CN101421413A - 用羟基类固醇脱氢酶通过还原氧代类固醇化合物或者氧化羟基类固醇化合物制备类固醇衍生物的方法 - Google Patents

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Abstract

一种对映体选择性酶促还原类固醇结构之化合物(ABCD)的方法，所述类固醇结构之化合物在环结构中包含一个或多个杂原子，一个或多个双键和/或一个芳香环，并且在类固醇环系的3，7，11，12或17位或者在类固醇骨架任何碳基团的α位至少有一个桥氧基(＝氧代类固醇化合物/羟基类固醇化合物)，其中在存在NADH或者NADPH作为辅因子的条件下，所述氧代类固醇化合物用羟基类固醇脱氢酶还原，其特征在于：a)氧代类固醇化合物在反应混合物中的浓度为＞50g/l，b)通过氧化通式为RXRYCHOH的二级醇，其中RX，RY彼此独立是氢、支链或者无支链C1－C8烷基，且C总数≥3，或者通过氧化C4－C6－环烷醇，持续性地再生由羟基类固醇脱氢酶形成的氧化辅因子NAD或者NADP，和c)另外的氧化还原酶/醇脱氢酶用于氧化通式为RXRYCHOH的二级醇或者环烷醇。

Description

用羟基类固醇脱氢酶通过还原氧代类固醇化合物或者氧化羟基类固醇化合物制备类固醇衍生物的方法
本发明涉及一种对映体选择性酶促还原化合物的方法，所述化合物包括类固醇结构(ABCD)，该结构在环结构中包含一个或多个杂原子，一个或多个双键和/或一个芳香环，并且在类固醇环系的3，7，11，12或17位或者在类固醇骨架任何碳基团的α位至少有一个桥氧基(＝氧代类固醇化合物)，其中在存在NADH或者NADPH作为辅因子的条件下，所述氧代类固醇化合物用羟基类固醇脱氢酶还原。
本发明还涉及一种氧化化合物的方法，所述化合物包括类固醇结构(ABCD)，该结构在环结构中包含一个或多个杂原子，一个或多个双键和/或一个芳香环，并且在类固醇环系的3，7，11，12或17位或者在类固醇骨架任何碳基团的α位至少有一个羟基(＝羟基类固醇化合物)，其中在存在NAD或者NADP作为辅因子的条件下，所述羟基类固醇化合物用羟基类固醇脱氢酶氧化。
类固醇是有胆固醇的环结构，且随双键的数量、功能基团的种类、数量和位置、甲基、烷基侧链的数量以及键之构型而不同的化合物。类固醇化合物存在于动物以及真菌(Pilzen)和植物中，并且有多种生物学作用，例如可作为雄性和雌性激素，肾上腺激素、维生素、胆汁酸(Gallensaeuren)、类固醇皂苷元(Steroidsapogenine)，作为心脏活性物质和作为蟾蜍毒素。
下面氧代类固醇化合物理解为前述定义的类固醇，也就是说，其中它们至少有一个酮功能团，所述酮功能团可包含在环系上或者在类固醇框架的侧链上。
下面羟基类固醇化合物理解为前述定义的类固醇，也就是说，其中它们至少有一个羟基功能团，所述羟基功能团可在环系上或者在类固醇框架的侧链上。
由于类固醇的很多生理学作用，人们认为类固醇化合物及其更大量的衍生物可用作医学中治疗有效的物质和药物。
例如发现世界上已广泛使用孕激素和雌激素衍生物用于避孕；雄激素(睾酮)例如在治疗前列腺癌时被用作促蛋白合成甾类和抗雄激素。糖皮质激素(可的松、氢化可的松、强的松龙和强的松)及其衍生物，由于其抗炎、抗过敏和免疫抑制作用而被广泛用于皮肤病、风湿性疾病、过敏反映、肾病、胃肠疾病以及许多其他疾病的治疗中。
生物活性类固醇化合物的市场很大。生物转化对于生产具有不同作用的不同类固醇衍生物起很大的作用。特别是由羟化酶和脱氢酶催化的反应很重要。在此起重要作用的是δ-1-脱氢反应、11β-还原、20β-还原、17β-还原，在3和7位的立体选择性还原，另外，还有羟基，特别是3、7、12和17位羟基的氧化作用。
迄今为止，只有用完整的细胞实现了对类固醇的工业生物还原，但物质浓度远低于10g/l。产生这种情况的原因是，生物转化所需的酶迄今尚未被表征或者表达出来，另外，没有令人满意的技术手段，一方面，类固醇在水介质中的溶解度小，另一方面，需要再生足够量的辅因子NADH和NADPH。
迄今为止，类固醇的氧化是用工业化学方法完成的。
从1975-1988年，G.Carrea就实质上描述了用分离的酶进行对映体选择还原类固醇的方法(Eur.J.Biochemistry 44，1974 p.401-405；Biotechnology andBioengineering，Vol 17，1975，p.1101-1108；Enzyme Microb.Technol.Vol 6，July，1984，p.307-311；Biotechnology and Bioengineering，Vol 26，1984，p.560-563；J.Org.Chem.51，1986，p.2902-2906；J.Org.Chem.58，1993，p.499-501；J.Org.Chem.53，1988，p.88-92；Enzyme Microb.Technol.，Vol 10，June，p.333-339；Archives of Biochemistry and Biophysics，159，1973，p.7-10)。
为此，需要使用不同的羟基类固醇脱氢酶(HSHD)，其中，实质上通过乳酸脱氢酶、甲酸脱氢酶或者来自酵母的醇脱氢酶连接可以实现辅因子NADH的再生。用葡萄糖脱氢酶实现NADP的再生。用乙酸乙酯和乙酸丁酯作为有机相的两相体系解决溶解度低的问题。在两相体系中的分离的酶会以远低于10g/l的浓度实施反应，其中所达到的“总转变数”(TTN＝mol还原的氧代类固醇化合物/mol所用的辅因子)同样远在1000以下，所述方法与全细胞方法相比，没有实质上的经济优势。
通过进一步努力，通过结合氧化和还原反应，7α羟基转化成7β羟基。这可以通过7αHSDH和7βHSDH的结合来实现(Pedrini et al.，Steroids 71(2006)p189-198)。但是，在该方法中，浓度也是远低于10g/l，且所达到的“总转变数”(TTN＝mol还原的氧代类固醇化合物/mol所用的辅因子)同样在100以下，该方法也是相对不经济的。
本发明的目的是为了克服上述缺陷和困难并以此为己任，发明了一种方法：在较高浓度下，以较高的转变能力，和较高的辅因子TTN并因此以经济的方式可以完成氧代类固醇化合物或者羟基类固醇化合物的对映体选择还原或者氧化反应。
就开始提及类型的方法而言，所述任务是通过下述方法完成的：
a)氧代类固醇化合物在反应混合物中的浓度≥50g/l，
b)通过氧化通式为RXRYCHOH的二级醇，或者通过氧化C4-C6环烷醇持续性地再生由羟基类固醇脱氢酶形成的氧化辅因子NAD或者NADP，其中RX，RY彼此独立是氢、支链或者无支链C1-C8烷基，且C总数≥3，和
c)另外的氧化还原酶/醇脱氢酶用于氧化通式为RXRYCHOH的二级醇或者环烷醇。
就开始提及类型的方法而言，上述任务还可以通过另一种方法完成：
a)羟基类固醇化合物在反应混合物中的浓度≥50g/l，
b)通过还原通式为RXRYCO的酮化合物，或者通过还原C4-C6环烷酮，持续性地再生由羟基类固醇脱氢酶形成的氧化辅因子NADH或者NADPH，其中RX，RY彼此独立是氢、支链或者无支链C1-C8烷基，且C总数≥3，和
c)另外的氧化还原酶/醇脱氢酶用于还原通式为RXRYCO的酮或者环烷酮。
本发明描述了明显改进现有技术有关类固醇结构中对映体选择性酶促还原和氧化反应的方法。本发明可以用大大高于现有技术所述浓度的自由酶，将氧代类固醇化合物还原或者氧化成相应的羟基-或者氧代类固醇。
在本发明方法中使用了辅因子NADH或者NADPH。在所述概念中，“NADP”是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，“NADPH”是还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸。“NAD”是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，“NADH”是还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。
按照优选的实施方案，本发明方法的特征在于，使用下列通式I的氧代类固醇化合物：
其中，
R1是氢、甲基、羟基或者桥氧基(Oxogruppe)；
R2是氢、甲基、羟基或者桥氧基；
R3是氢、羟基、桥氧基或者甲基；
R4是氢或者羟基；
R5是氢，-COR10，其中，R10是未取代的或者用羟基取代的C1-C4烷基，或者取代的或者未取代的C1-C4羧烷基；
或者R4和R5一起表示桥氧基；
R6是氢、甲基、羟基或者桥氧基；
R7是氢、甲基、羟基或者桥氧基；
R8是氢、甲基或者卤素；和
R9是氢、甲基、羟基或者桥氧基或者卤素；
其中R1、R2、R4+R5、R6、R8或者R9至少之一是氧桥基，或者R5是-COR10，且下列结构式：
Figure A200780012874D00112
是苯环或者有0、1或2个C-C双键的C6环。
按照本发明的优选技术方案，本发明发明特征在于，使用有下列通式I的羟基类固醇化合物：
Figure A200780012874D00121
其中
R1是氢、甲基、羟基或者桥氧基；
R2是氢、甲基、桥氧基或者羟基；
R3是氢、羟基、桥氧基或者甲基；
R4是氢或者羟基；
R5是氢，-COR10，其中，R10是未取代的或者用羟基取代的C1-C4烷基，或者取代的或者未取代的C1-C4羧烷基；
或者R4和R5一起表示桥氧基；
R6是氢、甲基、桥氧基或者羟基；
R7是氢、甲基、桥氧基或者羟基；
R8是氢、甲基或者卤素；和
R9是氢、甲基、羟基、桥氧基或者卤素；
其中R1、R2、R4、R6、R7、R8或者R9至少之一是羟基，且下列结构式：
Figure A200780012874D00122
是苯环或者有0、1或2个C-C双键的C6环。
优选是用2-丙醇、2-丁醇、2-戊醇、4-甲基-2-戊醇、2-己醇、2-庚醇、5-甲基-2-己醇或者2-辛醇作为通式RXRYCHOH的二级醇，和用环己醇作为环烷醇。
优选是用2-丁酮、2-戊酮、4-甲基-2-戊酮、2-己酮、2-庚酮、5-甲基-2-己酮或者2-辛酮作为通式RXRYCO的酮，和用环己酮作为环烷酮。
下面，将通式为RXRYCO的酮或C4-C6环烷酮与通式为RXRYCHOH的二级醇或C4-C6环烷醇概述为总的术语共底物(Cosubstrat)。
优选本发明的方法在含水的有机两相体系中完成。这里合适地，用于辅酶再生的共底物不能与水混合，并因此形成含水的有机两相体系中的有机相。
进一步的实施方案是在本发明方法中还使用不参与辅因子再生的有机溶剂，例如乙醚、叔-丁甲醚、二异丙醚、二丁醚、乙酸乙酯、乙酸丁酯、庚烷、己烷或者环己烷。
进一步优选本发明方法的TTN≥103。
此外，优选地，在2-96小时内，至少50％所用的氧代类固醇化合物或者羟基类固醇化合物，被还原成相应的羟基类固醇化合物或者被氧化成氧代类固醇化合物。
本发明方法优选的实施方案的特征在于，用例如酮石胆酸(Ketolithocholsaeure)(式II)、地塞米松(式III)、4-雄甾烯-3，17-二酮(式IV)、1，4-雄甾二烯-3，17-二酮(式V)、雌酮(式VI)、孕烯醇酮(式VII)和可的松(式VIII)作为氧代类固醇化合物。
进一步说，本发明优选的实施方案的特征在于，用例如胆汁酸的不同衍生物，如胆酸、鹅脱氧胆酸、12-氧代胆酸、3-羟基-12-氧代胆酸、酮石胆酸、石胆酸(lithocholsaeure)或者氢化可的松作为羟基类固醇化合物。
所谓羟基类固醇脱氢酶，通常理解为这样一种酶，即该酶能够催化类固醇结构中酮基还原成羟基，或者羟基氧化成相应酮基的反应。这里，所述氧化或者还原反应可以在类固醇自身的环系统中(例如7-α羟基类固醇-脱氢酶)或者也可在类固醇基本结构的碳上(例如20-β羟基类固醇脱氢酶)发生。
用于氧代类固醇化合物还原反应的适宜的羟基类固醇脱氢酶是例如3-α羟基类固醇脱氢酶(HSDH)、3βHSDH、12αHSDH、20βHSDH、7αHSDH、7βHSDH、17βHSDH和11βHSDH。
一种适宜的3-α羟基类固醇脱氢酶例如得自睾丸酮假单胞菌(Pseudomonastestosteroni)(J.Biol.Chem.276(13)，9961-9970(2001))，并可以用于3-α-羟基类固醇的氧化反应或者3-酮类固醇，象例如3-酮-胆汁酸、孕烯醇酮、4-雄甾烯-3，17-二酮、5-α-雄甾烷-3，17-二酮等的还原反应。
具有3-β-羟基类固醇脱氢酶活性的适宜的酶可以例如得自无害梭菌(Clostridium innocuum)(Applied and Environmental Microbiology，June 1989，p.1656-1659)或者得自睾丸酮假单胞菌，并可以用于3-β-羟基类固醇的氧化反应或者3-酮类固醇，象例如3-酮-胆汁酸、孕烯醇酮、4-雄烯-3，17-二酮、5-α-雄甾烷-3，17-二酮等的还原反应。
12αHSDH例如得自梭菌(Clostridien)(Eur.J.Biochem.196(1991)439-450)，并可以用于12α羟基类固醇(例如胆酸)的氧化反应，或者12-酮类固醇，例如象12-酮胆汁酸(12-酮鹅脱氧胆酸、脱氢胆酸)的还原反应。同样具有12β羟基类固醇脱氢酶活性的酶也来自梭菌(Biochim.Biophys.Acta 1988 Oct.14；962(3)：362-370)。
具有20-β羟基类固醇脱氢酶活性的酶例如得自链霉菌属的生物(TheJournal of Biological Chemistry，1977，Vol.252 Nol，Jan10，205-211)，并可以用于可的松和氢化可的松衍生物(可的松、氢化可的松、11-脱氧皮甾醇、黄体酮)生成相应20-β-羟基类固醇的还原反应(例如20-β羟基黄体酮)。
具有20-α-羟基类固醇脱氢酶活性的相应酶例如得自梭菌，特别是得自闪烁梭菌(Clostridium scindens)(Journal of Bacteriology，June 1989，p.2925-2932)，以及得自梨形四膜虫(Tetrahymena Pyriformis)(Biochem.J.(1994)297，195-200)的相应酶。
特别地，适宜的7-α羟基类固醇脱氢酶是来自肠内微生物区系的生物，例如来自梭菌(不同梭菌、肠内微生物区系氏梭菌)(Journal of Bacteriology，Aug.1994，p.4865-4874)，来自大肠杆菌(Journal of Bacteriology，Apr.，1991，p.2173-2179)，来自脆弱拟杆菌(Current Microbiology，Vol47(2003)475-484)，布鲁氏菌属、真杆菌属，并可以用于7-α-羟基类固醇(鹅石胆酸(Chenolithochlosaeure))的氧化反应，或者7-酮类固醇，例如象7-酮-胆汁酸(酮石胆酸)的还原反应。
具有7-β-羟基类固醇脱氢酶活性的相应酶同样得自梭菌，瘤胃球菌科的微生物(J.Biochemistry 102，1987，p.613-619)，或者得自消化链球菌属(Biochimicaand Biophysica Acta 1004，1989，p.230-238)，得自产气真杆菌(Applied andEnvironmental Microbiology，May 1982，p.1057-1063)和嗜麦芽假单胞菌(Pedriniet al.，Steroids 71(2006)p.189-198)。通过7-βHSDH可以从酮石胆酸产生乌索脱氧胆酸。
已知17-β羟基类固醇脱氢酶来自真菌，如Cylindrocarpon radicola(J.Biochemistry 103，1988，1039-1044)和Cochliobolus lunatus(J.Steroid Biochem.Molec.Biol.Vol.59，1996，No.2，p.205-214)，来自链霉菌科的细菌(Hoppe-Seyler’sZ.Physiol.Chem.，Bd.356，1975，1843-1852)，假单胞菌(The Journal of BiologicalChemistry，Vol.252 No.11，June 10，1977，p.3775-3783)和产碱菌属(Alcaligenes)(The Journal of Biological Chemistry，Vol.260，No.25，Nov.5，1985，p.13648-13655)。
17-β羟基类固醇脱氢酶例如可用于17-β羟基类固醇的氧化反应，或者17-酮类固醇，如4-雄甾烯-3，17-二酮、雄酮(Androsteron)、雌酮(Estron)的还原反应。
具有17α羟基类固醇脱氢酶活性的相应酶是来自真杆菌属(Journal of LipidResearch，Vol.35，1994，p.922-929)。
11-β羟基类固醇脱氢酶已知来自高等哺乳动物，并能够例如用于将氢化可的松氧化成可的松。
然而在催化类固醇结构的氧化或者还原反应中，还可以用任何其他氧化还原酶作为羟基类固醇脱氢酶。
用于NADH或者NAD再生的合适的二级醇脱氢酶例如当使用来自睾丸酮假单胞菌的17-β羟基类固醇脱氢酶、来自无害梭菌的3-β羟基类固醇脱氢酶或者来自脆弱拟杆菌的7-α羟基类固醇脱氢酶时是例如上面描述的那些，并且分离自念珠菌属和Pichia的酵母中分离，如来自Candida parapsilosis的羰基还原酶(CPCR)(US 5,523,223和US5,763,236；Enzyme Microb.Technol.1993 Nov；15(11)：950-8)，Pichia capsulata(DE 10327454.4)，Pichia farinosa(A 1261/2005，K.Cl2N)，Pichia finlandica(EP 1179595 A1)，Candida nemodendra(A 1261/2005，Kl.Cl2N)，Pichia trehalophila(A 1261/2005，Kl.Cl2N)，Rhodotorula mucilaginosa(A 1261/2005，Kl.Cl2N)，Lodderomyces elongisporus(A 1261/2005，Kl.Cl2N)和Pichia stipidis(A 1261/2005，Kl.Cl2N)。
另外，所述二级醇脱氢酶/氧化还原酶也可以完成NADH的再生，所述二级醇脱氢酶/氧化还原酶如所述并且分离自放线菌科的细菌，例如红城红球菌(US5523223)、Norcardia fusca(Biosci.Biotechnol.Biochem.，63(10)(1999)，p.1721-1729；Appl.Microbiol.Biotechnol.2003 Sep；62(4)：380-6，Epub 2003Apr.26)、赤红球菌(J.Org.Chem.2003 Jan 24；8(2)：402-6)或者微杆菌属(A1261/2005，Kl.Cl2N)。
用于NADPH或者NADP再生的合适的二级醇脱氢酶/氧化还原酶，例如在用来自累腐败梭菌的12-α羟基类固醇脱氢酶、来自真杆菌属的17-α羟基类固醇脱氢酶，或者来自索氏梭菌的7-α羟基类固醇脱氢酶时，是如所述并分离自下列微生物的所述酶：乳杆菌属(高加索酸奶乳杆菌US5200335)、短乳杆菌(DE19610984A1；Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.2000 Dec；56 Pt 12：1696-8)、稍小乳杆菌(DE 10119274)、肉色明串球菌(A 1261/2005，Kl.Cl2N)，或者如所述来自布氏热厌氧菌、Thermoanerobium ethanolicus或者拜氏梭菌的那些。
两种酶，羟基类固醇脱氢酶和氧化还原酶/醇脱氢酶优选用于在大肠杆菌中重组过表达。在本发明方法中，两种酶，羟基类固醇脱氢酶和醇脱氢酶/氧化还原酶可以以完全纯化地、部分纯化地，或者以含在细胞中的形式使用。所用的细胞可以是天然的、有渗透性的或者溶解形式存在。
每公斤待转化的氧代类固醇化合物或者羟基类固醇化合物使用50000至10Mio U羟基类固醇脱氢酶，以及50000至10Mio U醇脱氢酶(如上所公开的)。
酶单位1U相当于，对于羟基类固醇脱氢酶来说，每分钟(min)转化1μmol氧代类固醇化合物所需的羟基类固醇脱氢酶酶量，或者每分钟(min)氧化1μmol2-醇所需的醇脱氢酶酶量。
类似地，每公斤待转化的氧代类固醇化合物或者羟基类固醇化合物使用约10g至500g含羟基类固醇脱氢酶的大肠杆菌生物湿物质，和10g至500g含醇脱氢酶/氧化还原酶的大肠杆菌生物湿物质(按上文所公开的)。
NAD(P)H的再生用所述的酶偶联方式完成。
在本发明方法中氧代类固醇化合物或者羟基类固醇化合物的转化优选用两相系统完成，所述两相系统含有用于辅因子再生的2-醇或者酮化合物、羟基类固醇脱氢酶、醇脱氢酶、水、辅因子以及氧代类固醇化合物或者羟基类固醇化合物。此外，还含有另外的有机溶剂，所述溶剂不参与辅因子的再生，也就是说，没有通过所用的醇脱氢酶可氧化的羟基或者可还原的酮基而含有。
两相系统中与水不混合的有机组分的含量为占反应混合物总体积量的10％至90％，优选20％至80％。水占反应混合物总体积量的90％至10％，优选80％至20％。
可将pH值为5-10，优选6-9的缓冲液，例如磷酸钙-、Tris/HCl、甘氨酸-或者三乙醇胺-缓冲液加到水中。所述缓冲液还可含有用于稳定或者活化所述两种酶的离子，例如镁离子或者锌离子。
另外本发明方法中还可使用用于稳定羟基类固醇脱氢酶和醇脱氢酶的附加组分，例如甘油、山梨醇、1，4-DL-二硫苏糖醇(DTT)或者二甲基亚砜(DMSO)。
辅因子NAD(P)H的浓度，以水相为基础计算，为0.001mM-10mM，特别地0.01-1.0mM。温度可取决于所用酶具体的特点，为10℃-70℃，优选20℃-35℃。
本发明方法达到的TTN(总转变数＝mol还原的氧代类固醇化合物/mol所用的辅因子)可以为102-105，通常TTN>103。
待还原的氧代类固醇化合物或者羟基类固醇化合物通常难溶于水。在反应过程中，所述底物可以完全或者不完全溶解。若所述底物在反应混合物中不完全溶解，则一部分底物以固体形式存在，因此，可以形成第三固相。在转化过程中，反应混合物可以形成临时的乳液。
本发明方法中，待还原的氧代类固醇化合物或者待氧化的羟基类固醇化合物的量为，以总反应混合物的体积计≥50g/l。优选为50g/l-400g/l氧代类固醇化合物/羟基类固醇化合物，特别优选50g/l-200g/l。
优选的不参与辅因子再生的其他有机溶剂是，例如乙酸乙酯、乙酸丁酯、叔丁基甲级醚、异丙基醚、庚烷、己烷、甲苯、二氯甲烷或者环己烷或者其不同组成的混合物。
通过氧化通式为RXRYCHOH的二级醇或者C4-C6环烷醇完成NAD(P)H的再生。形成通式为RXRYC＝O的酮或者C4-C6环烷酮的反应产物。这里优选二级醇是脂肪族2-醇，例如异丙醇、2-丁醇、2-戊醇、2-己醇、2-庚醇、2-辛醇、4-甲基-2-戊醇、5-甲基-2-己醇，以及环二级醇，例如环己醇、环戊醇。原则上，二醇化合物也是可行的，例如1，4-环己二醇。
通过还原通式为RXRYC＝O的酮或者C4-C6环烷酮完成NAD(P)的再生。形成通式为RXRYCHOH的二级醇或者C4-C6环烷醇的反应产物。优选的酮化合物是酮，例如丙酮、2-丁酮、2-戊酮、2-己酮、2-庚酮、2-辛酮、4-甲基-2-戊酮、5-甲基-2-己酮，以及环酮，例如环己酮、环戊酮。原则上，二酮化合物也是可行的，例如1，4-环己二酮。
本发明方法例如在玻璃或者金属反应容器中完成。这样组分在反应容器中单独转化，同时在例如氮气或者空气下搅拌。根据所用的氧代类固醇化合物计算反应时间，为1小时至96小时，特别是2小时-48小时。在所述反应时间内，至少50％的氧代类固醇化合物被还原城相应的羟基类固醇或者将羟基类固醇氧化城相应的氧代类固醇化合物。
下来实施例将用于进一步说明本发明。
实施例
1.将雄甾烯-3，17-二酮还原成17-β-羟基-4-雄甾烯-3-酮(睾酮)
A)用于辅酶再生的含4-甲基-2-戊醇的两相系统
为了合成17β-羟基-4-雄甾烯-3-酮(睾酮)，向含有0.1mg NAD，30单位来自睾丸酮假单胞菌的重组17-β-羟基类固醇脱氢酶(J.Steroid Biochem.Mol.Biol.44(2)，133-139(1993)，Pubmed P19871)和50单位来自Pichia capsulata(DE-A103 27 454)的重组醇脱氢酶的0.5ml缓冲液(100mM三乙醇胺，pH＝7，1mMMgCl2，10％甘油)中，加入100mg溶于0.4ml 4-甲基-2-戊醇中的雄甾烯-3，17-二酮。将混合物在室温，恒定搅拌下培养24小时。雄甾烯-3，17-二酮在总反应体积中的浓度为大约100g/l。
反应结束后，例如处理反应混合物，其中用有机溶剂提取反应混合物，然后蒸馏除去所述有机溶剂。
24小时后，约94％的所用雄甾烯-3，17-二酮转化成17-β-羟基-4-雄甾烯-3-酮(睾酮)。
用气相色谱跟踪雄甾烯-3，17-二酮向17-β-羟基-4-雄甾烯-3-酮(睾酮)的转化。为此，用带有手性分离柱Lipodex E，12m(Machery-Nagel，Dueren，德国)，Flammen-Ionisations-Detektor和氦作为载气的Shimadzu的气相色谱GC-17A进行检测。
B)带有用于辅酶再生的乙酸丁酯和2-丙醇的两相系统
为了合成17-β-羟基-4-雄甾烯-3-酮(睾酮)，向含有0.1mg NAD，30单位来自睾丸酮假单胞菌的重组17-β-羟基类固醇脱氢酶(J.Steroid Biochem.Mol.Biol.44(2)，133-139(1993)，Pubmed P19871)和50单位来自Pichia capsulata(DE-A103 27 454)的重组醇脱氢酶的0.5ml缓冲液(100mM三乙醇胺，pH＝7，1mMMgCl2，10％甘油)中，加入100mg溶于0.3ml乙酸丁酯和0.1ml 2-丙醇中的雄甾烯-3，17-二酮。将混合物在室温，恒定搅拌下培养24小时。雄甾烯-3，17-二酮在总反应体积中的浓度为大约100g/l。
反应结束后，例如处理反应混合物，其中用有机溶剂提取反应混合物，然后蒸馏除去所述有机溶剂。
24小时后，约90％-95％所用雄甾烯-3，17-二酮转化成17-β-羟基-4-雄甾烯-3-酮(睾酮)。
2.将酮石胆酸还原成鹅石胆酸
A)用来自布氏热厌氧菌的ADH/两相系统完成辅酶再生
为了合成3α-7α-二羟基-5-β-胆酸(鹅石胆酸)，向含0.1mg NADP、10单位来自闪烁梭菌的重组7-α-羟基类固醇脱氢酶(Pubmed AAB61151)和10单位来自布氏热厌氧菌的重组醇脱氢酶的0.2ml缓冲液(100mM磷酸钙缓冲液，pH＝8.5，1mM MgCl2，10％甘油)中加入在0.5ml甲基戊醇中的100mg 3α-羟基-7-氧代-5-β-胆酸(酮石胆酸)。将混合物在室温，恒定搅拌下培养24小时。酮石胆酸在总反应体积中的浓度为大约100g/l。
24小时后，约90-98％的所用酮石胆酸转化成鹅石胆酸。
用HPLC跟踪酮石胆酸向鹅石胆酸的转化。为此，用分离柱EC125/4Nucleodur 100-5 Cl8ec(Machery-Nagel，Dueren，德国，)，MeOH/水(80：20)混合物进行检测。
B)用来自乳酸杆菌的ADH(DE 10119274)/两相系统完成辅酶再生
为了合成3α-7α-二羟基-5-β-胆酸(鹅石胆酸)，例如向含0.1mg NADP、10单位来自闪烁梭菌的重组7-α-羟基类固醇脱氢酶(Pubmed AAB61151)和10单位来自乳酸杆菌的重组醇脱氢酶(DE 10119274)的0.3ml缓冲液(100mM三乙醇胺缓冲液，pH＝7，1mM MgCl2，10％甘油)中加入在0.5ml辛醇中的100mg 3α-羟基-7-氧代-5-β-胆酸(酮石胆酸)。将混合物在室温，恒定搅拌下培养24小时。酮石胆酸在总反应体积中的浓度为大约100g/l。
24小时后，约70-80％的所用酮石胆酸转化成鹅石胆酸。3.将1，4-雄甾二烯-3，17-二酮还原成17-β-羟基-1，4-雄甾二烯-3-酮
为了合成17-β-羟基-1，4-雄甾二烯-3-酮，向含有0.1mg NAD，30单位来自睾丸酮假单胞菌的重组17-β-羟基类固醇脱氢酶(J.Steroid Biochem.Mol.Biol.44(2)，133-139(1993)，Pubmed P19871)和5单位来自Pichia capsulata(DE-A 10327 454)的重组醇脱氢酶的0.5ml缓冲液(100mM三乙醇胺，pH＝7，1mM MgCl2，10％甘油)中，加入100mg溶于0.4ml 4甲基-2-戊醇中的1，4-雄甾二烯-3，17-二酮。将混合物在室温，恒定搅拌下培养24小时。1，4-雄甾二烯-3，17-二酮在总反应体积中的浓度为大约100g/l。
反应结束后，例如反应混合物进行处理，其中有机相进行分离，然后蒸馏除去所述有机溶剂。
24小时后，约90％-98％的所用雄甾烯-3，17-二酮转化成17-β-羟基-1，4-雄甾二烯-3-酮。
用气相色谱跟踪1，4-雄甾二烯-3，17-二酮向17-β-羟基-1，4-雄甾二烯-3-酮的转化。为此，用Perkin Elmer的气相色谱Autosystem XL，配有带FS-毛细管柱Optima-5-MS(Machery-Nagel，Dueren，德国)的质谱仪，以氦作为载气，进行检测。
4.鹅石胆酸氧化成酮石胆酸
A)用来自布氏热厌氧菌的ADH/两相系统完成辅酶再生
为了合成3α-羟基-7-氧代-5-β-胆酸(酮石胆酸)，向0.4ml缓冲液(100mM磷酸钙缓冲液，pH＝8.5，1mM MgCl2，10％甘油)中，加入在0.5ml甲基异丁酮中的100mg 3α-7α-二羟基-5-β-胆酸(鹅石胆酸)，所述缓冲液含0.1mg NADP、10mg大肠杆菌生物湿物质(其中含有来自闪烁梭菌的过表达的7-α-羟基类固醇脱氢酶(Pubmed AAB61151))和5mg大肠杆菌生物湿物质(其中含有来自布氏热厌氧菌的过表达的醇脱氢酶)。将混合物在室温，恒定搅拌下培养24小时。酮石胆酸在总反应体积中的浓度为大约100g/l。
24小时后，80％以上的所用鹅石胆酸转化成酮石胆酸。
用薄层色谱跟踪鹅石胆酸向酮石胆酸的转化
B)用来自乳酸杆菌的ADH(DE 10119274)/两相系统完成辅酶再生
为了合成3α-羟基-7-氧代-5-β-胆酸(酮石胆酸)，向0.15ml缓冲液(100mM磷酸钙缓冲液，pH＝7.5，1mM MgCl2，10％甘油)中，加入在0.7ml甲基异丁酮中的100mg 3α-7α-二羟基-5-β-胆酸(鹅石胆酸)，所述缓冲液含0.1mg NADP、10mg大肠杆菌生物湿物质(其中含有来自闪烁梭菌的过表达的-α-羟基类固醇脱氢酶(Pubmed AAB61151))和5mg大肠杆菌生物湿物质(其中含有来自乳酸杆菌的过表达的醇脱氢酶(DE10119274))。将混合物在室温，恒定搅拌下培养24小时。酮石胆酸在总反应体积中的浓度为大约100g/l。
24小时后，90％以上的所用鹅石胆酸转化成酮石胆酸。

Claims (21)

1、一种对映体选择性酶还原化合物的方法，所述化合物包括类固醇结构(ABCD)，该结构在环结构中包含一个或多个杂原子，一个或多个双键和/或一个芳香环，并且在类固醇环系的3，7，11，12或17位或者在类固醇骨架任何碳基团的α位至少有一个桥氧基(＝氧代类固醇化合物)，
Figure A200780012874C00021
其中在辅因子NADH或者NADPH存在的条件下，用羟基类固醇脱氢酶还原所述氧代类固醇化合物，其特征在于
a)氧代类固醇化合物在反应混合物中的浓度≥50g/l，
b)通过氧化通式为RXRYCHOH的二级醇，或者通过氧化C4-C6环烷醇持续性地再生由羟基类固醇脱氢酶形成的氧化辅因子NAD或者NADP，其中RX，RY彼此独立是氢、支链或者无支链C1-C8烷基，且C总数≥3，和
c)另外的氧化还原酶/醇脱氢酶用于氧化通式为RXRYCHOH的二级醇或者环烷醇。
2、根据权利要求1的方法，其特征在于，是具有下列通式I的化合物用作氧代类固醇化合物：
Figure A200780012874C00022
其中
R1是氢、甲基、羟基或者桥氧基；
R2是氢、甲基、羟基或者桥氧基；
R3是氢、羟基、桥氧基或者甲基；
R4是氢或者羟基；
R5是氢，-COR10，其中，R10是未取代的或者用羟基取代的C1-C4烷基，或者取代的或者未取代的C1-C4羧烷基；
或者R4和R5一起表示桥氧基；
R6是氢、甲基、羟基或者桥氧基；
R7是氢、甲基、羟基或者桥氧基；
R8是氢、甲基或者卤素；和
R9是氢、甲基、羟基、桥氧基或者卤素；
其中R1、R2、R4+R5、R6、R8或者R9至少之一是氧桥基，或者R5是-COR10，且下列结构式：
Figure A200780012874C00031
是苯环或者有0、1或2个C-C双键的C6环。
3、根据权利要求1或者2的方法，其特征在于2-丙醇、2-丁醇、2-戊醇、4-甲基-2-戊醇、2-己醇、2-庚醇、5-甲基-2-己醇或者2-辛醇用作通式为RXRYCHOH的二级醇以及环己醇作为环烷醇。
4、根据权利要求1-3任一项的方法，其特征在于所述方法在含水的有机两相系统中完成。
5、根据权利要求4的方法，其特征在于另外地使用有机溶剂例如乙醚、叔丁基甲基醚、二异丙基醚、二丁基醚、乙酸乙酯、乙酸丁酯、庚烷、己烷或者环己烷。
6、根据权利要求1-5的任一项的方法，其特征在于TTN(总转变数＝mol还原的氧代类固醇化合物/mol所用的辅因子)≥103。
7、根据权利要求1-6的任一项的方法，其特征在于在2-96小时内，至少50％的所用氧代类固醇化合物被还原成羟基类固醇化合物。
8、根据权利要求1-7的任一项的方法，其特征在于用酮石胆酸(式II)作为氧代类固醇化合物：
9、根据权利要求1-7的任一项的方法，其特征在于用地塞米松(式III)作为氧代类固醇化合物：
10、根据权利要求1-7的任一项的方法，其特征在于用4-雄甾烯-3，17-二酮(式IV)作为氧代类固醇化合物：
11、根据权利要求1-7的任一项的方法，其特征在于用1，4-雄甾二烯-3，17-二酮(式V)作为氧代类固醇化合物：
Figure A200780012874C00044
12、根据权利要求1-7的任一项的方法，其特征在于用雌酮(式VI)作为氧代类固醇化合物：
Figure A200780012874C00051
13、根据权利要求1-7的任一项的方法，其特征在于用孕烯醇酮(式VII)作为氧代类固醇化合物：
Figure A200780012874C00052
14、根据权利要求1-7的任一项的方法，其特征在于用可的松(式VIII)作为氧代类固醇化合物：
Figure A200780012874C00053
15、一种对映体选择性酶氧化化合物的方法，所述化合物包括类固醇结构(ABCD)，该结构在环结构中包含一个或多个杂原子，一个或多个双键和/或一个芳香环，并且在类固醇环的3，7，11，12或17位或者在类固醇骨架任何碳基团的α位至少有一个羟基(＝羟基类固醇化合物)，
Figure A200780012874C00061
其中在辅因子NAD或者NADP存在的条件下，用羟基类固醇脱氢酶氧化所述羟基类固醇化合物，其特征在于
a)羟基类固醇化合物在反应混合物中的浓度≥50g/l，
b)通过还原通式RXRYCO的酮化合物，或者通过还原C4-C6环烷酮，持续性地再生由羟基类固醇脱氢酶形成的氧化辅因子NADH或者NADPH，其中RX，RY彼此独立是氢、支链或者无支链C1-C8烷基，且C总数≥3，和
c)另外的氧化还原酶/醇脱氢酶用于还原通式为RXRYCO的酮或者环烷酮。
16、根据权利要求15的方法，其特征在于，具有下列通式I的化合物用作羟基类固醇化合物：
Figure A200780012874C00062
其中
R1是氢、甲基、羟基或者桥氧基；
R2是氢、甲基、桥氧基或者羟基；
R3是氢、羟基、桥氧基或者甲基；
R4是氢或者羟基；
R5是氢，-COR10，其中，R10是未取代的或者用羟基取代的C1-C4烷基，或者取代的或者未取代的C1-C4羧烷基；
或者R4和R5一起表示桥氧基；
R6是氢、甲基、桥氧基或者羟基；
R7是氢、甲基、桥氧基或者羟基；
R8是氢、甲基或者卤素；和
R9是氢、甲基、羟基、桥氧基或者卤素；
其中R1、R2、R4、R6、R7、R8或者R9至少之一是羟基，且下列结构式：
是苯环或者有0、1或2个C-C双键的C6环。
17、根据权利要求15或者16的方法，其特征在于为2-丁酮、2-戊酮、4-甲基-2-戊酮、2-己酮、2-庚酮、5-甲基-2-己酮或者2-辛酮作为通式RXRYCO的酮，和用环己酮作为环烷酮。
18、根据权利要求15-17任一项的方法，其特征在于所述方法在含水的有机两相系统中完成。
19、根据权利要求18的方法，其特征在于另外地使用有机溶剂，例如乙醚、叔丁基甲基醚、二异丙基醚、二丁基醚、乙酸乙酯、乙酸丁酯、庚烷、己烷或者环己烷。
20、根据权利要求15-19的任一项的方法，其特征在于TTN(总转变数＝mol还原的羟基类固醇化合物/mol所用的辅因子)≥103。
21、根据权利要求15-21的任一项的方法，其特征在于在2-96小时内，至少50％的所用羟基类固醇化合物被氧化成羟基类固醇化合物。
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