CN104136620A - 用于氧化还原辅因子的酶再生的方法 - Google Patents

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Abstract

公开了一种用于一锅法反应中的氧化还原辅因子NAD+/NADH和NADP+/NADPH的酶再生的方法。在该方法中，由于相同反应批次中进行的至少两种另外的酶催化氧化还原反应(产物形成反应)，两种氧化还原辅因子中的一种以其还原型获得，且另一种以其氧化型获得。所公开的方法的特征在于：a)在将被还原的辅因子再转化为其初始氧化型的再生反应中，氧气或通式R1C(O)COOH的化合物被还原，且b)在将被氧化的辅因子再转化为其初始还原型的再生反应中，通式为R2CH(OH)R3的化合物被氧化，化合物中的R1、R2和R3具有不同含义。

Description

用于氧化还原辅因子的酶再生的方法
技术领域
本发明涉及一种用于一锅法反应中的氧化还原辅因子NAD+/NADH和NADP+/NADPH的酶再生的方法，其中，由于相同反应批次中进行的至少两种另外的酶催化氧化还原反应(＝产物形成反应)，两种氧化还原辅因子中的一种以其还原型累积，另一种以其氧化型累积。
背景技术
现有技术
酶催化氧化还原反应用于工业操作，例如，制备手性醇类、α-氨基酸类和α-羟基酸类。工业氧化还原反应中使用的大部分酶类使用诸如NADH或NADPH的辅因子。酶氧化还原反应中，由原位辅因子再生体系存储氧化还原辅因子是人们特别感兴趣的。其原因是仅使用催化量的昂贵辅因子(NAD(P)+/NAD(P)H)是可能的。合适的脱氢酶类和其他酶类的可得导致各种辅因子再生体系的开发。
至今为止描述的再生体系可归类为：酶联的(enzyme-linked)、底物联的(substrate-linked)、体内的(活有机体内的天然辅因子再生体系)、光化学的、化学的或电酶的。本处描述的方法涉及一种酶联再生体系。酶联再生体系的优点为高选择性、适用于制备各种产品和辅因子的高再利用率(总转换数，TTN)。
在90年代中期，使用酶联辅因子再生体系的第一种工业方法用在吨级。在该方法中，使用来自博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)的甲酸脱氢酶。现在已知的工业方法通常使用用于产物的合成的氧化还原酶和用于辅因子再生的另外的酶。
产物和用于辅因子再生的两种酶体系的形成中涉及的两种或更多种酶氧化还原反应(同时或依次)的方法在一个反应批次中进行，不必从其中区分被分离的中间产物。最近这样的酶级联反应(本文指一锅法反应)得到特别很大关注，因为其有效减少了运行成本、运行时间和环境影响。此外，氧化还原反应的酶级联有利于通过常规化学方法难以实施的转化。
然而，在一个一锅法反应中同时进行多个反应(氧化和还原)与平行的辅因子再生是具有挑战性的，因为对独立转化通常需要差异很大的反应条件。至今为止，仅进行了非常少量的使用相关联的辅因子再生体系的、包括氧化反应和还原反应的一锅法尝试。
在文献(Advanced Synth.Catal.，2008，第351卷，第9期，第1303-1311页)中，描述了使用7α-羟基类固醇脱氢酶(HSDH)、7β-HSDH和12α-HSDH的一锅法反应的实验。在该方法中，区域选择和立体选择的氧化在胆酸的7位和12位进行，随后区域选择和立体选择的还原在7位进行。在该方法中，使用乳酸脱氢酶(NAD+相关的)和葡萄糖脱氢酶(NADP+相关的)作为辅因子再生体系。丙酮酸盐和葡萄糖用作辅底物。尽管这个方法开始的目的是真实的一锅法方法，最后氧化反应和还原反应独立进行。这样，氧化步骤和还原步骤的分配出现在所谓的“茶包”反应器或膜反应器中。需要该分配以避免由于NADPH-葡萄糖脱氧酶的低辅因子选择性而产生副产物。然而，在一锅法反应中，葡萄糖脱氢酶NADP+部分转化为NAD+，这阻碍了氧化。在描述的方法中，仅12.5mM(～0.5％)的底物胆酸被使用，这从生态学的观点来看使该方法不受关注。
此外，描述了使用一锅法体系通过潜手性酮作为中间产物进行仲醇的消旋体的去消旋化的尝试(J.Am.Chem.Soc.，2008，第130卷，第13969-13972页)。仲醇类的去消旋化通过具有不同辅因子特异性的两种醇脱氢酶(S-特异性的和R-特异性的)达到。在该体系中，NADP通过NADPH氧化酶再生(过氧化氢制备)且NADH通过甲酸脱氢酶再生。使用甲酸盐和氧作为辅底物。在这样的体系中，使用4种酶，不划分氧化步骤和还原步骤。该方法的缺点为使用的底物的非常低的浓度0.2-0.5％，这不适合用于工业目的。
另一种一锅法体系描述在WO 2009/121785 A2中。在该方法中，将光活性的仲醇的异构体氧化为酮且随后还原为对应的旋光对映体，其中使用具有相反的立体选择性和不同的辅因子特异性的两种醇脱氢酶。通过所谓的“氢化物转移体系”仅使用一种另外的酶将辅因子再生。对于再生辅因子，使用各种酶类，诸如甲酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶、乳酸脱氢酶。该方法的缺点是使用的底物的浓度低。
现在已知的涉及辅因子再生体系的酶一锅法方法的缺点全部为非常低的底物浓度，这对工业过程是无效率的。
与此相反，其中使用辅因子再生体系的很多独立酶氧化还原反应已经是已知的。描述了使用微生物、细胞裂解物或独立酶类的实验，同时NAD(P)H或NAD(P)+再生。用于独立的氧化还原反应的已知酶辅因子再生体系包括，例如用于NADH的甲酸脱氢酶(甲酸盐作为辅底物)、用于NADH的来自假单胞菌属(Pseudomonas sp.)的醇脱氢酶(2-丙醇作为辅底物)、用于NADH和NADPH的脱氢酶(H2作为辅底物)、用于NADPH的来自肠膜明串珠菌(L.mesenteroides)的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(葡萄糖-6-磷酸盐作为辅底物)、用于NADH和NADPH的葡萄糖脱氢酶(葡萄糖作为辅底物)、用于NADH的NADH氧化酶(O2作为辅底物)和用于NADH的亚磷酸脱氢酶(亚磷酸盐作为辅底物)。
这样的独立的氧化还原反应的使用的例子为以适当的潜手性酮类化合物制备手性羟基化合物。在该方法中，辅因子通过另外的酶再生。这些方法的共同点是其构成了单独的还原反应且再生了NAD(P)H(参见例如EP 1 152 054)。
已经描述了在更高底物浓度(约＞1％)下进行的、使用与辅因子再生体系结合的羟基类固醇脱氢酶类的酶方法(EP l 731618；WO 2007/118644；Appl.Microbiol.Biotechnol.，2011，第90卷，第127-135页)。在该方法中，辅因子NAD(P)H或NAD(P)通过不同酶类(诸如，例如乳酸脱氢酶(丙酮酸盐作为辅底物)、来自布氏热厌氧杆菌(T.brockii)的醇脱氢酶(异丙醇作为辅底物)、来自短乳酸杆菌(L.brevis)、小型利什曼原虫(L.minor)、檬酸明串珠菌(Leuconostoc carnosum)、嗜热厌氧乙醇菌(T.ethanolicus)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)的醇脱氢酶)再生。然而，这些已知的方法仅涉及将单独的单个反应用于氧化羟基化合物或用于还原氧代化合物。
已经描述了使用苹果酸脱氢酶(苹果酸盐酶)的、用于NADH的辅因子再生体系(Can.J.Chem.Eng.1992，第70卷，第306-312页)。在该申请的公开内容中，其用于通过丙氨酸脱氢酶使丙酮酸盐还原胺化。辅因子再生过程中出现的丙酮酸盐随后用于产物形成反应。
在WO 2004/022764中，同样描述了通过苹果酸脱氢酶再生NADH。与前面描述的申请所公开的不同，没有另外使用苹果酸盐的氧化脱羧过程中出现的丙酮酸盐。
已经描述了涉及辅因子再生体系将D-木糖酶还原为木糖醇的例子(FEBS J.，2005，第272卷，第3816-3827页)。使用来自假单胞菌属的亚磷酸脱氢酶的NADPH相关的突变型作为辅因子再生酶。这也是用于形成产物的单个反应。
已经描述了富手性对映异构体的有机化合物(例如醇类或氨基酸类)的酶制备的另外例子(Organic Letters，2003，第5卷，第3649-3650页；US 7,163,815；Biochem.Eng.J.，2008，第39(2)卷，第319-327页；EP 1 285 962)。在该体系中，使用来自短乳酸杆菌或旧金山乳酸杆菌(Lactobacillus sanfranciscensis)的NAD(P)H相关的氧化酶作为辅因子再生酶。这些试验同样组成了用于形成产物的单个反应。
在WO 201I/000693中，描述了17β-羟基类固醇脱氢酶以及能够在4-雄甾烯-3，17-二酮的17位处进行氧化还原反应的方法。同样，这也为单独的还原反应。以上提到的独立进行的氧化反应或还原反应缺少一锅法反应的优点，诸如，例如由于节省时间和材料而节约成本以及由于酶级联反应的更好转换率。
发明内容
方法的目的和描述
本发明的目的是提供一种用于再生氧化还原辅因子NAD+/NADH和/或(例如，和)NADP+/NADPH以由其在一个反应批次中以经济的方式进行两种或更多种酶催化氧化还原反应的方法。
根据本发明，该目的以原来提到的方法来达到，其中提供了用于一锅法反应中的氧化还原辅因子NAD+/NADH和/或(例如，和)NADP+/NADPH的酶再生的方法，其中，由于在相同反应批次中进行至少两种另外的酶催化氧化还原反应(产物形成反应)，两种氧化还原辅因子中的一种以其还原型累积且另一种以其氧化型累积，该方法的特征在于：
a)在将被还原的辅因子再转化为其初始氧化型的再生反应中，氧气或以下通式的化合物被还原：
其中R1表示直链或支链(C1-C4)-烷基基团或(C1-C4)-羧基烷基基团，且
b)在将被氧化的辅因子再转化为其初始还原型的再生反应中，(C4-C8)-环烷醇或以下通式的化合物被氧化：
其中R2和R3独立地选自由H、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烯基、芳基、羧基或(C1-C4)羧基烷基、特别是环烷基构成的组，其中所述烷基为直链或支链烷基，所述烯基为直链或支链烯基且包括一至三个双键，所述芳基特别是C6-C12芳基，所述环烷基例如为C3-C8环烷基。
根据本发明提供的方法在本申请中也称为“根据本发明的方法”。
在另一方面，本发明提供了根据本发明的用于一锅法反应中的氧化还原辅因子NAD+/NADH和/或(例如和)NADP+/NADPH的酶再生的方法，其中，由于在相同反应批次中进行至少两种另外的酶催化氧化还原反应(等于产物形成反应)，两种氧化还原辅因子中的一种以其还原型累积，且另一种以其氧化型累积，该方法的特征在于：
a)在被氧化的辅因子的再生过程中，以下通式的化合物被还原：
其中R1表示取代或未取代的C1-C4烷基基团，且
b)在被还原的辅因子的再生过程中，以下通式的化合物被氧化：
其中R2和R3相互独立地选自由下列构成的组：
1)-H，
2)-(C1-C6)烷基，其中所述烷基为直链或支链烷基，
3)-(C1-C6)烯基，其中所述烯基为直链或支链烯基且任选地包括最多三个双键，
4)-环烷基，特别是C3-C8环烷基，
5)-芳基，特别是C6-C12芳基，
6)-(C1-C4)羧基烷基，在式I的化合物为丙酮酸盐的情况下，任选地为羧基。
在另一方面，根据本发明的方法中，R2和R3分别独立地选自由H、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烯基、芳基、羧基或(C1-C4)羧基烷基构成的组，其中所述烷基为直链或支链烷基，所述烯基为直链或支链烯基且包括一至三个双键，所述芳基特别是C6-C12芳基。
与现有技术相比，根据本发明的方法对其中化合物被酶氧化和酶还原的方法构成了很大改进，因为其能够在一个反应批次中进行需要的氧化反应和还原反应以及用于辅因子再生的相关联反应，同时，使用比根据现有技术的底物浓度明显更高的底物浓度。
在根据本发明的方法中，使用辅因子NADH和/或NADPH。其中，NAD+表示烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的氧化型且NADH表示烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的还原型，而NADP+表示烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的氧化型且NADPH表示烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的还原型。
不是辅因子再生的一部分且在根据本发明的方法中包括在产物的形成中的酶催化氧化还原反应，本申请中称为“氧化反应”和“还原反应”。“氧化反应”和“还原反应”以术语“产物形成反应”概括。根据本发明的方法中的产物形成反应总是包括至少一种氧化反应和至少一种还原反应。
如果使用NAD+作为氧化反应的辅因子，NADPH为用于还原反应的辅因子。如果使用NADP+作为用于氧化反应的辅因子，NADH为用于还原反应的辅因子。
在根据本发明的方法中，氧化反应和还原反应可以以按时间顺序平行或按时间顺序连续地、优选按时间顺序平行地在相同的反应批次中进行。
目的是形成产物而使用的化合物在本申请中称为底物。辅因子再生过程中反应的化合物在本申请中称为辅底物。
在根据本发明的方法中，可以使用一种底物以及多种底物。这样，还原反应和/或氧化反应可发生在相同的底物(分子主链)和不同的底物、优选相同的底物上。另外，在根据本发明的方法中，还原反应和/或氧化反应可发生在相同或不同的官能团上。
根据本发明的方法适合用于多种反应，例如，用于通过氧化为对应的酮且随后还原为立体特异性相反的羟基化合物转化立体异构羟基化合物的构型。
产物和用于辅因子再生的两种酶体系的形成中涉及的两种或更多酶氧化还原反应在一个反应批次中进行而没有分离中间产物的方法在本申请中称为“一锅法反应”。
酸和酸的盐的陈述在本申请中包括各个没有提到的术语。同样，酸类(特别是胆酸类)的陈述在本申请中包括由其衍生的所有酯类。另外，(部分)拥有保护基的化合物包括在潜在的物质的陈述中。
在本发明的优选实施例中，根据本发明的方法的特征在于，氧化反应和还原反应按时间顺序平行地进行。
在本发明的优选实施例中，根据本发明的方法的特征在于，氧化反应和还原反应都在相同的分子主链上发生。
在本发明的优选实施例中，根据本发明的方法的特征在于，使用通过乳酸脱氢酶被还原为乳酸盐的丙酮酸盐(辅底物)作为式I的化合物(2-氧代酸)，这表示，在将被还原的辅因子再转化为其初始氧化型的再生反应中，通过乳酸脱氢酶将丙酮酸盐还原为乳酸盐。
在本发明的优选实施例中，根据本发明的方法的特征在于，使用通过醇脱氢酶被氧化为丙酮的2-丙醇(异丙醇，IPA)(辅底物)作为式II的化合物(仲醇)，这表示，在将被氧化的辅因子再转化为其初始还原型的再生反应中，通过醇脱氢酶将2-丙醇氧化为丙酮。
在本发明的优选实施例中，根据本发明的方法的特征在于，使用通过NADH氧化酶被还原的氧气。
在本发明的优选实施例中，根据本发明的方法的特征在于，使用通过丁酮二酸盐脱羧的苹果酸脱氢酶(苹果酸盐酶)被氧化为丙酮酸盐和CO2的苹果酸盐(辅底物)作为仲醇，例如在将被氧化的辅因子在转化为其初始还原型的再生反应中，通过苹果酸脱氢酶将苹果酸盐氧化为丙酮酸盐和CO2。
在该实施例中，使新生的丙酮酸盐在不用于形成产物但是构成第二辅因子再生反应的另一种氧化还原反应中反应。
在本发明的优选实施例中，根据本发明的方法的特征在于，该方法用于在相同反应批次中分别进行以下通式的化合物的至少一种氧化反应和至少一种还原反应：
其中
R4表示氢、甲基基团、羟基基团或氧代基团，
R5表示氢、羟基基团、氧代基团或甲基基团，
R6表示氢或羟基基团，
R7表示氢、-COR13、取代的或未取代的C1-C4羧基烷基基团，其中R13为未取代或被羟基基团取代的C1-C4烷基基团，所述取代的C1-C4羧基烷基基团特别为被羟基基团取代的C1-C4羧基烷基基团，
或R6与R7一起表示氧代基团，
R8表示氢、甲基基团、羟基基团或氧代基团，
R9表示氢、甲基基团、羟基基团或氧代基团，
R10表示氢、甲基基团或卤素，
R11表示氢、甲基基团、羟基基团、氧代基团或卤素，和
R12表示氢、羟基基团、氧代基团或甲基基团，
其中结构元素
表示苯环或包括6个碳原子和0、1或2个C-C双键的环；其中反应批次中提供的用于产物的形成中涉及的还原反应的底物的浓度＜5％(重量/体积)。
在本发明的优选实施例中，根据本发明的方法的特征在于，发生了式VII的脱氢表雄酮(DHEA)至式VIII的睾酮的酶转化：
在本发明的优选实施例中，根据本发明的方法的特征在于，发生了例如使用两种立体特异性相反的羟基类固醇脱氢，通过酶氧化为式V的酮基石胆酸(KLC)和还原为式VI的3α，7β-二羟基-5β-胆甾烷酸(熊去氧胆酸，UDC)的式IV的羟基类固醇化合物3α，7α-二羟基-5β-胆甾烷酸(鹅去氧胆酸，CDC)的酶差向异构化：
在本发明的优选实施例中，根据本发明的方法的特征在于，该方法用于例如，使用3种立体特异性羟基类固醇脱氢酶(所述3种立体特异性羟基类固醇脱氢酶中的两种具有相反的立体特异性)通过下列步骤的式IX的3α，7α，12α-三羟基-5β-胆甾烷酸(胆甾烷酸)的酶差向异构化
A)通过氧化以获得式X的3α，7α-二羟基-12-氧代-5β-胆甾烷酸(12-氧代-CDC)
所述式X的3α，7α-二羟基-12-氧代-5β-胆甾烷酸(12-氧代-CDC)进一步反应以获得式XI的3α-羟基-7，12-二氧代-5β-胆甾烷酸(12氧代-KLC)
且随后还原为式XII的立体异构羟基化合物3α，7β-二羟基-12-氧代-5β-胆甾烷酸(12-酮基-熊去氧胆酸)
或
B)通过氧化以获得式XIII的3α，12α-二羟基-7-氧代-5β-胆甾烷酸
接下来通过酶氧化以获得式XI的所述3α-羟基-7，12-二氧代-5β-胆甾烷酸(12氧代-KLC)，且随后通过还原以获得式XII的所述立体异构羟基化合物3α，7β-二羟基-12-氧代-5β-胆甾烷酸(12-酮基-熊去氧胆酸)，
或
C)通过氧化以获得式XIII的3α，12α-二羟基-7-氧代-5β-胆甾烷酸，接下来通过酶还原以获得式XIV的3α，7β，12α-三羟基-5β-胆甾烷酸
且随后通过氧化以获得式XII的所述立体异构羟基化合物3α，7β-二羟基-12-氧代-5β-胆甾烷酸(12-酮基-熊去氧胆酸)；
或
A)、B)和/或C)的任意组合。
在本发明的优选实施例中，根据本发明的方法的特征在于，使用C5-糖类或C6-糖类作为底物，例如，该方法用于C5-糖类或C6-糖类的异构化。
在本发明的优选实施例中，根据本发明的方法的特征在于，葡萄糖的异构化通过还原为山梨糖醇和氧化为果糖来发生，例如，该方法用于通过还原为山梨糖醇且随后氧化为果糖使葡萄糖异构化。
根据本发明的方法优选在含水体系中进行，其中可能的是用于氧化和还原反应的底物部分地以形式为悬浮液和/或作为第二液相的未溶解的状态提供。
在特定实施例中，根据本发明的方法的特征在于，反应批次中提供的用于产物的形成中涉及的氧化反应的底物的浓度为至少5％(重量/体积)或更高、优选7％(重量/体积)或更高、特别优选9％(重量/体积)或更高，例如在5％(重量/体积)至20％(重量/体积)范围内、诸如在5％(重量/体积)至15％(重量/体积)范围内、例如在5％(重量/体积)至12％(重量/体积)范围内、诸如在5％(重量/体积)至10％(重量/体积)范围内。
在特定实施例中，根据本发明的方法的特征在于，产物形成反应中整体上达到≥70％、特别是≥90％的转换率。
在根据本发明的方法中，可将缓冲液加入含水体系。合适的缓冲液为，例如pH在5至10范围内、优选在6至9范围内的磷酸钾、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)和甘氨酸。另外或可选地，可将用于稳定酶类的离子(诸如Mg2+)或其他添加剂(诸如甘油)加入体系。在根据本发明的方法中，加入的辅因子NAD(P)+和NAD(P)H的浓度通常在0.001mM与10mM之间、优选在0.01mM与1mM之间。
取决于使用的酶类，根据本发明的方法可在10℃至70℃范围内、优选在20℃至45℃范围内的温度下进行。
羟基类固醇脱氢酶类(HSDH)应当理解为催化了类固醇骨架上羟基基团至对应酮基基团的氧化或相反地酮基基团至对应羟基基团的还原的酶类。
可用于羟基类固醇类的氧化还原反应的适当羟基类固醇脱氢酶类为，例如3α-HSDH、3β-HSDH、7α-HSDH、7β-HSDH或17β-HSDH。
可从，例如梭状芽胞杆菌(不同梭菌(Clostridium absonum)、索氏梭菌(Clostridiumsordelii))、大肠杆菌(E.coli)或脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)获得具有7α-HSDH活性的适当的酶类。
可从，例如瘤胃球菌(Ruminococcus sp.)或不同梭菌，获得具有7β-HSDH活性的适当的酶类。
可从，例如穴兔(Oryctolagus cuniculus)，获得适当的乳酸脱氢酶类。
可从，例如高加索酸奶乳杆菌(Lactobacillus kefir)，获得适当的醇脱氢酶类。
可从，例如热带念珠菌(Candida tropicalis)，获得适当的木糖还原酶。
可从，例如绵羊肝、枯草杆菌(Bacillus subtilis)或苹果(Malus domestica)，获得适当的山梨糖醇脱氢酶类。
可从，例如肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、变异链球菌(Streptococcus mutans)、氨基戊酸梭菌(Clostridium aminovalericum)，获得适当的NADH氧化酶。
在根据本发明的方法中，酶类优选地用作大肠杆菌中重组地过度表达的蛋白质类，其中优选继续使用对应的细胞裂解物而不进行任何另外的纯化。由此，酶的单位1U对应于每min反应1μmol的底物需要的酶的量。
附图说明
图1示出了通过中间产物3α-羟基-7氧代-5β-胆甾烷酸将鹅去氧胆酸差向异构化为熊去氧胆酸的反应方案，其中使用2-丙醇和丙酮酸盐进行辅因子再生。
图2示出了通过中间产物3α-羟基-7氧代-5β-胆甾烷酸将鹅去氧胆酸差向异构化为熊去氧胆酸的反应方案，其中使用苹果酸盐和丙酮酸盐进行辅因子再生。
图3示出了通过中间产物3α-羟基-7氧代-5β-胆甾烷酸将鹅去氧胆酸差向异构化为熊去氧胆酸的反应方案，其中使用2-丙醇和氧气进行辅因子再生。
图4示出了将葡萄糖异构化为果糖的反应方案，其中使用2-丙醇和丙酮酸盐进行辅因子再生。
图5示出了将葡萄糖异构化为果糖的反应方案，其中使用2-丙醇和氧气进行辅因子再生。
图6示出了通过中间产物3α，7β-二羟基-12-氧代-5β-胆甾烷酸和3α-羟基-7，12-二氧代-5β-胆甾烷酸将胆甾烷酸差向异构化为3α，7β-二羟基-12-氧代-5β-胆甾烷酸的反应方案，其中使用2-丙醇和丙酮酸盐进行辅因子再生。
图7示出了通过中间产物3α，7β-二羟基-12-氧代-5β-胆甾烷酸和3α-羟基-7，12-二氧代-5β-胆甾烷酸将胆甾烷酸差向异构化为3α，7β-二羟基-12-氧代-5β-胆甾烷酸的反应方案，其中使用2-丙醇和氧气进行辅因子再生。
图8和图9示出了通过中间产物3α，7α-二羟基-12-氧代-5β-胆甾烷酸和3α-羟基-7，12-二氧代-5β-胆甾烷酸将胆甾烷酸差向异构化为3α，7β-二羟基-12-氧代-5β-胆甾烷酸的反应方案，其中使用2-丙醇、丙酮酸盐和氧气进行辅因子再生。
图10示出了通过不同中间产物和辅因子再生体系将胆甾烷酸差向异构化为3α，7β-二羟基-12-氧代-5β-胆甾烷酸的反应方案。为了再生NAD+，可选地使用乳酸脱氢酶(丙酮酸盐作为底物)和NADH氧化酶(氧作为底物)。对于NADPH的再生，使用醇脱氢酶(异丙醇作为底物)。
图11示出了通过中间产物3α-羟基-7氧代-5β-胆甾烷酸(7-酮基石胆酸＝7K-LCA＝KLC)将鹅去氧胆酸差向异构化为熊去氧胆酸的反应方案，其中使用2-丙醇和2-戊醇(每种情况下醇脱氢酶)以及丙酮酸盐(乳酸脱氢酶)和氧(NADH氧化酶)进行辅因子再生。
图中使用了以下缩写：
BsSDH          来自枯草杆菌的山梨糖醇脱氢酶
CA        ＝   3α，7α，12α-三羟基-5β-胆甾烷酸
7β-CA    ＝   3α，7β，12α，-三羟基-5β-胆甾烷酸
Caoxo          氨基戊酸梭菌NADH氧化酶
CDC，CDCA      3α，7α-二羟基-5β-胆甾烷酸
CtXR           热带念珠菌木糖还原酶
7α-HSDH       7α-羟基类固醇脱氢酶
7β-HSDH       7β-羟基类固醇脱氢酶
12α-HSDH ＝   12α-羟基类固醇脱氢酶
KLC            3α-羟基-7-氧代-5β-胆甾烷酸
7K-LCA    ＝   3α-羟基-7-氧代-5β-胆甾烷酸
LacDH          NAD(H)-相关的乳酸脱氢酶
LkADH          NADP(H)-相关的高加索酸奶乳杆菌醇脱氢酶
Lmoxid    ＝   肠膜明串珠菌NADH-氧化酶
MalDH          NADP(H)-相关的大肠杆菌苹果酸脱氢酶
7oxo-CA   ＝   3α，12α-二羟基-7-氧代-5β-胆甾烷酸
12oxo-CDC ＝   3α，7α-二羟基-12-氧代-5β-胆甾烷酸
12oxo-KLC ＝   3α-羟基-7，12-二氧代-5β-胆甾烷酸
12oxo-UDC ＝   3α，7β-二羟基-12-氧代-5β-胆甾烷酸
SISDH          羊肝山梨糖醇脱氢酶
SmOxo          变异链球菌NADH氧化酶
UDC.UDCA       3α，7β-二羟基-5β-胆甾烷酸
具体实施方式
在以下示例中，所有温度数据以摄氏度(℃)给出。使用以下缩写：
EtOAc      乙酸乙酯
h          小时
IPA        异丙基醇(2-丙醇)
MeOH       甲醇
Rt         室温
示例1
使用乳酸脱氢酶和醇脱氢酶相关的辅因子再生体系、通过7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶将鹅去氧胆酸差向异构化为熊去氧胆酸
0.5ml原料(charge)含有50mg鹅去氧胆酸、12U来自大肠杆菌的重组7α-羟基类固醇脱氢酶、6U来自扭链瘤胃球菌的重组7β-羟基类固醇脱氢酶以及0.5mM NAD+和0.3mMNADPH。为了再生NAD+，使用6U重组乳酸脱氢酶和350mM丙酮酸钠。为了再生NADPH，使用6U来自高加索酸奶乳杆菌的重组醇脱氢酶和初始的2.4％IPA(重量/体积)。使反应在连续摇动(850rpm)下在25℃的含水磷酸钾缓冲液(100mM，pH＝7.8)中进行。继续使用敞开的体系以促进丙酮的蒸发和反应向熊去氧胆酸的移动。6h之后将1.6％(重量/体积)IPA、16h之后将2.4％(重量/体积)IPA另外配入，24h之后将3.9％(重量/体积)IPA另外配入，且40h之后将0.8％(重量/体积)IPA另外配入。此外，24h之后将20μl的4-甲基-2-戊醇加入。46h之后将200μl的2-戊醇以及1.6％(重量/体积)IPA加入。48h之后，反应混合物中所有胆酸中熊去氧胆酸的比例＞97％。
示例2
使用乳酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶相关的辅因子再生体系、通过7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶将鹅去氧胆酸差向异构化为熊去氧胆酸
0.5ml原料含有50mg鹅去氧胆酸、20U来自大肠杆菌的重组7α-羟基类固醇脱氢酶、20U来自扭链瘤胃球菌的重组7β-羟基类固醇脱氢酶以及1mM NAD+和1mM NADPH。为了再生NAD+，使用10U乳酸脱氢酶(Sigma-Aldrich)，且为了开始反应，使用16.5mM丙酮酸钠。为了再生NADPH，使用20U来自大肠杆菌的重组苹果酸脱氢酶和320mM苹果酸钠。使反应在连续摇动(850rpm)下在25℃的含水磷酸钾缓冲液(100mM，pH＝7.8)中进行。继续使用敞开的体系以允许产生的CO2逸出。16h之后和40h之后另外配入20U的7α-HSDH以及10U的乳酸脱氢酶。20h、24h、44h和48h之后另外配入10U的7β-HSDH。另外，40h之后另外配入10U苹果酸脱氢酶。72h之后，反应混合物中所有胆酸中的熊去氧胆酸的比例为约90％。
示例3
使用NADH氧化酶和醇脱氢酶相关的辅因子再生体系，通过7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶将鹅去氧胆酸差向异构化为熊去氧胆酸
0.5ml原料含有50mg鹅去氧胆酸、12U来自大肠杆菌的重组7α-羟基类固醇脱氢酶、7.5U来自扭链瘤胃球菌的重组7β-羟基类固醇脱氢酶以及1mM NAD+和1mM NADPH。为了再生NAD+，使用20U来自氨基戊酸梭菌的重组NADH氧化酶。为了再生NADPH，使用5U来自高加索酸奶乳杆菌的重组醇脱氢酶和初始的2％IPA(重量/体积)。使反应在连续摇动(850rpm)下在25℃的含水磷酸钾缓冲液(100mM，pH＝6)中进行。继续使用敞开的体系以促进丙酮的挥发和反应向熊去氧胆酸的移动。18h、22h、26h和41h之后将2％IPA另外配入，且41h之后和48h之后将5％IPA另外配入。24h之后将20U的NADH氧化酶另外配入，且41h之后将7.5U的7β-羟基类固醇脱氢酶以及5U醇脱氢酶另外配入。48h之后，反应混合物中所有胆酸中的熊去氧胆酸的比例为约95-98％。
示例4
胆酸类的再处理和分析
示例1至3中描述的反应结束时，用EtOAc萃取反应混合物。随后，通过蒸发除去溶剂。将蒸发残留物溶解在MeOH∶乙腈∶磷酸钠缓冲液pH＝3，0.78g/l(40∶30∶37)的混合物中且通过HPLC监控鹅去氧胆酸至熊去氧胆酸的转化。由此，使用均来自Agilent TechnologiesInc.的反相分离塔( XDB C18，流速0.8ml/mm)和光折射检测器(RID)，Agilent1260
示例5
使用用于再循环NADPH的醇脱氢酶和用于再循环NAD+的乳酸脱氢酶、通过木糖还原酶和山梨糖醇脱氢酶将葡萄糖转化为果糖
0.5ml原料含有50mg/ml葡萄糖和6U/ml来自热带念珠菌(大肠杆菌BL21(DE3)中过度表达的)的重组木糖还原酶和0.1mM NADP+。为了再生辅因子，加入7％IPA和来自高加索酸奶乳杆菌(大肠杆菌BL21(DE3)中过度表达的)的重组醇脱氢酶。酶类以细胞裂解物的形式使用。使反应在连续摇动(900rpm)下在敞开的体系中在40℃且pH＝9(50mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液)下进行24h。敞开的体系导致丙酮的除去，这驱动反应趋向形成山梨糖醇。在敞开的体系中，水和IPA也蒸发了，使得6h和21h之后另外配入水和IPA。由此，总是调节为0.5ml的总体积以及7％(体积/体积)的IPA浓度。24h之后，将反应容器在真空中在60℃下孵育以使酶类去活和蒸发有机溶剂。冷却至室温之后，将最终浓度为5U/ml的来自枯草杆菌(大肠杆菌BL21(DE3)中过度表达的)的重组山梨糖醇脱氢酶、最终浓度为1mM的ZnCl2和最终浓度为O.1mM的NAD+加入。为了再生辅因子，使用5U/ml(最终浓度)来自兔子肌肉的乳酸脱氢酶(Sigma Aldrich)和300mM丙酮酸盐。加水达到0.5ml。反应在连续摇动(900rpm)下在封闭体系中在40℃下进行另外24h。达到＞90％的D-葡萄糖至D-果糖的转化率。
示例6
使用用于再循环NADPH的醇脱氢酶和用于再循环NAD+的NADH氧化酶、通过木糖还原酶和山梨糖醇脱氢酶将葡萄糖转化为果糖
0.5ml原料含有50mg/ml葡萄糖、6U/ml来自热带念珠菌(大肠杆菌BL21(DE3)中过度表达的)重组木糖还原酶和O.1mM NADP+。为了再生辅因子，加入7％(体积/体积)IPA和来自高加索酸奶乳杆菌(大肠杆菌BL21(DE3)中过度表达的)的重组醇脱氢酶。酶类以细胞裂解物的形式使用。使反应在连续摇动(900rpm)下在敞开的体系中在40℃且pH＝8下(50mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液)进行24h。敞开的体系导致丙酮的除去，这驱动反应趋向形成山梨糖醇。在敞开的体系中，水和IPA也蒸发了，使得6h和21h之后另外配入水和IPA。由此，总是调节为0.5ml的总体积以及7％(体积/体积)的IPA浓度。24h之后，将反应容器在真空中在60℃下孵育以使酶类去活和蒸发IPA以及已经形成的任何丙酮。冷却至室温之后，将最终浓度为5U/ml的来自枯草杆菌(大肠杆菌BL21(DE3)中过度表达的)的重组D-山梨糖醇脱氢酶、最终浓度为1mM的CaCl2和最终浓度为0.1mM的NAD+和NADH的混合物加入。为了再生辅因子，使用10U/ml(最终浓度)来自肠膜明串珠菌(大肠杆菌BL21(DE3)中过度表达的)的NADH氧化酶。酶类以细胞裂解物的形式使用。用水使原料达到0.5ml。使反应在连续摇动(900rpm)下在敞开体系中在40℃下进行24h，以保证来自空气的、用于NADH氧化酶的充足的氧气供应。在40℃的敞开体系中，水蒸发。因此，6h和21h之后，用水使容器注满0.5ml。达到约98％的D-葡萄糖至D-果糖的转化率。
示例7
糖类的再处理和分析
将原料在65℃下孵育10min，用于使酶类去活，随后离心。然后将上清液用0.2μM PVDF过滤器过滤且用配体交换HPLC(Agilent Technologies Inc.)分析。这样，糖类与多元醇类通过具有80℃的、0.5ml/min水流(VWR International GmbH，HPLC级的)的Showa Denko K.K.铅塔(Sugar SP0810)分离。检测在光折射检测器(RID，Agilem 1260AgilentTechnologies Inc.)的辅助下进行。使用Agilent Technologies Inc.的在线过滤器和作为前置柱的阴离子交换柱(Axpak-WAG)、反相柱( ODP-506E)和ShowaDenko K.K.的糖前置柱。
示例8
使用乳酸脱氢酶和醇脱氢酶相关的辅因子再生体系，通过12α-羟基类固醇脱氢酶、7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶将胆甾烷酸生物转化为3α，7β-二羟基-12-氧代-5β-胆甾烷酸
0.5ml原料含有25mg胆甾烷酸、12.5U来自迟缓埃格特菌(Eggertella lenta)或球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericu)的重组12α-羟基类固醇脱氢酶、16U来自大肠杆菌的重组7α-羟基类固醇脱氢酶、6U来自扭链瘤胃球菌的重组7β-羟基类固醇脱氢酶、以及1mM NAD+和1mM NADPH。为了再生NAD+，使用12.5U来自穴兔(肌肉亚型)的重组乳酸脱氢酶和200mM丙酮酸钠。为了再生NADPH，使用5U来自高加索酸奶乳杆菌的重组醇脱氢酶和初始的2％IPA(重量/体积)。使反应在连续摇动(850rpm)下在25℃的含水磷酸钾缓冲液(100mM，pH7.8)中进行。另外使用敞开系统以允许丙酮挥发和反应向3α，7β-二羟基-12-氧代-5β-胆甾烷酸移动。18h和24h之后，另外配入2％IPA(重量/体积)。48h之后，使用的胆甾烷酸的61％反应为3α，7α-二羟基-12-氧代-5β-胆甾烷酸。
示例9
使用乳酸脱氢酶、NADH-氧化酶和醇脱氢酶相关的辅因子再生体系，通过12α-羟基类固醇脱氢酶、7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶将胆甾烷酸生物转化为3α，7β-二羟基-12-氧代-5β-胆甾烷酸
0.5ml原料含有25mg胆甾烷酸、12.5U来自迟缓埃格特菌或球形赖氨酸芽孢杆菌的重组12α-羟基类固醇脱氢酶、16U来自大肠杆菌的重组7α-羟基类固醇脱氢酶、6U来自扭链瘤胃球菌的重组7β-羟基类固醇脱氢酶、以及1mM NAD+和1mM NADPH。为了再生NAD+，使用5U来自肠膜明串珠菌的重组NADH氧化酶和12.5U来自穴兔(肌肉亚型)的重组乳酸脱氢酶和200mM丙酮酸钠。为了再生NADPH，使用5U来自高加索酸奶乳杆菌的重组醇脱氢酶和初始的2％IPA(重量/体积)。使反应在连续摇动(850rpm)下在25℃的含水磷酸钾缓冲液(100mM，pH7.8)中进行。另外使用敞开体系以允许丙酮蒸发和反应向3α，7β-二羟基-12-氧代-5β-胆甾烷酸移动。18h和24h之后，将2％IPA(重量/体积)另外配入。48 h之后，使用的胆甾烷酸的70％反应为3α，7α-二羟基-12-氧代-5β-胆甾烷酸。
示例10
使用乳酸脱氢酶和醇脱氢酶相关的辅因子再生体系，使用7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶将鹅去氧胆酸差向异构化为熊去氧胆酸。加入氯化锰(MnCl2)的优点
0.5ml原料含有50mg鹅去氧胆酸、12U来自大肠杆菌的重组7α-羟基类固醇脱氢酶、6U来自扭链瘤胃球菌的重组7β-羟基类固醇脱氢酶、以及0.5mM NAD+和0.3mM NADPH。为了再生NAD+，使用6U重组乳酸脱氢酶和350mM丙酮酸钠。为了再生NADPH，使用6U来自高加索酸奶乳杆菌的重组醇脱氢酶和初始的2.4％IPA(重量/体积)。使反应在连续摇动(850rpm)下在25℃的含有5mM MnCl2的含水磷酸钾缓冲液(100mM，pH＝7.8)中进行。另外使用敞开的体系以允许丙酮蒸发和反应向熊去氧胆酸移动。6h之后将1.6％(重量/体积)IPA另外配入，16h之后将2.4％(重量/体积)IPA另外配入，且24h之后将3.9％(重量/体积)IPA另外配入。36h之后，将200μl的2-戊醇以及3％(重量/体积)IPA加入，且48h之后将100μl的2-戊醇和4％(重量/体积)IPA另外配入。64h之后，反应混合物中所有胆酸中的熊去氧胆酸的比例＞99％。特别地，鹅去氧胆酸的比例为约0.3％。不加入MnCl2的对照原料中，鹅去氧胆酸的比例为约2％且熊去氧胆酸的比例为约97.5％(每个都是来自5个试验的平均值)。
示例11
使用醇脱氢酶相关的辅因子再生体系以及组合的乳酸脱氢酶和NADH氧化酶相关的辅因子再生体系，通过7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶将将鹅去氧胆酸差向异构化为熊去氧胆酸
0.5ml原料含有50mg鹅去氧胆酸、12U来自大肠杆菌的重组7α-羟基类固醇脱氢酶、6U来自扭链瘤胃球菌的重组7β-羟基类固醇脱氢酶、以及0.5mM NAD+和0.3mM NADPH。为了再生NAD+，使用6U重组乳酸脱氢酶和350mM丙酮酸钠。为了再生NAD+，除了9U来自肠膜明串珠菌的重组NADH氧化酶，还使用6U来自氨基戊酸梭菌的重组NADH氧化酶。为了再生NADPH，使用6U来自高加索酸奶乳杆菌的重组醇脱氢酶和初始的2.4％(重量/体积)IPA。使反应在连续摇动(850rpm)下在25℃的含水磷酸钾缓冲液(100mM，pH＝7.8)中进行。另外使用敞开的体系以允许丙酮挥发和使反应向熊去氧胆酸移动。6h之后将1.6％(重量/体积)IPA另外配入，16h之后将2.4％(重量/体积)IPA另外配入，且24h之后将3.9％(重量/体积)IPA另外配入。36h之后将200μl的2-戊醇以及3％(重量/体积)IPA加入，且48h之后将100μl的2-戊醇和4％(重量/体积)IPA另外配入。64h之后，反应混合物中所有胆酸中的熊去氧胆酸的比例＞99％。特别地，鹅去氧胆酸的比例为约0.2％。在没有加入NADH-氧化酶的对照原料中，鹅去氧胆酸的比例为约2％且熊去氧胆酸的比例为约97.5％(与示例11中的对照原料相同；每个都是来自5个实验的平均值)。
示例12
使用醇脱氢酶相关的辅因子再生体系以及组合的乳酸脱氢酶和NADH氧化酶相关的辅因子再生体系，通过7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶将鹅去氧胆酸差向异构化为熊去氧胆酸。2-戊醇和2-丙醇的另外作用
50ml原料含有5g鹅去氧胆酸、24U/ml来自大肠杆菌的重组7α-羟基类固醇脱氧酶、12U/ml来自扭链瘤胃球菌的重组7β-羟基类固醇脱氢酶以及0.5mM NAD+和0.3mMNADPH。为了再生NAD+，使用12U/ml重组乳酸脱氢酶和350mM丙酮酸钠。为了再生NAD+，另外使用18U/ml来自肠膜明串珠菌的重组NADH氧化酶以及12U/ml来自氨基戊酸梭菌的重组NADH氧化酶。为了再生NADPH，使用12U/ml来自高加索酸奶乳杆菌的重组醇脱氢酶和初始的1.5％(重量/体积)IPA。使反应在25℃的含有5mM MnCl2的含水磷酸钾缓冲液(100mM，pH＝7.8)中进行。将其在具有KPG-搅拌器的三颈烧瓶(3-neck-piston)中以约100rpm搅拌。来自反应的丙酮的移除通过经过反应容器的气流(约400-600ml/min)来实现。由于2-丙醇同时也被蒸发，例如以下量的另外配入是需要的：0.75ml(1，5h)、0.75ml(3h)、0.5ml(4h)、0.75ml(6h)、0.75ml(8h)、0.5ml(11h)、0.5ml(14h)、0.5ml(17h)、0.5ml(21h)、1ml(23h)、2.5ml(25h)、4ml(29h)。约30h之后另外加入20ml的2-戊醇和2ml 2-丙醇。整个反应时间过去46h之后，7-酮基石胆酸的比例是约1％(与鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸和7-酮基石胆酸的和相关)。加入另外的2-丙醇：3ml(46h)、4ml(52h)、4ml(54h)，以及此外加入10ml的2-戊醇。总反应时间过去72h之后，7-酮基石胆酸的比例可低至小于0.2％。熊去氧胆酸的比例为＞99％。
示例13
胆酸类的后处理和分析
示例8至12中描述的反应结束之后，试验中存在的胆酸类可通过示例4中描述的方法来分析。

Claims (15)

1.一种用于一锅法反应中的氧化还原辅因子NAD+/NADH和/或，特别是和，NADP+/NADPH的酶再生的方法，其中，由于相同反应批次中进行的至少两种另外的酶催化氧化还原反应(产物形成反应)，所述两种氧化还原辅因子中的一种以其还原型累积，且另一种以其氧化型累积，其特征在于：
a)在将被还原的辅因子再转化为其初始氧化型的再生反应中，氧气或以下通式的化合物被还原：
其中R1表示直链或支链(C1-C4)-烷基基团或(C1-C4)-羧基烷基基团，和
b)在将被氧化的辅因子再转化为其初始还原型的再生反应中，(C4-C8)-环烷醇或以下通式的化合物被氧化：
其中R2和R3独立地选自由H、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烯基、芳基、羧基或(C1-C4)羧基烷基、特别是环烷基构成的组，其中所述烷基为直链或支链烷基，所述烯基为直链或支链烯基且包括一至三个双键，所述芳基特别是C6-C12芳基，所述环烷基例如为C3-C8环烷基。
2.根据权利要求1所述的用于一锅法反应中的氧化还原辅因子NAD+/NADH和/或，特别是和，NADP+/NADPH的酶再生的方法，其中由于相同反应批次中进行的至少两种另外的酶催化氧化还原反应(＝产物形成反应)，所述两种氧化还原辅因子中的一种以其还原型累积，且另一种以其氧化型累积，其特征在于：
a)在被氧化的辅因子的再生过程中，以下通式的化合物被还原：
其中R1表示取代或未取代的C1-C4烷基基团，和
b)在被还原的辅因子的再生过程中，以下通式的化合物被氧化：
其中R2和R3相互独立地选自由下列构成的组：
1)-H，
2)-(C1-C6)烷基，其中所述烷基为直链或支链烷基，
3)-(C1-C6)烯基，其中所述烯基为直链或支链烯基且任选地包括最多三个双键，
4)-环烷基，特别是C3-C8环烷基，
5)-芳基，特别是C6-C12芳基，
6)-(C1-C4)羧基烷基，在式I的化合物为丙酮酸盐的情况下，任选为羧基。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中R2和R3相互独立地选自由H、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烯基、芳基、羧基或(C1-C4)羧基烷基构成的组，其中所述烷基为直链或支链烷基，所述烯基为直链或支链烯基且包括一至三个双键，所述芳基特别是C6-C12芳基。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述氧化反应和所述还原反应在相同的底物(分子主链)上发生。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述氧化反应和所述还原反应按时间顺序平行地进行。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，在将被氧化的辅因子再转化为其初始还原型的再生反应中，通过醇脱氢酶将2-丙醇氧化为丙酮。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，在将被还原的辅因予再转化为其初始氧化型的再生反应中，通过乳酸脱氢酶将丙酮酸盐还原为乳酸盐。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在将被氧化的辅因子再转化为其初始还原型的再生反应中，通过苹果酸脱氢酶将苹果酸盐氧化为丙酮酸盐和CO2。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法用于在相同反应批次中分别进行以下通式的化合物的至少一种氧化反应和至少一种还原反应：
其中
R4表示氢、甲基基团、羟基基团或氧代基团，
R5表示氢、羟基基团、氧代基团或甲基基团，
R6表示氢或羟基基团，
R7表示氢、-COR13、取代的或未取代的C1-C4羧基烷基基团，其中R13为未取代或被羟基基团取代的C1-C4烷基基团，所述取代的C1-C4羧基烷基基团特别为被羟基基团取代的C1-C4羧基烷基基团，
或R6与R7一起表示氧代基团，
R8表示氢、甲基基团、羟基基团或氧代基团，
R9表示氢、甲基基团、羟基基团或氧代基团，
R10表示氢、甲基基团或卤素，
R11表示氢、甲基基团、羟基基团、氧代基团或卤素，和
R12表示氢、羟基基团、氧代基团或甲基基团，
其中结构元素
表示苯环或包括6个碳原子和0、1或2个C-C双键的环；特别是其中反应批次中提供的用于产物的形成中涉及的还原反应的底物的浓度＜5％(重量/体积)。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法用于将式VII的脱氢表雄酮(DHEA)转化为式VIII的睾酮
11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法用于使用两种立体特异性相反的羟基类固醇脱氢酶、通过氧化为式V的酮基石胆酸且随后还原为式VI的立体特异性羟基化合物3α，7β-二羟基-5β-胆甾烷酸(熊去氧胆酸)而使式IV的3α，7α-二羟基-5β-胆甾烷酸(鹅去氧胆酸)酶差向异构化：
特别是由此氧化反应由来自大肠杆菌的7α-羟基类固醇脱氢酶催化和/或还原反应由来自扭链瘤胃球菌Ruminococcus torques的7β-羟基类固醇脱氢酶催化。
12.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法用于使用其中两种具有相反的立体特异性的3种立体特异性羟基类固醇脱氢酶、通过下列使式IX的3α，7α，12α-三羟基-5β-胆甾烷酸(胆甾烷酸)酶差向异构化：
A)通过氧化以获得式X的3α，7α-二羟基-12-氧代-5β-胆甾烷酸(12-氧代-CDC)
使所述式X的3α，7α-二羟基-12-氧代-5β-胆甾烷酸(12-氧代-CDC)进一步反应以获得式XI的3α-羟基-7，12-二氧代-5β-胆甾烷酸(12氧代-KLC)
且随后还原为式XII的立体异构羟基化合物3α，7β-二羟基-12-氧代-5β-胆甾烷酸(12-酮基-熊去氧胆酸)
或
B)通过氧化以获得式XIII的3α，12α-二羟基-7-氧代-5β-胆甾烷酸
接下来通过酶氧化以获得式XI的所述3α-羟基-7，12-二氧代-5β-胆甾烷酸(12氧代-KLC)，且随后通过还原以获得式XII的所述立体异构羟基化合物3α，7β-二羟基-12-氧代-5β-胆甾烷酸(12-酮基-熊去氧胆酸)，
或
C)通过氧化以获得式XIII的3α，12α-二羟基-7-氧代-5β-胆甾烷酸，接下来通过酶还原以获得式XIV的3α，7β，12α-三羟基-5β-胆甾烷酸
且随后通过氧化以获得式XII的所述立体异构羟基化合物3α，7β-二羟基-12-氧代-5β-胆甾烷酸(12-酮基-熊去氧胆酸)。
13.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法用于C5-或C6-糖类的异构化，特别是用于通过还原为山梨糖醇且随后氧化为果糖的葡萄糖的异构化。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其特征在于，所述反应批次中提供的用于产物的形成中涉及的氧化反应的底物的浓度为至少5％(重量/体积)和更高、特别是7％(重量/体积)和更高、特别是9％(重量/体积)和更高。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其特征在于，所述产物形成反应中整体上达到≥70％、特别是≥90％的转换率。
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