KR20090004862A - 하이드록시스테로이드 디하이드로게나아제를 이용하는, 옥소스테로이드 화합물의 환원에 의한 또는 하이드록시스테로이드 화합물의 산화에 의한 스테로이드 유도체의 제조를 위한 공정 - Google Patents

하이드록시스테로이드 디하이드로게나아제를 이용하는, 옥소스테로이드 화합물의 환원에 의한 또는 하이드록시스테로이드 화합물의 산화에 의한 스테로이드 유도체의 제조를 위한 공정 Download PDF

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Abstract

고리 구조 내에 하나 또는 그 이상의 헤테로원자, 하나 또는 그 이상의 이중 결합 및/또는 방향족을 포함하는 스테로이드 구조 (ABCD)를 가지고, 스테로이드 고리 시스템의 3, 7, 11, 12 또는 17 위치에 또는 스테로이드 골격 (= 옥소스테로이드 화합물／하이드록시스테로이드 화합물) 상의 임의의 탄소 라디칼의 α-위치 내에 하나 이상의 옥소기를 가지는 화합물의 거울상이성질선택적(enantioselective) 효소적 환원을 위한 공정으로서,
Figure 112008059512611-PCT00018
여기서 상기 옥소스테로이드 화합물은 보조인자(cofactor) NADH 또는 NADPH의 존재 하에 하이드록시스테로이드 디하이드로게나아제를 사용하여 환원되고,
a) 상기 옥소스테로이드 화합물은 반응 혼합물 내에 ＞50 g/l의 농도로 존재하고,
b) 상기 하이드록시스테로이드 디하이드로게나아제에 의해 형성된, 산화된 보조인자 NAD 또는 NADP는 일반식 RXRYCHOH의 이차 알코올의 산화에 의해 또는 C4-C6-시클로알칸올의 산화에 의해 연속적으로 재생되고 (여기서 RX,RY은 서로 수 소, 분기상(branched) 또는 직선상(unbranched) C1-C8-알킬 및 Ctotal≥3을 독립적으로 나타낸다), 또한
c) 추가적인 산화환원효소(oxidoreductase)/알코올 디하이드로게나아제는 일반식 RXRYCHOH의 이차 알코올 또는 시클로알칸올의 산화에 사용된다
는 것을 특징으로 한다.

Description

하이드록시스테로이드 디하이드로게나아제를 이용하는, 옥소스테로이드 화합물의 환원에 의한 또는 하이드록시스테로이드 화합물의 산화에 의한 스테로이드 유도체의 제조를 위한 공정 {PROCESS FOR THE PREPARATION OF STEROID DERIVATIVES BY REDUCTION OF OXOSTEROID COMPOUNDS OR BY OXIDATION OF HYDROXYSTEROID COMPOUNDS USING A HYDROXYSTEROID DEHYDROGENASE}
본 발명은 고리 구조 내에 하나 또는 복수의 헤테로원자, 하나 또는 복수의 이중 결합 및/또는 하나의 방향족 성분을 포함하는 스테로이드 구조 (ABCD)를 포함하고, 상기 스테로이드 고리 시스템 내의 3, 7, 11, 12 또는 17 위치에 또는 상기 스테로이드 골격 (= 옥소스테로이드 화합물) 상의 임의의 탄소 모이어티의 α-위치 내에 하나 이상의 옥소기를 가지는 화합물의 거울상이성질선택적(enantioselective) 효소적 환원을 위한 공정에 관한 것으로, 여기서 상기 옥소스테로이드 화합물은 보조인자(cofactor) NADH 또는 NADPH의 존재 하에 하이드록시스테로이드 디하이드로게나아제를 사용하여 환원된다.
또한, 본 발명은 고리 구조 내에 하나 또는 복수의 헤테로원자, 하나 또는 복수의 이중 결합 및/또는 하나의 방향족 성분을 포함하는 스테로이드 구조 (ABCD)를 포함하고, 상기 스테로이드 고리 시스템 내의 3, 7, 11, 12 또는 17 위치에 또는 상기 스테로이드 골격 (= 하이드록시스테로이드 화합물) 상의 임의의 탄소 모이 어티의 α-위치 내에 하나 이상의 하이드록시기를 가지는 화합물의 산화를 위한 공정에 관한 것으로, 여기서 상기 하이드록시스테로이드 화합물은 보조인자 NAD 또는 NADP의 존재 하에 하이드록시스테로이드 디하이드로게나아제를 사용하여 산화된다.
스테로이드는 콜레스테롤의 고리 시스템을 가지고, 또한 이중 결합의 수, 작용기의 유형, 수 및 위치, 메틸기의 수, 알킬 측쇄 및 결합의 배열(configuration) 면에서 상이한 화합물이다. 스테로이드 화합물은 동물 유기체에서 및 곰팡이 및 식물 모두에서 발견되고, 예를 들어, 남성 및 여성 호르몬으로서의, 부신(adrenal gland) 호르몬으로서의, 비타민으로서의, 담즙산으로서의, 스테로이드 사포게닌(sapogenine)으로서의, 심장작용(cardioactive) 물질로서의 및 두꺼비 독으로서의 다양한 생물학적 활성을 나타낸다.
옥소스테로이드 화합물은, 최초에 정의된 종류의 스테로이드, 즉, 하나 이상의 케토 작용기(function)를 갖는 것들로 이하에서 이해되고, 여기서 상기 작용기는 고리 시스템 내에 또는 스테로이드 골격에 위치된 측쇄 내에도 포함될 수 있다.
하이드록시스테로이드 화합물은, 최초에 정의된 종류의 스테로이드, 즉, 하나 이상의 하이드록시 작용기를 갖는 것들로 이하에서 이해되고, 여기서 상기 작용기는 고리 시스템 내에 또는 스테로이드 골격에 위치된 측쇄 내에도 포함될 수 있다.
스테로이드의 다양한 생리학적 효과 때문에 다수의 스테로이드 화합물 및 유도체는 치료적 유효 물질 및 약제로서 약에도 사용되는 것이 명백하다.
예를 들어, 프로게스테론 및 에스트로겐 유도체는 세계적으로 피임제로서 사용되고; 안드로겐 (테스토스테론)은 동화제(anabolic)로서 사용되며, 항안드로겐은 예를 들어, 전립선 암종의 치료에 사용된다. 글루코코르티코이드 (코르티손(cortisone), 코르티솔(cortisol), 프레드니솔론(prednisolone) 및 프레드니손(prednisone)) 및 이의 유도체는 그들의 소염(antiphlogistic), 항알레르기 및 면역억제 효과에 기인하여 피부 질환, 류머티스성 질환, 알레르기 반응, 신장 질환, 소화관 질환 및 다수의 다른 장애의 치료 요법에 널리 사용된다.
생물학적으로 활성인 스테로이드 화합물 세계 시장은 거대하다. 상이한 효과를 가지는 여러 스테로이드 유도체의 생산에서, 생물학적변환(biotransformation)은 중요한 역할을 한다. 특히, 하이드록실라아제(hydroxylase) 및 디하이드로게나아제에 의해 촉매되는 반응이 그 때문에 중요하다. 이 관계(connection)에서, 위치 3 및 7에서의 델타-1-탈수소반응(dehydrogenation), 11 베타-환원, 20 베타-환원, 17 베타-환원, 입체선택적(stereoselective) 환원 및 하이드록시기의 산화, 특히 위치 3, 7, 12 및 17에서의 하이드록시기의 산화도 특이적인 역할을 한다.
산업적으로, 스테로이드 상의 생물학적환원(bioreduction)은 이제까지 오직 전체 원형 세포(whole intact cell)를 가지고 또한 10 g/l을 매우 밑도는 기질 농도에서만 수행되어 왔다. 우선, 이는 생물학적변환에 필수적인 효소가 지금까지 특징화되지 않았으며 또한 발현가능하지 않았다는 각각의 사실에 기인하며, 또한, 두번째로, 한편, 수성 매체에서의 스테로이드의 난용성(poor solubility) 문제 및, 한편, 보조인자인 NADH 및 NADPH를 충분한 정도까지 재생시키는 문제를 개선시키는 어떠한 만족할만한 기술적 해결책도 이용할 수 없었다는 사실에 기인한다.
스테로이드 상의 산화는 산업적 방식으로 화학적으로 수행되어 왔다.
단리된 효소로의 스테로이드의 거울상이성질선택적 환원의 시도는 1975부터 1988까지 G. Carrea에 의해 실질적으로 기술되었다 (Eur. J. Biochemistry 44, 1974 p.401-405; Biotechnology and Bioengineering, Vol 17, 1975, p.1101-1108; Enzyme Microb. Technol. Vol 6, July, 1984, p.307-311; Biotechnology and Bioengineering, Vol 26, 1984, p.560-563; J. Org. Chem. 51, 1986, p.2902-2906; J. Org. Chem. 58, 1993, p.499-501; J. Org. Chem., 53, 1988, p.88-92; Enzyme Microb. Technol. Vol 10, June, p.333-339; Archieves of Biochemistry and Biophysics, 159, 1973, p.7-10).
그렇게 하는 데에는, 여러 하이드록시스테로이드 디하이드로게나아제 (HSHD)가 사용되었으며, 이에 의해 보조인자 NADH의 재생은 본질적으로 락테이트 디하이드로게나아제, 포르메이트(formate) 디하이드로게나아제 또는 효모로부터의 알코올 디하이드로게나아제 효소와의 커플링에 의해 달성되었다. NADP의 재생은 글루코스 디하이드로게나아제에 의해 달성되었다. 가용성 문제를 극복하기 위해, 실험은 유기상으로서 에틸 아세테이트 및 부틸 아세테이트를 갖는 2상(two-phase) 시스템에서도 수행되었다. 또한 2상에서 단리된 효소를 갖는, 조작(operation)은 보통 10 g/l을 매우 밑도는 농도 범위에서 수행되었고, 이에 의해 달성된 "총 턴오버 수(total turn over number)" (TTN = 환원된 옥소스테로이드 화합물의 mol / 사용 된 보조인자의 mol)는 역시 1000을 매우 밑돌며, 이는 상기 공정이 전체-세포(whole-cell) 공정에 비하여 실질적인 경제적 이점을 제공하는데에 실패한 이유이다.
추가로, 7 알파로부터 7 베타로의 하이드록시기의 전환(conversion)이 커플링 산화 및 환원에 의해 달성된 논문이 있다. 이는 7α HSDH 및 7β HSDH의 커플링에 의해 달성되었다 (Pedrini 등, Steroids 71 (2006), p.189-198). 이 공정에서도, 조작은 10 g/l을 매우 밑도는 농도 범위에서 수행되었고, 달성된 "총 턴오버 수" (TTN = 환원된 옥소스테로이드 화합물의 mol / 사용된 보조인자의 mol)는 1000을 매우 밑돌며, 이는 이들 공정이 경제적으로 적절하지 않은 이유이다.
본 발명은 상기 단점 및 어려움을 피하는 것을 목표로 하고, 또한 보다 높은 턴오버를 가지는, 보다 높은 농도 범위의, 또한 보조인자의 보다 높은 TTN을 가지는, 또한 따라서 보다 경제적인 방식인, 옥소스테로이드 화합물 및 하이드록시스테로이드 화합물 각각의 거울상이성질선택적 환원 및 산화 각각을 가능케하는 공정를 제공하는 것을 목적으로 한다.
서두에 언급한 종류의 공정으로, 상기 목적은
a) 상기 옥소스테로이드 화합물은 반응에서 ≥50 g/l의 농도로 제공되고,
b) 상기 하이드록시스테로이드 디하이드로게나아제에 의해 형성된, 산화된 보조인자 NAD 또는 NADP는 일반식 RXRYCHOH의 이차 알코올의 산화에 의해 또는 C4-C6-시클로알칸올의 산화에 의해 연속적으로 재생되고 (여기서 RX,RY은 수소, 분기상(branched) 또는 직선상(unbranched) C1-C8-알킬 및 Ctotal≥3을 독립적으로 나타낸다), 또한
c) 추가적인 산화환원효소(oxidoreductase)/알코올 디하이드로게나아제는 일반식 RXRYCHOH의 이차 알코올 또는 시클로알칸올 각각의 산화에 사용된다
는 점에서 달성된다.
서두에 언급한 종류의 추가적 공정에서, 상기 목적은
a) 상기 하이드록시스테로이드 화합물은 반응에서 ≥50 g/l의 농도로 제공되고,
b) 상기 하이드록시스테로이드 디하이드로게나아제에 의해 형성된, 환원된 보조인자 NADH 또는 NADPH는 일반식 RXRYCO의 케토 화합물의 환원에 의해 또는 C4-C6-시클로알칸온의 환원에 의해 연속적으로 재생되고 (여기서 RX,RY은 수소, 분기상 또는 직선상 C1-C8-알킬 및 Ctotal≥3을 독립적으로 나타낸다), 또한
c) 추가적인 산화환원효소/알코올 디하이드로게나아제는 일반식 RXRYCO의 케토 화합물 또는 시클로알칸온 각각의 환원에 사용된다
는 점에서 달성된다.
본 발명은 종래기술과 비교하여 스테로이드 골격에서의 거울상이성질선택적 효소적 환원 및 산화 반응의 실질적인 향상을 포함한다. 본 발명은 종래 기술에 기술된 것들을 훨씬 초과하는 농도 범위의 자유 효소를 가지고 옥소스테로이드 화합물의 상응하는 하이드록시스테로이드로의 환원 및 산화 각각을 가능하게 한다.
본 발명의 공정에서, NADH 또는 NADPH는 보조인자로서 사용된다. 용어 "NADP"는, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트로 이해되고, 용어 "NADPH"는 환원된 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트로 이해된다. 용어 "NAD"는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드를 나타내고, 용어 "NADH"는 환원된 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드를 나타낸다.
바람직한 구체예에 따라, 본 발명의 공정은 일반식 Ⅰ의 화합물
Figure 112008059512611-PCT00001
을 옥소스테로이드 화합물로 사용하는 것을 특징으로 하고,
여기서
R1은 수소, 메틸기, 하이드록시기 또는 옥소기를 나타내고,
R2는 수소, 메틸기, 하이드록시기 또는 옥소기를 나타내며,
R3는 수소, 하이드록시기, 옥소기 또는 메틸기를 나타내고,
R4는 수소 또는 하이드록시기를 나타내며,
R5는 수소, 모이어티 -COR10를 나타내고, 여기서 R10은 하이드록시기로 치환되거나 또는 비치환된 C1-C4-알킬기 또는 치환되거나 또는 비치환된 C1-C4-카르복시알킬기이거나,
또는 R4 및 R5는 함께 옥소기를 나타내며,
R6는 수소, 메틸기, 하이드록시기 또는 옥소기를 나타내고,
R7은 수소, 메틸기, 하이드록시기 또는 옥소기를 나타내며,
R8은 수소, 메틸기 또는 할로겐화물(halide)을 나타내고, 또한
R9은 수소, 메틸기, 하이드록시기, 옥소기 또는 할로겐화물을 나타내며, 여기서 R1, R2, R4+R5, R6, R8 또는 R9의 하나 이상은 각각 옥소기이거나, 또는 R5는 모이어티 -COR10이고, 또한 구조적 요소
Figure 112008059512611-PCT00002
는 벤젠 고리이거나 또는 0, 1 또는 2개의 C-C-이중 결합을 가지는 C6-고리를 나타낸다.
바람직한 구체예에 따라, 본 발명의 공정은 일반식 Ⅰ의 화합물
Figure 112008059512611-PCT00003
을 하이드록시스테로이드 화합물로 사용하는 것을 특징으로 하고,
여기서
R1은 수소, 메틸기, 하이드록시기 또는 옥소기를 나타내고,
R2는 수소, 메틸기, 옥소기 또는 하이드록시기를 나타내며,
R3는 수소, 하이드록시기, 옥소기 또는 메틸기를 나타내고,
R4는 수소 또는 하이드록시기를 나타내며,
R5는 수소, 모이어티 -COR10를 나타내고, 여기서 R10은 하이드록시기로 치환되거나 또는 비치환된 C1-C4-알킬기 또는 치환되거나 또는 비치환된 C1-C4-카르복시알킬기이거나,
또는 R4 및 R5는 함께 옥소기를 나타내며,
R6는 수소, 메틸기, 옥소기 또는 하이드록시기를 나타내고,
R7은 수소, 메틸기, 옥소기 또는 하이드록시기를 나타내며,
R8은 수소, 메틸기 또는 할로겐화물을 나타내고, 또한
R9은 수소, 메틸기, 하이드록시기, 옥소기 또는 할로겐화물을 나타내며, 여기서 R1, R2, R4, R6, R7, R8 또는 R9의 하나 이상은 하이드록시기이고, 또한 구조적 요소
Figure 112008059512611-PCT00004
는 벤젠 고리이거나 또는 0, 1 또는 2개의 C-C-이중 결합을 가지는 C6-고리를 나타낸다.
2-프로판올, 2-부탄올, 2-펜탄올, 4-메틸-2-펜탄올, 2-헥산올, 2-헵탄올, 5-메틸-2-헥산올 또는 2-옥탄올은 일반식 RXRYCHOH의 이차 알코올로서 바람직하게 사용되고, 또한 시클로헥산올은 시클로알코올로서 사용된다.
아세톤, 2-부탄온, 2-펜탄온, 4-메틸-2-펜탄온, 2-헥산온, 2-헵탄온, 5-메틸-2-헥산온 또는 2-옥탄온은 일반식 RXRYCO의 케톤으로서 바람직하게 사용되고, 또한 시클로헥산온은 시클로알칸온으로서 사용된다.
이하에서, 일반식 RXRYCO의 케톤 또는 C4-C6-시클로알칸온 각각, 및 일반식 RXRYCHOH의 이차 알코올 또는 C4-C6-시클로알칸올 각각은 일반 명사 보조기질(cosubstrate) 하에 요약된다.
본 발명의 공정은 바람직하게는 수성 유기 2상 시스템(aqueous organic two-phase system)에서 수행된다. 그 때문에, 조효소(coenzyme) 재생을 위해 사용된 보조기질은 물과 혼화하기에 적합하지 않고, 따라서 수성 유기 2상 시스템의 유기상을 형성한다.
추가의 가능한 구체예에 따르면, 보조인자의 재생에 관여하지 않는 유기 용매, 예를 들어, 디에틸 에테르, 3차 부틸 메틸 에테르, 디이소프로필 에테르, 디부틸 에테르, 에틸 아세테이트, 부틸 아세테이트, 헵탄, 헥산 또는 시클로헥산 등은 상기 공정에 추가적으로 사용된다.
또한, 본 발명의 공정의 TTN은 ≥103인 것이 바람직하다.
추가로, 바람직하게는 사용된 옥소스테로이드 화합물 또는 하이드록시스테로이드 화합물 각각의 50% 이상은 2 내지 96h 내에 각각 상응하는 하이드록시스테로이드 화합물로 환원되거나 또는 옥소스테로이드 화합물로 산화된다.
본 발명의 공정의 바람직한 구체예는 예를 들어, 케토리토콜산(ketolithocholic acid) (식 Ⅱ), 덱사메타손 (식 Ⅲ), 4-안드로스텐-3,17-디온 (식 Ⅳ), 1,4-안드로스타디엔-3,17-디온 (식 Ⅴ), 에스트론 (식 Ⅵ), 프레그네놀론(pregnenolone) (식 Ⅶ) 및 코르티손 (식 Ⅷ)을 옥소스테로이드 화합물로서 사용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 공정의 바람직한 구체예는 예를 들어, 콜산, 케노디옥시콜산(chenodeoxycholic acid), 12-옥소콜산, 3-하이드록시-12-옥소콜산, 케토리토콜산, 리토콜산과 같은 담즙산의 여러 유도체 또는 하이드로코르티손이 하이드록시스테로이드 화합물로서 사용되는 것 또한 특징으로 한다.
하이드록시스테로이드 디하이드로게나아제는, 이들 효소가 스테로이드 골격 상의 케토기를 환원시켜 하이드록시기가 되도록 하거나 또는 하이드록시기를 산화시켜 상응하는 케토기가 되도록 하는 촉매 작용을 할 수 있는 것으로 일반적으로 이해된다. 상기 산화 또는 환원 각각은 따라서 스테로이드 자체의 고리 시스템 상에서 일어나거나 (예를 들어, 7-α 하이드록시스테로이드 디하이드로게나아제) 또는 스테로이드의 골격 구조의 탄소 모이어티 상에서도 일어날 수 있다 (예를 들어, 20-β 하이드록시스테로이드 디하이드로게나아제).
옥소스테로이드 화합물의 환원에 적합한 하이드록시스테로이드 디하이드로게나아제는 예를 들어, 3-α 하이드록시스테로이드 디하이드로게나아제 (HSDH), 3β HSDH, 12α HSDH, 20β HSDH, 7α HSDH, 7β HSDH, 17β HSDH 및 11β HSDH이다.
적합한 3-α 하이드록시스테로이드 디하이드로게나아제는, 예를 들어, 슈도모나스 테스토스테로니 (Pseudomonas testosteroni) (J. Biol. Chem. 276(13), 9961-9970 (2001))로부터 수득할 수 있고, 또한 3-α 하이드록시스테로이드의 산화 및 예를 들어, 3-케토-담즙산, 프로게스테론, 4-안드로스텐-3,17-디온, 5-α-안드로스탄-3,17-디온 등과 같은 3-α 케토스테로이드의 환원 각각에 사용될 수 있다.
3-β-하이드록시스테로이드 디하이드로게나아제 활성을 가지는 적합한 효소는, 예를 들어, 클로스트리디움 이노쿰(Clostridium innocuum)(Applied and Environmental Microbiology, June 1989, p.1656-1659)으로부터 또는 슈도모나스 테스 토스테로니로부터 수득할 수 있고, 또한 3-β-하이드록시스테로이드의 산화 및 예를 들어, 3-케토-담즙산, 프로게스테론, 4-안드로스텐-3,17-디온, 5-α-안드로스탄-3,17-디온 등과 같은 3-케토스테로이드의 환원 각각에 사용될 수 있다.
12α HSDH는 예를 들어, 클로스트리디아(Clostridia)(Eur. J. Biochem. 196(1991) 439-450)로부터 수득할 수 있고, 또한 12α-하이드록시스테로이드 (예를 들어, 콜산)의 산화 및 예를 들어, 12-케토-담즙산 (12-케토케노디옥시콜산, 디하이드로콜산)과 같은 12-케토스테로이드의 환원 각각에 사용될 수 있다. 12-β 하이드록시스테로이드 디하이드로게나아제 활성을 갖는 클로스트리디아로부터의 효소는 이하에도 기술되어 있다 (Biochim. Biophys. Acta 1988 Oct. 14; 962(3): 362-370).
20-β 하이드록시스테로이드 디하이드로게나아제 활성을 가지는 효소는 예를 들어, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 그룹의 유기체로부터 수득할 수 있고 (The Journal of Biological Chemistry, 1977, Vol 252, No 1, Jan 10, 205-211), 또한 코르티손 및 코르티솔 유도체 (코르티손, 코르티솔, 코르텍솔론, 프로게스테론)의 상응하는 20-β 하이드록시스테로이드 (예를 들어, 20-β-하이드록시프로게스테론)로의 환원에 사용될 수 있다.
20-α 하이드록시스테로이드 디하이드로게나아제 활성을 가지는 상응하는 효소는 예를 들어, 클로스트리디아, 특히 클로스트리디움 신덴스(Clostridium scindens)(Journal of Bacteriology, June 1989, p.2925-2932)로부터, 및 테트라하이메나 파이리포르미스 (Tetrahymena pyriformis)(Biochem. J. (1994) 297, 195-200)로부터 수득할 수 있다. 적합한 7-α 하이드록시스테로이드 디하이드로게나아제는 그 중에서도 특히, 예를 들어, 클로스트리디아 (클로스트리디움 압소눔(Clostridium absonum), 클로스트리디움 소르델리(Clostridium sordellii)와 같은 장내균총(intestinal flora)의 유기체로부터 (Journal of Bacteriology, Aug. 1994, p.4865-4874), 대장균(Escherichia coli)으로부터 (Journal of Bacteriology Apr., 1991, p.2173-2179), 박테로이데스 프라길리스(Bacteroides fragilis)(Current Microbiology, Vol 47 (2003) 475-484), 브루셀라(Brucella), 유박테리 움(Eubacterium)으로부터 수득할 수 있고, 또한 7-α-하이드록시스테로이드 (케노리토콜산)의 산화 및 예를 들어, 7-케토-담즙산(케토리토콜산)과 같은 7-케토스테로이드의 환원 각각에 사용될 수 있다.
7-β 하이드록시스테로이드 디하이드로게나아제 활성을 가지는 상응하는 효소는 클로스트리디아로부터, 루미노코커스 과(family) (J. Biochemistry 102, 1987, p.613-619) 또는 펩토스트렙토코커스 과 (Biochimica and Biophysica Acta 1004, 1989, p.230-238) 각각의 미생물로부터, 유박테리움 에어로파시엔스(Eubacterium aerofaciens)(Applied and Environmental Microbiology, May 1982, p.1057-1063), 및 잔토모나스 말토필라(Xanthomonas maltophila)(Pedrini 등, Steroids 71 (2006) p.189-198)로부터 수득할 수 있는 것으로 역시 기재된다. 7-β HSDH에 의해, 우르소디옥시콜산(ursodeoxycholic acid)은 예를 들어, 케토리토콜산으로부터 생산될 수 있다.
17-β 하이드록시스테로이드 디하이드로게나아제는 실린드로카르폰 라디콜라(Cylindrocarpon radicola)(J. Biochemistry 103, 1988, 1039-1044) 및 코클리오볼 루스 루나투스(Cochliobolus lunatus)(J. Steroid Biochem. Molec. Biol. Vol 59, 1996, No.2, p.205-214)와 같은 곰팡이로부터, 스트렙토마이세스(Streptomyces) (Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem, Vol.356, 1975, 1843-1852), 슈도모나스(Pseudomonas) (The Journal of Biological Chemistry, Vol.252 No.11, June 10, 1977, p.3775-3783) 및 알칼리게네스(Alcaligenes)(The Journal of Biological Chemistry, Vol.260, No.25, Nov 5, 1985, p.13648-13655) 과의 세균으로부터 알려졌다.
17-β 하이드록시스테로이드 디하이드로게나아제는 예를 들어, 17-β-하이드록시스테로이드의 산화 및 예를 들어, 4-안드로스텐-3,17-디온, 안드로스테론, 에스트론과 같은 17-케토스테로이드의 환원 각각에 사용될 수 있다.
17-α 하이드록시스테로이드 디하이드로게나아제 활성을 가지는 상응하는 효소는 유박테리움 종(sp.)으로부터 수득할 수 있는 것으로 기재된다 (Journal of Lipid Research, Vol.35, 1994, p.922-929).
11-β 하이드록시스테로이드 디하이드로게나아제는 고등 포유류로부터 알려져 있으며, 예를 들어 코르티솔로부터의 코르티손으로의 산화에 사용될 수 있다.
그러나, 스테로이드 골격 상에서 산화 및 환원을 각각 촉매작용하는 임의의 다른 산화환원효소는 하이드록시스테로이드 디하이드로게나아제로서 사용될 수도 있다.
예를 들어, 슈도모나스 테스토스테로니로부터의 17-β 하이드록시스테로이드 디하이드로게나아제, 클로스트리디움 이노쿰으로부터의 3-β 하이드록시스테로이드 디하이드로게나아제 또는 박테로이데스 프라길리스로부터의 7-α 하이드록시스테로이드 디하이드로게나아제를 이용할 때, NADH 또는 NAD 각각의 재생을 위해 적합한 이차 알코올 디하이드로게나아제는, 예를 들어, 상기한 바와 같은 것들 및 예를 들어: 칸디다 파라실로시스(Candida parapsilosis; CPCR)(US 5,523,223 및 US 5,763,236; Enzyme Microb. Technol. 1993 Nov; 15(11): 950-8), 피치아 캅슐라타(Pichia capsulata)(DE 10327454.4), 피치아 파리노사(Pichia farinosa)(A 1261/2005, Kl. C12N), 피치아 핀란디카(Pichia finlandica)(EP 1179595 A1), 칸디다 네모덴드라(Candida nemodendra)(A 1261/2005, Kl. C12N), 피치아 트레할로필라(Pichia trehalophila)(A 1261/2005, Kl. C12N), 로 도토룰라 무실라지노사(Rhodotorula mucilaginosa)(A 1261/2005, Kl. C12N), 로드데로마이세스 엘론기스포루스(Lodderomyces elongisporus)(A 1261/2005, Kl. C12N) 피치아 스티피디스(Pichia stipidis)(A 1261/2005, Kl. C12N)로부터의 카르보닐 환원효소와 같은 칸디다 속 및 피치아 속의 효모로부터 단리된 것들이다.
또한, NADH의 재생은, 악티노박테리아 강(class)의 세균으로부터, 예를 들어, 로도코커스 에리트로폴리스(Rhodococcus erythropolis)(US 5,523,223), 노르카르디아 푸스카(Norcardia fusca)(Biosci. Biotechnol. Biochem., 63(10) (1999), pp.1721-1729; Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003 Sep; 62(4):380-6, Epub 2003 Apr 26), 로도코커스 루베르(Rhodococcus ruber)(J. Org. Chem 2003 Jan 24; 8(2):402-6) 또는 마이크로박테리움 종(Microbacterium spec .) (A 1261/2005, Kl. C12N)으로부터 단리된 및 상기한 바와 같은 이차 알코올 디하이드로게나아제/산화환원효소를 사용하여 달성될 수 있다.
예를 들어, 클로스트리디움 파라푸트리피쿰(Clostridium paraputrificum)으로부터의 12-α 하이드록시스테로이드 디하이드로게나아제, 유박테리움 종으로부터의 17-α 하이드록시스테로이드 디하이드로게나아제 또는 클로스트리 디움 소르델리로부터의 7-α 하이드록시스테로이드 디하이드로게나아제를 사용할 때, NADPH 또는 NADP 각각의 재생을 위해 적합한 이차 알코올 디하이드로게나아제/산화환원효소는, 예를 들어, 상기한 바와 같은 것들 및 예를 들어, 락토바실레일스(Lactobacillales) 목(order)(락토바실러스 케피어(Lactobacillus kefir)(US 5,200,335), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)(DE 19610984 A1; Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 2000 Dec; 56 Pt 12: 1696-8), 락토바실러스 마이너(Lactobacillus minor)(DE 10119274), 류코노스톡 카르노섬(Leuconostoc carnosum)(A 1261/2005, Kl. C12N)의 유기체로부터 단리된 것들 또는 써모언에로비움 브록키(Thermoanerobium brockii), 써모언에로비움 에탄올리쿠스(Thermoanerobium ethanolicus) 또는 클로스트리디움 베이제린키(Clostridium beijerinckii)로부터 기술된 것들이다.
하이드록시스테로이드 디하이드로게나아제 및 산화환원효소/알코올 디하이드로게나아제 두 효소 모두는 바람직하게는 대장균 내에서 재조합 과발현된 상태로 사용된다. 본 발명의 공정에서, 하이드록시스테로이드 디하이드로게나아제 및 알코올 디하이드로게나아제/산화환원효소 두 효소 모두는 완전히 정제된 상태로, 일부 정제된 상태로 또는 세포 내에 포함된 상태 어느것으로든 사용될 수 있다. 따라서 상기 사용된 세포는 고유(native) 상태로, 투과화된(permeabilized) 상태로, 또는 용해된(lysed) 상태로 존재할 수 있다.
전환될 옥소스테로이드 화합물 및 하이드록시스테로이드 화합물 각각의 kg 당 50 000 내지 10 Mio U의 하이드록시스테로이드 디하이드로게나아제 및 50 000 내지 10 Mio U의 알코올 디하이드로게나아제가 사용된다 (상한 없음).
따라서 효소 단위 1U는 분(min) 당 1μmol의 옥소스테로이드 화합물을 전환하는데 요구되는 하이드록시스테로이드 디하이드로게나아제의 효소 량 또는 분(min) 당 1μmol의 2-알코올을 산화시키는데 요구되는 알코올 디하이드로게나아제의 효소 량 각각에 상응한다.
유추하여, 전환될 옥소스테로이드 화합물 또는 하이드록시스테로이드 화합물 각각의 kg 당 하이드록시스테로이드 디하이드로게나아제를 함유하는 대장균의 약 10 g 내지 500 g의 생물학적 함수 질량(wet mass) 및 알코올 디하이드로게나아제/산화환원효소를 함유하는 대장균의 10 g 내지 500 g의 생물학적 함수 질량이 사용될 수 있다 (상한 없음).
기술된 공정에서, NAD(P)H의 재생은 효소-커플된 방식으로 달성된다.
본 발명의 공정에서, 옥소스테로이드 화합물 또는 하이드록시스테로이드 화합물 각각의 전환은 바람직하게는 보조인자 재생을 위한 2-알코올 또는 케토 화합물 각각, 하이드록시스테로이드 디하이드로게나아제, 알코올 디하이드로게나아제, 물, 보조인자 및 옥소스테로이드 화합물 또는 하이드록시스테로이드 화합물 각각을 함유하는 2상 시스템에서 일어난다. 또한, 보조인자 재생에 관여하지 않는, 즉 사용된 알코올 디하이드로게나아제에 의해 산화될 수 있는 임의의 하이드록시기 또는 사용된 알코올 디하이드로게나아제에 의해 환원가능한 임의의 케토기를 각각 함유하지 않는 추가적인 유기 용매도 포함될 수 있다.
2상 시스템에서 물과 혼화할 수 없는 유기 성분 부분은 반응의 총 부피에 기초하여 10% 내지 90%, 바람직하게는 20% 내지 80%의 범위일 수 있다. 수성 부분은 반응 배치(batch)의 총 부피에 기초하여 90% 내지 10%, 바람직하게는 80% 내지 20%의 범위일 수 있다.
5 내지 10, 바람직하게는 6 내지 9의 pH 값을 가지는 완충액, 예를 들어, 인산칼륨(potassium phosphate), 트리스(tris)/HCl, 글라이신(glycine) 또는 트리에탄올아민 완충액이 물에 첨가될 수 있다. 추가로, 완충액은 두 효소의 안정화 또는 활성화를 위한 이온, 예를 들어, 마그네슘 이온 또는 아연 이온을 포함할 수 있다.
추가로, 효소인 하이드록시스테로이드 디하이드로게나아제 및 알코올 디하이드로게나아제의 안정화를 위한, 예를 들어, 글리세롤, 소르비톨, 1,4-DL-디티오트레이톨(1,4-DL-dithiothreitol; DTT) 또는 디메틸 술폭사이드 (dimethyl sulfoxide;DMSO)와 같은 추가의 첨가제도 본 발명의 공정에 사용될 수 있다.
수성상에 기초한 보조인자 NAD(P)H의 농도는 0.001 mM 내지 10 mM, 특히 0.01 mM 내지 1.0 mM의 범위이다. 상기 효소의 특이적 특징에 의존하여, 온도는 10℃ 내지 70℃, 바람직하게는 20℃ 내지 35℃의 범위일 수 있다.
본 발명의 공정에서 달성된 TTN (총 턴오버 수 = 환원된 옥소스테로이드 화합물의 mol / 사용된 보조인자의 mol)은 따라서 102 내지 105의 범위에 놓일 수 있고, 정상적으로는, TTN ＞ 103이 바람직하다.
보통, 환원되는 옥소스테로이드 화합물 및 하이드록시스테로이드 화합물 각각은 물에 난용성이다. 반응 동안, 기질은 완전하게 또는 불완전하게 용해된 상태로 존재할 수 있다. 만약 상기 기질이 반응 혼합물 내에 완전하게 용해되지 않는다면, 기질 부분은 고체 형태로 제공되고, 또한 따라서 제3 고체상을 형성할 수 있다. 전환 동안, 반응 혼합물은 또한 일시적으로 에멀션을 형성한다. 본 발명의 공정에서, 환원되는 옥소스테로이드 화합물 및 산화되는 하이드록시스테로이드 화합물 각각은 반응 배치의 총 부피에 기초하여 ≥ 50 g/l의 양으로 사용된다. 바람직하게는, 옥소스테로이드 화합물／하이드록시스테로이드 화합물의 50 g/l 내지 400 g/l, 바람직하게는 50 g/l 내지 200 g/l가 사용된다.
보조인자의 재생에 관여하지 않는 바람직한 추가적 유기 용매는 예를 들어, 에틸 아세테이트, 부틸 아세테이트, 3차 부틸 메틸 에테르, 디이소프로필 에테르, 헵탄, 헥산, 톨루엔, 디클로로메탄 또는 시클로헥산 또는 상이한 조성의 이의 혼합물이다.
NAD(P)H의 재생은 일반식 RXRYCHOH의 이차 알코올의 또는 C4-C6-시클로알칸올 각각의 산화에 의해 달성된다. 그럴 경우, 일반식 RXRYC＝O의 케톤 또는 C4-C6-시클로알칸온이 각각 반응 산물로 형성된다. 바람직한 이차 알코올은 예를 들어, 이소프로판올, 2-부탄올, 2-펜탄올, 2-헥산올, 2-헵탄올, 2-옥탄올, 4-메틸-2-펜탄올, 5-메틸-2-헥산올과 같은 지방족 2-알코올뿐만 아니라 시클로헥산올, 시클로펜탄올과 같은 환상(cyclic) 이차 알코올이다. 원칙적으로는, 예를 들어, 1,4-시클로헥산디올과 같은 디올(diol)의 사용도 생각할 수 있다.
NAD(P)의 재생은 일반식 RXRYC＝O의 케토 화합물 또는 C4-C6-시클로알칸온 각각의 환원에 의해 달성된다. 그럴 경우, 일반식 RXRYCHOH의 이차 알코올 또는 C4-C6-시클로알칸올이 각각 반응 산물로 형성된다. 바람직한 케토 화합물은 예를 들어, 아세톤, 2-부탄온, 2-펜탄온, 2-헥산온, 2-헵탄온, 2-옥탄온, 4-메틸-2-펜탄온, 5-메틸-2-헥산온과 같은 케톤뿐만 아니라 시클로헥산온, 시클로펜탄온과 같은 환상 케톤이다. 원칙적으로는, 예를 들어, 1,4-시클로헥산디온과 같은 디온(dione)의 사용도 생각할 수 있다.
본 발명의 공정은 예를 들어, 유리 또는 금속으로 제조된 반응 용기 내에서 수행된다. 이 목적을 위해, 상기 성분은 반응 용기 내부로 개별적으로 옮겨지고, 예를 들어, 질소 또는 공기 분위기 하에서 교반된다. 사용되는 옥소스테로이드 화합물에 의존적으로, 반응 시간은 1 시간 내지 96시간, 특히 2 시간 내지 48 시간의 범위이다. 이 기간에는, 상기 옥소스테로이드 화합물은 상응하는 하이드록시스테로이드로 50% 이상 환원되고, 또는 상기 하이드록시스테로이드는 옥소스테로이드 화합물로 50% 이상 산화된다.
이하에, 본 발명을 실시예로서 추가적으로 상세하게 설명한다.
실시예:
1. 안드로스텐 -3,17- 디온으로부터 17-β- 하이드록시 -4- 안드로스텐 -3-온(테스토스테론)의 환원
A) 조효소 재생을 위한 4- 메틸 -2-펜탄올을 가지는 2상 시스템
17β-하이드록시-4-안드로스텐-3-온(테스토스테론)의 합성을 위해, 0.4 ㎖의 4-메틸-2-펜탄올에 용해된 100 ㎎의 안드로스텐-3,17-디온을, NAD 0.1 ㎎, 슈도모나스 테스토스테로니로부터의 재조합 17-β-하이드록시스테로이드 디하이드로게나아제 (J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 44(2), 133-139 (1993), Pubmed P19871) 30 유닛 및 피 치아 캅슐라타로부터의 재조합 알코올 디하이드로게나아제 (DE-A 103 27 454) 50 유닛을 함유하는 0.5 ㎖의 완충액 (100 mM 트리에탄올아민, pH = 7, 1 mM MgCl2, 10% 글리세롤)에 첨가한다. 상기 혼합물을 지속적인 혼합 하에 실온에서 24 h 동안 인큐베이트한다. 총 반응 부피 내의 안드로스텐-3,17-디온의 농도는 약 100 g/l에 달한다.
상기 반응의 완료 후, 상기 반응 혼합물은 예를 들어 유기 용매로의 반응 혼합물의 추출 및 이어서 증류를 통한 상기 용매의 제거에 의해 처리된다.
24 시간 후, 사용된 안드로스텐-3,17-디온의 약 94%는 17-β-하이드록시-4-안드로스텐-3-온 (테스토스테론)으로 전환되었다.
안드로스텐-3,17-디온으로부터의 17-β-하이드록시-4-안드로스텐-3-온 (테스토스테론)으로의 전환은 가스 크로마토그래피에 의해 모니터되었다. 이 목적을 위해, 키랄 분리 컬럼 Lipodex E, 12m (Machery-Nagel, Duren, Germany), 불꽃 이온화(flame ionization) 검출기 및 캐리어 가스로서 헬륨을 갖춘 시마즈(Shimadzu) 사의 가스 크로마토그래프 GC-17A를 사용하였다.
B) 조효소 재생을 위한 2- 프로판올 및 부틸 아세테이트를 갖는 2상 시스템
17-β-하이드록시-4-안드로스텐-3-온(테스토스테론)의 합성을 위해, 0.3 ㎖의 부틸 아세테이트 및 0.1 ㎖의 2-프로판올에 용해된 100 ㎎의 안드로스텐-3,17-디온을, NAD 0.1 ㎎, 슈도모나스 테스토스테로니로부터의 재조합 17-β-하이드록시스테로이드 디하이드로게나아제 (J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 44(2), 133-139 (1993), Pubmed P19871) 30 유닛 및 피치아 캅슐라타로부터의 재조합 알코올 디하이드로게나아제 (DE-A 103 27 454) 50 유닛을 함유하는 0.5 ㎖의 완충액 (100 mM 트리에탄올아민, pH = 7, 1 mM MgCl2, 10% 글리세롤)에 첨가한다. 상기 혼합물을 지속적인 혼합 하에 실온에서 24 h 동안 인큐베이트한다. 총 반응 부피 내의 안드로스텐-3,17-디온의 농도는 약 100 g/l에 달한다.
상기 반응의 완료 후, 상기 반응 혼합물은 예를 들어 유기 용매로의 반응 혼합물의 추출 및 이어서 증류를 통한 상기 용매의 제거에 의해 처리된다.
24 시간 후, 사용된 안드로스텐-3,17-디온의 약 90-95%는 17-β-하이드록시-4-안드로스텐-3-온 (테스토스테론)으로 전환되었다.
2. 케토리토콜산으로부터 케노리토콜산으로의 환원
A) 써모언에로비움 브록키 로부터의 ADH /2상 시스템으로의 조효소 재생
3α-7α-디하이드록시-5-β-콜란산 (케노디옥시콜산)의 합성을 위해, 0.5 ㎖의 메틸펜탄올에 용해된 100 ㎎의 3α-하이드록시-7-옥소-5-β-콜란산 (케토리토콜산)을, NADP 0.1 ㎎, 클로스트리디엠 신덴스로부터의 재조합 7-α-하이드록시스테로이드 디하이드로게나아제 (Pubmed AAB61151) 10 유닛 및 써모언에로비움 브록키로부터의 재조합 알코올 디하이드로게나아제 10 유닛을 함유하는 0.2 ㎖의 완충액 (100 mM 인산칼륨 완충액, pH = 8.5, 1 mM MgCl2, 10% 글리세롤)에 첨가한다. 상기 혼합물을 지속적인 혼합 하에 실온에서 24 h 동안 인큐베이트한다. 총 반응 부피 내의 케토리토콜산의 농도는 약 100 g/l에 달한다.
24 시간 후, 사용된 케토리토콜산의 약 90-98%는 케노디옥시콜산으로 전환되었다.
케토리토콜산의 케노디옥시콜산으로의 전환은 HPLC에 의해 모니터되었다. 이 목적을 위해, 분리 컬럼 EC125/4 Nucleodur 100-5 C18ec (Machery-Nagel, Duren, Germany)를 MeOH/물 (80:20)의 혼합물로 등용리적으로(isocratically) 사용하였다.
B) 락토바실러스(DE 10119274)로부터의 ADH /2상 시스템으로의 조효소 재생
3α-7α-디하이드록시-5-β-콜란산 (케노디옥시콜산)의 합성을 위해, 0.5 ㎖ 의 옥탄올에 용해된 100 ㎎의 3α-하이드록시-7-옥소-5-β-콜란산 (케토리토콜산)을, 예를 들어, NADP 0.1 ㎎, 클로스트리디엠 신덴스(Pubmed AAB61151)로부터의 재조합 7-α-하이드록시스테로이드 디하이드로게나아제 10 유닛 및 락토바실러스 (DE 10119274)로부터의 재조합 알코올 디하이드로게나아제 10 유닛을 함유하는 0.3 ㎖의 완충액 (100 mM 트리에탄올아민 완충액, pH = 7, 1 mM MgCl2, 10% 글리세롤)에 첨가한다. 상기 혼합물을 지속적인 혼합 하에 실온에서 24 h 동안 인큐베이트한다. 총 반응 부피 내의 케토리토콜산의 농도는 약 100 g/l에 달한다.
24 시간 후, 사용된 케토리토콜산의 약 70-80%는 케노디옥시콜산으로 전환되었다.
3. 1,4- 안드로스타디엔 -3,17- 디온으로부터 17-β- 하이드록시 -1,4- 안드로스타디엔 -3-온으로의 환원
17-β-하이드록시-1,4-안드로스타디엔-3-온의 합성을 위해, 0.4 ㎖의 4-메틸-2-펜탄올에 용해된 100 ㎎의 1,4-안드로스타디엔-3,17-디온을, NAD 0.1 ㎎, 슈도모나스 테스토스테로니로부터의 재조합 17-β-하이드록시스테로이드 디하이드로게나아제 (J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 44(2), 133-139 (1993), Pubmed P19871) 30 유닛 및 피치아 캅슐라타로부터의 재조합 알코올 디하이드로게나아제 (DE-A 103 27 454) 5 유닛을 함유하는 0.5 ㎖의 완충액 (100 mM 트리에탄올아민, pH = 7, 1 mM MgCl2, 10% 글리세롤)에 첨가한다. 상기 혼합물을 지속적인 혼합 하에 실온에서 24시간 동안 인큐베이트한다. 총 반응 부피 내의 1,4-안드로스타디엔-3,17-디온의 농도는 약 100 g/l에 달한다.
상기 반응의 완료 후, 상기 반응 혼합물은 예를 들어 유기상의 분리 및 이어서 증류를 통한 상기 용매의 제거에 의해 처리된다.
24 시간 후, 사용된 안드로스텐-3,17-디온의 약 90-98%가 17-β-하이드록시-1,4-안드로스타디엔-3-온 (테스토스테론)으로 전환되었다.
1,4-안드로스타디엔-3,17-디온의 17-β-하이드록시-1,4-안드로스타디엔-3-온으로의 전환은 가스 크로마토그래피에 의해 모니터하였다. 이 목적을 위해, 질량분광기가 장착된 Perkim Elmer의 가스 크로마토그래프 Autosystem XL을 FS-모세관 컬럼 Optima-5-MS (Machery-Nagel, Duren, Germany) 및 캐리어 가스로서의 헬륨과 함께 사용하였다.
4. 케노리토콜산의 케토리토콜산으로의 산화
A) 써모언에로비움 브록키 로부터의 ADH /2상 시스템으로의 조효소 재생
3α-하이드록시-7-옥소-5-β-콜란산 (케토리토콜산)의 합성을 위해, 0.5 ㎖의 메틸 이소부틸 케톤에 용해된 100 ㎎의 3α-7α-디하이드록시-5-β-콜란산 (케노디옥시콜산)을, NADP 0.1 ㎎, 클로스트리디엠 신덴스(Pubmed AAB61151)로부터의 과발현된 7-α-하이드록시스테로이드 디하이드로게나아제를 함유하는 10 ㎎의 생물학적 함수 질량 대장균 및 써모언에로비움 브록키로부터의 과발현된 알코올 디하이드로게나아제를 함유하는 5 ㎎의 생물학적 함수 질량 대장균을 함유하는 0.4 ㎖의 완충액 (100 mM 인산칼륨 완충액, pH = 8.5, 1 mM MgCl2, 10% 글리세롤)에 첨가한다. 상기 혼합물을 지속적인 혼합 하에 실온에서 24 h 동안 인큐베이트한다. 총 반응 부피 내의 케토리토콜산의 농도는 약 100 g/l에 달한다.
24 시간 후, 사용된 케노디옥시콜산의 80% 초과량이 케토리토콜산으로 전환되었다.
케토리토콜산의 케노디옥시콜산으로의 전환은 박막 크로마토그래피에 의해 모니터되었다.
B) 락토바실러스(DE 10119274)로부터의 ADH /2상 시스템으로의 조효소 재생
3α-하이드록시-7-옥소-5-β-콜란산 (케토리토콜산)의 합성을 위해, 0.7 ㎖의 메틸 이소부틸 케톤에 용해된 100 ㎎의 3α-7α-디하이드록시-5-β-콜란산 (케노디옥시콜산)을, 0.1 ㎎의 NADP, 클로스트리디엠 신덴스(Pubmed AAB61151)로부터의 과발현된 7-α-하이드록시스테로이드 디하이드로게나아제를 함유하는 10 ㎎의 생물학적 함수 질량 대장균 및 락토바실러스(DE 10119274)로부터의 과발현된 알코올 디하이드로게나아제를 함유하는 5 ㎎의 생물학적 함수 질량 대장균을 함유하는 0.15 ㎖의 완충액 (100 mM 인산칼륨 완충액, pH = 7.5, 1 mM MgCl2, 10% 글리세롤)에 첨가한다. 상기 혼합물을 지속적인 혼합 하에 실온에서 24 h 동안 인큐베이트한다. 총 반응 부피 내의 케토리토콜산의 농도는 약 100 g/l에 달한다.
24 시간 후, 사용된 케노디옥시콜산의 90% 초과량이 케토리토콜산으로 전환되었다.

Claims (21)

  1. 고리 구조 내에 하나 또는 복수의 헤테로원자, 하나 또는 복수의 이중 결합 및/또는 하나의 방향족 성분을 포함하는 스테로이드 구조 (ABCD)를 포함하고, 상기 스테로이드 고리 시스템 내의 3, 7, 11, 12 또는 17 위치에 또는 상기 스테로이드 골격 (= 옥소스테로이드 화합물) 상의 임의의 탄소 모이어티의 α-위치 내에 하나 이상의 옥소기를 가지는 화합물의 거울상이성질선택적(enantioselective) 효소적 환원을 위한 공정으로서,
    Figure 112008059512611-PCT00005
    여기서 상기 옥소스테로이드 화합물은 보조인자(cofactor) NADH 또는 NADPH의 존재 하에 하이드록시스테로이드 디하이드로게나아제를 사용하여 환원되고,
    a) 상기 옥소스테로이드 화합물은 반응에서 ≥50 g/l의 농도로 제공되고,
    b) 상기 하이드록시스테로이드 디하이드로게나아제에 의해 형성된, 산화된 보조인자 NAD 또는 NADP는 일반식 RXRYCHOH의 이차 알코올의 산화에 의해 또는 C4-C6-시클로알칸올의 산화에 의해 연속적으로 재생되고 (여기서 RX,RY은 수소, 분기상(branched) 또는 직선상(unbranched) C1-C8-알킬 및 Ctotal≥3을 독립적으로 나 타낸다), 또한
    c) 추가적인 산화환원효소(oxidoreductase)/알코올 디하이드로게나아제는 일반식 RXRYCHOH의 이차 알코올 또는 시클로알칸올 각각의 산화에 사용된다
    는 것을 특징으로 하는, 공정.
  2. 청구항 1에 있어서, 일반식 Ⅰ의 화합물
    Figure 112008059512611-PCT00006
    이 옥소스테로이드 화합물로서 사용되는 것을 특징으로 하고,
    여기서
    R1은 수소, 메틸기, 하이드록시기 또는 옥소기를 나타내고,
    R2는 수소, 메틸기, 하이드록시기 또는 옥소기를 나타내며,
    R3는 수소, 하이드록시기, 옥소기 또는 메틸기를 나타내고,
    R4는 수소 또는 하이드록시기를 나타내며,
    R5는 수소, 모이어티 -COR10를 나타내고, 여기서 R10은 하이드록시기로 치환되 거나 또는 비치환된 C1-C4-알킬기 또는 치환되거나 또는 비치환된 C1-C4-카르복시알킬기이거나,
    또는 R4 및 R5는 함께 옥소기를 나타내며,
    R6는 수소, 메틸기, 하이드록시기 또는 옥소기를 나타내고,
    R7은 수소, 메틸기, 하이드록시기 또는 옥소기를 나타내며,
    R8은 수소, 메틸기 또는 할로겐화물(halide)을 나타내고, 또한
    R9은 수소, 메틸기, 하이드록시기, 옥소기 또는 할로겐화물을 나타내며, 여기서 R1, R2, R4+R5, R6, R8 또는 R9의 하나 이상은 옥소기이거나, 또는 R5는 모이어티 -COR10이고, 또한 구조적 요소
    Figure 112008059512611-PCT00007
    는 벤젠 고리이거나 또는 0, 1 또는 2개의 C-C-이중 결합을 가지는 C6-고리를 나타내는 것인, 공정.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 2-프로판올, 2-부탄올, 2-펜탄올, 4-메틸-2-펜탄올, 2-헥산올, 2-헵탄올, 5-메틸-2-헥산올 또는 2-옥탄올은 일반식 RXRYCHOH의 이차 알코올로서 사용되고, 또한 시클로헥산올은 시클로알코올로서 사용되는 것을 특징으로 하는, 공정.
  4. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서, 수성 유기 2상 시스템(aqueous organic two-phase system)에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 공정.
  5. 청구항 4에 있어서, 예를 들어, 디에틸 에테르, 3차 부틸 메틸 에테르, 디이소프로필 에테르, 디부틸 에테르, 에틸 아세테이트, 부틸 아세테이트, 헵탄, 헥산 또는 시클로헥산과 같은 유기 용매가 추가로 사용되는, 공정.
  6. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서, TTN (총 턴오버 수 = 환원된 옥소스테로이드 화합물의 mol / 사용된 보조인자의 mol)이 ≥103인 것을 특징으로 하는, 공정.
  7. 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사용된 옥소스테로이드 화합물의 50% 이상이 2 내지 96 시간 내에 하이드록시스테로이드 화합물로 환원되는 것을 특징으로 하는, 공정.
  8. 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서, 케토리토콜산(ketolithocholic acid) (식 Ⅱ)이 옥소스테로이드 화합물로서 사용되는 것을 특징으로 하는, 공정.
    Figure 112008059512611-PCT00008
  9. 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서, 덱사메타손(dexamethasone) (식 Ⅲ)이 옥소스테로이드 화합물로서 사용되는 것을 특징으로 하는, 공정.
    Figure 112008059512611-PCT00009
  10. 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서, 4-안드로스텐-3,17-디온(4-androstene-3,17-dione) (식 Ⅳ)이 옥소스테로이드 화합물로서 사용되는 것을 특징으로 하는, 공정.
    Figure 112008059512611-PCT00010
  11. 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서, 1,4-안드로스타디엔-3,17-디온(1,4-androstadiene-3,17-dione) (식 Ⅴ)이 옥소스테로이드 화합물로서 사용되는 것을 특징으로 하는, 공정.
    Figure 112008059512611-PCT00011
  12. 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서, 에스트론(estrone) (식 Ⅵ)이 옥소스테로이드 화합물로서 사용되는 것을 특징으로 하는, 공정.
    Figure 112008059512611-PCT00012
  13. 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서, 프레그네놀론(pregnenolone) (식 Ⅶ)이 옥소스테로이드 화합물로서 사용되는 것을 특징으로 하는, 공정.
    Figure 112008059512611-PCT00013
  14. 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서, 코르티손(cortisone) (식 Ⅷ)이 옥소스테로이드 화합물로서 사용되는 것을 특징으로 하는, 공정.
    Figure 112008059512611-PCT00014
  15. 고리 구조 내에 하나 또는 복수의 헤테로원자, 하나 또는 복수의 이중 결합 및/또는 하나의 방향족 성분을 포함하는 스테로이드 구조 (ABCD)를 포함하고, 스테 로이드 고리 시스템 내의 3, 7, 11, 12 또는 17 위치에 또는 스테로이드 골격 (= 하이드록시스테로이드 화합물) 상의 임의의 탄소 모이어티의 α-위치 내에 하나 이상의 하이드록시기를 가지는 화합물의 효소적 산화를 위한 공정으로서,
    Figure 112008059512611-PCT00015
    여기서 상기 하이드록시스테로이드 화합물은 보조인자 NAD 또는 NADP의 존재 하에 하이드록시스테로이드 디하이드로게나아제를 사용하여 산화되고,
    a) 상기 하이드록시스테로이드 화합물은 반응에서 ≥50 g/l의 농도로 제공되고,
    b) 상기 하이드록시스테로이드 디하이드로게나아제에 의해 형성된, 환원된 보조인자 NADH 또는 NADPH는 일반식 RXRYCO의 케토 화합물의 환원에 의해 또는 C4-C6-시클로알칸온의 환원에 의해 연속적으로 재생되고 (여기서 RX,RY은 수소, 분기상 또는 직선상 C1-C8-알킬 및 Ctotal≥3을 독립적으로 나타낸다), 또한
    c) 추가적인 산화환원효소/알코올 디하이드로게나아제는 일반식 RXRYCO의 케토 화합물 또는 시클로알칸온 각각의 환원에 사용된다
    는 것을 특징으로 하는, 공정.
  16. 청구항 15에 있어서, 일반식 Ⅰ의 화합물
    Figure 112008059512611-PCT00016
    이 하이드록시스테로이드 화합물로 사용되는 것을 특징으로 하고,
    여기서
    R1은 수소, 메틸기, 하이드록시기 또는 옥소기를 나타내고,
    R2는 수소, 메틸기, 옥소기 또는 하이드록시기를 나타내며,
    R3는 수소, 하이드록시기, 옥소기 또는 메틸기를 나타내고,
    R4는 수소 또는 하이드록시기를 나타내며,
    R5는 수소, 모이어티 -COR10를 나타내고, 여기서 R10은 하이드록시기로 치환되거나 또는 비치환된 C1-C4-알킬기 또는 치환되거나 또는 비치환된 C1-C4-카르복시알킬기이거나,
    또는 R4 및 R5는 함께 옥소기를 나타내며,
    R6는 수소, 메틸기, 옥소기 또는 하이드록시기를 나타내고,
    R7은 수소, 메틸기, 옥소기 또는 하이드록시기를 나타내며,
    R8은 수소, 메틸기 또는 할로겐화물을 나타내고, 또한
    R9은 수소, 메틸기, 하이드록시기, 옥소기 또는 할로겐화물을 나타내며, 여기서 R1, R2, R4, R6, R7, R8 또는 R9의 하나 이상은 하이드록시기이고, 또한 구조적 요소
    Figure 112008059512611-PCT00017
    는 벤젠 고리이거나 또는 0, 1 또는 2개의 C-C-이중 결합을 가지는 C6-고리를 나타내는 것인, 공정.
  17. 청구항 15 또는 청구항 16에 있어서, 아세톤, 2-부탄온, 2-펜탄온, 4-메틸-2-펜탄온, 2-헥산온, 2-헵탄온, 5-메틸-2-헥산온 또는 2-옥탄온은 일반식 RXRYCO의 케톤으로서 사용되고, 또한 시클로헥산온은 시클로알칸온으로서 사용되는 것을 특징으로 하는, 공정.
  18. 청구항 15 내지 청구항 17 중 어느 한 항에 있어서, 수성 유기 2상 시스템에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 공정.
  19. 청구항 18에 있어서, 예를 들어, 디에틸 에테르, 3차 부틸 메틸 에테르, 디이소프로필 에테르, 디부틸 에테르, 에틸 아세테이트, 부틸 아세테이트, 헵탄, 헥 산 또는 시클로헥산과 같은 유기 용매가 추가로 사용되는, 공정.
  20. 청구항 15 내지 청구항 19 중 어느 한 항에 있어서, TTN (총 턴오버 수 = 산화된 하이드록시스테로이드 화합물의 mol / 사용된 보조인자의 mol)이 ≥103인 것을 특징으로 하는, 공정.
  21. 청구항 15 내지 청구항 21 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사용된 하이드록시스테로이드 화합물의 50% 이상이 2 내지 96 시간 내에 옥소스테로이드 화합물로 산화되는 것을 특징으로 하는, 공정.
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