)、1M硫酸镁、1M氯化钙、20％D-葡萄糖、pH值为6.5的PBS缓冲液(0.2M的NaH2PO4与0.2M的Na2HPO4按68.5：31.5体积比混合)，灭菌；然后将灭菌的上述溶液于超净台中按下表所示依次加入到无菌容器中，定容至适当体积。
所述的采用工程菌发酵生产人工熊胆粉的方法，其特征在于：步骤e)中的底物以粉末或水溶液形式加入。
所述的采用工程菌发酵生产人工熊胆粉的方法，其特征在于：所述底物浓度为0.5～50g/L，使底物中牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)终浓度为0.7～20g/L(优选2～20g/L)。
所述的采用工程菌发酵生产人工熊胆粉的方法，其特征在于：步骤d)中预培养9～24小时(优选10～16小时)。
所述的采用工程菌发酵生产人工熊胆粉的方法，其特征在于：步骤d)中菌种按1:50稀释后培养3～6小时(优选3～5小时)至OD600＝0.6～0.8。
所述的采用工程菌发酵生产人工熊胆粉的方法，其特征在于：加入IPTG前培养温度为20～37℃(优选25～37℃)，时间为3～6小时(优选3～4小时)至OD600＝0.6～0.8；
所述的采用工程菌发酵生产人工熊胆粉的方法，其特征在于：步骤d)中加入IPTG浓度为0.1～2mM(优选0.5～1mM)；诱导培养温度为20～37℃(优选25～35℃)，诱导培养时间为2～6小时(优选3～4小时)。
所述的采用工程菌发酵生产人工熊胆粉的方法，其特征在于：步骤e)中菌体以5～20(优选10～20)倍浓缩至发酵培养基中；发酵温度为16～37℃(优选20～28℃)，发酵时间为1小时～24小时(优选1～12小时)。
所述的采用工程菌发酵生产人工熊胆粉的方法，其特征在于：步骤g)中的萃取及减压浓缩挥干。
所述的采用工程菌发酵生产人工熊胆粉的方法，其特征在于：步骤f)中去除菌体的发酵液中TUDCA与TCDCA含量比例在(1.3～2.0):1.0，且T-7K-LCA含量低于胆汁酸成分总量的6％。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1)选用的非致病性大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)BL21star(DE3)作为工程菌宿主菌，易于培养，发酵过程易于控制。
2)选用密码子优化的7α-HSDH和7β-HSDH基因作为修饰宿主菌的工程基因，其表达水平高，酶的催化活力强。
3)底物中牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)转化速度快，可在较短时间内得到一定比例的TUDCA，且终端发酵液中T-7-KLCA含量低于6％。
4)发酵过程无污染，由发酵液制备产物工艺简便，使规模化及低成本制备人工熊胆粉成为可能，对人工熊胆粉的理论研究及药用价值的广泛利用具有重要贡献。
附图说明
图1.双基因表达载体图谱pETM6-α2β2
图2.本发明所用TCDCA、TUDCA、T-7K-LCA标准品的总离子流图。
图3.本发明方法所得样品中TCDCA、TUDCA、T-7K-LCA总离子流图。
图4.工程菌发酵液样品HPLC图谱。
图4的详细解释：图4由A、B、C三部分组成的，其中，A.载体对照，即工程菌E.coliBL21star-pETM6，发酵培养3小时；B.工程菌E.coli BL21star-pETM6-α1β2，发酵培养3小时；C.工程菌E.coli BL21star-pETM6-α1β2，发酵培养6小时。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细地说明，这些实例和附图仅起说明性作用，并不因此限制本发明的内容。因此，凡不违背本发明精神所做的修改及变形，均应包括在本发明范围内。
实施例1
全基因合成密码子优化的7α-HSDH和7β-HSDH基因
7α-HSDH和7β-HSDH分别为7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶；
两个7α-HSDH分别来源于:撒丁岛梭菌(Clostridium sardiniense strainDSM599,GenBank登录号：JN191345.1)和大肠杆菌(Escherichia coli strain TW14359,GenBank登录号：CU928163.2)，
两个7β-HSDH基因分别来源于:撒丁岛梭菌(Clostridium sardiniense strainDSM599,GenBank登录号：JN191345.1)和活泼瘤胃球菌(Ruminococcus gnavus strainN53,GenBank登录号：KF052988.1)。
分别采用http://www.jcat.de/在线软件以大肠杆菌为宿主菌，根据密码子偏好性，对全基因序列进行密码子优化，并进行全基因合成，分别记为α1、α2、β1、β2。
密码子优化后的来源于撒丁岛梭菌(Clostridium sardiniense)的7α-HSDH(记为α1)基因序列如SEQ ID No 1所示；密码子优化后的来源于大肠杆菌(Escherichia coli)的7α-HSDH(记为α2)基因序列如SEQ ID No 2所示；密码子优化后的来源于撒丁岛梭菌(Clostridium sardiniense)的7β-HSDH(记为β1)基因序列如SEQ ID No 3所示；密码子优化后的来源于活泼瘤胃球菌(Ruminococcus gnavus strain N53)的7β-HSDH(记为β2)基因序列如SEQ ID No 4所示；上述密码子优化后的基因序列5’和3’端分别加上NdeI和XhoI酶切位点，委托上海英俊生物科技有限公司进行全基因合成。
实施例2
工程菌的构建
1)扩大培养以pMD为载体、带有合成的目的基因α1、α2、β1、β2的大肠杆菌，以及DH5α-pETM6菌株：取10μl样品，加入10ml的LB(Amp+)培养基，37℃摇床培养12～16个小时，摇床速度为225rpm。
2)用购自上海创英生物科技有限公司的质粒抽提试剂盒抽提以上细菌的质粒，按试剂盒的操作说明操作。
3)对抽提得到的pMD-α1、pMD-α2、pMD-β1、pMD-β2质粒及表达载体pETM6进行双酶切，酶切体系如下：
37℃酶切2～4个小时，用胶回收试剂盒纯化目的片段。
4)将回收的850bp的目的基因片段α1、α2、β1、β2、分别和5.6kb的pETM6载体片段连接，连接体系如下：
将体系混匀，22℃连接1-3个小时，
5)连接体系转化大肠杆菌DH5α
Ⅰ.将10μl体系于超净台转入到根据标准方案制备的化学感受态大肠杆菌DH5α中，轻轻混匀，冰上放置30min。
Ⅱ.42℃热击45秒，冰上放置2min，于超净台加入250μl的SOC培养基。
Ⅲ.放置37℃摇床、200～300rpm，活化45min～1个小时，涂至LB(Amp+)固体平板培养基。
Ⅳ.将涂好的平板放入37℃培养箱，培养12～16个小时。
6)菌落PCR筛选分别含有pETM6-α1、pETM6-α2、pETM6-β1或pETM6-β2质粒的DH5α阳性菌：
I.用核酸序列两端15～35bp的包括酶切位点的片段合成引物，扩增α1、α2的正反向引物为T7 Promoter、SH3-R，扩增β1、β2的正反向引物为T7 Promoter、PDZ-R。
Ⅱ.PCR反应体系如下：
III.在超净台用鱼线挑取优势菌落，置入PCR管，简短离心，使鱼线和反应液收集至PCR管底部。
IV. PCR扩增条件条件如下：
95℃3min；(95℃30s，55℃30s，72℃1min)X 30个循环；72℃10min；4℃保存。
Ⅴ.电泳检测PCR产物，选出带有目的片段的阳性菌落DH5α-pETM6-α1、DH5α-pETM6-α2、DH5α-pETM6-β1、DH5α-pETM6-β2。
7)于超净台挑取以上阳性菌落，加入5ml LB(Amp+)液体培养基，于37℃、200～300rpm摇床，培养12～16个小时。
8)用上海创英生物技术有限公司的质粒抽提试剂盒，抽提扩大培养的阳性菌，并用NheI/SalI双酶切pETM6-α1、pETM6-α2，胶回收约6kb的大片段作为载体；用AvrⅡ/SalI双酶切pETM6-β1、pETM6-β2，胶回收约850bp的小片段作为插入子。酶切体系同上述3)。
9)将回收的载体片段pETM6-α1、pETM6-α2，分别与插入子片段β1、β2连接，连接体系同上述4)。
10)将连接体系转化大肠杆菌DH5α菌株，操作同上述5)。
11)进行菌落PCR，筛选分别含有pETM6-α1β1、pETM6-α1β2、pETM6-α2β1或pETM6-α2β2的DH5α阳性克隆：
通过T7Promoter、PDZ-R正反向引物扩增β1、β2，电泳检测PCR产物，筛选出带有目的片段的阳性菌落DH5α-pETM6-α1β1、DH5α-pETM6-α1β2、DH5α-pETM6-α2β1、DH5α-pETM6-α2β2，PCR反应体系及循环条件同上述6)。
12)挑取阳性克隆菌，加入5ml LB(Amp+)液体培养基，于37℃、200～300rpm摇床，培养12～16个小时，提取质粒，酶切鉴定，确认载体构建正确。
13)将重组质粒转入(Escherichia coli，E.coli)BL21star(DE3)表达载体，得到BL21star(DE3)pETM6-α1β1、BL21star(DE3)pETM6-α1β2、BL21star(DE3)pETM6-α2β1、BL21star(DE3)pETM6-α2β2。
实施例3
工程菌的培养及发酵
1)将-80℃冰箱保存的工程菌用划线法涂布到含有100mg/L氨苄青霉素的LB固体平板培养基中，于37℃活化培养12个小时；
所述的LB固体培养基的组成如下：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂糖15.0g/L。
2)从LB固体平板培养基上挑取单菌落，接种于附加100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中，在225rpm、37℃震荡培养12小时；
所述的LB液体培养基的组成如下：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L；
3)将上述培养物按1:50比例接种到液体1XM9培养基，在225rpm/min、37℃下 震荡培养5小时，加入1mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，调至30℃继续培养3小时；
4)用pH值6.5的PBS缓冲液配制含有6.78g/L的Na2HPO4，3g/L的KH2PO4，0.5g/L的NaCl，1g/L的NH4Cl，2mM MgSO4，0.1mM CaCl2，0.4％D-葡萄糖的1XM9-PBS液体培养基；
添加100mg/L的氨苄青霉素和1mM的IPTG，再按终浓度5g/L称取适量精制鸡胆粉为底物，加入培养基中，充分溶解并混匀，用0.22μm无菌滤器过滤除菌，作为发酵培养基。
5)将3)中工程菌培养物以5000g/min离心，收集菌体，按15倍浓缩比加入发酵培养基中，于225rpm、25℃震荡培养3小时，进行发酵。
实施例4
产物的收集制备
1)发酵过程结束，收集发酵液，离心去除菌体，收集上清液；
2)取1ml上清液用0.22μm滤膜过滤，采用Waters XBridgeTM C18column色谱柱，分析转化产物。
3)将剩余上清液中加入等体积正丁醇萃取，合并正丁醇萃取液，减压浓缩挥干正丁醇。
4)将浓缩得到的残渣用乙醇充分溶解，再次减压浓缩挥干。所得干燥物即为以牛磺熊去氧胆酸为主要成分的人工熊胆粉制品。
实施例5
产物的HPLC检测分析
1)色谱柱：Waters XBridgeTM C18column(5μm，4.6mm×150mm)
Agilent 1100高效液相色谱仪，PL-ELS 1000蒸发光散射检测器；
ELSD参数：漂移管温度为85℃；N2流速1.5L min-1；
柱温：40℃；流速：1ml min-1；进样量25μl；
流动相：A-0.2％的甲酸乙腈；B-0.3％的甲酸水溶液
梯度条件：
2)LC-MS分析
色谱柱：Waters Acquity UPLC BEH C18column(1.7μm，100mm×2.1mm)；
预柱：Acquity UPLC BEH C18Van Guard pre-column(1.7μm，5mm×2.1mm)；
柱温：45℃；样品槽：4℃；流速：0.3mL/min；进样量：5μL；
流动相：A-0.2％的甲酸乙腈；B-0.3％的甲酸水溶液
梯度条件：
| 时间 | A的比例 | B的比例 |
| 0 | 70 | 30 |
| 10 | 67.5 | 32.5 |
| 12 | 62.5 | 37.5 |
| 15 | 70 | 30 |
MS分析选用负离子模式，在以下条件下进行：离子源温度(Source temp)：120℃；脱溶剂温度(Desolvation temp)：350度；脱溶剂(N2)流速Desolvation(L/Hr)600；锥孔气(N2)流速Cone(L/Hr)50；毛细管电压Capillary(Kv)2.80；锥孔电压Cone(V)55；全扫描质谱范围母离子为m/z 100～1000，子离子为m/z 50～500。LC-MS数据分析采用仪器随带的Finnigan Xcalibur 1.3软件进行。
实施例6
发酵3小时、6小时产物中TUDCA、TCDCA、T-7K-LCA含量测定
1)发酵3小时及6小时后，收集发酵液，高速离心，去除菌体。
2)取1ml上清液，用0.22μm滤膜过滤，采用实例3中所述条件方法，根据已建立的标准曲线产物，测定发酵产物中TUDCA、TCDCA和T-7K-LCA含量。
3)发酵产物典型的HPLC图谱如附图4所示。
4)发酵产物中测得的各成分含量如下表所示：
实施例7
构建基因拷贝优化的工程菌
1)用NheI/SalI双酶切pETM6-α1β1、pETM6-α1β2、pETM6-α2β1、pETM6-α2β2，胶回收7.1kb大片段；用AvrⅡ/SalI双酶切pETM6-β1、pETM6-β2，胶回收850bp的小片段；酶切体系及连接方式与实施例2中相同。
2)将连接体系转化至(Escherichia coli，E.coli)DH5α克隆菌株，分别得到
E.coli DH5α-pETM6-α1β1β1、E.coli DH5α-pETM6-α1β1β2、
E.coli DH5α-pETM6-α1β1β2、E.coli DH5α-pETM6-α2β1β1、
E.coli DH5α-pETM6-α2β1β2、E.coli DH5α-pETM6-α2β2β2六个阳性克隆菌株；转化及阳性克隆筛选方式与实施例2中相同。
3)提取上述菌株质粒，分别转化至(Escherichia coli，E.coli)BL21star(DE3)菌株，得到E.coli BL21star-pETM6-α1β1β1、E.coli BL21star-pETM6-α1β1β2、
E.coli BL21star-pETM6-α1β1β2、E.coli BL21star-pETM6-α2β1β1、
E.coli BL21star-pETM6-α2β1β2、E.coli BL21star-pETM6-α2β2β2六个工程菌；质粒提取、转化及阳性工程菌筛选方式与实施例2中相同。
实施例8
pH对发酵的影响
按实施例3所述方法进行转化实验，TCDCA的加入量为1g/L时，配制pH为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5的M9培养基。以E.coli BL21star-pETM6-α2β2为例，实验结果见表1所示，不同pH值条件下的产物比例见表2所示。
表1.不同pH值条件下发酵液中产物浓度与得率
| pH值 | TUDCA(mg/L) | T-7K-LCA(mg/L) | TCDCA(mg/L) | TUDCA得率(％) |
| 5.5 | 0 | 116.4±13.2 | 527.0±67.8 | 0 |
| 6.0 | 124.3±17.2 | 137.9±24.5 | 685.1±300.2 | 12.4±1.7 |
| 6.5 | 202.2±154.5 | 435.5±18.9 | 506.8±277.4 | 20.2±1.5 |
| 7.0 | 329.0±58.8 | 816.2±61.7 | 174.0±24.0 | 32.9±5.8 |
| 7.5 | 267.6±27.7 | 971.9±40.3 | 122.9±23.6 | 26.7±2.7 |
| 8.0 | 146.7±39.5 | 1078.2±82.3 | 0 | 14.7±3.9 |
| 8.5 | 146.6±55.1 | 1011.8±32.8 | 107.2±15.8 | 14.7±5.5 |
表2.不同pH值条件下的发酵液中各成分比例
| pH值 | TUDCA/T-7K-LCA/TCDCA |
| 5.5 | 0：2：9 |
| 6.0 | 2：2：5 |
| 6.5 | 2：4：5 |
| 7.0 | 2：5：1 |
| 7.5 | 2：7：1 |
| 8.0 | 3：2：0 |
| 8.5 | 1：7：1 |
SEQUENCE LISTING的说明
。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海中医药大学
<120> 一种采用工程菌发酵生产人工熊胆粉的方法
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 888
<212> DNA
<213> Clostridium sardiniense strain
<400> 1
catatggtga acataatgaa aagattagaa ggaaaagtcg caatagtaac atcatctact 60
agaggaatag gacgtgcatc tgcagaagca ttagcaaaag aaggtgcttt agtatatcta 120
gcagcacgtt cagaggaatt agctaatgaa gttatagcag atataaaaaa gcaaggtgga 180
gtagctaagt ttgtttactt taatgctaga gaagaagaaa cttacacttc aatggtagaa 240
aaagttgctg aagctgaagg caggatagat atattagtta ataactacgg tggaacaaat 300
gttaatttag ataagaactt aactgctgga gatacagatg aattctttag aatattaaaa 360
gataacgttc aaagtgtata cttaccagca aaagctgcta taccacacat ggaaaaagta 420
ggcggtggaa gcatagttaa tatctcaact ataggatcag ttgttccaga tatatcaaga 480
atagcttact gtgtatcaaa atccgctata aactctttaa ctcaaaacat agcattacaa 540
tatgcaagaa agaatatcag atgtaatgca gtattacctg gtttaatagg aactagagca 600
gcactcgaaa atatgactga tgaatttaga gactcattct taggacatgt tcctttaaat 660
agagtaggaa gaccagaaga tatagcaaat gcagttttat actatgcctc tgatgattca 720
ggttatgtaa caggaatgat tcatgaagtt gcaggaggtt ttgcattagg aactcctcaa 780
tattcagaat actgtccaag aggaggagga ggatctggag gaggaggatc tggaggagga 840
ggatctcctc ctcctgcact gcctccgaaa cgtcgtcgtt aactcgag 888
<210> 2
<211> 858
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 2
catatggtgt ttaattctga caacctgaga ctcgacggaa aatgcgccat catcacaggt 60
gcgggtgcag gtattggtaa agaaatcgcc attacattcg cgacagctgg cgcatctgtg 120
gtggtcagtg atattaacgc cgacgcagct aaccatgttg tagacgaaat tcaacaactg 180
ggtggtcagg catttgcctg ccgttgtgat attacttccg aacaggaact ctctgcactg 240
gcagactttg ctatcagtaa gctgggtaaa gttgatattc tggttaacaa cgccggtggc 300
ggtggaccta aaccgtttga tatgccaatg gcggattttc gccgtgctta tgaactgaat 360
gtgttttctt ttttccatct gtcacaactt gttgcgccag aaatggaaaa aaatggcggt 420
ggcgttattc tgaccatcac ttctatggcg gcagaaaata aaaatataaa catgacttcc 480
tatgcatcat ctaaagctgc ggccagtcat ctggtcagaa atatggcgtt tgacctgggt 540
gaaaaaaata ttcgggtaaa tggcattgcg ccgggggcaa tattaaccga tgccctgaaa 600
tccgttatta caccagaaat tgaacaaaaa atgttacagc acacgccgat cagacgtctg 660
ggccaaccgc aagatattgc taacgcagcg ctgttccttt gctcgcctgc tgcgagctgg 720
gtaagcggac aaattctcac cgtctccggt ggtggggtac aggagctcaa tggaggagga 780
ggatctggag gaggaggatc tggaggagga ggatctcctc ctcctgcact gcctccgaaa 840
cgtcgtcgtt aactcgag 858
<210> 3
<211> 861
<212> DNA
<213> Clostridium sardiniense
<400> 3
catatgaatt ttagagaaaa atatggacaa tggggaattg ttttaggggc aacagaagga 60
attggtaaag ctagtgcttt tgaattagct aaaagaggga tggatgttat tttagttgga 120
agaagaaaag aagcattaga agagttagct aaggcaatac atgaagaaac aggaaaagaa 180
atcagagtat taccacaaga tttatctgaa tatgatgctg cagaaagatt aatagaagca 240
actaaagatt tagatatggg agtcattgag tatgttgcat gtctacatgc aatgggacaa 300
tataataaag ttgactacgc taaatatgaa caaatgtata gagttaatat aagaacattc 360
tcaaaattat tacatcacta tataggtgaa ttcaaagaaa gagatagagg tgcattcata 420
acaataggat ctttatcagg atggacatca ttaccattct gtgcagaata tgcagcagaa 480
aaagcttata tgatgacagt aacagaagga gttgcttacg aatgtgcaaa tactaatgtt 540
gacgtaatgc ttttatcagc gggttcaaca atcacaccta cttggttaaa aaataaacca 600
tcagatccta aggcggttgc agcagcaatg tatccagaag atgttataaa agatggattt 660
gaacaattag gaaagaaatt tacttattta gctggagagt taaatagaga aaaaatgaag 720
gaaaataatg caatggatag aaatgattta attgcaaaac taggaaaaat gtttgatcac 780
atggcaggag gaggaggatc tggaggagga ggatctggag gaggaggatc tggtgttaaa 840
gaaagcctgg tttaactcga g 861
<210> 4
<211> 867
<212> DNA
<213> Ruminococcus gnavus strain N53
<400> 4
catatgacat tgagagaaaa atatggagaa tggggaatta ttttaggcgc tactgaaggt 60
gtcggaaaag cattttgtga aaggcttgcc aaagaaggta tgaatgtcgt aatggtcgga 120
cgccgtgaag aaaaattaaa agagctcggt gaggaactaa aaaacactta tgagattgat 180
tataaagtcg taaaagcaga cttttcgctg ccagatgcta ctgacaaaat ttttgctgca 240
acagaaaatc tggatatggg atttatggcc tatgtagcct gcttacactc ttttggcaaa 300
atccaggata caccttggga aaagcatgag gcaatgatca acgtaaacgt tgttacattt 360
atgaaatgct tctatcacta tatgaaaatc tttgctgcac aggatcgcgg tgctgtcatc 420
aacgtatctt ctatgactgg aatttccagt tcaccatgga atggccaata tggtgcagga 480
aaggcattca ttttaaaaat gacagaggct gttgcctgtg aaacggaaaa gaccaatgtt 540
gatgtggaag tcatcacttt gggaactact ctgacaccaa gtcttttaag caacctgcct 600
ggcggaccac agggggaagc tgttatgaag actgctcaaa caccggaaga agttgtggac 660
gaagcttttg aaaaattagg aaaagaactg tctgtcattt ccggagagcg taataaagcc 720
agcgtccatg actggaaagc gaatcataca gaagatgact atatccgcta tatgggatct 780
ttctatcaag aaggaggagg aggatctgga ggaggaggat ctggaggagg aggatctggt 840
gttaaagaaa gcctggttta actcgag 867
Claims (5)
1.一种采用工程菌发酵生产人工熊胆粉的方法，其特征在于：
工程菌直接发酵转化法，包括带有密码子优化的7α-HSDH和7β-HSDH基因工程菌的培养、底物的转化及产物制备；所述工程菌为同时表达7α-HSDH和7β-HSDH基因的大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)BL21star(DE3)；所述底物为家禽胆汁制品。
2.根据权利要求1的一种采用工程菌发酵生产人工熊胆粉的方法，其特征在于：
7α-HSDH和7β-HSDH分别为7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶；
两个7α-HSDH分别来源于:撒丁岛梭菌(Clostridium sardiniense strain DSM599，GenBank登录号：JN191345.1)和大肠杆菌(Escherichia coli strain TW14359，GenBank登录号：CU928163.2)，
两个7β-HSDH基因分别来源于:撒丁岛梭菌(Clostridium sardiniense strainDSM599，GenBank登录号：JN191345.1)和活泼瘤胃球菌(Ruminococcus gnavus strainN53，GenBank登录号：KF052988.1)，
分别采用http://www.jcat.de/在线软件以大肠杆菌为宿主菌，根据密码子偏好性，对全基因序列进行密码子优化，并进行全基因合成，分别记为α1、α2、β1、β2。
3.根据权利要求1的一种采用工程菌发酵生产人工熊胆粉的方法其特征在于：包括如下具体步骤：
a)双基因表达载体构建
①两个7α-HSDH和两个7β-HSDH分别进行密码子优化，并进行全基因合成，分别记为α1、α2、β1、β2；
②合成的四个基因各自双酶切并分别连接入pETM6载体，得pETM6-α1、pETM6-α2、pETM6-β1、pETM6-β2；
③将pETM6-α1、pETM6-α2、pETM6-β1、pETM6-β2分别进行酶切连接，得到pETM6-α1β1、pETM6-α1β2、pETM6-α2β1、pETM6-α2β2。
b)多基因表达载体构建
在pETM6-α1β1、pETM6-α1β2、pETM6-α2β1、pETM6-α2β2重组载体的基础上，分别酶切重组载体和pETM6-β1、pETM6-β2，再次连接β基因，得到pETM6-α1β1β1、pETM6-α1β1β2、pETM6-α1β2β2、pETM6-α2β1β1、pETM6-α2β1β2、pETM6-α2β2β2；
c)工程菌的构建
①将pETM6-α1β1、pETM6-α1β2、pETM6-α2β1、pETM6-α2β2分别转入大肠杆菌BL21star感受态细胞，得到四个带有双基因表达载体的工程菌
E.coli BL21star-pETM6-α1β1、
E.coli BL21star-pETM6-α1β2、
E.coli BL21star-pETM6-α2β1、
E.coli BL21star-pETM6-α2β2；
pETM6空载体转入大肠杆菌，得到E.coli BL21star-pETM6，作为载体对照工程菌；
②将pETM6-α1β1β1、pETM6-α1β1β2、pETM6-α1β2β2、pETM6-α2β1β1、pETM6-α2β1β2、pETM6-α2β2β2分别转入大肠杆菌BL21star感受态细胞，得到六个带有多基因表达载体的工程菌
E.coli BL21star-pETM6-α1β1β1、
E.coli BL21star-pETM6-α1β1β2、
E.coli BL21star-pETM6-α1β1β2、
E.coli BL21star-pETM6-α2β1β1、
E.coli BL21star-pETM6-α2β1β2、
E.coli BL21star-pETM6-α2β2β2；
d)工程菌的培养
①将工程菌接种到LB固体平板培养基中活化，于20～40℃活化培养9～36小时；
所述的LB固体培养基的组成如下：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂糖15.0g/L。
②从LB固体平板培养基上挑取单菌落，接种于加有附加50～100mg/L氨苄青霉素LB液体培养基的三角瓶中，在75～225rpm、20～40℃下震荡培养9～24小时；
所述的LB液体培养基的组成如下：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L；
③将上述培养物按1:50比例接种到1XM9液体培养基，在75～225rpm、20～40℃下震荡培养3～6小时至OD600＝0.6～0.8，加入0.1～1mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，继续培养3～5小时；
所述的1XM9液体培养基为：含有6.78g/L的Na2HPO4，3g/L的KH2PO4，0.5g/L的NaCl，1g/L的NH4Cl，2mM MgSO4，0.1mM CaCl2，0.04～20％D-葡萄糖的培养基；
e)底物发酵转化
①配制1XM9-PBS液体培养基，添加50～100mg/L氨苄青霉素、0.1～2mM的IPTG，并加入适量家禽胆汁制品为底物，充分溶解并混匀，0.22μm无菌滤器抽滤除菌，作为发酵培养基；
所述的1XM9-PBS液体培养基为：用pH值为6.5的PBS缓冲液配制的含有6.78g/L的Na2HPO4，3g/L的KH2PO4，0.5g/L的NaCl，1g/L的NH4Cl，2mM MgSO4，0.1mM CaCl2，0.04～20％D-葡萄糖的培养基；
②将d)中工程菌培养物离心，收集菌体，以5～20倍浓缩至发酵培养基中，于75～225rpm、16～37℃下震荡培养1小时～24小时，进行发酵培养；
f)人工熊胆粉制备
①发酵过程结束，收集发酵液，离心或用0.22μm滤器抽滤去除菌体，收集上清液或滤过液。用等体积的正丁醇分三次反复萃取，合并萃取液，减压浓缩挥干正丁醇；
②所得残渣用乙醇溶解后，再次减压浓缩挥干，所得干燥物即为以牛磺熊去氧胆酸为主要成分的人工熊胆粉制品。
4.根据权利要求3所述的一种采用工程菌发酵生产人工熊胆粉的方法，其特征在于：1XM9液体培养基为pH值5.5-8.5的水溶液。
5.根据权利要求3所述的一种采用工程菌发酵生产人工熊胆粉的方法，其特征在于：1XM9-PBS液体培养基为pH值为6.0-7.5的水溶液。
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