WO2021145458A1 - 胆汁酸を生成するための組成物 - Google Patents

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3βhsdh
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bacteria
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広瀬　信義
賢也 本田
優子 佐藤
幸二 新
聖子 成島
康通 新井
梢 竹下
悟史 笹島
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学校法人慶應義塾
Jsr株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a composition for producing bile acids. More specifically, the present invention relates to a composition containing a bacterium that produces bile acid related to 100 years of life (life span of 100 years or more) or the like as an active ingredient. The present invention also relates to an antibacterial use of the composition against Gram-positive bacteria, a therapeutic or preventive use of prostate cancer and the like.
  • the microbiota (a concept that integrates the genes and functions of the bacterial flora) is considered to be an important factor that influences the health condition of the elderly, such as resistance to pathogen infection, immunity, nerve activity, bone density, and digestive and absorptive function.
  • Non-Patent Documents 1 to 5 Phenomena of individual disparity and diversity are often found in the bacterial flora of the elderly, which are thought to be associated with aging of immune function, chronic systemic inflammation and senility (Non-Patent Document 6 and). 7).
  • Non-Patent Documents 8 and 9 It is known that centenarians who are 100 years old or older are less likely to suffer from diseases such as hypertension, diabetes, obesity and cancer, and thus achieve longevity. Furthermore, many centenarians have survived infectious diseases such as influenza, pulmonary tuberculosis, dysentery, and salmorella, and starvation (Non-Patent Document 10). This suggests that the bacterial flora of centenarians contributes not only to longevity, but also to aging health, resilience and homeostasis (). Non-Patent Documents 6 and 11-13).
  • An object of the present invention to be solved is to identify beneficial symbiotic bacteria peculiar to centenarians and to provide a method for preventing or treating pathogenic bacterial infection using the bacteria or the like.
  • the present inventors compared the 100-year-old (average 107 years old) with the elderly (85-89 years old) and the young (21-55 years old). Then, it was found that it specifically possesses intestinal bacteria that produce secondary bile acids such as isoalllo lithocholic acid (lithocholic acid, LCA), isoLCA, 3-oxoLCA, allolCA, and 3-oxoalloloLCA. In particular, the biochemical synthetic pathway that induces isoalloloLCA has not been reported so far.
  • the present inventors also revealed that the 5AR and 3 ⁇ HSDH are involved not only in the production of isoallolCA but also in the metabolism of testosterone.
  • Prostate cancer, etc. by producing metastasis-resistant 3 ⁇ -androstandiol while these enzymes, or the bacteria that produce them, deplete tumor-induced testosterone and 5 ⁇ -dihydrotestosterone (DHT).
  • DHT 5 ⁇ -dihydrotestosterone
  • the present inventors reduce the risk of infection with pathogenic bacteria, prostate cancer, etc. by specific secondary bile acid metabolites, enzymes involved in their production, and bacteria producing the enzymes. We have found that it is involved in longevity and have completed the present invention.
  • the present invention provides the following.
  • the present invention also provides for the manufacture of a composition for converting the 3-oxo - ⁇ 4 -LCA 3-Okisoaro LCA, it relates to the use of bacteria with a polynucleotide encoding the 5AR.
  • a composition for converting 3-oxoaloloLCA to isoalloloLCA which comprises a bacterium having a polynucleotide encoding 3 ⁇ -hydroxysteroid dehydrogenase (3 ⁇ HSDH) as an active ingredient.
  • the present invention also relates to the use of a bacterium having a polynucleotide encoding 3 ⁇ -hydroxysteroid dehydrogenase (3 ⁇ HSDH) to produce a composition for converting 3-oxoaroLCA to isoaroLCA.
  • a bacterium having a polynucleotide encoding 3 ⁇ -hydroxysteroid dehydrogenase (3 ⁇ HSDH) to produce a composition for converting 3-oxoaroLCA to isoaroLCA.
  • ⁇ 3> as an active ingredient a bacterium having a polynucleotide encoding a bacterial and 3 ⁇ HSDH with polynucleotides encoding 5AR, 3- oxo - [delta 4 compositions for producing Isoaro LCA from -LCA.
  • the present invention also relates to the use of 3-oxo - ⁇ 4 -LCA for the manufacture of a composition for producing Isoaro LCA, the bacteria with a polynucleotide encoding bacterial and 3 ⁇ HSDH having a polynucleotide encoding the 5AR Regarding.
  • ⁇ 4> as an active ingredient a bacterium having a polynucleotide encoding the polynucleotide and 3 ⁇ HSDH encoding 5AR, 3- oxo - [delta 4 compositions for producing Isoaro LCA from -LCA.
  • the present invention also provides 3-oxo - ⁇ 4 -LCA for the manufacture of a composition for producing Isoaro LCA, relates to the use of bacteria with a polynucleotide encoding the polynucleotide and 3 ⁇ HSDH encoding 5AR.
  • ⁇ 6> as an active ingredient a bacterium having a polynucleotide encoding 5BR, 3-oxo - ⁇ 4 -LCA the 3-oxo LCA (3-oxoLCA) composition for conversion to.
  • the present invention also provides for the manufacture of a composition for converting the 3-oxo - ⁇ 4 -LCA 3-oxo LCA, it relates to the use of bacteria with a polynucleotide encoding 5BR.
  • isoaroLCA from isoLCA or 3-oxoLCA containing a bacterium having a polynucleotide encoding 5AR, a polynucleotide encoding 3 ⁇ HSDH, and a polynucleotide encoding 5BR as an active ingredient.
  • Composition a bacterium having a polynucleotide encoding 5AR, a polynucleotide encoding 3 ⁇ HSDH, and a polynucleotide encoding 5BR as an active ingredient.
  • the present invention also provides 5AR-encoding polynucleotides, 3 ⁇ HSDH-encoding polynucleotides, and 5BR-encoding polynucleotides for producing compositions for producing isoaroLCA from isoLCA or 3-oxoLCA. Regarding the use of bacteria that have.
  • composition according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 7> which is an antibacterial composition against Gram-positive bacteria.
  • An antibacterial composition against Gram-positive bacteria containing at least one enzyme selected from 5AR, 3 ⁇ HSDH, and 5BR as an active ingredient.
  • composition according to any one of ⁇ 8> to ⁇ 10> which is a composition for treating or preventing an infectious disease of Gram-positive bacteria.
  • composition according to any one of ⁇ 8> to ⁇ 10> which is a composition for treating or preventing an infectious disease of Clostridium difficile.
  • ARDS / ALI acute respiratory distress syndrome
  • the present invention also comprises antibacterial compositions against Gram-positive bacteria, compositions for treating or preventing infections with Gram-positive bacteria, compositions for treating or preventing infections with Clostridium difficile, or sepsis and For producing a composition for treating or preventing at least one disease selected from the group consisting of ARDS / ALI having sepsis as an underlying disease.
  • a bacterium having a polynucleotide encoding a polynucleotide a polynucleotide encoding 5AR, a polynucleotide encoding 3 ⁇ HSDH
  • a bacterium having a polynucleotide encoding 5BR a polynucleotide encoding 5BR.
  • the present invention also provides for suppressing the growth of Gram-positive bacteria, for treating or preventing Gram-positive bacterial infections, for treating or preventing Clostridium difficile infections, or for sepsis and sepsis.
  • Bacteria with a polynucleotide encoding 5AR, a bacterium with a polynucleotide encoding 3 ⁇ HSDH, a bacterium with a polynucleotide encoding 5AR and a bacterium having a polynucleotide encoding 3 ⁇ HSDH, and a polynucleotide encoding 5AR and 3 ⁇ HSDH It relates to the use of at least one bacterium selected from the group consisting of a bacterium having a polynucleotide encoding a polynucleotide, a polynucleotide encoding 5AR, a polynucleotide encoding 3 ⁇ HSDH, and a bacterium having a polynucleotide encoding 5BR.
  • the present invention is also selected from the group consisting of suppression of growth of Gram-positive bacteria, treatment or prevention of Gram-positive bacterial infections, treatment or prevention of Clostridium difficile infections, or ARDS / ALI having sepsis and sepsis as underlying diseases.
  • Bacteria with a polynucleotide encoding 5AR, a bacterium with a polynucleotide encoding 3 ⁇ HSDH, a bacterium with a polynucleotide encoding 5AR and a bacterium having a polynucleotide encoding 3 ⁇ HSDH, and a polynucleotide encoding 5AR and 3 ⁇ HSDH The present invention relates to at least one bacterium selected from the group consisting of a bacterium having a polynucleotide encoding a polynucleotide, a polynucleotide encoding 5AR, a polynucleotide encoding 3 ⁇ HSDH, and a bacterium having a polynucleotide encoding 5BR.
  • the present invention also relates to a bacterium having a polynucleotide encoding 5AR, a bacterium having a polynucleotide encoding 3 ⁇ HSDH, a bacterium having a polynucleotide encoding 5AR, and a bacterium having a polynucleotide encoding 3 ⁇ HSDH, and a poly encoding 5AR.
  • At least one bacterium selected from the group consisting of a bacterium having a polynucleotide encoding a nucleotide and a polynucleotide encoding 3 ⁇ HSDH, and a bacterium having a polynucleotide encoding 5AR, a polynucleotide encoding 3 ⁇ HSDH, and a polynucleotide encoding 5BR.
  • the present invention also comprises antibacterial compositions against Gram-positive bacteria, compositions for treating or preventing infections with Gram-positive bacteria, compositions for treating or preventing infections with Clostridium difficile, or sepsis and With respect to the use of isoaroLCA or isoLCA to produce a composition for treating or preventing at least one disease selected from the group consisting of ARDS / ALI having sepsis as the underlying disease.
  • the present invention also provides for suppressing the growth of Gram-positive bacteria, for treating or preventing Gram-positive bacterial infections, for treating or preventing Clostridium difficile infections, or for sepsis and sepsis.
  • ARDS / ALI having as an underlying disease.
  • isoaroLCA or isoLCA With respect to the use of isoaroLCA or isoLCA.
  • the present invention is also selected from the group consisting of suppression of growth of Gram-positive bacteria, treatment or prevention of Gram-positive bacterial infections, treatment or prevention of Clostridium difficile infections, or sepsis and ARDS / ALI having sepsis as an underlying disease.
  • isoaroLCA or isoLCA for use in the treatment or prevention of at least one disease.
  • the present invention also administers an effective amount of isoaroLCA or isoLCA to a subject, infection with Clostridium difficile for the treatment or prevention of Gram-positive bacterial infections to suppress the growth of Gram-positive bacteria. It relates to a method for treating or preventing a disease, or for treating or preventing sepsis and at least one disease selected from the group consisting of ARDS / ALI having sepsis as an underlying disease.
  • the present invention also comprises antibacterial compositions against Gram-positive bacteria, compositions for treating or preventing infections with Gram-positive bacteria, compositions for treating or preventing infections with Clostridium difficile, or sepsis and At least one enzyme selected from 5AR, 3 ⁇ HSDH, and 5BR for producing a composition for treating or preventing at least one disease selected from the group consisting of ARDS / ALI having sepsis as an underlying disease. Regarding the use of.
  • the present invention also provides for suppressing the growth of Gram-positive bacteria, for treating or preventing Gram-positive bacterial infections, for treating or preventing Clostridium difficile infections, or for sepsis and sepsis. It relates to the use of at least one enzyme selected from 5AR, 3 ⁇ HSDH, and 5BR to treat or prevent at least one disease selected from the group consisting of ARDS / ALI having as an underlying disease.
  • the present invention is also selected from the group consisting of suppression of growth of Gram-positive bacteria, treatment or prevention of Gram-positive bacterial infections, treatment or prevention of Clostridium difficile infections, or sepsis and ARDS / ALI having sepsis as an underlying disease.
  • at least one enzyme selected from 5AR, 3 ⁇ HSDH, and 5BR for use in the treatment or prevention of at least one disease.
  • the present invention also administers an effective amount of at least one enzyme selected from 5AR, 3 ⁇ HSDH, and 5BR to a subject to treat or prevent Gram-positive bacterial infections to suppress the growth of Gram-positive bacteria.
  • at least one enzyme selected from 5AR, 3 ⁇ HSDH, and 5BR to treat or prevent an infection with Crostridium difficile, or to treat or prevent sepsis and at least one disease selected from the group consisting of ARDS / ALI with sepsis as the underlying disease. , Regarding the method.
  • a composition for converting 5 ⁇ -dihydrotestosterone (DHT) to 3 ⁇ -androstenediol which comprises a bacterium having a polynucleotide encoding 3 ⁇ HSDH as an active ingredient.
  • the present invention also relates to the use of bacteria having a polynucleotide encoding 3 ⁇ HSDH to produce a composition for converting DHT to 3 ⁇ -androstenediol.
  • a composition for producing 3 ⁇ -androstenediol from testosterone which comprises a bacterium having a polynucleotide encoding 5AR and a bacterium having a polynucleotide encoding 3 ⁇ HSDH as active ingredients.
  • the present invention also relates to the use of a bacterium having a polynucleotide encoding 5AR and a bacterium having a polynucleotide encoding 3 ⁇ HSDH for producing a composition for producing 3 ⁇ -androstenediol from testosterone.
  • a composition for producing 3 ⁇ -androstenediol from testosterone which comprises a bacterium having a polynucleotide encoding 5AR and a polynucleotide encoding 3 ⁇ HSDH as an active ingredient.
  • the present invention also relates to the use of bacteria having a polynucleotide encoding 5AR and a polynucleotide encoding 3 ⁇ HSDH for producing a composition for producing 3 ⁇ -androstenediol from testosterone.
  • composition containing 3 ⁇ HSDH as an active ingredient for producing 3 ⁇ -androstanediol from DHT is a composition containing 3 ⁇ HSDH as an active ingredient for producing 3 ⁇ -androstanediol from DHT.
  • the present invention also relates to the use of 3 ⁇ HSDH for producing compositions for producing 3 ⁇ -androstanediol from DHT.
  • composition for producing 3 ⁇ -androstanediol from testosterone which contains 5AR and 3 ⁇ HSDH as active ingredients.
  • the present invention also relates to the use of 5AR and 3 ⁇ HSDH to produce compositions for producing 3 ⁇ -androstanediol from testosterone.
  • composition disease group according to any one of ⁇ 14> to ⁇ 18>, which is a composition for treating or preventing at least one disease selected from the following disease groups: Prostate cancer, androgenetic alopecia, polycystic ovary syndrome, acne, hirsutism, ovarian endothelial cancer, neuroinflammation, and GABAA receptor-mediated epilepsy.
  • the present invention also comprises the production of a composition for treating or preventing at least one disease selected from the disease group.
  • the present invention also provides for the treatment or prevention of at least one disease selected from the disease group.
  • Bacteria with polynucleotides encoding 3 ⁇ HSDH, bacteria with polynucleotides encoding 5AR, bacteria with polynucleotides encoding 3 ⁇ HSDH, bacteria with polynucleotides encoding 5AR and polynucleotides encoding 3 ⁇ HSDH, and 3 ⁇ HSDH, and 5, The use of at least one substance selected from the group consisting of 5AR and 3 ⁇ HSDH.
  • the present invention also encodes a bacterium having a polynucleotide encoding 3 ⁇ HSDH and a bacterium having a polynucleotide encoding 5AR and 3 ⁇ HSDH for use in the treatment or prevention of at least one disease selected from the disease group. It relates to a bacterium having a polynucleotide, a bacterium having a polynucleotide encoding 5AR and a polynucleotide encoding 3 ⁇ HSDH, 3 ⁇ HSDH, and at least one substance selected from the group consisting of 5AR and 3 ⁇ HSDH.
  • the present invention also comprises a bacterium having a polynucleotide encoding 3 ⁇ HSDH, a bacterium having a polynucleotide encoding 5AR, a bacterium having a polynucleotide encoding 3 ⁇ HSDH, a polynucleotide encoding 5AR, and a polynucleotide encoding 3 ⁇ HSDH.
  • ⁇ 20> An evaluation method for at least one disease selected from the following disease groups.
  • Disease group Prostate cancer, androgenetic alopecia, polycystic ovary syndrome, acne, hirsutism, ovarian endothelial cancer, neuroinflammation, and GABAA receptor-mediated epilepsy, (1) A step of quantifying bacteria producing 3 ⁇ HSDH in the feces of a subject, (2) A step of comparing the value obtained by quantifying in step (1) with a corresponding value obtained by quantifying the bacterium of a centenarian, and (3) a result of comparison in step (2). When the quantitative value in the feces of the subject is equal to or higher than the corresponding value, it is determined that the subject is unlikely to suffer from the disease. A step of determining that a subject is likely to have or is likely to suffer from the disease when the quantitative value in the feces of the subject is lower than the corresponding value is included.
  • ⁇ 21> A method for preventing or treating at least one disease selected from the following disease groups.
  • Disease group Prostate cancer, androgenetic alopecia, polycystic ovary syndrome, acne, hirsutism, ovarian endothelial cancer, neuroinflammation, and GABAA receptor-mediated epilepsy,
  • a method for administering a bacterium that produces 3 ⁇ HSDH to the subject determined to have a high possibility of suffering from the disease or having a high possibility of suffering from the disease by the method according to ⁇ 20>.
  • ⁇ 22> A method for evaluating the possibility of survival over 100 years old.
  • (1) In the feces of the subject, at least one bile acid selected from the group consisting of 3-oxoLCA, isoaroLCA, 3-oxoaroLCA, alloloLCA, 3-oxoLCA and isoLCA is quantified.
  • Process, (2) The step of comparing the value obtained by quantifying in step (1) with the corresponding value obtained by quantifying the bile acid of the centenarian, and the result of comparison in step (3) step (2).
  • the quantitative value in the feces of the subject is equal to or higher than the corresponding value, it is determined that the subject is likely to survive 100 years or older.
  • a method comprising a step of determining that a subject is unlikely to survive over 100 years of age when the quantitative value in the feces of the subject is lower than the corresponding value.
  • a method for evaluating the possibility of survival over 100 years old (1) A step of quantifying bacteria producing at least one enzyme selected from 5AR, 3 ⁇ HSDH, and 5BR in the feces of a subject. (2) A step of comparing the value obtained by quantifying in step (1) with a corresponding value obtained by quantifying the bacterium of a centenarian, and (3) a result of comparison in step (2). When the quantitative value in the feces of the subject is equal to or higher than the corresponding value, it is determined that the subject is likely to survive 100 years or older. A method comprising a step of determining that a subject is unlikely to survive over 100 years of age when the quantitative value in the feces of the subject is lower than the corresponding value.
  • ⁇ 24> A method to improve the chances of surviving over 100 years old.
  • a method for evaluating resistance to Gram-positive bacteria (1) A step of quantifying at least one bile acid selected from the group consisting of 3-oxoLCA and isoaroLCA in the feces of a subject. (2) The step of comparing the value obtained by quantifying in step (1) with the corresponding value obtained by quantifying the bile acid of the centenarian, and the result of comparison in step (3) step (2). When the quantitative value in the feces of the subject is equal to or higher than the corresponding value, the subject is determined to have high resistance to Gram-positive bacteria.
  • a method comprising a step of determining that a subject has low resistance to Gram-positive bacteria when the quantitative value in the feces of the subject is lower than the corresponding value.
  • a method for evaluating resistance to Gram-positive bacteria (1) A step of quantifying bacteria producing at least one enzyme selected from 5AR, 3 ⁇ HSDH, and 5BR in the feces of a subject. (2) A step of comparing the value obtained by quantifying in step (1) with a corresponding value obtained by quantifying the bacterium of a centenarian, and (3) a result of comparison in step (2). When the quantitative value in the feces of the subject is equal to or higher than the corresponding value, the subject is determined to have high resistance to Gram-positive bacteria. A method comprising a step of determining that a subject has low resistance to Gram-positive bacteria when the quantitative value in the feces of the subject is lower than the corresponding value.
  • ⁇ 27> A method of preventing gram-positive bacterial infections. Select from 3-oxoLCA, isoaroLCA, and 5AR, 3 ⁇ HSDH, and 5BR for the subject determined to have low resistance to Gram-positive bacteria by the method according to ⁇ 25> or ⁇ 26>.
  • a method for producing isoaroLCA which comprises a step of culturing a bacterium having a polynucleotide encoding 3 ⁇ HSDH in the presence of 3-oxoaroLCA and collecting the isoaroLCA produced in the bacterium and / or the culture thereof. ..
  • ⁇ 29> the presence of 3-oxo - ⁇ 4 -LCA, culturing a bacterium comprising the polynucleotide encoding a bacterial and 3 ⁇ HSDH having a polynucleotide encoding the 5AR, produced in bacteria and / or cultures thereof
  • a method for producing an isoaro LCA which comprises a step of collecting the isoaro LCA.
  • a bacterium having a polynucleotide encoding 5AR, a polynucleotide encoding 3 ⁇ HSDH, and a polynucleotide encoding 5BR is cultivated, and the bacterium and / or a culture thereof.
  • a method for producing isoaroLCA which comprises a step of collecting the isoaroLCA produced in.
  • a method for producing isoaroLCA which comprises a step of producing isoaroLCA from 3-oxoaroLCA in the presence of 3 ⁇ HSDH and collecting the isoaroLCA.
  • ⁇ 33> 5AR and presence of 3BetaHSDH generates Isoaro LCA from 3-oxo - ⁇ 4 -LCA, comprising the step of collecting the Isoaro LCA, manufacturing method of Isoaro LCA.
  • a method for producing isoaroLCA which comprises a step of producing isoaroLCA from isoLCA or 3-oxoLCA in the presence of 5AR, 3 ⁇ HSDH and 5BR, and collecting the isoaroLCA.
  • bile acids related to Hyakuju can be produced.
  • the bile acids, enzymes involved in their production, bacteria producing the enzymes, and the like enable treatment or prevention of infectious diseases of Gram-positive bacteria, prostate cancer, and the like.
  • by using the amount of these bacteria in feces as an index, resistance to gram-positive bacterial infections, possibility of developing prostate cancer, etc., and possibility of survival over 100 years old It is also possible to evaluate sex.
  • FIG. 1A A PCoA plot of ⁇ -diversity showing the dissimilarity of Bray-Curtis. It is shown that the intestinal flora of younger subjects (elderly and younger) gradually separates from the intestinal flora of centenarians.
  • Figures 1A to 1G show the gut microbiota of subjects (Japanese long-lived (centenarian), elderly, and young) based on whole metagenomic shotgun sequencing and de novo assembly analysis. Show features.
  • centenarian and elderly subjects There was a significant increase in centenarian and elderly subjects compared to younger subjects, which are dot plots showing the Shannon diversity index (P ⁇ 0.05, linear model). It is a graph which shows the relative abundance (Reactive amount) of 5 bacterial phylums having a large abundance. It is a graph which shows the change of the relative abundance (RelAb) of the intestinal bacterial species (MSPs) among the centenarian, the elderly, and the youth controls, grouped according to the characteristics of old age for the different abundance. It is a graph which shows the change of the relative abundance of Gut microbiota among the centenarian, the elderly, and the adolescent controls, grouped according to the characteristics of young people for the different abundance.
  • MSPs intestinal bacterial species
  • each feature shows a model representing different relative abundance situations for species belonging to a predetermined trajectory within a group of centenarians, the elderly and young.
  • the color scale represents the coefficients from the linear model, and in each comparison shows the increase (“red” under color display) and decrease (“blue” under color display) of the species.
  • the Hyakujusha 91 (CE91) that the present inventors have paid attention to is shown by a dotted frame.
  • 2A-2G show that the feces of centenarians have significantly higher contents of isoLCA, 3-oxoLCA, allolCA, isoalloloLCA and 3-oxoLLCA.
  • a multidimensional scaling plot (MDS) using Spearman's correlation showing differences between individual bile acid analysis results. Each point indicates each individual donor color-coded by age group (centenarian vs. elderly; P 4.27E-9, centenarian vs.
  • FIG. 5 is a graph showing the average ratio of CA-based bile acids (having 7 ⁇ - and 12 ⁇ -OH groups) to CDCA-based bile acids (having 7 ⁇ -OH groups). It is a graph which shows the quantitative result of each bile acid compound in feces.
  • FIGS. 3B and 3C show the result of the bile acid metabolism using 50 ⁇ M LCA as a substrate by 68 strains derived from CE91.
  • CE91 from 68 strain shows the results of the bile acid metabolism as a substrate 3-oxo- ⁇ 4 -LCA of 50 [mu] M, which is a graph.
  • FIGS. 3B and 3C the isolated bacteria were cultured under anaerobic conditions in a medium adjusted to pH 9 for 48 hours at 37 ° C.
  • the presence or absence of the predicted bile acid metabolizing enzyme gene homologue is shown on the right side of the waffle chart. Homolog was defined as ⁇ 1e-12 E value;> 30% sequence match;> 60% query coverage.
  • a graph region lightly colored in red under color display indicates a compound having a trans-type chemical structure, and blue indicates a compound having a cis-type chemical structure.
  • P. It is a schematic diagram of the predicted bile acid metabolizing enzyme gene in merdae St3 and Odoribacteraceae St21. Arrows indicate coding sequences. In addition, under color display, they are color-coded based on the identified functions. P. It is a graph which shows the result of the bile acid metabolism assay in the deletion strain of the 5AR, 3 ⁇ HSDH or 5BR gene of merdae St3.
  • MIC90 minimum inhibitory concentration
  • Arrows indicate shape changes after isoalloloLCA treatment. 12.5 ⁇ M in a 3-oxo- ⁇ 4 -LCA containing WCA medium from CE91 Odoribacteraceae St21, C. innocuum St51 or P.I. C.I. when co-cultured with distasonis St4. It is a graph which shows the result of in vitro growth suppression of Difficile 630 or VRE. CFU when cultured overnight is shown (n 6). It is a figure which shows the MIC90 of isoalloloLCA with respect to a symbiotic strain in WCA medium or BHI medium. It is a dot plot figure which shows the Shannon index about the diversity of the stool culture solution after the secondary bile acid treatment.
  • FIGS. 4D and 4F The results of incubating human fecal samples of healthy young donors in improved WCA medium supplemented with 3-oxoLCA or LCA, isoalloloLCA (50 ⁇ M) for 48 hours are shown.
  • the data are shown as mean ⁇ standard deviation. *** indicates that P ⁇ 0.001.
  • FIG. 4D shows the results of the Mann-Whitney test with Welch correction.
  • FIG. 4F shows the results of the Kruskal-Wallis test with the Dunn test. ns indicates that there is no significant difference. Each point shows the result of one microtiter plate in FIG. 4D and the result of stool culture of the donor in FIG. 4F.
  • MMSE Mini-mental state examination
  • FIG. 5 is a graph showing relative abundance of species significantly increased in centenarians among centenarians, the elderly, young people, direct relatives of centenarians, and IBD patients.
  • FIG. 5 is a graph showing the relative abundance of species significantly reduced in centenarians among centenarians, the elderly, young people, direct relatives of centenarians, and IBD patients.
  • FIG. 5 is a graph showing the relative abundance of centenarians and their lineal relatives to species in centenarians, the elderly, young people, lineal relatives of centenarians, and IBD patients.
  • centenarians 160
  • elderly people 112
  • young people 40
  • FIGS. 8A-8C the data are shown as mean ⁇ standard deviation. *** P ⁇ 0.001; ** P ⁇ 0.01; * P ⁇ 0.05; One-way ANOVA with Tukey's test. ns indicates that there is no significant difference. It is a scatter diagram which shows the correlation between the pH level in feces and each secondary bile acid by a regression line. Each dot indicates an individual result. The coefficient (r) of Spaarman and its superiority (P) are shown in the samples of centenarians (under color display, orange), elderly people (under color display, blue), and young people (under color display, gray). Calculated separately for the group.
  • ns indicates that there is no significant difference.
  • the total amount of bile acid in stool is expressed in ⁇ mol / g with respect to the wet weight of stool.
  • nd indicates that it has not been detected. It is a graph which shows the result of having analyzed the bile acid metabolism using CDCA as a substrate in in vitro, pH 7 by 68 strains derived from CE91. It is a graph which shows the result of having analyzed the bile acid metabolism using CDCA as a substrate in in vitro, pH 9 by 68 strains derived from CE91.
  • FIG. 3A It is a figure which shows the outline of the gene cluster which encodes the bile acid metabolizing enzyme of the Bacteroidetes strain. The result of analysis of the gene cluster of the Bacteroidetes strain isolated from the centenarian (CE91) is shown.
  • Gene clusters containing homologs of 5AR color display, magenta color
  • 5BR color display, blue
  • 3 ⁇ HSDH group 1 color display, green
  • 3 ⁇ HSDH group 2 color display, purple
  • Gene homologues were defined as having ⁇ 1e- 12E values,> 30% sequence identity, and> 60% query coverage similarity.
  • the arrows indicate the coding sequence and are color coded according to the annotated function.
  • 3 is a graph showing the results of culturing the Bacteroidetes strain in WCA medium adjusted to pH 9 by adding 3-oxoalloLCA (final concentration 50 ⁇ M) as a substrate and analyzing the metabolism of LCA-related compounds.
  • 3 is a graph showing the results of culturing the Bacteroidetes strain in WCA medium adjusted to pH 9 by adding 3-oxoLCA (final concentration 50 ⁇ M) as a substrate and analyzing the metabolism of LCA-related compounds.
  • It is a graph which shows the result of culturing the Bacteroidetes strain in the WCA medium adjusted to pH 9 by adding isoLCA (final concentration 50 ⁇ M) as a substrate, and analyzing the metabolism of an LCA-related compound.
  • isoLCA final concentration 50 ⁇ M
  • the plasmid for making the deletion was prepared by inserting the homologous sequences immediately upstream and downstream of the target gene into the pLGB30 plasmid. The fact that the deletion product could be prepared was confirmed by PCR using primers inside (# 3- # 4) and outside (# 1- # 2) at the homologous sequence site. It is a graph which shows the growth curve of a pathogen at the time of culturing by changing the secondary bile acid concentration. The growth was detected by measuring the absorbance (OD600) of the medium cultured under anaerobic conditions at 37 ° C. using WCA medium.
  • the arrowhead indicates the shape change after isoalloloLCA treatment.
  • WCA medium and Brain Heart Infusion (BHI) medium containing different concentrations of isoalloloLCA, C.I. Difficile 630, VRE, SDSE, C.I. symbiosum, C.I. scandens, or C.I.
  • BHI Brain Heart Infusion
  • the dot diagram in the center is a dot diagram showing the correlation between the amount of secondary bile acids in the feces of centenarians and the relative abundance of the corresponding species. Black dots indicate a significant Spearman correlation at FDR P ⁇ 0.05. Wild type (WT) P.I. merdae St3 (“PmWT” in the figure) or 5AR-deficient type ( ⁇ 5AR) P.I. It is a graph which shows the result of having analyzed the metabolism of testosterone in vitro by merdee St3 (“Pm ⁇ 5AR” in the figure). The strain was anaerobically cultured at 37 ° C. for 48 hours in WCA medium adjusted to pH 7. P.
  • ⁇ 3-oxo-5 ⁇ -steroid-4-dehydrogenase The 3-oxo-5 ⁇ -steroid-4-dehydrogenase (3-oxo-5-alpha-steroid-4-dehydrogenase, 5AR) according to the present invention is also referred to as 5 ⁇ -reductase (5 ⁇ -reductase), and EC1.3. An enzyme identified by 99.5.
  • 5AR according to the present invention, 3-oxo - [delta 4 reaction to convert the -LCA 3-Okisoaro LCA (or converting the 3-Okisoaro LCA 3-oxo - ⁇ 4 -LCA reactions) and / or 5 ⁇ testosterone -An enzyme that has the activity of catalyzing a reaction that converts dihydrotestosterone (DHT) (or a reaction that converts DHT to testosterone).
  • DHT dihydrotestosterone
  • 5AR according to the present invention is preferably a protein containing an amino acid sequence having high homology with respect to the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 69 to 89.
  • the 5AR according to the present invention may have a natural or non-natural (artificial) mutation introduced into the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 69 to 89. That is, the 5AR according to the present invention includes an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, added, and / or inserted in the amino acid sequence of 5AR (amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 69, etc.). It also contains proteins.
  • the term "plurality” is not particularly limited, but is preferably 2 to 150, more preferably 2 to 100, still more preferably 2 to 70, more preferably 2 to 50, still more preferably 2 to. 30, more preferably 2 to 20, still more preferably 2 to 10 (for example, 2 to 9, 2 to 8, 2 to 7, 2 to 6, 2 to 5, 2 to 4) 2 to 3 pieces, 2 pieces).
  • 5AR according to the present invention is a protein containing an amino acid sequence encoded by a DNA encoding the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 69 to 89 and a DNA that hybridizes under stringent conditions. You may.
  • the 3 ⁇ -hydroxysteroid dehydrogenase (3 ⁇ -hydroxysteroid dehydrogenase, 3 ⁇ HSDH) is an enzyme specified by EC 1.1.1.145 and can be two isotypes (3 ⁇ HSDH1 and 3 ⁇ HSDH2), but is preferable. It is 3 ⁇ HSDH2.
  • the 3 ⁇ HSDH according to the present invention is a reaction for converting 3-oxoaroLCA to isoaroLCA (or a reaction for converting isoaroLCA to 3-oxoaroLCA), and a reaction for converting 3-oxoaloca to isoLCA (or isoLCA 3).
  • 3 ⁇ HSDH1 is preferably a protein containing an amino acid sequence having high homology with respect to the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 113 to 129.
  • 3 ⁇ HSDH2 is preferably a protein containing an amino acid sequence having high homology with respect to the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 130 to 141.
  • the 3 ⁇ HSDH1 according to the present invention may have a natural or non-natural (artificial) mutation introduced into the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 113 to 129. That is, the 3 ⁇ HSDH1 according to the present invention contains an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, added, and / or inserted in the amino acid sequence of 3 ⁇ HSDH1 (amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 113, etc.). It also contains proteins.
  • the term "plurality” is not particularly limited, but is preferably 2 to 200, more preferably 2 to 180, still more preferably 2 to 150, more preferably 2 to 100, still more preferably 2 to.
  • 70 pieces more preferably 2 to 50 pieces, still more preferably 2 to 30 pieces, more preferably 2 to 20 pieces, still more preferably 2 to 10 pieces (for example, 2 to 9 pieces, 2 to 8 pieces, 2 to 7 pieces). 2 to 6 pieces, 2 to 5 pieces, 2 to 4 pieces, 2 to 3 pieces, 2 pieces).
  • the 3 ⁇ HSDH2 according to the present invention may have a natural or non-natural (artificial) mutation introduced into the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 130 to 141. That is, the 3 ⁇ HSDH2 according to the present invention contains an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, added, and / or inserted in the amino acid sequence of 3 ⁇ HSDH2 (amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 130, etc.). It also contains proteins.
  • the term "plurality” is not particularly limited, but is preferably 2 to 150, more preferably 2 to 100, still more preferably 2 to 70, more preferably 2 to 50, still more preferably 2 to. 30, more preferably 2 to 20, still more preferably 2 to 10 (for example, 2 to 9, 2 to 8, 2 to 7, 2 to 6, 2 to 5, 2 to 4) 2 to 3 pieces, 2 pieces).
  • the 3 ⁇ HSDH1 according to the present invention may be a protein containing an amino acid sequence encoded by a DNA encoding the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 113 to 129 and a DNA hybridizing under stringent conditions. good.
  • 3 ⁇ HSDH2 is a protein containing an amino acid sequence encoded by a DNA encoding the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 130 to 141 and a DNA that hybridizes under stringent conditions. You may.
  • the 3-oxo-5 ⁇ -steroid-4-dehydrogenase (3-oxo-5 ⁇ -steroid 4-dehydrogenase, 5BR) according to the present invention is an enzyme specified by EC1.3.999.6.
  • 5BR have activity to catalyze 3-oxo - [delta 4 reaction to convert the -LCA 3-oxo-LCA (or converting the 3-oxo LCA 3-oxo - ⁇ 4 -LCA reaction) It is an enzyme.
  • the 5BR according to the present invention is preferably a protein containing an amino acid sequence having high homology with respect to the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 90 to 112.
  • the 5BR according to the present invention may have a natural or non-natural (artificial) mutation introduced into the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 90 to 112. That is, the 5BR according to the present invention includes an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, added, and / or inserted in the amino acid sequence of 5BR (amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 90, etc.). It also contains proteins.
  • the term "plurality” is not particularly limited, but is preferably 2 to 250, more preferably 2 to 200, still more preferably 2 to 150, more preferably 2 to 100, still more preferably 2 to.
  • 70 pieces more preferably 2 to 50 pieces, still more preferably 2 to 30 pieces, more preferably 2 to 20 pieces, still more preferably 2 to 10 pieces (for example, 2 to 9 pieces, 2 to 8 pieces, 2 to 7 pieces). 2 to 6 pieces, 2 to 5 pieces, 2 to 4 pieces, 2 to 3 pieces, 2 pieces).
  • 5BR is a protein containing an amino acid sequence encoded by a DNA encoding the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 90 to 112 and a DNA that hybridizes under stringent conditions. You may.
  • high homology is 20% or more (for example, 25% or more, 30% or more, 35% or more, 40% or more, 45% or more, 50% or more, 55% or more). , 60% or more (for example, 65% or more, 70% or more, 75% or more, 85% or more), and 80% or more (for example, 85% or more, 86% or more, 87% or more, 88% or more, 89%). More preferably, 90% or more (for example, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more). It is preferable, and it is particularly preferable that it is 100%.
  • “Homology” can mean similarity or identity.
  • “homology” may mean, in particular, identity.
  • the homology of the amino acid sequence can be determined by using an alignment program such as BLAST (Basic Local Sequence Search Tool at the National Center for Biological Information). For example, amino acid sequence homology includes homology between amino acid sequences calculated using blastp, and more specifically, blastp using default parameters (ie, using default parameters). ) Homology between the calculated amino acid sequences can be mentioned.
  • amino acid substitutions and the like are preferably conservative substitutions.
  • Constant substitution means substituting with another amino acid residue having a chemically similar side chain.
  • a group of amino acid residues having chemically similar amino acid side chains is well known in the art to which the present invention belongs.
  • acidic amino acids (aspartic acid / glutamic acid), basic amino acids (lysine, arginine, histidine), neutral amino acids, amino acids having a hydrocarbon chain (glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline), hydroxy groups Amino acids with (serine / threonine), amino acids containing sulfur (cysteine / methionine), amino acids with amide group (aspartin / glutamine), amino acids with imino group (proline), amino acids with aromatic group (phenylalanine / tyrosine / It can be classified by tryptophan).
  • the "stringent condition” is, for example, a hybridization condition of about “1XSSC, 0.1% SDS, 37 ° C.”, and the stricter condition is "0.5XSSC, 0. Hybridization conditions of about 1% SDS, 42 ° C., and more stringent conditions include hybridization conditions of about 0.2XSSC, 0.1% SDS, 65 ° C.
  • sequence numbers that specify various sequences according to the present invention are shown in Tables 1 to 4 below. Furthermore, in Tables 1 to 4, the presence or absence of possession of various enzymes of the bacterial strains (68 species) peculiar to centenarians is also shown.
  • the numbers in the items of 16SrDNA to 3 ⁇ HSDH2 indicate the sequence number of the DNA sequence that specifies 16SrDNA and the sequence number of the amino acid sequence that specifies various enzymes. Further, in the item of 16SrDNA to 3 ⁇ HSDH, the black circle indicates that the bacterial strain carries the enzyme, although the sequence information is not disclosed. A hyphen indicates that the bacterial strain does not carry the enzyme.
  • enzyme according to the present invention may be directly or indirectly added to "5AR", “3 ⁇ HSDH” and “5BR” (hereinafter, also collectively referred to as “enzyme according to the present invention") according to the present invention.
  • the addition is not particularly limited, and may be an addition at the gene level or a chemical addition.
  • the site to be added is not particularly limited, and may be either the amino terminal or the carboxyl terminal of the enzyme according to the present invention, or both. Addition at the gene level is achieved by adding a DNA encoding the enzyme according to the present invention to which a reading frame of a DNA encoding another protein is added.
  • the "other protein” added in this manner is not particularly limited, and for the purpose of facilitating the purification of the enzyme according to the present invention, the polyhistidine (His-) tag (tag) protein, FLAG-
  • a tag protein for purification such as tag protein (registered trademark, Sigma-Aldrich), glutathione-S-transferase (GST) is preferably used, and for the purpose of facilitating the detection of the enzyme according to the present invention,
  • a tag protein for detection such as a fluorescent protein such as GFP and a chemically luminescent protein such as luciferase is preferably used.
  • the chemical addition may be covalent or non-covalent.
  • the “covalent bond” is not particularly limited, and is, for example, an amide bond between an amino group and a carboxyl group, an alkylamine bond between an amino group and an alkyl halide group, a disulfide bond between thiols, a thiol group and a maleimide group or an alkyl halide.
  • a thioether bond with a group can be mentioned.
  • Examples of the "non-covalent bond” include a biotin-avidin bond.
  • a fluorescent dye such as Cy3 or rhodamine is preferably used. Be done.
  • the enzyme according to the present invention can be obtained by culturing bacteria or the like that produce each of these enzymes.
  • the cultured bacteria or the like are recovered from the medium by filtration, centrifugation or the like, and the recovered bacteria or the like are treated by cell lysis, grinding treatment, pressure crushing or the like, and further, ultrafiltration treatment, salting out, etc.
  • examples thereof include a method of purifying and concentrating a protein expressed in bacteria or the like by solvent precipitation such as sulfate precipitation, chromatography (for example, gel chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography) or the like.
  • the purified tag protein When the above-mentioned purified tag protein is added to the enzyme according to the present invention, it can be purified and collected using a substrate to which the tag protein is adsorbed. Further, these purification and concentration methods may be carried out alone or in combination as appropriate and may be carried out in multiple steps.
  • the enzyme according to the present invention is not limited to the above biological synthesis, and can also be produced by using the DNA or the like and the cell-free protein synthesis system according to the present invention described later.
  • the cell-free protein synthesis system is not particularly limited, and examples thereof include wheat germ-derived, Escherichia coli-derived, rabbit reticulocyte-derived, and insect cell-derived synthetic systems. Further, those skilled in the art can chemically synthesize the enzyme according to the present invention using a commercially available peptide synthesizer or the like.
  • the enzyme according to the present invention may be mixed with other components and used.
  • the other components are not particularly limited, and examples thereof include sterile water, physiological saline, vegetable oils, surfactants, lipids, solubilizers, buffers, protease inhibitors, and preservatives.
  • the polynucleotide according to the present invention may be a natural DNA or RNA as long as it encodes the above-mentioned enzyme according to the present invention, and is a DNA or RNA in which a mutation is artificially introduced into the natural DNA or RNA. It may be a DNA or RNA consisting of an artificially designed nucleotide sequence. Furthermore, the morphology is not particularly limited, and includes cDNA, genomic DNA, mRNA, chemically synthesized DNA, and chemically synthesized RNA. Preparation of these polynucleotides can be carried out by using conventional means for those skilled in the art.
  • genomic DNA is extracted from various bacteria to prepare a genomic library (plasmids, phages, cosmids, BACs, PACs, etc. can be used as vectors), and the present invention is developed. It can be prepared by performing colony hybridization or plaque hybridization using a probe prepared based on the nucleotide sequence of the gene encoding such an enzyme. It is also possible to prepare a primer specific to the gene encoding the enzyme according to the present invention and perform PCR using the primer.
  • cDNA for example, cDNA is synthesized based on mRNA extracted from various bacteria, and this is inserted into a vector such as ⁇ ZAP to prepare a cDNA library, which is expanded to develop colony high in the same manner as above. It can be prepared by performing hybridization or plaque hybridization, or by performing PCR.
  • a mutation encoding the above-mentioned amino acid substitution can be introduced into the DNA thus prepared by a person skilled in the art by using a known part-specific mutation introduction method.
  • the part-specific mutagenesis method include the Kunkel method (Kunkel, TA, Proc Natl Acad Sci USA, 1985, Vol. 82, No. 2, pp. 488-492), SOE (splicing-by-overlap).
  • SOE splicing-by-overlap
  • -Extension) -PCR method Ho, S.N., Hunt, HD, Horton, RM, Pullen, JK, and Peace, LR, Gene, 1989, Vol. 77 , Pages 51-59).
  • a person skilled in the art can artificially design a nucleotide sequence encoding the protein into which the above-mentioned amino acid substitution has been introduced, and based on the sequence information, use an automatic nucleic acid synthesizer to obtain the polynucleotide according to the present invention. It can also be chemically synthesized.
  • the polynucleotide according to the present invention is an enzyme according to the present invention in which codons are optimized according to the type of the host cell from the viewpoint of further improving the expression efficiency of the enzyme according to the present invention to be encoded.
  • the aspect of the DNA encoding the above can also be taken.
  • the vector in which the DNA is inserted can be taken so that the above-mentioned polynucleotide can be replicated in the host cell.
  • the "vector” exists as a self-replicating vector, that is, an extrachromosomal independent body, and its replication does not depend on chromosomal replication, for example, it can be constructed on the basis of a plasmid.
  • the vector may also be one that, when introduced into a host cell, integrates into the genome of the host cell and replicates with the chromosome into which it has been integrated.
  • Examples of such a vector include a plasmid and a phage DNA.
  • the plasmids include Escherichia coli-derived plasmids (pET22, pBR322, pBR325, pUC118, pUC119, pUC18, pUC19, etc.), yeast-derived plasmids (YEp13, YEp24, YCp50, etc.), Bacillus subtilis-derived plasmids (pUB110, pTP5, etc.).
  • Examples of the phage DNA include ⁇ phage (Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, ⁇ gt10, ⁇ gt11, ⁇ ZAP, etc.).
  • an insect viral vector such as baculovirus
  • an animal viral vector such as a retrovirus or an adenovirus vector
  • the procedure and method for constructing the vector according to the present invention those commonly used in the field of genetic engineering can be used. For example, in order to insert the DNA according to the present invention into a vector, first, the purified DNA is cleaved with an appropriate restriction enzyme, inserted into the restriction enzyme site or multicloning site of the appropriate vector, and ligated to the vector. Etc. are adopted.
  • the vector according to the present invention may be in the form of an expression vector containing the enzyme according to the present invention encoded by the DNA in a state in which it can be expressed in a host cell.
  • a DNA sequence that controls the expression and a transformed host cell are used. It is desirable to include a genetic marker or the like for selection.
  • the DNA sequence that controls expression includes a promoter, an enhancer, a splicing signal, a poly A addition signal, a ribosome binding sequence (SD sequence), a terminator, and the like.
  • the promoter is not particularly limited as long as it exhibits transcriptional activity in the host cell, and can be obtained as a DNA sequence that controls the expression of a gene encoding a protein that is the same as or different from that of the host cell.
  • a DNA sequence that induces expression may be included.
  • the expression of the gene located downstream is induced by adding isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside (IPTG).
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside
  • lactose operon There is a lactose operon that can be used.
  • the gene marker in the present invention may be appropriately selected depending on the method for selecting the transformed host cell, and for example, a gene encoding drug resistance or a gene complementing auxotrophy can be used.
  • DNA encoding the enzyme according to the present invention may be inserted into the vector, or a plurality of types of DNA may be inserted into one vector.
  • a plurality of types of DNA When inserting a plurality of types of DNA into a vector, it is preferable that these DNAs form an operon when a plurality of types of DNA are inserted into one vector.
  • the "operon" is a nucleic acid sequence unit composed of one or a plurality of genes transcribed under the control of the same promoter.
  • the "bacterium having a polynucleotide encoding 5AR" according to the present invention is not particularly limited as long as it is a bacterium having the above-mentioned polynucleotide encoding 5AR according to the present invention, and for example, Parabacteroides having the polynucleotide. Goldsteini, Parabacteroides merdee, Bacteroides dorie, Bacteroides thetaiotaomicron, Bacteroides uniformis, Alistopes finegoldii, Alisiteradic.
  • Parabacteroides goldsteinii which has a polynucleotide having a very high identity to the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 2.
  • Parabacteroides merdae which has a polynucleotide having a very high identity to the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3.
  • SEQ ID NO: Bacteroides dorei which has a polynucleotide having a very high identity to the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 6 or 7.
  • SEQ ID NO: Bacteroides thetaiotaomicron which has a polynucleotide having a very high identity to the nucleotide sequence set forth in 8 or 9.
  • Alistopes finegoldii which has a polynucleotide having a very high identity to the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 15 or 16.
  • Alistopes onderdonkii which has a polynucleotide having a very high identity to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17 or 18.
  • the "bacterium having a polynucleotide encoding 3 ⁇ HSDH” according to the present invention is not particularly limited as long as it is a bacterium having the above-mentioned polynucleotide encoding 3 ⁇ HSDH according to the present invention, and for example, Parabacteroides having the polynucleotide.
  • Parabacteroides goldsteinii which has a polynucleotide having a very high identity to the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 2.
  • Parabacteroides merdae which has a polynucleotide having a very high identity to the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3.
  • SEQ ID NO: Bacteroides dorei which has a polynucleotide having a very high identity to the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 6 or 7.
  • SEQ ID NO: Bacteroides thetaiotaomicron which has a polynucleotide having a very high identity to the nucleotide sequence set forth in 8 or 9.
  • Alistopes finegoldii which has a polynucleotide having a very high identity to the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 15 or 16.
  • Alistopes onderdonkii which has a polynucleotide having a very high identity to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17 or 18.
  • SEQ ID NO: Corynebacterium striatum which has a polynucleotide having a very high identity to the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 29.
  • Gordonibacter pamelaea which has a polynucleotide having a very high identity to the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 32.
  • the "bacteria having a polynucleotide encoding 5AR and a polynucleotide encoding 3 ⁇ HSDH" according to the present invention is a bacterium having the above-mentioned polynucleotide encoding 5AR and a polynucleotide encoding 3 ⁇ HSDH according to the present invention.
  • Parabacteroides goldsteinii which has a polynucleotide having a very high identity to the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 2.
  • Parabacteroides merdae which has a polynucleotide having a very high identity to the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3.
  • SEQ ID NO: Bacteroides dorei which has a polynucleotide having a very high identity to the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 6 or 7.
  • SEQ ID NO: Bacteroides thetaiotaomicron which has a polynucleotide having a very high identity to the nucleotide sequence set forth in 8 or 9.
  • Alistopes finegoldii which has a polynucleotide having a very high identity to the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 15 or 16.
  • Alistopes onderdonkii which has a polynucleotide having a very high identity to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17 or 18.
  • the "bacteria having a polynucleotide encoding 5BR" according to the present invention is not particularly limited as long as it has the above-mentioned polynucleotide encoding 5BR according to the present invention.
  • Parabacteroides goldsteinii and Parabacteroides having the polynucleotide.
  • Parabacteroides goldsteinii which has a polynucleotide having a very high identity to the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 2.
  • Parabacteroides merdae which has a polynucleotide having a very high identity to the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3.
  • SEQ ID NO: Parabacteroides distasonis which has a polynucleotide having a very high identity to the nucleotide sequence set forth in 4 or 5.
  • SEQ ID NO: Bacteroides dorei which has a polynucleotide having a very high identity to the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 6 or 7.
  • Alistopes finegoldii which has a polynucleotide having a very high identity to the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 15 or 16.
  • Alistopes onderdonkii which has a polynucleotide having a very high identity to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17 or 18.
  • Odoribacter laneus which has a polynucleotide having a very high identity to the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 19 or 20.
  • SEQ ID NO: Odribacteraceae which has a polynucleotide having a very high identity to the nucleotide sequence set forth in any of 21-24.
  • Raoultibacter timonesis which has a polynucleotide having a very high identity to the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 30 or 31.
  • Christensenellaceae which has a polynucleotide having a very high identity to the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 36 or 37.
  • Ruminococcaceae which has a polynucleotide having a very high identity to the nucleotide sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 40, 41 and 45. Very much for the nucleotide sequence set forth in either Emergencia timonesis, which has a polynucleotide having a very high identity to the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 48 or 49, or SEQ ID NO: 58, 61 and 62. Lachnospiraceae with polynucleotides with high identity Can be mentioned.
  • the "bacteria having a polynucleotide encoding 5AR and a polynucleotide encoding 3 ⁇ HSDH, and a polynucleotide encoding 5BR" according to the present invention is the above-mentioned polynucleotide encoding 5AR according to the present invention and a poly encoding 3 ⁇ HSDH.
  • the nucleotide and as long as it has a polynucleotide encoding a 5BR not particularly limited, for example, with these polynucleotides, Parabacteroides goldsteinii, Parabacteroides merdae, Bacteroides dorei, Bacteroides thetaiotaomicron, Bacteroides uniformis, Alistipes finegoldii, Alistipes onderdonkii, Odoribacter laneus , Or Odoribacteraceae.
  • Parabacteroides goldsteinii which has a polynucleotide having a very high identity to the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 2.
  • Parabacteroides merdae which has a polynucleotide having a very high identity to the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3.
  • SEQ ID NO: Bacteroides dorei which has a polynucleotide having a very high identity to the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 6 or 7.
  • SEQ ID NO: Bacteroides thetaiotaomicron which has a polynucleotide having a very high identity to the nucleotide sequence set forth in 8 or 9.
  • Alistopes finegoldii which has a polynucleotide having a very high identity to the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 15 or 16.
  • Alistopes onderdonkii which has a polynucleotide having a very high identity to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17 or 18.
  • nucleotide sequence identity is preferably 95% or more (96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more), and particularly preferably 100%.
  • identity can also be determined using an alignment program such as BLAST.
  • nucleotide sequence identity includes identity between nucleotide sequences calculated using blastn, more specifically using blastn with default parameters (ie, with default parameters). ) The calculated identity between the nucleotide sequences can be mentioned.
  • the bacterium according to the present invention may have a polynucleotide encoding a substrate of each enzyme and / or a transporter of bile acid produced by a reaction catalyzed by each enzyme, in addition to the above-mentioned enzymes. Preferred (see FIG. 12).
  • the bacterium according to the present invention is not particularly limited as long as it has a polynucleotide encoding the enzyme according to the present invention, and may be a naturally occurring bacterium, and the above-mentioned DNA or vector according to the present invention. It may be a host cell (transformant) such as a bacterium that is carried by introducing exogenously.
  • Bacteria into which the DNA or vector according to the present invention is introduced are not particularly limited, and examples thereof include the above-mentioned enterobacteria and other microorganisms (Escherichia coli, budding yeast, fission yeast, Bacillus subtilis, actinomycetes, filamentous fungi, etc.). Be done. Further, in the present invention, instead of the bacterium, a transformant obtained by introducing the above-mentioned DNA or vector according to the present invention into a cell can also be used. Examples of such cells include plant cells, insect cells, animal cells and the like.
  • the introduction of the DNA or vector according to the present invention can also be carried out according to a method commonly used in this field.
  • examples of the method for introducing into bacteria such as Escherichia coli include a heat shock method, an electroporation method, a spheroplast method, a lithium acetate method, and a joining method, and as a method for introducing into plant cells, Agrobacterium is used.
  • Examples of the method to be used and the particle gun method include a method using baculovirus and an electroporation method as a method of introduction into insect cells, and a method of introduction into animal cells includes a calcium phosphate method, a lipofection method and an electroporation method. Examples include the ration method and the microinjection method.
  • the DNA or the like introduced into the bacterium or the cell in this way may be temporarily retained in the bacterium or the like, or may be permanently retained (in the bacterium or the like). For example, it may be retained by being randomly inserted into the genomic DNA, or it may be retained by homologous recombination), and if it is a vector, it can be replicated and retained as an independent body outside the genomic DNA.
  • composition of the present invention will be described. As shown in Examples described later, the present inventors have clarified that the above-mentioned bacteria according to the present invention are involved in the production pathway of bile acids involved in Hyakuju and the like. Therefore, the present invention provides a composition of the following aspects. (1) as an active ingredient a bacterium having a polynucleotide encoding the 5AR according to the present invention, the composition for converting the 3-oxo - ⁇ 4 -LCA 3-Okisoaro LCA.
  • a composition for converting 3-oxoaroLCA into isoaroLCA which comprises a bacterium having a polynucleotide encoding 3 ⁇ HSDH according to the present invention as an active ingredient.
  • a bacterium having a polynucleotide encoding a 5BR according to the present invention as an active ingredient a bacterium having a polynucleotide encoding a 5BR according to the present invention, the composition for converting the 3-oxo - ⁇ 4 -LCA 3-oxo LCA.
  • a composition for producing isoaroLCA from oxoLCA isoaroLCA.
  • the present invention also provides a composition of the following aspects. (7) The composition according to any one of (1) to (4) and (6) above, which is an antibacterial composition against Gram-positive bacteria. (8) An antibacterial composition against Gram-positive bacteria containing isoaroLCA or isoLCA as an active ingredient. (9) An antibacterial composition against Gram-positive bacteria, which comprises at least one enzyme selected from 5AR according to the present invention, 3 ⁇ HSDH according to the present invention, and 5BR according to the present invention as an active ingredient.
  • the present invention also provides a composition of the following aspects.
  • a composition for converting 5 ⁇ -dihydrotestosterone (DHT) into 3 ⁇ -androstenediol which comprises a bacterium having a polynucleotide encoding 3 ⁇ HSDH according to the present invention as an active ingredient.
  • a composition for producing 3 ⁇ -androstandiol from testosterone which comprises a bacterium having a polynucleotide encoding 5AR according to the present invention and a bacterium having a polynucleotide encoding 3 ⁇ HSDH according to the present invention as active ingredients. thing.
  • a composition for producing 3 ⁇ -androstandiol from testosterone which comprises a bacterium having a polynucleotide encoding 5AR according to the present invention and a polynucleotide encoding 3 ⁇ HSDH according to the present invention as an active ingredient.
  • compositions for producing 3 ⁇ -androstanediol from testosterone which comprises 5AR according to the present invention and 3 ⁇ HSDH according to the present invention as active ingredients.
  • composition disease group according to any one of (10) to (14) above, which is a composition for treating or preventing at least one disease selected from the following disease groups: Prostate cancer, androgenetic alopecia, polycystic ovary syndrome, acne, hirsutism, ovarian endothelial cancer, neuroinflammation, and GABAA receptor-mediated epilepsy.
  • the "bacteria” according to the present invention are as described above, but the “bacteria” contained as an active ingredient in the composition of the present invention may be live bacteria or dead cells. It may be both live and dead.
  • the "killed cell” include a heat-treated body, a fire-treated body, a steamed body, a radiation ( ⁇ -ray, etc.) irradiation-treated body, an enzyme-treated body, a drug (antibiotic, etc.) treated body, and a chemical substance (formaline, etc.). )
  • a processed body and an ultrasonic processed body can be mentioned.
  • the form of the bacterium according to the present invention is not particularly limited and may be either liquid or solid, but the dry form (for example, powder form, bacterial powder form, etc.) is handled during production or storage. It is preferable from the viewpoint that it is easy to use.
  • the dried product can be prepared by drying a suspension in which the cells are dispersed in a solvent (water or the like).
  • the drying method is not particularly limited, and examples thereof include a spray drying method and a freeze drying method.
  • the sterilization method is not particularly limited, and the retort sterilization method, UHT sterilization method, air sterilization method, pressure sterilization method, high pressure steam sterilization method, dry heat sterilization method, distribution steam sterilization method, electromagnetic wave sterilization method, electron beam sterilization method, High-frequency sterilization method, radiation sterilization method, ultraviolet sterilization method, ethylene oxide gas sterilization method, hydrogen peroxide plasma sterilization method, chemical sterilization method (alcohol sterilization method, formalin fixation method, electrolyzed water treatment method) and the like can be mentioned.
  • surfactant treatment, grinding / crushing treatment, enzyme treatment, fractionation treatment, etc. can be performed before and after the sterilization treatment by heating or the like, or before and after the drying treatment.
  • surfactant treatment, grinding / crushing treatment, enzyme treatment, fractionation treatment, etc. can be performed.
  • the obtained product can also be contained in the composition of the present invention.
  • Bacteria contained as an active ingredient in the composition of the present invention include not only the above-mentioned bacterial cells, but also products of the bacterium (for example, secretory products of the bacterium, metabolites of the bacterium), and constituent substances (of the bacterium itself). Ingredients. So-called bacterial cell components. For example, amino acids, peptides, nucleic acids, sugars, lipids, vitamins, hormones, and their complexes, and complexes of them and phosphorus / sulfur metal elements that compose the bacterium. Etc.).
  • the active ingredient contained in the composition of the present invention may be a culture of bacteria according to the present invention.
  • the culture may be one containing the bacterium (culture solution containing the grown bacterium, solid medium, etc.), and the form of the culture is not particularly limited and may be either liquid or solid.
  • a dry form (for example, a dried culture product) is suitable for this form from the viewpoint of easy handling during production and storage. Those skilled in the art can appropriately prepare such a dried culture product or the like by using the above-mentioned drying method.
  • the "enzyme” contained as an active ingredient in the composition of the present invention is as described above.
  • the "bile acid” contained as an active ingredient in the composition of the present invention is as described in Examples described later, but as long as it has its activity, it is a pharmacologically acceptable salt, hydrate or solvent. Japanese products are also included.
  • Such a pharmacologically acceptable salt is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the structure of each compound and the like.
  • an acid addition salt for example, hydrochloride, hydrogen bromide, sulfuric acid
  • Inorganic acid salts such as salts, hydrogen sulfates, nitrates, carbonates, hydrogen carbonates, phosphates, monohydrogen phosphates, dihydrogen phosphates, acetates, propionates, lactates, citrates, Organic acid salts such as tartrate), base addition salts (for example, alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt, alkaline earth metal salts such as calcium salt and magnesium salt, zinc salt, aluminum salt, ammonium salt, tetramethyl Ammonium salts), organic amine addition salts (eg, morpholin, piperidine and other addition salts), amino acid addition salts (eg, lysine, glycine, phenylalanine and other addition salts).
  • the hydrate or solvate is not particularly limited, and examples thereof include bile acid or a salt thereof to which 0.1 to 10 molecules of water or a solvent are added.
  • the "bile acid" according to the present invention includes all isomers and isomers such as tautomers, geometric isomers, asymmetric carbon-based optical isomers, and stereoisomers as long as they have inhibitory activity. Includes body mixture. Furthermore, the substance undergoes metabolism such as oxidation, reduction, hydrolysis, amination, deamination, hydroxylation, phosphorylation, dehydroxylation, alkylation, dealkylation, and conjugation in vivo, and its inhibitory activity is still present. The present invention also includes compounds that produce the substance by undergoing metabolism such as oxidation, reduction, and hydrolysis in vivo.
  • composition of the present invention may be in the form of a pharmaceutical composition (pharmaceutical product, quasi-drug, etc.), a food composition (food or drink, animal feed, etc.), or a reagent used in a model animal experiment or the like.
  • composition in the present invention can be formulated by a known pharmaceutical method according to the form of the substance (bile acid, enzyme, bacterium, etc.) which is an active ingredient.
  • the substance bile acid, enzyme, bacterium, etc.
  • parenterally eg, intestinal tract
  • carriers that are pharmacologically or acceptable as food and drink, specifically, physiological saline, sterile water, medium, vegetable oil, solvent, excipients, bases, emulsifiers, suspensions, and surfactants.
  • Activators, stabilizers, flavors, fragrances, vehicles, preservatives, binders, diluents, isotonic agents, soothing agents, bulking agents, disintegrants, buffers, coatings, lubricants, colorants , Sweeteners, thickeners, flavoring agents, solubilizing agents or other additives and the like can be appropriately combined.
  • the composition of the present invention should be efficiently delivered into the intestinal tract, particularly in the preparation intended for oral administration. It may be combined with a composition that enables it.
  • the composition capable of such delivery into the intestinal tract is not particularly limited, and a known composition can be appropriately adopted, for example, a pH-sensitive composition, a composition that suppresses release to the intestinal tract.
  • Bioadhesive compositions eg, US Pat. No. 6,368.586
  • examples include the polymers described herein), protease inhibitor-containing compositions, and compositions that are specifically degraded by intestinal enzymes.
  • composition of the present invention When the composition of the present invention is used as a food composition, for example, in health foods, functional foods, foods for specified health uses, nutritionally functional foods, foods with functional claims, nutritional supplements, foods for the sick, or feeds for animals. possible.
  • Functional foods are usually classified into four categories, probiotics, biogenics, prebiotics, and symbiotics, based on their mechanism of action.
  • probiotics, biogenics, and symbiotics are classified. It can take the form of tics and prebiotics.
  • the food and drink of the present invention can be ingested as the composition as described above, and can also be ingested as various foods and drinks.
  • Specific examples of foods and drinks include functional foods, drinks, jelly-like foods, soft drinks, dairy foods, tea foods, alcoholic foods, soups and other liquid foods; yogurt, drinks.
  • Products containing oil such as cooking oil, dressing, mayonnaise, margarine; Carbohydrate-containing foods such as rice, noodles and bread; Processed livestock foods such as ham and sausage; Processed marine foods such as kamaboko, dried food and salt; Pickles Processed vegetable foods such as; Semi-solid foods such as jelly; Fermented foods such as miso; Western confectionery, Japanese confectionery, candy, gums, gummy, chilled confectionery, ice confectionery, etc. Retort products; instant foods such as instant soup and instant miso soup, and microwave-compatible foods.
  • healthy foods and drinks prepared in the form of powder, granules, tablets, capsules, liquid, paste or jelly can also be mentioned.
  • the food and drink according to the present invention can be produced by a production technique known in the art.
  • the act of "displaying” includes all acts that inform the consumer of the use, and constitutes an expression that can directly recognize the use or an expression that can recall or infer the use. It may be attached to the product itself, or it may be attached to the container, packaging material or package insert containing the composition. Further, “display” refers to information related to the composition of the present invention, such as leaflets, pamphlets, pops, catalogs, posters, books, storage media such as DVDs, advertisements such as electronic bulletin boards and the Internet, and the like. It may be something that displays / advertises that it is effective.
  • the target "Gram-positive bacteria” may be bacteria that are stained dark blue or purple by Gram stain, and are not particularly limited.
  • Gram-positive bacteria shown in FIGS. 4A and 4E can be mentioned.
  • antibacterial means suppressing the growth of Gram-positive bacteria and / or sterilizing them.
  • the compositions (7) to (9) of the present invention can also be used as a composition for treating or preventing an infectious disease of Gram-positive bacteria.
  • the "infectious disease” is not particularly limited, and examples thereof include Clostridium difficile infection, sepsis, and acute respiratory distress syndrome (ARDS / ALI) having sepsis as an underlying disease.
  • the target diseases are as described above, but for the treatment or prevention of "prostate cancer", as shown in Examples described later, the prostate cancer Inhibition of progression and / or metastasis is also included.
  • the present invention also treats or treats Gram-positive bacterial infections by administering to a subject an effective amount of at least one enzyme selected from 5AR according to the invention, 3 ⁇ HSDH according to the invention, and 5BR according to the invention. Regarding how to prevent it.
  • the present invention includes a bacterium having a polynucleotide encoding 5AR according to the present invention, a bacterium having a polynucleotide encoding 3 ⁇ HSDH according to the present invention, and a bacterium having a polynucleotide encoding 5AR according to the present invention.
  • the present invention relates to a method of treating or preventing a Gram-positive bacterial infection by administering an effective amount of isoaroLCA or isoLCA to a subject.
  • a bacterium having a polynucleotide encoding 3 ⁇ HSDH according to the present invention a bacterium having a polynucleotide encoding 5AR according to the present invention and a bacterium having a polynucleotide encoding 3 ⁇ HSDH according to the present invention, and 5AR according to the present invention.
  • prevention includes suppression and delay of infection, suppression of onset of cancer and the like, delay and suppression of recurrence thereof.
  • Treatment includes not only complete recovery from infectious diseases and cancer, but also alleviation or amelioration of those symptoms, suppression of their progression, and suppression of their recurrence.
  • the "subject" in the treatment of the present invention is an animal including humans.
  • the animals other than humans are not particularly limited, and various domestic animals, poultry, pets, experimental animals and the like can be targeted. Specific examples include, but are not limited to, pigs, cows, horses, sheep, goats, chickens, ducks, ostriches, ducks, dogs, cats, rabbits, hamsters, mice, rats, monkeys and the like.
  • the subject of the present invention may be a person suffering from the above-mentioned infectious diseases and cancer, but it is not necessary to be diagnosed with these diseases, for example, a person who may have suffered from these diseases. Some people feel that they have these diseases. Moreover, even a healthy person can take it on a daily basis for the purpose of preventing these diseases.
  • Non-therapeutic use is a concept that does not include medical practice, that is, treatment of the human body by treatment. For example, health promotion and the like can be mentioned.
  • the method for administering or ingesting the bacteria, enzyme and bile acid according to the present invention is not particularly limited and may be oral administration or parenteral administration (for example, administration into the intestinal tract).
  • oral administration it is preferable that the subject reduces the production of gastric acid by ingesting a proton pump inhibitor (PPI) or the like from the viewpoint of further improving the effect of the bacteria or the like according to the present invention. ..
  • PPI proton pump inhibitor
  • the above-mentioned aspects of the composition can be preferably used in the administration or ingestion of these substances.
  • the dose or ingestion thereof shall be the age, body weight, symptoms of the above-mentioned diseases, health condition, type of composition (pharmaceutical products, foods and drinks, etc.). ), The type of active ingredient and its form, etc., are appropriately selected.
  • it may be administered or ingested once or in a plurality of times (for example, twice or three times) per day.
  • the period of administration or ingestion may be discontinued depending on the degree of improvement, but from the viewpoint of prevention, administration or ingestion may be continued without discontinuation.
  • continuous it may be continued every day or at intervals, but it is preferable to continuously administer or ingest it every day in terms of effect.
  • the present invention is a method for evaluating at least one disease selected from the following disease groups.
  • Disease group Prostate cancer, androgenetic alopecia, polycystic ovary syndrome, acne, hirsutism, ovarian endothelial cancer, neuroinflammation, and GABAA receptor-mediated epilepsy, (1) A step of quantifying bacteria producing 3 ⁇ HSDH in the feces of a subject, (2) A step of comparing the value obtained by quantifying in step (1) with a corresponding value obtained by quantifying the bacterium of a centenarian, and (3) a result of comparison in step (2).
  • a step of determining that a subject is likely to have or is likely to suffer from the disease when the quantitative value in the feces of the subject is lower than the corresponding value is included. Provide a method.
  • the present invention is a method for preventing or treating at least one disease selected from the group of diseases. Also provided is a method of administering a bacterium that produces 3 ⁇ HSDH to the subject determined by the method to have a high probability of suffering from the disease or a high possibility of suffering from the disease.
  • the present invention is also a method of assessing the likelihood of survival over 100 years of age.
  • the quantitative value in the feces of the subject is equal to or higher than the corresponding value, it is determined that the subject is likely to survive 100 years or older.
  • Provided is a method including a step of determining that a subject is unlikely to survive over 100 years of age when the quantitative value in the feces of the subject is lower than the corresponding value.
  • the present invention is a method for evaluating the possibility of survival over 100 years old.
  • a step of quantifying bacteria preferably bacteria producing at least 3 ⁇ HSDH2 that produce at least one enzyme selected from 5AR, 3 ⁇ HSDH, and 5BR in the feces of a subject.
  • the quantitative value in the feces of the subject is equal to or higher than the corresponding value, it is determined that the subject is likely to survive 100 years or older.
  • a method comprising the step of determining that the subject is unlikely to survive over 100 years of age when the quantitative value in the feces of the subject is lower than the corresponding value.
  • the present invention is a method for improving the possibility of survival over 100 years old.
  • At least one enzyme selected from 3-oxoLCA, isoaroLCA, and 5AR, 3 ⁇ HSDH, and 5BR was given to the subject who was determined by the above method to be unlikely to survive over 100 years of age.
  • Also provided is a method of administering at least one substance selected from the group consisting of producing bacteria (preferably bacteria producing at least 3 ⁇ HSDH2).
  • the present invention is also a method for assessing resistance to Gram-positive bacteria.
  • the quantitative value in the feces of the subject is equal to or higher than the corresponding value, the subject is determined to have high resistance to Gram-positive bacteria.
  • a method comprising a step of determining that a subject has low resistance to Gram-positive bacteria when the quantitative value in the feces of the subject is lower than the corresponding value.
  • the present invention is a method for evaluating resistance to Gram-positive bacteria.
  • a step of quantifying bacteria preferably bacteria producing at least 3 ⁇ HSDH2 that produce at least one enzyme selected from 5AR, 3 ⁇ HSDH, and 5BR in the feces of a subject.
  • the quantitative value in the feces of the subject is equal to or higher than the corresponding value, the subject is determined to have high resistance to Gram-positive bacteria.
  • a method comprising a step of determining that a subject has low resistance to Gram-positive bacteria when the quantitative value in the feces of the subject is lower than the corresponding value.
  • the present invention is a method for preventing infection with Gram-positive bacteria.
  • the subject determined to have low resistance to Gram-positive bacteria is produced with at least one enzyme selected from 3-oxoLCA, isoaroLCA, and 5AR, 3 ⁇ HSDH, and 5BR.
  • a method of administering at least one substance selected from the group consisting of bacteria preferably bacteria producing at least 3 ⁇ HSDH2.
  • the "subject" in each evaluation method of the present invention is not particularly limited and is the same as the “subject” in the above-mentioned treatment method and the like, but is limited to humans.
  • the number of bacteria to be quantified may be at least one, but preferably two or more (for example, three or more and four or more), and more preferably five or more (for example, 6).
  • “Quantification of bacteria in feces” does not have to be the amount (number) of the bacteria itself, and can be performed, for example, by measuring the amount of a substance peculiar to the bacteria that reflects the amount (number) of the bacteria. can.
  • substances include the bacterium-specific oligonucleotide (for example, 16S rRNA gene and its transcript), the bacterium-specific constituent substance (peptides, nucleic acids, sugars, lipids, and complexes thereof that constitute the bacterium). Etc.), products of the bacterium (eg, secretory products of the bacterium, metabolites of the bacterium).
  • PCR RT-PCR, real-time PCR, quantitative PCR
  • DNA microarray analysis method DNA microarray analysis method
  • Northern blotting next-generation sequencing method (sequencing-by-synthesis, For example, Illumina Solexa Genome Analyzer or Sequencing with Hiseq® 2000), Pyro Sequencing Method (eg, Sequencing with Roche Diagnostex (454) Sequencer GSLX or FLX (so-called 454 Sequencing) )), Rigase reaction sequencing method (for example, Sequencing by SoliD® or 5500 xl manufactured by Life Technology Co., Ltd.), T-RFLP method, bead array method, in situ hybridization, dot blot, RNase protection assay method, It can be quantified using mass analysis, genomic PCR, and southern blotting.
  • next-generation sequencing method for example, Illumina Solexa Genome Analyzer or Sequencing with Hiseq® 2000
  • Pyro Sequencing Method eg, Sequencing with Roche Diagno
  • enzyme-linked immunosorbent assay ELISA method
  • CLEIA chemical luminescent enzyme immunoassay
  • latex aggregation method antibody array
  • immunobrotting immunochromatography
  • imaging cytometry flow cytometry
  • radio radio
  • a method of detection using an antibody such as an immunoassay, an immunoprecipitation method, and an immunohistochemical staining method (immunological method), and a mass analysis method.
  • an antibody that binds to each substance is used, and the amount of each substance is determined by contacting the antibody with each substance to which each antibody binds and using the binding property of the antibody to each substance as an index. Detected.
  • Mass spectrometry (MS) method is a method in which a sample is ionized using an ion source, and in the analysis unit, the sample is moved in a vacuum and ionized using electromagnetic force or due to a flight time difference according to the mass-charge ratio. It refers to a measurement method using a mass spectrometer that can be separated and detected, and examples of the method of ionization using an ion source include methods such as the EI method, CI method, FD method, FAB method, MALDI method, and ESI method. Can be selected as appropriate.
  • a magnetic field deflection type, a quadrupole type, an ion trap type, a time-of-flight (TOF) type, a Fourier transform ion cyclotron resonance type, or the like is appropriately selected.
  • tandem mass spectrometry (MS / MS) and triple quadrupole mass spectrometry which are a combination of two or more mass spectrometry methods, can be used.
  • SRM Selected reaction monitoring
  • MRM Multiple reaction monitoring
  • the mass spectrometer may be used alone, or by combining liquid chromatography (LC) and high performance liquid chromatography (HPLC), the target substance can be separated and purified to prepare a sample.
  • Such "immunological method” and “mass spectrometry” can also be used for "quantification of enzymes in feces” and “quantification of bile acids in feces”. Further, in “quantification of bile acid in feces”, various types of chromatography (gas chromatography, high performance liquid chromatography, LC / MS, LC-MS / MS, thin layer chromatography, etc.) can be preferably used.
  • the value obtained by quantifying in this way may be a relative value as well as an absolute quantity.
  • the relative value include a quantitative ratio (so-called numerical value expressed in an arbitrary unit (AU)) based on the measuring method or measuring device used for detection.
  • the relative value in the amount of bacteria may be, for example, a value (relative abundance, occupancy rate) indicating the ratio of the bacteria in the entire intestinal flora, as shown in Examples described later. Further, a value calculated based on the amount of reference intestinal bacteria may be used.
  • the "reference gut bacterium” according to the present invention may be a bacterium that is stably present in a stool sample and has a small difference in amount between different biological samples.
  • the "corresponding value” is a quantitative value in a human individual aged 100 years or older, and may be a value that functions as a cutoff value or a reference value in each method of the present invention.
  • a human individual aged 100 years or older The median or average value of each amount of substance detected in the group can be mentioned.
  • the "corresponding value” may be a preset quantitative value (fixed value), and it is preferable that the fixed value related to the instruction manual of the kit related to the evaluation method is described.
  • the human individual aged 100 years or older to be compared is preferably a person who has the same characteristics of at least one of gender, race, and nationality as the subject.
  • Such "comparison” can be performed by a person skilled in the art by appropriately selecting a statistical analysis method suitable for the above detection method.
  • Statistical analysis methods include, for example, Mann-Whitney U test, t test, analysis of variance (ANOVA), Kruskal-Wallis test, Wilcoxon test, odds ratio, hazard ratio, Fisher's accurate test, receiver operating characteristic analysis. (ROC analysis), classification tree and determination tree analysis (CART analysis). Normalized or standardized and normalized data can also be used for comparison.
  • the amount of substance detected is higher or lower than the corresponding value, and the difference is considered to be statistically significant (for example, P ⁇ 0.05).
  • the amount of the detected substance is twice or more (preferably 5 times or more and 10 times or more) or 0.5 times or less (preferably 0.2 times or less, 0.1 times or less) the corresponding value. It can also be mentioned that.
  • “equivalent to the corresponding value” means, for example, that the difference between the detected substance amount and the corresponding value is not statistically significant (for example, P> 0.05). Further, for example, the amount of the detected substance is more than 0.5 times and less than 2 times the corresponding value.
  • “High probability” and “low probability” are, for example, 80% or more and less than 20%, preferably 90% or more and less than 10%, and more preferably 95%, respectively. More than and less than 5%.
  • “high resistance to Gram-positive bacteria” and “low resistance to Gram-positive bacteria” mean, for example, that the probability of being infected with Gram-positive bacteria is 80% or more and less than 20%, respectively.
  • the probabilities are preferably 90% or more and less than 10%, and more preferably 95% or more and less than 5%.
  • the method of the present invention includes a method of collecting data on the above-mentioned quantitative values for diagnosis by a doctor, a method of presenting the data to a doctor, a method of comparing and analyzing the above-mentioned quantitative values and the corresponding values. It can also be described as a method for assisting a doctor's diagnosis in consideration of the patient's clinical symptoms and / or other test results.
  • isoaroLCA comprising the step of culturing a bacterium having a polynucleotide encoding 3 ⁇ HSDH according to the present invention in the presence of 3-oxoaroLCA and collecting the isoaroLCA produced in the bacterium and / or the culture thereof.
  • a bacterium having a polynucleotide encoding 5AR according to the present invention and a bacterium having a polynucleotide encoding 3 ⁇ HSDH according to the present invention were cultured, and the bacterium and / or a bacterium thereof A method for producing an isoaro LCA, which comprises a step of collecting the isoaro LCA produced in the culture.
  • a bacterium having a polynucleotide encoding 5AR according to the present invention and a polynucleotide encoding 3 ⁇ HSDH according to the present invention was cultivated, and in the bacterium and / or a culture thereof.
  • a method for producing an isoaro LCA which comprises a step of collecting the produced isoaro LCA.
  • a bacterium having a polynucleotide encoding 5AR according to the present invention, a polynucleotide encoding 3 ⁇ HSDH according to the present invention, and a polynucleotide encoding 5BR according to the present invention is cultured.
  • a method for producing an isoaro LCA which comprises a step of collecting the isoaro LCA produced in the bacterium and / or a culture thereof.
  • a method for producing isoaroLCA which comprises a step of producing isoaroLCA from 3-oxoaroLCA and collecting the isoaroLCA in the presence of 3 ⁇ HSDH according to the present invention.
  • Presence of 3 ⁇ HSDH according to 5AR and the invention according to the present invention generates a Isoaro LCA from 3-oxo - ⁇ 4 -LCA, comprising the step of collecting the Isoaro LCA, manufacturing method of Isoaro LCA.
  • a method for producing isoaroLCA which comprises a step of producing isoaroLCA from isoLCA or 3-oxoLCA and collecting the isoaroLCA in the presence of 5AR according to the present invention, 3 ⁇ HSDH according to the present invention and 5BR according to the present invention. ..
  • the "bacteria" to be cultured are as described above, but also in the production method of the present invention, instead of the bacteria, a host cell into which the DNA or vector according to the present invention has been introduced externally is also used. be able to.
  • the condition for "culturing the bacterium (host cell)" may be any condition as long as the bacterium or the like can produce isoaroLCA, and if it is a person skilled in the art, the temperature and air can be adjusted according to the type of the bacterium and the medium used. With or without addition, oxygen concentration, carbon dioxide concentration, medium pH (for example, pH 7-9), culture temperature (usually 20-40 ° C, preferably 25-37 ° C), culture time, humidity, etc. are appropriately adjusted. Can be adjusted and set.
  • the medium may contain a medium that can be assimilated by bacteria or the like, and may contain carbon sources, nitrogen sources, sulfur sources, inorganic salts, metals, peptone, yeast extract, meat extract, casein hydrolyzate, serum and the like. It is mentioned as an inclusion. Further, in such a medium, for example, IPTG for inducing the expression of a polynucleotide encoding the enzyme according to the present invention and an antibiotic corresponding to a drug resistance gene that can be encoded by the vector according to the present invention (for example, ampicillin) are used. ), Or a nutrient (eg, arginine, histidine) corresponding to a gene that complements the auxotrophy that can be encoded by the vector according to the present invention may be added.
  • a nutrient eg, arginine, histidine
  • the "culture” is a medium containing a proliferated bacterium or the like, a secreted product of the bacterium or the like, and a metabolite of the bacterium or the like, which is obtained by culturing the bacterium or the like in the medium. , Includes their dilutions and concentrates.
  • the "enzyme” used in the present invention is as described above, but the conditions for producing isoaroLCA in the presence of the enzyme according to the present invention may be any conditions as long as the production reaction is promoted, and those skilled in the art can use it. If there is, the composition of the reaction solution (for example, buffer solution), the pH of the reaction solution (for example, pH 7 to 9), the reaction temperature (usually 20 to 40 ° C., preferably 25 to 37 ° C.), the reaction time and the like are appropriately adjusted. Can be adjusted and set.
  • the reaction solution for example, buffer solution
  • the pH of the reaction solution for example, pH 7 to 9
  • the reaction temperature usually 20 to 40 ° C., preferably 25 to 37 ° C.
  • the reaction time and the like are appropriately adjusted. Can be adjusted and set.
  • the collection of isoaroLCA from such bacteria, their cultures, reaction solutions and the like is also not particularly limited, and can be carried out by a known recovery and purification method.
  • a collection method include extraction with a solvent and various types of chromatography (gas chromatography, high performance liquid chromatography, LC-MS, LC-MS / MS, thin layer chromatography, etc.). Further, these methods may be carried out alone or in combination as appropriate and may be carried out in multiple steps.
  • the time of collection may be appropriately adjusted according to the type of bacteria, enzyme, etc. to be used and may be a time during which isoaroLCA can be produced, but it is usually 1 hour to 14 days, preferably 12 hours to 7 days. It's a day.
  • Fecal samples were suspended in PBS containing 20% glycerol and 10 mM EDTA and stored at -80 ° C until use. After thawing, gently place the 100 ⁇ L suspension in 800 ⁇ L TE10 (10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA) buffer containing RNase A (final concentration 100 ⁇ g / mL, Invitrogen) and lysozyme (final concentration 15 mg / mL, Sigma). They were mixed and incubated at 37 ° C. for 1 hour.
  • 16S rRNA sequencing was performed using MiSeq according to the Illumina protocol. PCR was performed on the V1-V2 region of the 16S rRNA gene using 27Fmod primer 5'-AGRGTTTGATYMTGGCTCAG-3'(SEQ ID NO: 166) and 338R primer 5'-TGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3' (SEQ ID NO: 167). The amplicon ( ⁇ 330bp) obtained from each sample was purified using APPure XP magnetic beads (Beckman Coulter).
  • DNA was quantified using Quant-iT Picogreen dsDNA assay kit (Invitrogen) and Infinity M Plex plate reader (Tecan). The purified DNA was stored at ⁇ 20 ° C.
  • the two paired end reads were combined using fastq-join program based on the overlapping sequences. Leads that did not match for both universal primers with an average quality value of less than 25 were removed. Both primer sequences were removed, 3000 reads that passed the quality filter were arranged in descending order according to quality value, with a cutoff of 97% for pairwise sequence matching, using the UCLUST program (Edgar 2010) version 5.2.32. Clustering was performed to obtain an operational taxomic unit (OTU).
  • OTU operational taxomic unit
  • Taxonomy of each OTU by searching for homology to Ribosomal Database Project (RDP) and National Center for Biotechnology Information (NCBI) genome database by GLSEARCH program.
  • RDP Ribosomal Database Project
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • Reads are mapped to a gene catalog using a BWA [50] subject to a unique and strong mapping with at least 95% sequence identity to the length of the read, using an in-tissue script. It was counted (count catalog) and standardized to transscript-per-milion (TPM matrix). Countmatlix used MSPminer as an input for binning genes into metagenome seed pan genomes (core genes and accessory genes) with default settings [51]. The abundance of all metagenomic species in one sample was then expressed as the median TPM of the top 30 representative core genes output by MSPminer. Assembled genes were annotated with NCBI RefSeq (version May 2018) at the species, genus, and phyla levels, as previously reported [52].
  • Phylophlan was used by default to annotate metagenomic species that do not match any of the NCBI RefSeq species [53]. Based on relative abundance at the species level, ⁇ -diversity was calculated using the Shannon index and ⁇ -diversity was calculated using the Bray-Curtis dissimilarity (R vegan package). To identify and annotate homologous proteins with at least 40% sequence match and 80% coverage on the query sequence, C.I. Query the non-redundant gene catalog with USEARCH ublast using the protein in the Sindens bai operon [26] or the protein in the isolates reported here as 5AR, 5BR, 3 ⁇ HSDHI, or 3 ⁇ HSDHII. Executed. The same processing pipeline has been applied to a dataset of gut microbiota in Sardinian longevity over 100 years [8].
  • Linear modeling includes covariates of fixed effects, ie gender (male or female) and cohort information (longevity, older or younger than 100 years). Random effects include subject information for one or more samples among a small number of long-lived individuals over 100 years of age.
  • PERMANOVA was applied to the Bray-Curtis dissimilarity (as performed by the adonis () function in the vegan package of R) to identify the correlation between gut microbiota composition and cohort and gender information as a whole.
  • a pairwise Wilcoxon rank sum test was used to assess the difference in relative abundance of bi-operon homologs among long-lived individuals over 100 years of age compared to elderly and adolescent controls.
  • Ammonium acetate acetonitrile (86: 14, v / v) 0.5 minutes, (78:22, v / v) 0.5-5 minutes, (72:28, v / v) 5-28 minutes, (46). : 54, v / v) 28-55 minutes, (2: 98, v / v) 55-66 minutes, (2: 98, v / v) 66 minutes-70 minutes. The total operating time was 70 minutes. The following MS parameters were used as the cation MRM mode to operate LC / ESI-MS / MS.
  • ion spray voltage 5,500 V, interface temperature; 500 ° C, curtain gas; 30 psi, collision gas (nitrogen); 9 psi, nebulizing gas; 80 psi, and heats.
  • the following MS parameters were used as the anion MRM mode.
  • the concentration of short-chain fatty acids in feces was determined by GC-MS (Shimadzu QP2020 system with a flame ionization detector) equipped with PAL RTC autosampler (CTC Analytics). Helium was used as the carrier gas, and a molten silica capillary column 30 mx 0.25 mm coated with a film thickness of 0.25 ⁇ m was used. The inlet temperature was set to 250 ° C. The initial oven temperature was 60 ° C. for 2 minutes and then raised to 330 ° C. at 15 ° C./min. The MS parameters were set as follows.
  • the ion source temperature is 200 ° C
  • the interface temperature is 280 ° C
  • the loop time is 0.3 seconds.
  • 50 ⁇ L stool samples prepared with ethanol to concentrations of 0.5 ⁇ g / ⁇ L and 20 ⁇ g / ⁇ L were mixed with 10 ⁇ L acetic acid-d4 (80 ⁇ M).
  • acetic acid-d4 80 ⁇ M
  • Reagent 10 ⁇ L was added to each stool sample and reacted for 9 hours prior to injection into GC-MS. Samples were analyzed and quantified using LabSolutions Insight GC-MS software (Shimadzu).
  • the pH of stool was measured by applying the supernatant of 0.1 mg / ⁇ L stool dispersion suspended in distilled water to a pH meter (Horiba Ltd.). Also, from the same stool suspension, stool ammonia levels were quantified using an enzamatic ammonia ELISA assay kit (Abcam) according to the manufacturer's protocol.
  • the isolated strain used universal primers (27Fmod: 5'-AGRGTTTGATYMTGGCTCAG-3'(SEQ ID NO: 166), 1492R: 5'-GGYTACCTTGTTACCGACTT-3' (SEQ ID NO: 168)) for sanger sequencing.
  • the 16S rRNA gene region was amplified by PCR and identified using NCBI genome database. Individual isolates in the culture collection named species with 16S rRNA sequence homology> 98.0%, families with homology> 94.5%, and eyes with homology> 86.5%.
  • the isolated bacteria were stored frozen at ⁇ 80 ° C. in the optimum medium containing 20% glycerol.
  • WCA medium (based on DSMZ 1611 YCFA modified medium) supplemented with a 29% volatile fatty acid solution was used.
  • Alistopes finegoldii St16, Campylobacter urealyticus St25, Christianenellaceae St36-37, and Ruminococcaceae St44 are 4% salt solutions (0.2 g / L calcium chloride, 0.2 g / L magnesium phosphate, 0.2 g / L magnesium phosphate, 1 g / L).
  • Mixture A (10 mM ammonium acetate, 0.01% formic acid, 20% acetonitrile) and Mixture B (30% acetonitrile, 70% methanol) are used as eluents, and separation is performed by a linear gradient at a flow rate of 0.2 mL / min. I went there.
  • the mobile phase composition was gradually changed as follows.
  • Genome sequences were determined by whole-genome shotgun sequencing using the PacBio Sequence and Illumina MiSeq sequencers.
  • the donor (E. coli MFDpil) and the receptor (P. merdae St3) were grown in LB medium and BHI medium until the OD600 was 0.5, and mixed at a ratio of 1: 1. The mixture was dropped onto a BHI agarose plate and incubated under anaerobic conditions at 37 ° C. for 16 hours. Perfective colonies were formed on BHI agarose plates containing tetracycline (6 ⁇ g / mL).
  • the conjugated product was 0.25% (wt / vol) glucose and 50 mg / L L-cysteine, 5 mg / L hemin, 2 .5 ⁇ g / L vitamin K1,2mg / L FeSO 4 ⁇ 7H 2 O, and plated on M9 agarose plates supplemented with 5 [mu] g / L vitamin B12,10mM rhamnose.
  • the success or failure of the gene deletion was confirmed by PCR and Sanger sequencing.
  • Clostridioides difficile stream 630 (ATCC BAA-1382), Clostridioides difficile VPI 10463 (ATCC 43255), vancomycin-resistant Enterococcus faec equimimilis (ATCC 12394), carbapenemase-resistant Klebsiella pneumoniae (ATCC BAA-1705), and Salmonella enterica subsp. enterica (ATCC 14028) was purchased from the American Type Culture Collection (ATCC).
  • Clostridium perfringens JCM 1290T
  • Bacillus cereus JCM 2152T
  • methicillin-resistant Staphylococcus aureus JCM 16555
  • Streptococcus pyogenes JCM 5674T
  • Streptococcus sanguinis JCM 5708T
  • Proteus mirabilis JCM 1669T
  • Proteus vulgaris JCM 2001
  • Treg-inducing strains previously reported by the laboratory to which the present inventors belong were also included in the symbiotic fungus panel.
  • Hungatella hatchayii, Eubacterium rectale, and Alistopes putridinis isolated from human feces in the laboratory to which the present inventors belong were also used.
  • Clostridium HGF2 (innocum) HM287 was obtained through BEI Resources, NIAID, NIH as part of the Human Microbiome Project: Clostridium sp. , Straight HGF2, HM-287.
  • a primary suspension adjusted to have an OD600 of 0.63 in WCA medium was prepared.
  • a secondary suspension was prepared by diluting 100 ⁇ L of the primary suspension in the medium to a final 2.4 mL.
  • a 10 ⁇ L secondary suspension was inoculated into media containing the following bile acids at various concentrations (3.175, 6.25, 12.5, 25, and 50 ⁇ M) to a final 200 ⁇ L.
  • Bacterial growth was monitored every 0.5 to 1 hour by shaking at a microplate reader (Sunrise Thermo, Tecan) set at 37 ° C. for 60 seconds before the measurement point and measuring OD600. To determine the minimum inhibitory concentration, 10 ⁇ L of secondary suspension was inoculated into medium containing 0.25 to 50 ⁇ M isoalloloLC to a final 200 ⁇ L.
  • EM Electro Microscopy
  • Samples were dried using a critical point dryer (CPD300, Leica Biosystems) and coated with osmium to a thickness of approximately 2 nm using a conductive osmium coater (Neoc-ST, Meiwafosis).
  • CPD300 critical point dryer
  • Neoc-ST conductive osmium coater
  • the SEM image was taken with a SU6600 (Hitachi High Tech) and an electron volt of 5 keV.
  • Bacterial pellets were prepared by centrifuging 25 mL of bacterial culture (13,000 rpm, 2 minutes) for use in transmission electron microscopy. The pellet was fixed in a 2.5% glutaraldehyde solution at 4 ° C. overnight. After washing with 0.1 M phosphate buffer, the sample was fixed at 1.0% osmium tetroxide at 4 ° C for 2 hours, washed with distilled water, and wrapped in low gelling temperature Type VII-A agarose (Sigma-Aldrich). Buried.
  • the sample is dehydrated with a series of solutions that increase the ethanol concentration to absolute ethanol, to acetone (Sigma-Aldrich), n-butyl glycidyl ether (Okenshoji Co., Ltd.), and a stepwise epoxy resin.
  • 100% epoxy resin 100 g Epon (trade name) contains 27.0 g MNA, 51.3 g EPOK-812, 21.9 g DDSA and 1.1 mL DMP-30. Okenshoji Co., Ltd.) It was immersed at 4 ° C. for 48 hours. Polymerization of the pure epoxy resin was completed at 60 ° C. for 72 hours.
  • an ultrathin film piece (70 nm) was prepared on a copper grid (Veco Specimen Grids, Nissin-EM) and stained with uranyl acetate and lead citrate, respectively, for 10 minutes. ..
  • the TEM image was taken with an electron volt of 80-100 keV using JEM-1400plus (JEOL).
  • the stool culture was carried out under anaerobic conditions at 37 ° C. for 48 hours in the presence of bile acids (LCA, 3-oxoLCA, isoalloloLCA) having a final concentration of 50 ⁇ M.
  • DNA was extracted from the fecal culture as described above for 16S metagenomic sequencing.
  • LC-MS / MS Quantification of steroid hormones using LC-MS / MS Parabacteroides merdae St3 and Odoribacteraceae St21-24 strains isolated from CE91, along with 50 ⁇ M testosterone or 5 ⁇ -dihydrotestosterone (DHT), were coated with a gas permeable membrane (Breath-easier TM , Diverside plate). Lab) was anaerobically cultured. 20 ⁇ L of bacterial culture from the logarithmic growth phase to the stationary phase was inoculated into 1 mL of Wilkins-Chalgrain Anaerobe (WCA, Thermo Fisher) medium adjusted to pH 7 (using MOPS buffer, Dojindo). After culturing for 3 hours, 6 hours, 9 hours and 12 hours, each culture supernatant was collected for LC-MS / MS quantification.
  • WCA Wilkins-Chalgrain Anaerobe
  • sample preparation 40 ⁇ L of culture supernatant was mixed with 160 ⁇ L of deuterium-labeled internal standard material (testosterone-d 3,12.5 nM methanol solution) and 800 ⁇ L of 80% methanol. The sample was sonicated at room temperature for 10 minutes and then passed through a filter having a pore size of 0.45 ⁇ m (Pure Clean for Solvent 0.45 ⁇ m, KURABO). 2 ⁇ L of solution was injected into LC / ESI-MS / MS (ESI probe and Exion LC AD ultra-high precision liquid chromatography system; Triple Quad 6500 + tandem mass spectrometer equipped with SCIEX).
  • deuterium-labeled internal standard material testosterone-d 3,12.5 nM methanol solution
  • 800 ⁇ L 80% methanol.
  • the sample was sonicated at room temperature for 10 minutes and then passed through a filter having a pore size of 0.45 ⁇ m (Pure Clean for Solvent 0.45
  • the separation column InertSstein C18 (inner diameter 150 mm ⁇ 2.1 mm, particle size 2 ⁇ m; GL Sciences Inc.) was used at 40 ° C.
  • Mixture A (5 mM ammonium formate in distilled water) and Mixture B (5 mM ammonium formate in methanol) were used as gradients and separated by linear gradient elution at a flow rate of 0.2 mL / min.
  • the mobile phase composition was gradually changed as follows.
  • the total operating time was 30 minutes.
  • MS parameters were used to operate the LC-ESI-MS / MS. ion spray voltage; 5,500 V, interface temperature; 500 ° C, curtain gas; 30 psi, collision gas (nitrogen); 9 psi, nebulizing gas; 80 psi, and heat. Samples were taken using Analyst software ver1.71 and analyzed using SCIEX OS-MQ software ver1.7.0.3666606.
  • centenarians show signs of mild inflammation as evidenced by elevated levels of serum C-reactive protein and fecal lipocalin [9,12,13], which means that aging is a complete barrier. Consistent with the preconceived notion of having chronic inflammation due to decreased sexuality and immunosenescence (FIGS. 5C and 5D). Nevertheless, the majority of centenarians do not have chronic diseases such as obesity, diabetes, hypertension and cancer, and the prevalence of these diseases is significantly increased compared to the elderly group. Not (FIGS. 5E and 5F, and Table 6).
  • the first characteristic group is a taxon whose abundance increased or decreased with age (Fig. 1D).
  • msp_161 or Eubacterium siraeum was the most abundant in centenarians, followed by the elderly and then the young.
  • Blautia wexlerae showed the opposite tendency, with the youngest being the most, followed by the centenarian, and then the elderly.
  • Alisteps shahii was relatively high in both the elderly and centenarian groups compared to the young. Previous findings suggest that the relative abundance of these taxa reflects adaptation to aging and may be related to physical activity, environment, and diet. It was consistent with the study [4-6, 8].
  • the second characteristic group is a taxon in which the abundance is similar between centenarians and young people, but different from that of elderly people (Fig. 1E). These species may contribute to the maintenance of youth and may have anti-aging effects. In particular, the unknown Firmicutes (msp_197), Ruminococcus gnavus, and Eggerthella lenta were relatively abundant in both centenarians and young people. Interestingly, the latter two species are involved in bile acid metabolism and may be involved in the biosynthesis of isobile acids in the host intestine [18].
  • the third characteristic group is a taxon specific to centenarians, whose abundance is significantly different between centenarians and control groups (elderly and young), and is between the two control groups. It is not positioned (Fig. 1F).
  • Fig. 1F Alistimes, Parabacteroides, Clostridium species, and the major archaea in the human intestine, Methanobrevibacter, were particularly abundant in the perennial population compared to the control group.
  • One of the most abundant species of centenarians is Clostridium Sindens, which is known to have the relatively rare 7 ⁇ -dehydration ability required to convert primary bile acids to secondary bile acids. Yes [19, 20].
  • major butyric acid-producing bacteria such as Faecalibacterium prausnitzii and Eubacterium rectale were selectively depleted in centenarians (Fig. 1F).
  • Some bacterial species such as Phascorarctobacterium faecium and Alistopes putridinis, were more abundant in centenarians and their families than in the control group (Fig. 7D).
  • the increase in these taxa in centenarians and their direct descendants may be due to heredity, lifestyle, and diet. For example, consumption of cruciferous vegetables has been reported to favor the expansion of the taxa described above [21].
  • fecal pH was significantly higher in centenarians than in controls (Fig. 8C), which may be due in part to lower SCFA levels and reduced age-characteristic gastric juice production. There is.
  • Primary bile acids are synthesized from hepatic cholesterol, bind to either glycine or taurine, and are secreted into the bile ducts [24,25]. These primary bile acids are then uncoupled by the gut flora and converted to various secondary bile acids [19, 25]. The main biochemical conversion is 7 ⁇ -dehydroxylation of primary bile acids (cholic acid (CA) and chenodeoxycholic acid (CDCA)), thereby causing them to be secondary bile acids (deoxycholic acid (DCA) and lithocholic). Converted to acid (LCA)).
  • Bile acid metabolism via the bacterial flora is a plurality of oxidations catalyzed by enzymes encoded by bile acid-induced (bai) operon genes (BaiB, BaiCD, BaiA2, BaiE, BaiF, and BaiH), as shown below. It consists of a reduction reaction [19, 26].
  • bile acids undergo oxidation and epimerization to undergo oxo- (keto-), iso- (3 ⁇ -hydroxy) and allo- (5 ⁇ -H-), and cis- and trans. Converted to isomers [25].
  • centenarians had lower levels of primary bile acids and associated higher levels of CDCA metabolites (FIGS. 2D-2F).
  • levels of iso-LCA, 3-oxoLCA, isoalloloLCA, allo-LCA and 3-oxoalllo-LCA were significantly elevated in centenarians, but this increase was seen between the elderly and young.
  • Figs. 2A and 2F concentrations of alloloCA, 3-oxoalllo-LCA and isoalloloLCA were positively correlated with fecal pH (Fig. 8D), and increased levels of these bile acids in perennial individuals were associated with changes in diet and digestive function, and the like. It is suggested that it may reflect the resulting changes in the intestinal metabolome.
  • Such an intestinal environment may promote the growth of certain bacterial species and / or the expression of enzymes involved in the production of isoLCA, 3-oxoLCA, and isoalloloLCA.
  • colonization of isoLCA-producing bacteria, 3-oxoLCA-producing bacteria, and isoalloloLCA-producing bacteria in the intestine may causally affect other members of the gut flora and their metabolic processes.
  • Example 3 Identification of isoLCA-producing bacterial strain, 3-oxoLCA-producing bacterial strain, and isoallolCA-producing bacterial strain
  • 3-oxoLCA and isoLCA involves 5BR, 3 ⁇ HSDH and 3 ⁇ HSDH as well as 3-oxoDCA and isoDCA, as shown below.
  • a stool sample of CE91 was cultured in various media, bacterial colonies were analyzed by 16S rRNA gene sequencing, and an aggregate of 68 characteristic strains that roughly reproduced the bacterial flora structure of CE91 was prepared. (FIGS. 3A and 8-11).
  • Raoulibacter timonensis St30-31 and Lachnospiraceae spp. St57 can also convert LCA to 3-oxoLCA, and these species are E. coli. It was suggested to have 3 ⁇ HSDH as well as lenta.
  • 3-oxo- ⁇ 4- LCA was used as a substrate, 3-oxoLCA was found in Hungatella hatchei St54-55 and Lachnospiraceae spp. High levels of accumulation in the culture supernatant of St62 suggested that these strains had 5BR (FIGS. 3C and 11E and 11F).
  • isoLCA can be found in Clostridium innocuum St51 and Lachnospiraceae spp. Culture supernatant with 3-oxo- ⁇ 4 since it is generated by high-level from -LCA (FIG. 3C, and FIG. 11E and 11F) in ST58, these strains is suggested that owns 5BR and 3 ⁇ HSDH rice field.
  • Parabacteroides disstasonis St4-5 converts LCA to 3-oxo- ⁇ 4 -LCA via 3-oxoLCA (FIGS. 3B and 11C and 11D), and further from 3-oxo- ⁇ - 4- LCA.
  • the conversion to isoLCA and LCA (FIGS. 3C and 11E and 11F) was noteworthy, suggesting that these strains carry 3 ⁇ HSDH, 3 ⁇ HSDH and 5BR.
  • Bacteroides strains of total 20 (St4,5,8, and St1-24 strains except 14 strains) will become apparent that it is possible to convert 3-oxo- ⁇ 4 -LCA the 3-oxoalloLCA, the 8 strains of which , It has been found that isoalloloLCA can be reliably produced.
  • the culture at pH 9 which represents the intestinal environment of centenarians, enhanced the accumulation of 3-oxoalloLCA, isoalloLCA, isoLCA, and 3-oxoLCA compared to the culture at pH7 (Fig. 11A-11F), an alkaline environment may promote the activity or expression of enzymes involved in the production of these bile acids.
  • Example 4 Conversion of 3-oxo- ⁇ 4- LCA to isoalloloLCA involving 5AR and 3 ⁇ HSDH
  • SDR short-chain dehydrogenase
  • Porphyromonas Somerae St14 lacks the putative 5AR and 3 ⁇ HSDH genes, while being able to generate isoalloloLCA from 3-oxoalloLCA (FIG. 13A), suggesting that it carries a strain-specific gene with 3 ⁇ HSDH activity. Will be done.
  • E. coli In the presence of LCA, E. coli was used to investigate whether isolates with different genes could metabolize bile acids in a coordinated manner.
  • lenta St34 (with 3 ⁇ HSDH, 3 ⁇ HSDH) or P.I. disstasonis St4 (with 3 ⁇ HSDH, 3 ⁇ HSDH, 5BR) and P.I. Co-culture with merdae St3 or Odoribacteraceae St21 (having 5BR, 5AR, 3 ⁇ HSDH) was performed.
  • Bacteroides gene group identified above may contribute to the coordinated production of bile acids. At least, it may be involved in the unique composition distribution of bile acids in feces found in Bacteroides.
  • Example 5 Bactericidal effect of isoallolCA against gram-positive pathogens Secondary bile acids are used to regulate host metabolism and immune response (including the induction of regulatory T cells, [25, 30-35]) and pathogens in the intestinal tract. It is known to play some biologically important roles, such as prevention of proliferation [36-39]. In particular, DCA, LCA, and isoLCA are known to be involved in inhibiting the growth of Clostridioides difficile, the most urgent antibiotic-resistant strain [36,40,41].
  • C.I. Difficile 630 was cultured in the presence of various concentrations of isoLCA, 3-oxoLCA, isoalloloCA, 3-oxololLCA, LCA, DCA, or control group, and growth in vitro was followed over time using optical density measurements. ..
  • isoalloloLCA It strongly inhibited the growth of differentialle 630 (FIGS. 4A and 4B, and FIGS. 13A and 13B).
  • the minimum inhibitory concentration (MIC90) required to prevent growth of 90% or more in WCA medium was 2.0 ⁇ M, well below the concentrations of other bile acids tested (FIGS. 4A and 4B, as well as).
  • FIG. 13A Strong growth inhibition by isoalloloLCa is a toxin-producing C.I. Difficile VPI10463 and vancomycin-resistant Enterococcus faecium (VRE) were also found (FIGS. 4A and 4B, and FIGS. 13A and 13B).
  • isoalloloLCA has bactericidal properties, and C.I. Difficile 630 and VRE have been shown to result in morphological and hyperfine structure changes, including cell wall collapse, swelling, and multiple wall penetrations (Fig. 4C). These damage patterns are often observed with ⁇ -lactam antibiotics [42].
  • C.I. innocuum St51 isoLCA producing bacterium
  • P.I. When co-cultured with distasonis St4 (isoLCA and LCA-producing bacteria), no bacteriostatic effect was observed.
  • MRSA methicillin-resistant Staphylococcus aureus
  • SDSE Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis
  • Clostridium perfringens Streptococcus pyogenes, Streptococcus sanguinis, and pathogens Gram-positive containing Bacillus cereus, as well as, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Salmonella enterica, Proteus vulgaris, and isoalloLCA against pathogens of gram-negative including Proteus mirabilis
  • S. Aureus is a well-known skin pathogen, but it often colonizes the intestine and is known to be resistant to most bile acids [43].
  • Isoallo LCA is S.M. It strongly inhibited the growth of all Gram-positive pathogens tested, including aureus, with MIC90 values ranging from 0.5 to 3 ⁇ M in WCA medium and 3 to 6.25 ⁇ M in BHI medium (FIGS. 4A and 4B). , And FIGS. 15A and 15B).
  • isoallolCA exerts a strong bactericidal / bacteriostatic effect by interfering with the cell wall of bacteria, especially against Gram-positive pathogens.
  • isoalloloLCA is described in S.I. It is also suggested that it exerts a preventive and therapeutic effect on skin diseases such as atopic dermatitis using aureus as a pathogen.
  • Example 6 Effect of isoallolCA on commensal intestinal flora Since intestinal metabolites encounter not only intestinal pathogens but also symbiotic bacteria, isoallolCA is common in human intestinal flora. We investigated how it affects common bacteria.
  • Bacteria constituting a total of 42 general gut microbiota consisting of both Gram-positive and Gram-negative bacteria were selected from the culture collection and cultured in WCA and BHI media while increasing the concentration of isoallolCA.
  • IsoalloLCA did not significantly affect the growth of most Gram-negative symbiotic bacteria such as Bacteroides (FIGS. 4E and 16A).
  • human fecal flora from young and healthy sample donors was used to assess the effects of isoalloloCA on complex normal gut flora using isoalloloCA, 3-oxoLCA, LCA, or control systems.
  • the cells were cultured and the changes in the bacterial flora were analyzed by 16S rRNA gene sequencing.
  • IsoalloloCA induces Treg cells, and 3-oxoLCA and isoLCA have been reported to suppress Therper17 (TH17) cells [30], and the accumulation of these bile acids protects against excessive immune response and inflammation. there is a possibility.
  • isoallolCA also exerts a very strong antibacterial effect against Gram-positive pathogens.
  • Bile acids have been reported to contribute to protection against intestinal pathogenic bacterial infections [36,44,45].
  • isoalloloLCA has been shown to function as the most potent antibacterial agent with high specificity against Gram-positive bacteria, including multidrug-resistant pathogens.
  • bile acids can be used as biomarkers to monitor health and predict lifespan, regardless of whether an increase in bacteria that produce isoalloloLCA, isoLCA, or 3-oxoLCA contributes to longevity as a result of longevity.
  • the bile acid pool was logically manipulated, and ultimately, antibiotic-resistant C.I. It is possible to improve infectious diseases caused by Gram-positive pathogens such as difficile, VRE and MRSA.
  • Example 7 Effect the inventors of testosterone metabolism of the intestinal bacteria, as described above, involved in the reduction of 3-oxo- ⁇ 4 -LCA to 3-oxoalloLCA, bacteria and enzymes which they produce (5AR) was found. Further, as shown in (Example 3), human 5AR is known to catalyze the enzymatic reduction of testosterone (testosterone) to 5 ⁇ -dihydrotestosterone (DHT), and it is known to catalyze the enzymatic reduction to 3-oxoalloLCA. Similar to reduction. Therefore, the present inventors focused on this similarity and predicted that the above-mentioned bacterial enzyme may also be involved in the metabolism of testosterone, as shown below.
  • Prostate cancer is the fifth leading cause of cancer death in men, with an estimated 1.2 million new cases reported worldwide in 2018 [61].
  • Tumor progression in prostate cancer is mediated by androgen receptor (AR) signaling in glandular cells.
  • Androgen deprivation therapy is currently used as the primary treatment to reduce testicular androgen levels to suppress prostate cancer cells, but most patients eventually develop hormone-refractory tumors [] 62].
  • both testosterone and DHT are ligands for AR, DHT is a more potent androgen that binds AR with high affinity [28]. It has been reported that 3 ⁇ -androstenediol metabolized by 3 ⁇ HSDH activates estrogen receptor ⁇ (ER ⁇ ) without binding to AR and inhibits prostate cancer cell migration by reducing E-cadherin expression. Yes [63,64].
  • Odoribacteraceae strain isolated from long-lived individuals over 100 years of age rapidly metabolizes testosterone and DHT to 3 ⁇ -androstenediol. Proved to have the ability.
  • Odoribacteraceae strain may have a therapeutic role in prostate cancer by depleting tumor-induced testosterone and DHT, presumably producing transference-resistant 3 ⁇ -androstenediol.
  • activation of 3 ⁇ -androstenediol of ER ⁇ has a growth inhibitory effect and a chemotherapy enhancing effect on ovarian endothelial cancer [66], and activation of ER ⁇ in breast cancer cells is generally a disease. It is believed to have an antiproliferative effect on the progression of [67].
  • the 3 ⁇ -androstanediol produced by these strains also has the potential for treatment as a neurosteroid [68,69].
  • Microbiomes other than the gut inflammaging and age-related diseases. Semin. Immunopathol. (2020). 14. Claesson, M.C. J. et al. Composition, variability, and numeric stability of the intestinal microbiota of the elderly. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. S. A. 108, 4586-4591 (2011). 15. Hirata, T.K. et al. Associations of cardiovascular biomarkers and plasma albumin with exposure existional to the highest ages. Nat. Commun. 11, 1-17 (2020). 16. Bloom, D.I. E. & Cadarette, D.I. Infectious disease threats in the twenty-first century: Strengthening the global response. Front. Immunol. 10, 549 (2019). 17.
  • the present invention it is possible to reduce the risk of infection with Gram-positive bacteria, prostate cancer, and the like. Therefore, the present invention is useful in the development of pharmaceuticals for these diseases.

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Abstract

百寿者の糞便において、イソアロＬＣＡ、３－オキソＬＣＡ、アロＬＣＡ及び３－オキソアロＬＣＡの含有比率が、それより若い者と比較して高いことを見出した。またこれら胆汁酸の生成に関与する、百寿者特有の腸内細菌を同定した。さらに、これら胆汁酸、これらの生成に関与する酵素、及び当該酵素を産生する細菌が、病原菌の感染や前立腺がん等のリスクを低減させ、長寿に関与することを見出した。

Description

胆汁酸を生成するための組成物
　本発明は、胆汁酸を生成するための組成物に関する。より詳しくは、本発明は、百寿（寿命が百歳以上となること）等に関連する胆汁酸を産生する細菌を有効成分とする組成物に関する。また、本発明は、当該組成物の、グラム陽性菌に対する抗菌用途、前立腺がん等の治療又は予防用途に関する。
　マイクロバイオーム（細菌叢が持つ遺伝子や機能を統合する概念）は、病原菌感染に対する抵抗性、免疫、神経活動、骨密度、消化吸収機能といった、高齢者の健康状態を左右する重要な因子と考えられてきた（非特許文献１～５）。高齢者の細菌叢には、しばしば個人間格差や多様性の現象が見られ、これらが、免疫機能の老化、慢性全身炎症や老衰と関連していると考えられている（非特許文献６及び７）。老化に関わる健康全般や組織の恒常性の修復や維持のために、細菌叢を構成する各細菌の機能の動的な調和を総合的に理解し、それらを論理的に操作する戦略の構築が不可欠となる。
　百歳以上の高齢者である百寿者は、高血圧、糖尿病、肥満やがんといった疾患にかかりにくいために長寿が達成されることが知られている（非特許文献８及び９）。さらに、百寿者の多くは、インフルエンザ、肺結核、赤痢、サルモレラ等の感染症や飢餓期を生き延びてきている（非特許文献１０）。このことは、百寿者の有する細菌叢は、長寿の結果としてだけでなく、健康に年を重ねる事や回復力、恒常性の維持に積極的に寄与していることを示唆している（非特許文献６及び１１～１３）。
　しかしながら、病原菌感染や環境負荷への抵抗性に寄与している百寿者が保有する有益な共生細菌等はいまだ明らかとなっていない。
Ｎｉｃｏｌｅｔｔｉ，Ｃ．Ａｇｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｂａｒｒｉｅｒ：Ｌｏｃａｌ　ａｎｄ　ｓｙｓｔｅｍｉｃ　ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｅｘｐｅｒｔ　Ｒｅｖ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｈｅｐａｔｏｌ．９，１４６７～１４６９（２０１５）． Ｈｕａｎｇ，Ｚ．＆Ｋｒａｕｓ，Ｖ．Ｂ．Ｄｏｅｓ　ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ　ｈａｖｅ　ａ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ＯＡ？　Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．１２，１２３～１２９（２０１６）． Ｍｏｒａｉｓ，Ｌ．Ｈ．，Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｈ．Ｌ．＆Ｍａｚｍａｎｉａｎ，Ｓ．Ｋ．Ｔｈｅｇｕｔ　ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ‐ｂｒａｉｎ　ａｘｉｓ　ｉｎ　ｂｅｈａｖｉｏｕｒ　ａｎｄ　ｂｒａｉｎ　ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２０２０）． Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉ，Ｃ．，Ｇａｒａｇｎａｎｉ，Ｐ．，Ｐａｒｉｎｉ，Ｐ．，Ｇｉｕｌｉａｎｉ，Ｃ．＆Ｓａｎｔｏｒｏ，Ａ．Ｉｎｆｌａｍｍａｇｉｎｇ：ａ　ｎｅｗ　ｉｍｍｕｎｅ‐ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　ｖｉｅｗｐｏｉｎｔ　ｆｏｒ　ａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄ　ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１４，５７６～５９０（２０１８）． Ｓａｎｔｏｒｏ，Ａ．ｅｔ　ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅｓ　ｏｔｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈｅ　ｇｕｔ：ｉｎｆｌａｍｍａｇｉｎｇ　ａｎｄ　ａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄ　ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．（２０２０）． Ｃｌａｅｓｓｏｎ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ　ａｌ．Ｇｕｔ　ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ　ｗｉｔｈ　ｄｉｅｔ　ａｎｄ　ｈｅａｌｔｈ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｅｌｄｅｒｌｙ．Ｎａｔｕｒｅ　４８８，１７８～１８４（２０１２）． Ｃｌａｅｓｓｏｎ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ　ａｌ．Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ，ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ，ａｎｄ　ｔｅｍｐｏｒａｌ　ｓｔａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｌｄｅｒｌｙ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０８，４５８６～４５９１（２０１１）． Ａｎｄｅｒｓｅｎ，Ｓ．Ｌ．，Ｓｅｂａｓｔｉａｎｉ，　Ｐ．，Ｄｗｏｒｋｉｓ，Ｄ．Ａ．，Ｆｅｌｄｍａｎ，Ｌ．＆Ｐｅｒｌｓ，Ｔ．Ｔ．Ｈｅａｌｔｈ　ｓｐａｎ　ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｓ　ｌｉｆｅ　ｓｐａｎ　ａｍｏｎｇ　ｍａｎｙ　ｓｕｐｅｒｃｅｎｔｅｎａｒｉａｎｓ：Ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ　ａｔ　ｔｈｅ　ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅ　ｌｉｍｉｔ　ｏｆ　ｌｉｆｅ　ｓｐａｎ．Ｊｏｕｒｎａｌｓ　Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．－Ｓｅｒ．Ａ　Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．６７Ａ，３９５～４０５（２０１２）． Ｈｉｒａｔａ，Ｔ．ｅｔ　ａｌ．Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ　ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ　ａｎｄ　ｐｌａｓｍａ　ａｌｂｕｍｉｎ　ｗｉｔｈ　ｅｘｃｅｐｔｉｏｎａｌ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｈｉｇｈｅｓｔ　ａｇｅｓ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．１１，１～１７（２０２０）． Ｂｌｏｏｍ，Ｄ．Ｅ．＆Ｃａｄａｒｅｔｔｅ，Ｄ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｔｈｒｅａｔｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｔｗｅｎｔｙ－ｆｉｒｓｔ　ｃｅｎｔｕｒｙ：Ｓｔｒｅｎｇｔｈｅｎｉｎｇ　ｔｈｅ　ｇｌｏｂａｌ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０，５４９（２０１９）． Ｂａｒｃｅｎａ，Ｃ．ｅｔ　ａｌ．Ｈｅａｌｔｈｓｐａｎ　ａｎｄ　ｌｉｆｅｓｐａｎ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　ｂｙ　ｆｅｃａｌ　ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　ｉｎｔｏ　ｐｒｏｇｅｒｏｉｄ　ｍｉｃｅ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２５，１２３４～１２４２（２０１９）． Ｂｉａｇｉ，Ｅ．ｅｔ　ａｌ．Ｇｕｔ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ　ａｎｄ　Ｅｘｔｒｅｍｅ　Ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ．Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．２６，１４８０～１４８５（２０１６）． Ｗｕ，Ｌ．ｅｔ　ａｌ．Ａ　ｃｒｏｓｓ－ｓｅｃｔｉｏｎａｌ　ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ　ａｎｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｐｒｏｆｉｌｅｓ　ｏｆ　ｇｕｔ　ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ　ｉｎ　Ｓａｒｄｉｎｉａｎ　ｃｅｎｔｅｎａｒｉａｎｓ．ｍＳｙｓｔｅｍｓ　４，ｅ００３２５－１９（２０１９）．
　本発明が解決しようとする課題は、百寿者特有の有益な共生細菌を同定し、当該細菌等を用いた病原菌感染の予防又は治療方法等を提供することを目的とする。
　百寿者は、慢性炎症や老化に伴う疾患への罹患率が低く、その結果として長寿を達成している。腸内細菌叢は、長寿や健康に関わる重要因子と考えられている。
　そこで、本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、百寿者（平均１０７歳）が、高齢者（８５～８９歳）や若年者（２１～５５歳）と比較して、特異的に、ｉｓｏａｌｌｏ　ｌｉｔｈｏｃｈｏｌｉｃ　ａｃｉｄ（リトコール酸、ＬＣＡ）、ｉｓｏＬＣＡ、３－ｏｘｏＬＣＡ、ａｌｌｏＬＣＡ、３－ｏｘｏａｌｌｏＬＣＡ等の二次胆汁酸を産生する腸内細菌を保有していることを見出した。特に、ｉｓｏａｌｌｏＬＣＡを誘導する生化学合成経路はこれまでに報告されていない。
　さらに、百寿者の便より単離された６８種の細菌株において、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｍｅｒｄａｅ及びＯｄｏｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅに属する複数の株がｉｓｏａｌｌｏＬＣＡを効果的に誘導することが明らかになった。さらにまた、Ｐ．ｍｅｒｄａｅの遺伝子欠損株を用いた実験により、３－オキソ－５α－ステロイド－４－デヒドロゲナーゼ（別称：５α－ｒｅｄｕｃｔａｓｅ（５ＡＲ））と３βヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（３β－ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（３βＨＳＤＨ））がｉｓｏａｌｌｏＬＣＡの生成を担っていることが判明した。
　そして、これら二次胆汁酸誘導体は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ　ｄｉｆｆｉｃｉｌｅやｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃｉｕｍ等のグラム陽性多剤耐性菌に対する抗菌作用が非常に高いということも見出した。
　また、前記５ＡＲ及び３βＨＳＤＨが、ｉｓｏａｌｌｏＬＣＡの生成のみならず、テストステロンの代謝に関与していることも、本発明者らは明らかにした。これら酵素、又はそれらを産生する菌が、腫瘍誘発性のテストステロン及び５α－ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）を枯渇させる一方で、転移抵抗性である３β－アンドロスタンジオールを生成することによって、前立腺がん等に対し、治療的効果が奏され得る。
　このように、本発明者らは、特定の二次胆汁酸代謝物、これらの生成に関与する酵素、及び当該酵素を産生する細菌が、病原菌の感染や前立腺がん等のリスクを低減させ、長寿に関与することを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下を提供するものである。
　＜１＞　３－オキソ－５α－ステロイド－４－デヒドロゲナーゼ（５ＡＲ）をコードするポリヌクレオチドを有する細菌を有効成分とする、３－ｏｘｏ－Δ４－ＬＣＡ（３－オキソ－Δ４－ＬＣＡ）を３－ｏｘｏａｌｌｏＬＣＡ（３－オキソアロＬＣＡ）に変換するための組成物。
　本発明はまた、３－オキソ－Δ４－ＬＣＡを３－オキソアロＬＣＡに変換するための組成物を製造するための、５ＡＲをコードするポリヌクレオチドを有する細菌の使用に関する。
　＜２＞　３βヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（３βＨＳＤＨ）をコードするポリヌクレオチドを有する細菌を有効成分とする、３－オキソアロＬＣＡをイソアロＬＣＡ（ｉｓｏａｌｌｏＬＣＡ）に変換するための組成物。
　本発明はまた、３－オキソアロＬＣＡをイソアロＬＣＡに変換するための組成物を製造するための、３βヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（３βＨＳＤＨ）をコードするポリヌクレオチドを有する細菌の使用に関する。
　＜３＞　５ＡＲをコードするポリヌクレオチドを有する細菌と３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチドを有する細菌とを有効成分とする、３－オキソ－Δ４－ＬＣＡからイソアロＬＣＡを生成するための組成物。
　本発明はまた、３－オキソ－Δ４－ＬＣＡからイソアロＬＣＡを生成するための組成物を製造するための、５ＡＲをコードするポリヌクレオチドを有する細菌と３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチドを有する細菌の使用に関する。
　＜４＞　５ＡＲをコードするポリヌクレオチド及び３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチドを有する細菌を有効成分とする、３－オキソ－Δ４－ＬＣＡからイソアロＬＣＡを生成するための組成物。
　本発明はまた、３－オキソ－Δ４－ＬＣＡからイソアロＬＣＡを生成するための組成物を製造するための、５ＡＲをコードするポリヌクレオチド及び３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチドを有する細菌の使用に関する。
　＜５＞　３－オキソ－５β－ステロイド－４－デヒドロゲナーゼ（５ＢＲ）をコードするポリヌクレオチドを有する細菌。
　＜６＞　５ＢＲをコードするポリヌクレオチドを有する細菌を有効成分とする、３－オキソ－Δ４－ＬＣＡを３－オキソＬＣＡ（３－ｏｘｏＬＣＡ）に変換するための組成物。
　本発明はまた、３－オキソ－Δ４－ＬＣＡを３－オキソＬＣＡに変換するための組成物を製造するための、５ＢＲをコードするポリヌクレオチドを有する細菌の使用に関する。
　＜７＞　５ＡＲをコードするポリヌクレオチド、３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチド、及び５ＢＲをコードするポリヌクレオチドを有する細菌を有効成分とする、イソＬＣＡ（ｉｓｏＬＣＡ）又は３－オキソＬＣＡからイソアロＬＣＡを生成するための組成物。
　本発明はまた、イソＬＣＡ又は３－オキソＬＣＡからイソアロＬＣＡを生成するための組成物を製造するための、５ＡＲをコードするポリヌクレオチド、３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチド、及び５ＢＲをコードするポリヌクレオチドを有する細菌の使用に関する。
　＜８＞　グラム陽性菌に対する抗菌用組成物である、＜１＞～＜７＞のうちのいずれか一項に記載の組成物。
　＜９＞　イソアロＬＣＡ又はイソＬＣＡを有効成分とする、グラム陽性菌に対する抗菌用組成物。
　＜１０＞　５ＡＲ、３βＨＳＤＨ、及び５ＢＲから選択される少なくとも１の酵素を有効成分とする、グラム陽性菌に対する抗菌用組成物。
　＜１１＞　グラム陽性菌の感染症を治療又は予防するための組成物である、＜８＞～＜１０＞のうちのいずれか一項に記載の組成物。
　＜１２＞　クロストリジウム・ディフィシルの感染症を治療又は予防するための組成物である、＜８＞～＜１０＞のうちのいずれか一項に記載の組成物。
　＜１３＞　敗血症及び敗血症を基礎疾患として有する急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ／ＡＬＩ）からなる群から選択される少なくとも１の疾患を、治療又は予防するための組成物である、＜８＞～＜１０＞のうちのいずれか一項に記載の組成物。
　本発明はまた、グラム陽性菌に対する抗菌用組成物、グラム陽性菌の感染症を治療若しくは予防するための組成物、クロストリジウム・ディフィシルの感染症を治療若しくは予防するための組成物、又は、敗血症及び敗血症を基礎疾患として有するＡＲＤＳ／ＡＬＩからなる群から選択される少なくとも１の疾患を、治療若しくは予防するための組成物を製造するための、
５ＡＲをコードするポリヌクレオチドを有する細菌、３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチドを有する細菌、５ＡＲをコードするポリヌクレオチドを有する細菌と３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチドを有する細菌、５ＡＲをコードするポリヌクレオチド及び３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチドを有する細菌、並びに５ＡＲをコードするポリヌクレオチド、３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチド、及び５ＢＲをコードするポリヌクレオチドを有する細菌からなる群から選択される少なくとも１の細菌の使用に関する。
　本発明はまた、グラム陽性菌の増殖を抑制するための、グラム陽性菌の感染症を治療若しくは予防するための、クロストリジウム・ディフィシルの感染症を治療若しくは予防するための、又は、敗血症及び敗血症を基礎疾患として有するＡＲＤＳ／ＡＬＩからなる群から選択される少なくとも１の疾患を、治療若しくは予防するための、
５ＡＲをコードするポリヌクレオチドを有する細菌、３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチドを有する細菌、５ＡＲをコードするポリヌクレオチドを有する細菌と３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチドを有する細菌、５ＡＲをコードするポリヌクレオチド及び３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチドを有する細菌、並びに、５ＡＲをコードするポリヌクレオチド、３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチド、及び５ＢＲをコードするポリヌクレオチドを有する細菌からなる群から選択される少なくとも１の細菌の使用に関する。
　本発明はまた、グラム陽性菌の増殖抑制、グラム陽性菌感染症の治療若しくは予防、クロストリジウム・ディフィシル感染症の治療若しくは予防、又は、敗血症及び敗血症を基礎疾患として有するＡＲＤＳ／ＡＬＩからなる群から選択される少なくとも１の疾患の、治療若しくは予防に用いるための、
５ＡＲをコードするポリヌクレオチドを有する細菌、３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチドを有する細菌、５ＡＲをコードするポリヌクレオチドを有する細菌と３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチドを有する細菌、５ＡＲをコードするポリヌクレオチド及び３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチドを有する細菌、並びに、５ＡＲをコードするポリヌクレオチド、３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチド、及び５ＢＲをコードするポリヌクレオチドを有する細菌からなる群から選択される少なくとも１の細菌に関する。
　本発明はまた、５ＡＲをコードするポリヌクレオチドを有する細菌、３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチドを有する細菌、５ＡＲをコードするポリヌクレオチドを有する細菌と３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチドを有する細菌、５ＡＲをコードするポリヌクレオチド及び３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチドを有する細菌、並びに、５ＡＲをコードするポリヌクレオチド、３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチド、及び５ＢＲをコードするポリヌクレオチドを有する細菌からなる群から選択される少なくとも１の細菌の有効量を、対象に投与する、
グラム陽性菌の増殖を抑制するための、グラム陽性菌の感染症を治療若しくは予防するための、クロストリジウム・ディフィシルの感染症を治療若しくは予防するための、又は、敗血症及び敗血症を基礎疾患として有するＡＲＤＳ／ＡＬＩからなる群から選択される少なくとも１の疾患を、治療若しくは予防するための、方法に関する。
　本発明はまた、グラム陽性菌に対する抗菌用組成物、グラム陽性菌の感染症を治療若しくは予防するための組成物、クロストリジウム・ディフィシルの感染症を治療若しくは予防するための組成物、又は、敗血症及び敗血症を基礎疾患として有するＡＲＤＳ／ＡＬＩからなる群から選択される少なくとも１の疾患を、治療若しくは予防するための組成物を製造するための、イソアロＬＣＡ又はイソＬＣＡの使用に関する。
　本発明はまた、グラム陽性菌の増殖を抑制するための、グラム陽性菌の感染症を治療若しくは予防するための、クロストリジウム・ディフィシルの感染症を治療若しくは予防するための、又は、敗血症及び敗血症を基礎疾患として有するＡＲＤＳ／ＡＬＩからなる群から選択される少なくとも１の疾患を、治療若しくは予防するための、
イソアロＬＣＡ又はイソＬＣＡの使用に関する。
　本発明はまた、グラム陽性菌の増殖抑制、グラム陽性菌感染症の治療若しくは予防、クロストリジウム・ディフィシル感染症の治療若しくは予防、又は、敗血症及び敗血症を基礎疾患として有するＡＲＤＳ／ＡＬＩからなる群から選択される少なくとも１の疾患の、治療若しくは予防に用いるための、イソアロＬＣＡ又はイソＬＣＡに関する。
　本発明はまた、イソアロＬＣＡ又はイソＬＣＡの有効量を、対象に投与する、グラム陽性菌の増殖を抑制するための、グラム陽性菌の感染症を治療若しくは予防するための、クロストリジウム・ディフィシルの感染症を治療若しくは予防するための、又は、敗血症及び敗血症を基礎疾患として有するＡＲＤＳ／ＡＬＩからなる群から選択される少なくとも１の疾患を、治療若しくは予防するための、方法に関する。
　本発明はまた、グラム陽性菌に対する抗菌用組成物、グラム陽性菌の感染症を治療若しくは予防するための組成物、クロストリジウム・ディフィシルの感染症を治療若しくは予防するための組成物、又は、敗血症及び敗血症を基礎疾患として有するＡＲＤＳ／ＡＬＩからなる群から選択される少なくとも１の疾患を、治療若しくは予防するための組成物を製造するための、５ＡＲ、３βＨＳＤＨ、及び５ＢＲから選択される少なくとも１の酵素の使用に関する。
　本発明はまた、グラム陽性菌の増殖を抑制するための、グラム陽性菌の感染症を治療若しくは予防するための、クロストリジウム・ディフィシルの感染症を治療若しくは予防するための、又は、敗血症及び敗血症を基礎疾患として有するＡＲＤＳ／ＡＬＩからなる群から選択される少なくとも１の疾患を、治療若しくは予防するための、５ＡＲ、３βＨＳＤＨ、及び５ＢＲから選択される少なくとも１の酵素の使用に関する。
　本発明はまた、グラム陽性菌の増殖抑制、グラム陽性菌感染症の治療若しくは予防、クロストリジウム・ディフィシル感染症の治療若しくは予防、又は、敗血症及び敗血症を基礎疾患として有するＡＲＤＳ／ＡＬＩからなる群から選択される少なくとも１の疾患の、治療若しくは予防に用いるための、５ＡＲ、３βＨＳＤＨ、及び５ＢＲから選択される少なくとも１の酵素に関する。
　本発明はまた、５ＡＲ、３βＨＳＤＨ、及び５ＢＲから選択される少なくとも１の酵素の有効量を、対象に投与する、グラム陽性菌の増殖を抑制するための、グラム陽性菌の感染症を治療若しくは予防するための、クロストリジウム・ディフィシルの感染症を治療若しくは予防するための、又は、敗血症及び敗血症を基礎疾患として有するＡＲＤＳ／ＡＬＩからなる群から選択される少なくとも１の疾患を、治療若しくは予防するための、方法に関する。
　＜１４＞　３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチドを有する細菌を有効成分とする、５α－ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）を３β－アンドロスタンジオールに変換するための組成物。
　本発明はまた、ＤＨＴを３β－アンドロスタンジオールに変換するための組成物を製造するための、３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチドを有する細菌の使用に関する。
　＜１５＞　５ＡＲをコードするポリヌクレオチドを有する細菌と３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチドを有する細菌とを有効成分とする、テストステロンから３β－アンドロスタンジオールを生成するための組成物。
　本発明はまた、テストステロンから３β－アンドロスタンジオールを生成するための組成物を製造するための、５ＡＲをコードするポリヌクレオチドを有する細菌と３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチドを有する細菌との使用に関する。
　＜１６＞　５ＡＲをコードするポリヌクレオチド及び３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチドを有する細菌を有効成分とする、テストステロンから３β－アンドロスタンジオールを生成するための組成物。
　本発明はまた、テストステロンから３β－アンドロスタンジオールを生成するための組成物を製造するための、５ＡＲをコードするポリヌクレオチド及び３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチドを有する細菌の使用に関する。
　＜１７＞　３βＨＳＤＨを有効成分とする、ＤＨＴから３β－アンドロスタンジオールを生成するための組成物。
　本発明はまた、ＤＨＴから３β－アンドロスタンジオールを生成するための組成物を製造するための、３βＨＳＤＨの使用に関する。
　＜１８＞　５ＡＲ及び３βＨＳＤＨを有効成分とする、テストステロンから３β－アンドロスタンジオールを生成するための組成物。
　本発明はまた、テストステロンから３β－アンドロスタンジオールを生成するための組成物を製造するための、５ＡＲ及び３βＨＳＤＨの使用に関する。
　＜１９＞　下記疾患群から選択される少なくとも１の疾患を、治療又は予防するための組成物である、＜１４＞～＜１８＞のうちのいずれか一項に記載の組成物
疾患群：
前立腺がん、男性ホルモン性脱毛症、多嚢胞性卵巣症候群、にきび、男性型多毛症、卵巣内皮がん、神経炎症、及びＧＡＢＡＡ受容体を介したてんかん。
　本発明はまた、前記疾患群から選択される少なくとも１の疾患を、治療又は予防するための組成物を製造するための、
３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチドを有する細菌、５ＡＲをコードするポリヌクレオチドを有する細菌と３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチドを有する細菌、５ＡＲをコードするポリヌクレオチド及び３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチドを有する細菌、３βＨＳＤＨ、並びに、５ＡＲ及び３βＨＳＤＨからなる群から選択される少なくとも１の物質の使用に関する。
　本発明はまた、前記疾患群から選択される少なくとも１の疾患を、治療又は予防するための、
３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチドを有する細菌、５ＡＲをコードするポリヌクレオチドを有する細菌と３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチドを有する細菌、５ＡＲをコードするポリヌクレオチド及び３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチドを有する細菌、３βＨＳＤＨ、並びに、５ＡＲ及び３βＨＳＤＨからなる群から選択される少なくとも１の物質の使用に関する。
　本発明はまた、前記疾患群から選択される少なくとも１の疾患の、治療又は予防に用いるための、３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチドを有する細菌、５ＡＲをコードするポリヌクレオチドを有する細菌と３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチドを有する細菌、５ＡＲをコードするポリヌクレオチド及び３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチドを有する細菌、３βＨＳＤＨ、並びに、５ＡＲ及び３βＨＳＤＨからなる群から選択される少なくとも１の物質に関する。
　本発明はまた、３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチドを有する細菌、５ＡＲをコードするポリヌクレオチドを有する細菌と３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチドを有する細菌、５ＡＲをコードするポリヌクレオチド及び３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチドを有する細菌、３βＨＳＤＨ、並びに、５ＡＲ及び３βＨＳＤＨからなる群から選択される少なくとも１の物質の有効量を、対象に投与する、前記疾患群から選択される少なくとも１の疾患を、治療又は予防するための、方法に関する。
　＜２０＞　下記疾患群から選択される少なくとも１の疾患の評価方法であって、
疾患群：
前立腺がん、男性ホルモン性脱毛症、多嚢胞性卵巣症候群、にきび、男性型多毛症、卵巣内皮がん、神経炎症、及びＧＡＢＡＡ受容体を介したてんかん、
（１）被検者糞便中、３βＨＳＤＨを産生する細菌を定量する工程、
（２）工程（１）で定量して得られた値を、百寿者の前記細菌を定量して得られる対応値と比較する工程、及び
（３）工程（２）における比較の結果、
　被検者糞便中の前記定量値が、前記対応値と同等又はそれより高い場合に、前記被検者は前記疾患に罹患する可能性は低いと判定し、
　被検者糞便中の前記定量値が、前記対応値より低い場合に、前記被検者は前記疾患に罹患する可能性が高い、又は罹患している可能性が高いと判定する工程を、含む方法。
　＜２１＞　下記疾患群から選択される少なくとも１の疾患の予防方法又は治療方法であって、
　疾患群：
前立腺がん、男性ホルモン性脱毛症、多嚢胞性卵巣症候群、にきび、男性型多毛症、卵巣内皮がん、神経炎症、及びＧＡＢＡＡ受容体を介したてんかん、
　＜２０＞に記載の方法にて、前記疾患に罹患する可能性が高い、又は罹患している可能性が高いと判定された前記被検者に、３βＨＳＤＨを産生する細菌を投与する方法。
　＜２２＞　百歳以上生存する可能性を評価する方法であって、
（１）被検者糞便中、３－オキソＬＣＡ、イソアロＬＣＡ、３－オキソアロＬＣＡ、アロＬＣＡ（ａｌｌｏＬＣＡ）、３－オキソＬＣＡ及びイソＬＣＡからなる群から選択される少なくとも１の胆汁酸を定量する工程、
（２）工程（１）で定量して得られた値を、百寿者の前記胆汁酸を定量して得られる対応値と比較する工程、及び
（３）工程（２）における比較の結果、
　被検者糞便中の前記定量値が、前記対応値と同等又はそれより高い場合に、前記被検者は百歳以上生存する可能性が高いと判定し、
　被検者糞便中の前記定量値が、前記対応値より低い場合に、前記被検者は百歳以上生存する可能性が低いと判定する工程を、含む方法。
　＜２３＞　百歳以上生存する可能性を評価する方法であって、
（１）被検者糞便中、５ＡＲ、３βＨＳＤＨ、及び５ＢＲから選択される少なくとも１の酵素を産生する細菌を定量する工程、
（２）工程（１）で定量して得られた値を、百寿者の前記細菌を定量して得られる対応値と比較する工程、及び
（３）工程（２）における比較の結果、
　被検者糞便中の前記定量値が、前記対応値と同等又はそれより高い場合に、前記被検者は百歳以上生存する可能性が高いと判定し、
　被検者糞便中の前記定量値が、前記対応値より低い場合に、前記被検者は百歳以上生存する可能性が低いと判定する工程を、含む方法。
　＜２４＞　百歳以上生存する可能性を向上させる方法であって、
　＜２２＞又は＜２３＞に記載の方法にて、百歳以上生存する可能性が低いと判定された前記被検者に、３－オキソＬＣＡ、イソアロＬＣＡ、３－オキソアロＬＣＡ、アロＬＣＡ、３－オキソＬＣＡ及びイソＬＣＡ、並びに、５ＡＲ、３βＨＳＤＨ、及び５ＢＲから選択される少なくとも１の酵素を産生する細菌からなる群から選択される少なくとも１を投与する方法。
　＜２５＞　グラム陽性菌に対する抵抗性を評価する方法であって、
（１）被検者糞便中、３－オキソＬＣＡ及びイソアロＬＣＡからなる群から選択される少なくとも１の胆汁酸を定量する工程、
（２）工程（１）で定量して得られた値を、百寿者の前記胆汁酸を定量して得られる対応値と比較する工程、及び
（３）工程（２）における比較の結果、
　被検者糞便中の前記定量値が、前記対応値と同等又はそれより高い場合に、前記被検者はグラム陽性菌に対する抵抗性が高いと判定し、
　被検者糞便中の前記定量値が、前記対応値より低い場合に、前記被検者はグラム陽性菌に対する抵抗性が低いと判定する工程を、含む方法。
　＜２６＞　グラム陽性菌に対する抵抗性を評価する方法であって、
（１）被検者糞便中、５ＡＲ、３βＨＳＤＨ、及び５ＢＲから選択される少なくとも１の酵素を産生する細菌を定量する工程、
（２）工程（１）で定量して得られた値を、百寿者の前記細菌を定量して得られる対応値と比較する工程、及び
（３）工程（２）における比較の結果、
　被検者糞便中の前記定量値が、前記対応値と同等又はそれより高い場合に、前記被検者はグラム陽性菌に対する抵抗性が高いと判定し、
　被検者糞便中の前記定量値が、前記対応値より低い場合に、前記被検者はグラム陽性菌に対する抵抗性が低いと判定する工程を、含む方法。
　＜２７＞　グラム陽性菌の感染症を予防する方法であって、
　＜２５＞又は＜２６＞に記載の方法にて、グラム陽性菌に対する抵抗性が低いと判定された前記被検者に、３－オキソＬＣＡ、イソアロＬＣＡ、並びに、５ＡＲ、３βＨＳＤＨ、及び５ＢＲから選択される少なくとも１の酵素を産生する細菌からなる群から選択される少なくとも１を投与する方法。
　＜２８＞　３－オキソアロＬＣＡの存在下、３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチドを有する細菌を培養し、該細菌及び／又はその培養物において生成されたイソアロＬＣＡを採取する工程を含む、イソアロＬＣＡの製造方法。
　＜２９＞　３－オキソ－Δ４－ＬＣＡの存在下、５ＡＲをコードするポリヌクレオチドを有する細菌と３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチドを有する細菌とを培養し、該細菌及び／又はその培養物において生成されたイソアロＬＣＡを採取する工程を含む、イソアロＬＣＡの製造方法。
　＜３０＞　３－オキソ－Δ４－ＬＣＡの存在下、５ＡＲをコードするポリヌクレオチドと３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチドとを有する細菌を培養し、該細菌及び／又はその培養物において生成されたイソアロＬＣＡを採取する工程を含む、イソアロＬＣＡの製造方法。
　＜３１＞　イソＬＣＡ又は３－オキソＬＣＡの存在下、５ＡＲをコードするポリヌクレオチド、３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチド、及び５ＢＲをコードするポリヌクレオチドを有する細菌を培養し、該細菌及び／又はその培養物において生成されたイソアロＬＣＡを採取する工程を含む、イソアロＬＣＡの製造方法。
　＜３２＞　３βＨＳＤＨの存在下、３－オキソアロＬＣＡからイソアロＬＣＡを生成し、当該イソアロＬＣＡを採取する工程を含む、イソアロＬＣＡの製造方法。
　＜３３＞　５ＡＲ及び３βＨＳＤＨの存在下、３－オキソ－Δ４－ＬＣＡからイソアロＬＣＡを生成し、当該イソアロＬＣＡを採取する工程を含む、イソアロＬＣＡの製造方法。
　＜３４＞　５ＡＲ、３βＨＳＤＨ及び５ＢＲの存在下、イソＬＣＡ又は３－オキソＬＣＡからイソアロＬＣＡを生成し、当該イソアロＬＣＡを採取する工程を含む、イソアロＬＣＡの製造方法。
　本発明によれば、百寿に関連する胆汁酸の製造が可能となる。また当該胆汁酸、それらの生成に関与する酵素、及び当該酵素を産生する細菌等によって、グラム陽性菌の感染症、又は前立腺がん等の治療又は予防が可能となる。さらに、本発明によれば、糞便中におけるこれら細菌等の量を指標とすることによって、グラム陽性菌の感染症への抵抗性、前立腺がん等の罹患の可能性、百歳以上生存する可能性を評価することも可能となる。
Ｂｒａｙ－Ｃｕｒｔｉｓの非類似度を示す、β多様性のＰＣｏＡプロットである。より若い被験者（高齢者及び若年者）の腸内細菌叢から百寿者の腸内細菌叢へ徐々に分離していくことが示される。図中、「Ｃｅｎｔｅｎａｒｉａｎ（又はＣＥ）」、「Ｅｌｄｅｒｌｙ」、及び「Ｙｏｕｎｇ」は各々、百寿者、高齢者及び若年者を示す（以下の図面においても同様）。図１Ａ～１Ｇに、全メタゲノムショットガンシーケンシングとｄｅ　ｎｏｖｏアセンブリ解析を基にした、被験者（日本人の百歳以上の長寿者（百寿者）、高齢者、若年者）の腸内細菌の特徴を示す。 Ｓｈａｎｎｏｎ多様性指数を示すドットプロット図である若年者と比較して百寿者と高齢者の被験者で有意に増加した（Ｐ＜０．０５、線形モデル）。 存在量の多い５つの細菌門の相対存在量（Ｒｅｌａｔｉｖｅ　ａｂｕｎｂａｎｃｅ）を示すグラフである。 差のある存在量について高齢の特徴に従ってグループ化された、百寿者、高齢者、若年者コントロール間の腸内細菌種（ＭＳＰｓ）の相対存在量（ＲｅｌＡｂ）の変化を示すグラフである。 差のある存在量について若年の特徴に従ってグループ化された、百寿者、高齢者、若年者コントロール間の腸内細菌種の相対存在量の変化を示すグラフである。 差のある存在量について百寿の特徴に従ってグループ化された、百寿者、高齢者、若年者コントロール間の腸内細菌種の相対存在量の変化を示すグラフである。図１Ｄ～１Ｆにおいて、それぞれの特徴は、百寿者、高齢者、若年者のグループの中の既定の軌跡に属する種に対する、異なる相対存在量の状況を表すモデルを示している。カラースケールは線形モデルからの係数を表し、それぞれの比較において、種の増加（カラー表示下「赤」）と減少（カラー表示下「青」）を示す。高齢者と比較した百寿者、若年者と比較した百寿者、若年者と比較した高齢者；それぞれのケースで後者のグループは、参照モデルとして使用した。ＦＤＲ　Ｐ＜０．０５で有意に存在量が異なる菌種を、アスタリスクで示す。 百寿者、高齢者、若年者グループのＣ．ｓｃｉｎｄｅｎｓのｂａｉオペロン（ｂａｉＡ２とｂａｉＮを除く）の遺伝子のホモログの存在量を示すドットプロット図である。アスタリスクは、Ｗｉｌｃｏｘｏｎの順位和検定を基にしたＦＤＲ　Ｐ＜０．０５において、有意に異なる存在量であることを示す。被験数：百寿者［ｎ＝１７６（１５３人）］、高齢者（ｎ＝１１０）、若年者（ｎ＝４４）。それぞれの点は個々の被験者を示す。 百寿者（ｎ＝１２７）、高齢者（ｎ＝１０８）、若年者（ｎ＝４７）及び百寿者の直系親族（図中「ＣＥ－Ｌ」と表記（以下、同様）、ｎ＝１８）について、個々の被験者の糞便における胆汁酸を、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより分析、定量した結果を示す、グラフである。カラー表示下、３－ｏｘｏａｌｌｏＬＣＡの比率を青色で、ｉｓｏａｌｌｏＬＣＡの比率を赤色で、ａｌｌｏＬＣＡの比率を緑色で、３－ｏｘｏＬＣＡの比率を水色で、ｉｓｏＬＣＡの比率を黄色で示す。結果を、それぞれのグループ内で年齢順に示す。本発明者らが注目した百寿者９１（ＣＥ９１）を、点線枠で示す。図２Ａ～２Ｇにおいて、百寿者の糞便において、ｉｓｏＬＣＡ、３－ｏｘｏＬＣＡ、ａｌｌｏＬＣＡ、ｉｓｏａｌｌｏＬＣＡ及び３－ｏｘｏａｌｌｏＬＣＡの含有量が有意に高いことを示す。 糞便中の胆汁酸化合物の総量について、４種の年齢群の個々人に対して定量した結果を示す、ドットプロット図である。 個人の胆汁酸分析結果間の差異を示す、Ｓｐｅａｒｍａｎの相関を用いた多次元尺度構成法プロット（ＭＤＳ）である。それぞれの点は、年齢群によって色分けされた各ドナー個人を示している（百寿者ｖｓ．高齢者；Ｐ＝４．２７Ｅ－９、百寿者ｖｓ．若年者；Ｐ＝２．７２Ｅ－１２、百寿者ｖｓ．百寿者の直系親族；Ｐ＝４．１８Ｅ－６、高齢者ｖｓ．若年者；Ｐ＝０．００１２３、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定）。 腸内細菌によって代謝される、トータル一次胆汁酸（Ｐｒｉｍａｒｙ　ＢＡ）とトータル二次胆汁酸（Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ　ＢＡ）の平均比率を示す、グラフである。 ＣＡを基にした胆汁酸（７α－と１２α－ＯＨ基を有する）とＣＤＣＡを基にした胆汁酸（７α－ＯＨ基を有する）の平均比率を示す、グラフである。 糞便中の各胆汁酸化合物の定量結果を示すグラフである。　　図２Ｂ及び２Ｄ～２Ｆにおいて、データは平均±標準偏差にて示す。＊＊＊　Ｐ＜０．００１；＊＊　Ｐ＜０．０１；＊　Ｐ＜０．０５；Ｔｕｋｅｙの検定を伴う一元配置分散分析。ｎｓは有意差なしであることを示す。各点は個々人を示す。糞便中の総胆汁酸量は、糞便の湿重量に対するμｍｏｌ／ｇをもって示す。 ＣＥ９１の糞便細菌組成を示す図である。ＣＥ９１の糞便から単離された６８細菌株を、それらの相対存在量と共に示す。図３Ａ～３Ｅにおいて、同定された、ｉｓｏＬＣＡ、３－ｏｘｏＬＣＡ及びｉｓｏａｌｌｏＬＣＡの生成に関わる細菌株と遺伝子を示す。 ＣＥ９１由来６８株による、５０μＭのＬＣＡを基質とする胆汁酸代謝の結果を示す、グラフである。 ＣＥ９１由来６８株による、５０μＭの３－ｏｘｏ－Δ４－ＬＣＡを基質とする胆汁酸代謝の結果を示す、グラフである。図３Ｂ及び３Ｃにおいて、単離菌は、嫌気条件下、ｐＨ９に調整された培地中で４８時間、３７℃で培養した。これらの図面において、予測される胆汁酸代謝酵素遺伝子ホモログの有無を、ワッフルチャートにて右側に示す。ホモログは＜１ｅ－１２　Ｅ値；＞３０％　配列一致度；＞６０％　クエリカバレッジとして定義した。また、これらの図面において、カラー表示下、赤で薄く色づけられたグラフ領域は、トランス型の化学構造を有する化合物を示し、青はシス型の化学構造を有する化合物を示す。 Ｐ．ｍｅｒｄａｅ　Ｓｔ３とＯｄｏｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ　Ｓｔ２１とにおいて、予測される胆汁酸代謝酵素遺伝子の概略図である。矢印はコーディング配列を示す。また、カラー表示下、同定された機能に基づき色分けしてある。 Ｐ．ｍｅｒｄａｅ　Ｓｔ３の、５ＡＲ、３βＨＳＤＨ又は５ＢＲ遺伝子の欠失株における胆汁酸代謝アッセイの結果を示す、グラフである。５０μＭの３－ｏｘｏａｌｌｏＬＣＡ、３－ｏｘｏ－Δ４－ＬＣＡ又は３－ｏｘｏＬＣＡを基質としてｐＨ９に調整した培地に加え、４８時間３７℃で培養した。カラー表示下、検出された基質濃度は薄い黄色で示す。ｎｄは未検出であることを示す。図３Ｂ、３Ｃ及び３Ｅにおいて、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳにて決定した胆汁酸濃度を示す。データはＮ＝２のサンプルの平均±標準偏差にて示す。 グラム陽性病原体及びグラム陰性病原体に対する、ＷＣＡ培地又はＢＨＩ培地における二次胆汁酸の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ９０）を示す図である。 各二次胆汁酸の濃度を変化させたＷＣＡ培地中での、病原体の増殖曲線を示すグラフである。カラー表示下、ＬＣＡ、ｉｓｏＬＣＡ及びｉｓｏａｌｌｏＬＣＡを各々、青色、黄色及び緑色にて示す。データは平均と標準偏差にて示す。エラーバーは、塗り潰し領域にて表す。 ８μＭ　ｉｓｏａｌｌｏＬＣＡ含有又は含有しないＷＣＡ培地中で、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ　６３０とＶＲＥを５時間培養した際の代表的な走査型電子顕微鏡画像（ＳＥＭ、左パネル）と透過型電子顕微鏡画像（ＴＥＭ、右パネル）である。スケールバーは、１．０μｍ（ＳＥＭ）、２００ｎｍ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ　６３０のＴＥＭ）、５００ｎｍ（ＶＲＥのＴＥＭ）を示す。矢印は、ｉｓｏａｌｌｏＬＣＡ処理後の形状変化を示す。 １２．５μＭ　３－ｏｘｏ－Δ４－ＬＣＡ含有ＷＣＡ培地中での、ＣＥ９１由来のＯｄｏｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ　Ｓｔ２１、Ｃ．ｉｎｎｏｃｕｕｍ　Ｓｔ５１又はＰ．ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ　Ｓｔ４と共培養した際の、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ　６３０又はＶＲＥのＩｎ　ｖｉｔｒｏ増殖抑制の結果を示す、グラフである。一晩培養した際のＣＦＵを示す（ｎ＝６）。 ＷＣＡ培地又はＢＨＩ培地中での、共生株に対するｉｓｏａｌｌｏＬＣＡのＭＩＣ９０を示す図である。 二次胆汁酸処理後の糞便培養液の多様性についてのＳｈａｎｎｏｎ指数を示す、ドットプロット図である。健康な若年ドナーのヒト糞便サンプルを、３－ｏｘｏＬＣＡ又はＬＣＡ、ｉｓｏａｌｌｏＬＣＡを添加（５０μＭ）した改良ＷＣＡ培地中で、４８時間インキュベートした結果を示す。図４Ｄと４Ｆにおいて、データは平均±標準偏差にて示す。＊＊＊はＰ＜０．００１であることを示す。図４Ｄは、Ｗｅｌｃｈの補正を伴うＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定の結果を示す。図４Ｆは、Ｄｕｎｎの検定を伴うＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定の結果を示す。ｎｓは有意差なしであることを示す。それぞれの点は、図４Ｄにおいては一つのマイクロタイタープレートの結果を示し、図４Ｆにおいては、ドナーの糞便培養の結果を示す。 腸内細菌叢の属レベルの組成変化を示す、グラフである。健康な若年ドナーのヒト糞便サンプルを、３－ｏｘｏＬＣＡ、ＬＣＡ、又はｉｓｏａｌｌｏＬＣＡ（各５０μＭ）を添加した改良ＷＣＡ培地中で、４８時間インキュベートした結果を示す。 百寿者群（図中「上」、ＡＤＬ、ｎ＝９４）と高齢者群（図中「下」、ＡＤＬ、ｎ＝１１２）のバーセルインデックスによって見積もられた日常生活動作スコア（ＡＤＬ）を示すグラフである。 百寿者群（図中「上」、ＭＭＳＥ、ｎ＝６８）と高齢者群（図中「下」、ＭＭＳＥ、ｎ＝１１１）のバーセルインデックスによって見積もられたミニメンタルステート検査（ＭＭＳＥ）スコアを示すグラフである。 百寿者（ｎ＝１４９－１５３）、高齢者（ｎ＝１１１－１１２）、若年者（ｎ＝１５－３９）の血液検査の結果を示すグラフである。赤血球数（ＲＢＣ）；アルブミン；Ｃ反応性たんぱく質（ＣＲＰ）；白血球数（ＷＢＣ）；総タンパク；血中尿素窒素（ＢＵＮ）；空腹時血糖；尿酸；クレアチニン。 ＥＬＩＳＡによって定量された、百寿者（ｎ＝１２２）、高齢者（ｎ＝６７）、若年者（ｎ＝１９）個々の糞便中のリポカリンレベルを示すグラフである。 百寿者（ｎ＝８９）、高齢者（ｎ＝１１２）、若年者（ｎ＝４３）個々のＢＭＩ値を示すグラフである。図５Ｃ～５Ｅにおいて、データは平均±標準偏差にて示す。＊＊＊　Ｐ＜０．００１；＊＊　Ｐ＜０．０１；＊　Ｐ＜０．０５；Ｄｕｎｎの検定を伴うＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定。ｎｓは有意差なしであることを示す。灰色の領域は、正常値の範囲を示す。 糖尿病、高血圧症、がんの病歴をもつ個人の割合を示すグラフである。黒色は、これらの疾患記録をもつ人の割合を示す。１３５人の百寿者と１１２人の高齢者と４３人の若年者の病歴を調査した。 百寿者、高齢者、若年者コントロールのアセンブルされた腸内メタゲノム中の全ての門に関する相対存在量を示すドットプロット図である。線形モデルにおけるＦＤＲ　Ｐ＜０．０５で有意に差のある群を、アスタリスクで示す。点は個々人を示す。 百寿者、高齢者、若年者、百寿者の直系親族、及びＩＢＤ患者群の個人間ｕｎｗｅｉｇｈｔｅｄ　ＵｎｉＦｒａｃ距離行列を基にしたＰＣｏＡプロットである。カラー表示下、百寿者、高齢者、若年者、百寿者の直系親族、及びＩＢＤ患者を、各々、オレンジ色、青色、灰色、黄色、及び赤色にて示す。 百寿者、高齢者、若年者、百寿者の直系親族、及びＩＢＤ患者における、百寿者で有意に増加した種についての相対存在量を示す、グラフである。 百寿者、高齢者、若年者、百寿者の直系親族、及びＩＢＤ患者における、百寿者で有意に減少した種についての相対存在量を示す、グラフである。 百寿者、高齢者、若年者、百寿者の直系親族、及びＩＢＤ患者における、百寿者と彼らの直系親族に特徴的な種についての相対存在量を示す、グラフである。図７Ａ～７Ｄにおいて、データは平均±標準偏差にて示す。＊＊＊　Ｐ＜０．００１；＊＊　Ｐ＜０．０１；＊　Ｐ＜０．０５；Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正を伴うＷｉｌｃｏｘｏｎの符号順位検定の事後検定。ｎｓは有意差なしであることを示す。点は個々人を示す。図７Ａ～７Ｄにおいて、百寿者（ｎ＝１６０）、高齢者（ｎ＝１１２）、若年者（ｎ＝４０）、百寿者の直系親族（ｎ＝２２、４８－９５歳、ａｖｇ．７４．５±１１．６歳）、及び炎症性腸疾患（ＩＢＤ）患者（ｎ＝１０３、１５－７８歳、ａｖｇ．４９±１．５１歳）の糞便について、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のシーケンシングした結果を示す。 ＧＣ／ＭＳによって、百寿者（ｎ＝４７）と高齢者（ｎ＝３１）、若年者（ｎ＝２３）の糞便中の短鎖脂肪酸を定量した結果を示すドットプロット図である。糞便中の短鎖脂肪酸量は、糞便の湿重量に対するμｍｏｌ／ｇで示す。 百寿者、高齢者、若年者における、個々人の糞便中のアンモニア濃度を示すドットプロット図である。 百寿者、高齢者、若年者における、個々人の糞便中のｐＨレベルを示すドットプロット図である。図８Ａ～８Ｃにおいて、データは平均±標準偏差にて示す。＊＊＊　Ｐ＜０．００１；＊＊　Ｐ＜０．０１；＊　Ｐ＜０．０５；Ｔｕｋｅｙの検定を伴う一元配置分散分析。ｎｓは有意差なしであることを示す。 糞便中のｐＨレベルと各二次胆汁酸との相関を回帰直線にて示す散布図である。各ドットは個々人の結果を示す。Ｓｐｅａｒｍａｎの係数（ｒ）とその優位性（Ｐ）を、百寿者（カラー表示下、オレンジ）、高齢者（カラー表示下、青）、若年者（カラー表示下、灰色）のサンプル、それぞれの群に対して別々に計算した。百寿者に関し、ｐＨと、糞便中のａｌｌｏＬＣＡレベル（Ｐ＝０．０１５６）、３－ｏｘｏａｌｌｏＬＣＡレベル（Ｐ＝０．００２３７）又はｉｓｏａｌｌｏＬＣＡレベル（Ｐ＝０．００３４）とにおいて、有意に正の相関が認められた。 サルデーニャの百歳以上の長寿コホートにおけるＣ．ｓｃｉｎｄｅｎｓのｂａｉオペロン遺伝子の存在量を示す、ドットプロット図である。百寿者、高齢者コントロール、若年者コントロールの中のＣ．ｓｃｉｎｄｅｎｓのｂａｉオペロン（ｂａｉＡ２とｂａｉＮを除く）の遺伝子に対するホモログの存在量を示す。各存在量において、ペアワイズのＷｉｌｃｏｘｏｎ検定を基にしたＦＤＲ　Ｐ＜０．０５条件下で有意に差のある存在量を、アスタリスクで示す。 百寿者（ｎ＝１２７）、高齢者（ｎ＝１０８）、若年者（ｎ＝４７）、百寿者の直系親族（ｎ＝１８）個々人における糞便胆汁酸をＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより定量した結果を示す、ドットプロット図である。 百寿者（ｎ＝１２７）、高齢者（ｎ＝１０８）、若年者（ｎ＝４７）、百寿者の直系親族（ｎ＝１８）個々人における糞便胆汁酸をＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより定量した結果を示す、ドットプロット図である。図１０Ａ及び１０Ｂにおいて、データは平均値±標準偏差にて示す。＊＊＊　Ｐ＜０．００１；＊＊　Ｐ＜０．０１；＊　Ｐ＜０．０５；Ｔｕｋｅｙの検定を伴う一元配置分散分析。ｎｓは有意差なしであることを示す。糞便の総胆汁酸量は糞便の湿重量に対してμｍｏｌ／ｇで示す。ｎｄは未検出であることを示す。 ＣＥ９１由来の６８株による、Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ、ｐＨ７でのＣＤＣＡを基質とする胆汁酸代謝を解析した結果を示すグラフである。 ＣＥ９１由来の６８株による、Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ、ｐＨ９でのＣＤＣＡを基質とする胆汁酸代謝を解析した結果を示すグラフである。 ＣＥ９１由来の６８株による、Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ、ｐＨ７でのＬＣＡを基質とする胆汁酸代謝を解析した結果を示すグラフである。 ＣＥ９１由来の６８株による、Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ、ｐＨ９でのＬＣＡを基質とする胆汁酸代謝を解析した結果を示すグラフである。 ＣＥ９１由来の６８株による、Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ、ｐＨ７での３－ｏｘｏ－Δ４－ＬＣＡを基質とする胆汁酸代謝を解析した結果を示すグラフである。 ＣＥ９１由来の６８株による、Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ、ｐＨ９での３－ｏｘｏ－Δ４－ＬＣＡを基質とする胆汁酸代謝を解析した結果を示すグラフである。図１１Ａ～１１Ｆにおいて、基質の濃度は５０μＭとし、各解析結果は、４８時間培養した培養液上清をＬＣ－ＭＳ／ＭＳ解析することにより取得した。データはＮ＝２の平均＋標準偏差として示す。また、各図における「Ｓｔｒａｉｎ　ｎｕｍｂｅｒ（株の番号）」及びカラー表示下における色分け等は、図３Ａに対応する。 Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ株の胆汁酸代謝酵素をコードする遺伝子クラスターの概要を示す図である。百寿者（ＣＥ９１）から単離されたＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ株の遺伝子クラスターを解析した結果を示す。５ＡＲ（カラー表示下、マゼンタ色）、５ＢＲ（カラー表示下、青色）、３βＨＳＤＨグループ１（カラー表示下、緑色）、３βＨＳＤＨグループ２（カラー表示下、紫色）のホモログを含む遺伝子クラスターは、ＴＣＡサイクルに関連する機能（カラー表示下、ベージュ色）及び／又はトランスポーター／エフラックスシステムの膜融合タンパク質（カラー表示下、黄色）としてアノテーションされる遺伝子に、かなり近接している。遺伝子ホモログは、＜１ｅ－１２　Ｅ値、＞３０％配列同一性、＞６０％クエリカバレッジの類似性をもつものとして定義した。矢印はコーディング配列を示し、アノテーションされた機能に応じて色分けした。 ３－ｏｘｏａｌｌｏＬＣＡ（終濃度５０μＭ）を基質として添加し、ｐＨ９に調整したＷＣＡ培地中で、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ株を培養し、ＬＣＡ関連化合物の代謝を解析した結果を示すグラフである。 ３－ｏｘｏＬＣＡ（終濃度５０μＭ）を基質として添加し、ｐＨ９に調整したＷＣＡ培地中で、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ株を培養し、ＬＣＡ関連化合物の代謝を解析した結果を示すグラフである。 ｉｓｏＬＣＡ（終濃度５０μＭ）を基質として添加し、ｐＨ９に調整したＷＣＡ培地中で、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ株を培養し、ＬＣＡ関連化合物の代謝を解析した結果を示すグラフである。図１３Ａ～１３Ｃにおいて、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる定量のため、培養上清を３７℃、４８時間の嫌気培養後に採取した。データは、Ｎ＝２の平均±標準偏差として示す。 Ｐ．ｍｅｒｄａｅ　Ｓｔ３又はＯｄｏｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ　Ｓｔ２１と、Ｐ．ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ　Ｓｔ４（図中、上側）又はＥ．ｌｅｎｔａ　Ｓｔ３４（図中、下側）との、５０μＭ　ＬＣＡを添加したｐＨ９に調整したＷＣＡ培地にて共培養をし、胆汁酸の代謝を解析した結果を示す、グラフである。図１３Ａ～１３Ｄにおいて、対応する株中の５ＡＲ（カラー表示下、赤）、５ＢＲ（カラー表示下、青）、３βＨＳＤＨＩ１（カラー表示下、緑）、３βＨＳＤＨ２（カラー表示下、紫）及び３αＨＳＤＨ（カラー表示下、オレンジ）に対するホモログの有無を、各図右側のワッフルチャート中に示す。 Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｍｅｒｄａｅ　Ｓｔ３の５ＡＲ（ＰＭ３８０６）、５ＢＲ（ＰＭ３８０５）、３βＨＳＤＨ（ＰＭ３８０４）遺伝子周辺の遺伝子編成の概略を示す図である。それぞれのタンパク質配列を、Ｐｆａｍ－Ａ　ＨＭＭ　ｄｏｍａｉｎ　ｌｉｂｒａｒｙに対するＨＭＭＥＲ　ｖ．３．１ｂ２のｈｍｍｓｃａｎによりアノテーションした。 ５ＡＲ、５ＢＲ又は３βＨＳＤＨについての欠失体作製の概要を示す図である。欠失体作製のためのプラスミドは、目的遺伝子のすぐ上流と下流の相同配列をｐＬＧＢ３０プラスミドに挿入することにより作製した。欠失体が作製できたことは、相同配列部位の中（＃３－＃４）と外（＃１－＃２）のプライマーを用いたＰＣＲにより確認した。 二次胆汁酸濃度を変化させて培養した際の、病原体の増殖曲線を示すグラフである。ＷＣＡ培地を用いて３７℃、嫌気条件下で培養した培地の吸光度（ＯＤ６００）を測定することにより、その増殖を検出した。カラー表示した、赤で薄く塗られた曲線は、ｉｓｏａｌｌｏＬＣＡを含む培養における結果である。 グラム陽性病原体に対するｉｓｏａｌｌｏＬＣＡの効果を示すグラフである。 グラム陰性病原体に対するｉｓｏａｌｌｏＬＣＡの効果を示すグラフである。図１５Ｂ及び１５Ｃにおいて、赤で薄く塗られた領域は、増殖が阻害されるｉｓｏａｌｌｏＬＣＡ濃度を示し、ＭＩＣ９０をその領域内に示す。データは、Ｎ＝２の平均±標準偏差である。 ＷＣＡ培地中で培養された腸内共生菌に対するｉｓｏａｌｌｏＬＣＡの増殖阻害効果を示すグラフである。３７℃、嫌気条件下で培養した培地の吸光度（ＯＤ６００）を測定することにより、グラム陽性共生菌とグラム陰性共生菌両方の増殖を検出した。データは、Ｎ＝２の平均と標準偏差とで示す。赤で薄く塗られた領域は、増殖阻害効果のあるｉｓｏａｌｌｏＬＣＡ濃度を示す。 コントロール、又は２．５μＭのｉｓｏａｌｌｏＬＣＡを含むＷＣＡ培地中で５時間培養した際の、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ　６３０、Ｃ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ、Ｃ．ｉｎｄｏｌｉ、Ｃ．ＨＧＦ２（ｉｎｎｏｃｕｕｍ）を、走査型電子顕微鏡にて観察して得られた、代表的な結果を示す写真である。各右側のパネルは、対応する高解像度画像を示す。スケールバーは５．０μｍと１．０μｍを示す。矢頭はｉｓｏａｌｌｏＬＣＡ処理後の形状変化を示す。 異なる濃度のｉｓｏａｌｌｏＬＣＡを含むＷＣＡ培地とＢｒａｉｎ　Ｈｅａｒｔ　Ｉｎｆｕｓｉｏｎ（ＢＨＩ）培地中で、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ　６３０、ＶＲＥ、ＳＤＳＥ、Ｃ．ｓｙｍｂｉｏｓｕｍ、Ｃ．ｓｃｉｎｄｅｎｓ、又はＣ．ＨＧＦ２（ｉｎｎｏｃｕｕｍ）を培養して得られる増殖曲線を示すグラフである。データはＮ＝２の平均と標準偏差で示す。赤で薄く塗られた領域は、増殖阻害効果のあるｉｓｏａｌｌｏＬＣＡ濃度を示す。また、下部に、ＷＣＡとＢＨＩ培地の栄養組成を併せて示す。 ３－ｏｘｏＬＣＡ量、ｉｓｏＬＣＡ量、ｉｓｏａｌｌｏＬＣＡ量と、５ＡＲ、５ＢＲ、３βＨＳＤＨｓを有する細菌種の相対量との相関を示す図である。図中、右側のワッフルチャートは、百寿者のアセンブルされた腸内メタゲノムから得られた腸内細菌種の、５ＡＲ（カラー表示下、赤）と５ＢＲ（カラー表示下、青）、３βＨＳＤＨ１（カラー表示下、緑）、３βＨＳＤＨ２（カラー表示下、紫）に対するホモログの有無を示す。中央のドット図は、百寿者の糞便中の二次胆汁酸量と、対応する種の相対存在量との相関を示すドット図である。黒いドットは、ＦＤＲ　Ｐ＜０．０５における有意なＳｐｅａｒｍａｎの相関を示す。 野生型（ＷＴ）Ｐ．ｍｅｒｄａｅ　Ｓｔ３（図中「ＰｍＷＴ」）又は５ＡＲ欠損型（Δ５ＡＲ）Ｐ．ｍｅｒｄａｅ　Ｓｔ３（図中「ＰｍΔ５ＡＲ」）によるｉｎ　ｖｉｔｒｏでのテストステロンの代謝を解析した結果を示すグラフである。菌株は、ｐＨ７に調整したＷＣＡ培地で、３７℃で４８時間嫌気的に培養した。 Ｐ．ｍｅｒｄａｅ　Ｓｔ３とＯｄｏｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ　Ｓｔ２１－２４による、テストステロンの代謝を解析した結果を示すグラフである。 Ｐ．ｍｅｒｄａｅ　Ｓｔ３とＯｄｏｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ　Ｓｔ２１－２４による、５α－ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）の代謝を解析した結果を示すグラフである。図１９Ｂ及び１９Ｃにおいて、培養上清は、３時間、６時間、９時間、１２時間後に回収した。各ステロイドホルモンの濃度はＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより決定した。データは、Ｎ＝２の平均±標準偏差にて示す。
　以下、本発明をその好適な実施形態に即して詳細に説明する。先ず、百寿等に関与する胆汁酸生成反応を触媒する活性を有する、本発明に係る各種酵素について説明する。
　＜３－オキソ－５α－ステロイド－４－デヒドロゲナーゼ（５ＡＲ）＞
　本発明に係る３－オキソ－５α－ステロイド－４－デヒドロゲナーゼ（３－ｏｘｏ－５－ａｌｐｈａ－ｓｔｅｒｏｉｄ－４－ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、５ＡＲ）は、５α－レダクターゼ（５α－ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）とも称され、ＥＣ１．３．９９．５によって特定される酵素である。
　本発明に係る５ＡＲは、３－オキソ－Δ４－ＬＣＡを３－オキソアロＬＣＡに変換する反応（若しくは３－オキソアロＬＣＡを３－オキソ－Δ４－ＬＣＡに変換する反応）及び／又はテストステロンを５α－ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）に変換する反応（若しくはＤＨＴをテストステロンに変換する反応）を触媒する活性を有する酵素である。
　また、本発明に係る５ＡＲは、配列番号：６９～８９のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列に対し、高い相同性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質であることが好ましい。
　また、本発明に係る５ＡＲは、配列番号：６９～８９のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列に、天然又は非天然（人工的）に変異が導入されているものであってもよい。すなわち、本発明に係る５ＡＲには、５ＡＲのアミノ酸配列（配列番号：６９に記載のアミノ酸配列等）において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含むタンパク質も含まれる。ここで「複数」とは、特に制限はないが、好ましくは２～１５０個、より好ましくは２～１００個、さらに好ましくは２～７０個、より好ましくは２～５０個、さらに好ましくは２～３０個、より好ましくは２～２０個、さらに好ましくは２～１０個（例えば、２～９個、２～８個、２～７個、２～６個、２～５個、２～４個、２～３個、２個）である。
　また、本発明に係る５ＡＲは、配列番号：６９～８９のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードするアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよい。
　＜３βヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（３βＨＳＤＨ）＞
　本発明に係る３βヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（３β－ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、３βＨＳＤＨ）は、ＥＣ　１．１．１．１４５によって特定される酵素であり、２種のアイソタイプ（３βＨＳＤＨ１及び３βＨＳＤＨ２）であり得るが、好ましくは３βＨＳＤＨ２である。
　本発明に係る３βＨＳＤＨは、３－オキソアロＬＣＡをイソアロＬＣＡに変換する反応（若しくはイソアロＬＣＡを３－オキソアロＬＣＡに変換する反応）、３－オキソＬＣＡをイソＬＣＡに変換する反応（若しくはイソＬＣＡを３－オキソＬＣＡに変換する反応）及びＤＨＴを３β－アンドロスタンジオールに変換する反応（若しくは３β－アンドロスタンジオールをＤＨＴに変換する反応）のうちの少なくとも１の反応を触媒する活性を有する酵素である。
　本発明に係る３βＨＳＤＨ１は、配列番号：１１３～１２９のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列に対し、高い相同性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質であることが好ましい。
　また、本発明に係る３βＨＳＤＨ２は、配列番号：１３０～１４１のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列に対し、高い相同性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質であることが好ましい。
　本発明に係る３βＨＳＤＨ１は、配列番号：１１３～１２９のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列に、天然又は非天然（人工的）に変異が導入されているものであってもよい。すなわち、本発明に係る３βＨＳＤＨ１には、３βＨＳＤＨ１のアミノ酸配列（配列番号：１１３に記載のアミノ酸配列等）において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含むタンパク質も含まれる。ここで「複数」とは、特に制限はないが、好ましくは２～２００個、より好ましくは２～１８０個、さらに好ましくは２～１５０個、より好ましくは２～１００個、さらに好ましくは２～７０個、より好ましくは２～５０個、さらに好ましくは２～３０個、より好ましくは２～２０個、さらに好ましくは２～１０個（例えば、２～９個、２～８個、２～７個、２～６個、２～５個、２～４個、２～３個、２個）である。
　本発明に係る３βＨＳＤＨ２は、配列番号：１３０～１４１のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列に、天然又は非天然（人工的）に変異が導入されているものであってもよい。すなわち、本発明に係る３βＨＳＤＨ２には、３βＨＳＤＨ２のアミノ酸配列（配列番号：１３０に記載のアミノ酸配列等）において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含むタンパク質も含まれる。ここで「複数」とは、特に制限はないが、好ましくは２～１５０個、より好ましくは２～１００個、さらに好ましくは２～７０個、より好ましくは２～５０個、さらに好ましくは２～３０個、より好ましくは２～２０個、さらに好ましくは２～１０個（例えば、２～９個、２～８個、２～７個、２～６個、２～５個、２～４個、２～３個、２個）である。
　本発明に係る３βＨＳＤＨ１は、配列番号：１１３～１２９のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードするアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよい。
　また、本発明に係る３βＨＳＤＨ２は、配列番号：１３０～１４１のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードするアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよい。
　＜３－オキソ－５β－ステロイド－４－デヒドロゲナーゼ（５ＢＲ）＞
　本発明に係る３－オキソ－５β－ステロイド－４－デヒドロゲナーゼ（３－ｏｘｏ－５β－ｓｔｅｒｏｉｄ　４－ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、５ＢＲ）は、ＥＣ１．３．９９．６によって特定される酵素である。
　本発明に係る５ＢＲは、３－オキソ－Δ４－ＬＣＡを３－オキソＬＣＡに変換する反応（若しくは３－オキソＬＣＡを３－オキソ－Δ４－ＬＣＡに変換する反応）を触媒する活性を有する酵素である。
　また、本発明に係る５ＢＲは、配列番号：９０～１１２のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列に対し、高い相同性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質であることが好ましい。
　また、本発明に係る５ＢＲは、配列番号：９０～１１２のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列に、天然又は非天然（人工的）に変異が導入されているものであってもよい。すなわち、本発明に係る５ＢＲには、５ＢＲのアミノ酸配列（配列番号：９０に記載のアミノ酸配列等）において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含むタンパク質も含まれる。ここで「複数」とは、特に制限はないが、好ましくは２～２５０個、より好ましくは２～２００個、さらに好ましくは２～１５０個、より好ましくは２～１００個、さらに好ましくは２～７０個、より好ましくは２～５０個、さらに好ましくは２～３０個、より好ましくは２～２０個、さらに好ましくは２～１０個（例えば、２～９個、２～８個、２～７個、２～６個、２～５個、２～４個、２～３個、２個）である。
　また、本発明に係る５ＢＲは、配列番号：９０～１１２のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードするアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよい。
　なお、本発明において、「高い相同性」とは、２０％以上（例えば、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上）であり、６０％以上（例えば、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８５％以上）が好ましく、８０％以上（例えば、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上）がより好ましく、９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）がさらに好ましく、１００％であることが特に好ましい。
　「相同性」とは、類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）又は同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を意味し得る。また、「相同性」とは、特に、同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を意味してもよい。アミノ酸配列の相同性は、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ　Ｌｏｃａｌ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｏｏｌ　ａｔ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等のアラインメントプログラムを利用して決定できる。例えば、アミノ酸配列の相同性とは、ｂｌａｓｔｐを用いて算出されるアミノ酸配列間の相同性が挙げられ、より具体的には、ｂｌａｓｔｐをデフォルトのパラメータを用いて（すなわち初期設定のパラメータを用いて）算出されるアミノ酸配列間の相同性が挙げられる。
　また、本発明において、アミノ酸の置換等は、好ましくは、保存的な置換である。「保存的な置換」とは、化学的に同様な側鎖を有する他のアミノ酸残基で置換することを意味する。化学的に同様なアミノ酸側鎖を有するアミノ酸残基のグループは、本発明の属する技術分野でよく知られている。例えば、酸性アミノ酸（アスパラギン酸・グルタミン酸）、塩基性アミノ酸（リジン・アルギニン・ヒスチジン）、中性アミノ酸においては、炭化水素鎖を持つアミノ酸（グリシン・アラニン・バリン・ロイシン・イソロイシン・プロリン）、ヒドロキシ基を持つアミノ酸（セリン・トレオニン）、硫黄を含むアミノ酸（システイン・メチオニン）、アミド基を持つアミノ酸（アスパラギン・グルタミン）、イミノ基を持つアミノ酸（プロリン）、芳香族基を持つアミノ酸（フェニルアラニン・チロシン・トリプトファン）で分類することができる。
　また、本発明において、「ストリンジェントな条件」としては、例えば、「１ＸＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳ、３７℃」程度のハイブリダイゼーションの条件であり、より厳しい条件としては「０．５ＸＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳ、４２℃」程度のハイブリダイゼーションの条件であり、さらに厳しい条件としては「０．２ＸＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳ、６５℃」程度のハイブリダイゼーションの条件が挙げられる。
　また、本発明に係る各種配列を特定する配列番号を、以下の表１～４に示す。さらに、表１～４において、百寿者特有の細菌株（６８種）の各種酵素の保有の有無を併せて示す。１６ＳｒＤＮＡ～３βＨＳＤＨ２の項目における数字は、１６ＳｒＤＮＡを特定するＤＮＡ配列の配列番号、及び各種酵素を特定するアミノ酸配列の配列番号を各々示す。また、１６ＳｒＤＮＡ～３αＨＳＤＨの項目において、黒丸は、配列情報は開示していないが、その細菌株がその酵素を保有していることを示す。ハイフンは、その細菌株がその酵素を保有していないことを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
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　本発明に係る「５ＡＲ」、「３βＨＳＤＨ」及び「５ＢＲ」（以下、「本発明に係る酵素」とも総称する）は、他の化合物が直接又は間接的に付加されていてもよい。かかる付加としては特に制限はなく、遺伝子レベルでの付加であってもよく、化学的な付加であってもよい。また付加される部位についても特に制限はなく、本発明に係る酵素のアミノ末端及びカルボキシル末端のいずれかであってもよく、その両方であってもよい。遺伝子レベルでの付加は、本発明に係る酵素をコードするＤＮＡに、他のタンパク質をコードするＤＮＡの読み枠を合わせて付加させたものを用いることにより達成される。このようにして付加される「他のタンパク質」としては特に制限はなく、本発明に係る酵素の精製を容易にする目的の場合には、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ－）タグ（ｔａｇ）タンパク質、ＦＬＡＧ－タグタンパク質（登録商標、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）等の精製用タグタンパク質が好適に用いられ、また本発明に係る酵素の検出を容易にする目的の場合には、ＧＦＰ等の蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ等の化学発光タンパク質等の検出用タグタンパク質が好適に用いられる。化学的な付加は、共有結合であってもよく、非共有結合であってもよい。「共有結合」としては特に制限はなく、例えば、アミノ基とカルボキシル基とのアミド結合、アミノ基とアルキルハライド基とのアルキルアミン結合、チオールどうし間のジスルフィド結合、チオール基とマレイミド基又はアルキルハライド基とのチオエーテル結合が挙げられる。「非共有結合」としては、例えば、ビオチン－アビジン間結合が挙げられる。また、このようにして化学的に付加される「他の化合物」としては、本発明に係る酵素の検出を容易にする目的の場合には、例えば、Ｃｙ３、ローダミン等の蛍光色素が好適に用いられる。
　本発明に係る酵素は、これら各酵素を産生する細菌等を培養することによって得ることができる。例えば、培養した当該細菌等を濾過、遠心分離等により培地から回収し、回収した細菌等を、細胞溶解、磨砕処理又は加圧破砕等によって処理し、さらに、限外濾過処理、塩析、硫安沈殿等の溶媒沈殿、クロマトグラフィー（例えば、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー）等によって、細菌等において発現したタンパク質を精製、濃縮する方法が挙げられる。また、本発明に係る酵素に、前述の精製タグタンパク質が付加されている場合には、該タグタンパク質が吸着する基質を用いて精製し、採取することもできる。さらに、これらの精製、濃縮方法は単独にて行ってもよく、また適宜組み合わせて多段階的に実施し得る。
　また、本発明に係る酵素は、上記生物学的合成に限定されることなく、後述の本発明に係るＤＮＡ等及び無細胞タンパク質合成系を用いても製造することができる。かかる無細胞タンパク質合成系としては特に制限はないが、例えば、コムギ胚芽由来、大腸菌由来、ウサギ網状赤血球由来、昆虫細胞由来の合成系が挙げられる。さらに、当業者であれば、市販のペプチド合成機等を用い、本発明に係る酵素を化学的に合成することもできる。
　また、本発明に係る酵素は、他の成分と混合して用いてもよい。他の成分としては特に制限はなく、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、プロテアーゼ阻害剤、保存剤が挙げられる。
　＜ポリヌクレオチド＞
　次に、本発明に係る酵素をコードするポリヌクレオチドについて説明する。本発明に係るポリヌクレオチドは、上述の本発明に係る酵素をコードする限り、天然のＤＮＡ又はＲＮＡであってもよく、天然のＤＮＡ又はＲＮＡに人為的に変異が導入されたＤＮＡ又はＲＮＡであってもよく、人工的に設計されたヌクレオチド配列からなるＤＮＡ又はＲＮＡであってもよい。さらに、その形態について特に制限はなく、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、化学合成ＤＮＡ、化学合成ＲＮＡが含まれる。これらポリヌクレオチドの調製は、当業者にとって常套手段を利用して行うことが可能である。ゲノムＤＮＡは、例えば、各種細菌からゲノムＤＮＡを抽出し、ゲノミックライブラリー（ベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、ＢＡＣ、ＰＡＣ等が利用できる）を作製し、これを展開して、本発明にかかる酵素をコードする遺伝子のヌクレオチド配列を基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより調製することが可能である。また、本発明に係る酵素をコードする遺伝子に特異的なプライマーを作製し、これを利用したＰＣＲを行うことによって調製することも可能である。また、ｃＤＮＡは、例えば、各種細菌から抽出したｍＲＮＡを基にｃＤＮＡを合成し、これをλＺＡＰ等のベクターに挿入してｃＤＮＡライブラリーを作製し、これを展開して、上記と同様にコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、また、ＰＣＲを行うことにより調製することが可能である。
　そして、このように調製したＤＮＡに、必要に応じ、上述のアミノ酸置換をコードする変異を導入することは、当業者であれば、公知の部異特異的変異導入法を利用することで行うことができる。部異特異的変異導入法としては、例えば、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ、１９８５年、８２巻、２号、４８８～４９２ページ）、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ－ｂｙ－ｏｖｅｒｌａｐ－ｅｘｔｅｎｔｉｏｎ）－ＰＣＲ法（Ｈｏ，Ｓ．Ｎ．，Ｈｕｎｔ，Ｈ．Ｄ．，Ｈｏｒｔｏｎ，Ｒ．Ｍ．，Ｐｕｌｌｅｎ，Ｊ．Ｋ．，ａｎｄ　Ｐｅａｓｅ，Ｌ．Ｒ．、Ｇｅｎｅ、１９８９年、７７巻、５１～５９ページ）が挙げられる。
　また、当業者であれば、上述のアミノ酸置換が導入されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列を人工的に設計し、該配列情報に基づき、自動核酸合成機を用いて、本発明にかかるポリヌクレオチドを化学的に合成することもできる。
　さらに、本発明に係るポリヌクレオチドは、コードする本発明に係る酵素の発現効率を宿主細胞においてより向上させるという観点から、当該宿主細胞の種類に合わせて、コドンを最適化した本発明に係る酵素をコードするＤＮＡの態様もとり得る。
　また、本発明においては、前述のポリヌクレオチドを宿主細胞内において複製することができるよう、当該ＤＮＡが挿入されているベクターの態様もとり得る。
　本発明において「ベクター」は、自己複製ベクター、すなわち、染色体外の独立体として存在し、その複製が染色体の複製に依存しない、例えば、プラスミドを基本に構築することができる。また、ベクターは、宿主細胞に導入されたとき、その宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであってもよい。
　このようなベクターとしては、例えば、プラスミド、ファージＤＮＡが挙げられる。また、プラスミドとしては、大腸菌由来のプラスミド（ｐＥＴ２２、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等）、酵母由来のプラスミド（ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０等）、枯草菌由来のプラスミド（ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）が挙げられる。ファージＤＮＡとしてはλファージ（Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等）が挙げられる。さらに、宿主細胞が昆虫由来であれば、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスベクターを、植物由来であればＴ－ＤＮＡ等、動物由来であればレトロウイルス、アデノウイルスベクター等の動物ウイルスベクターも、本発明に係るベクターとして用いることもできる。また、本発明に係るベクター構築の手順及び方法は、遺伝子工学の分野で慣用されているものを用いることができる。例えば、本発明に係るＤＮＡをベクターに挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法等が採用される。
　また、本発明に係るベクターは、前記ＤＮＡがコードする本発明にかかる酵素を宿主細胞内にて発現可能な状態で含んでなる発現ベクターの形態であってもよい。本発明にかかる「発現ベクター」は、これを宿主細胞に導入して本発明にかかる酵素を発現させるために、前記ＤＮＡの他に、その発現を制御するＤＮＡ配列や形質転換された宿主細胞を選択するための遺伝子マーカー等を含んでいるのが望ましい。発現を制御するＤＮＡ配列としては、プロモーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）及びターミネーター等がこれに含まれる。プロモーターは宿主細胞において転写活性を示すものであれば特に限定されず、宿主細胞と同種若しくは異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子の発現を制御するＤＮＡ配列として得ることができる。また、前記発現を制御するＤＮＡ配列以外に発現を誘導するＤＮＡ配列を含んでいても良い。かかる発現を誘導するＤＮＡ配列としては、宿主細胞が細菌である場合には、イソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加により、下流に配置された遺伝子の発現を誘導することのできるラクトースオペロンが挙げられる。本発明における遺伝子マーカーは、形質転換された宿主細胞の選択の方法に応じて適宜選択されてよいが、例えば薬剤耐性をコードする遺伝子、栄養要求性を相補する遺伝子を利用することができる。
　ベクターには、本発明に係る酵素をコードするＤＮＡが１種ずつ挿入されていてもよく、また複数種のＤＮＡを１のベクターに挿入してもよい。ベクターに複数種のＤＮＡを挿入する場合において、一つのベクターに複数種のＤＮＡが挿入される場合、これらのＤＮＡはオペロンを形成することが好ましい。ここで「オペロン」とは、同一のプロモーターの制御下に転写される１又は複数の遺伝子から構成される核酸配列単位である。
　＜細菌＞
　次に、上述の本発明に係るポリヌクレオチドを有する細菌について説明する。
　本発明に係る「５ＡＲをコードするポリヌクレオチドを有する細菌」は、上述の本発明に係る５ＡＲをコードするポリヌクレオチドを有する細菌である限り、特に制限はなく、例えば、当該ポリヌクレオチドを有する、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｇｏｌｄｓｔｅｉｎｉｉ、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｍｅｒｄａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｄｏｒｅｉ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ　ｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ、Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ　ｏｎｄｅｒｄｏｎｋｉｉ、Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ　ｌａｎｅｕｓ、又は、Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅが挙げられる。
　より具体的には、
　配列番号：１又は２に記載のヌクレオチド配列に対して極めて高い同一性を有するポリヌクレオチドを有するＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｇｏｌｄｓｔｅｉｎｉｉ、
配列番号：３に記載のヌクレオチド配列に対して極めて高い同一性を有するポリヌクレオチドを有するＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｍｅｒｄａｅ、
配列番号：６又は７に記載のヌクレオチド配列に対して極めて高い同一性を有するポリヌクレオチドを有するＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｄｏｒｅｉ、
配列番号：８又は９に記載のヌクレオチド配列に対して極めて高い同一性を有するポリヌクレオチドを有するＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、
配列番号：１０～１３のうちのいずれかに記載のヌクレオチド配列に対して極めて高い同一性を有するポリヌクレオチドを有するＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ、
配列番号：１５又は１６に記載のヌクレオチド配列に対して極めて高い同一性を有するポリヌクレオチドを有するＡｌｉｓｔｉｐｅｓ　ｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ、
配列番号：１７又は１８に記載のヌクレオチド配列に対して極めて高い同一性を有するポリヌクレオチドを有するＡｌｉｓｔｉｐｅｓ　ｏｎｄｅｒｄｏｎｋｉｉ、
配列番号：１９又は２０に記載のヌクレオチド配列に対して極めて高い同一性を有するポリヌクレオチドを有するＯｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ　ｌａｎｅｕｓ、又は
配列番号：２１～２４のうちのいずれかに記載のヌクレオチド配列に対して極めて高い同一性を有するポリヌクレオチドを有するＯｄｏｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅが挙げられる。
　本発明に係る「３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチドを有する細菌」は、上述の本発明に係る３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチドを有する細菌である限り、特に制限はなく、例えば、当該ポリヌクレオチドを有する、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｇｏｌｄｓｔｅｉｎｉｉ、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｍｅｒｄａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｄｏｒｅｉ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ　ｌａｎｅｕｓ、Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ、Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ　ｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ、Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ　ｏｎｄｅｒｄｏｎｋｉｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｔｒｉａｔｕｍ、Ｇｏｒｄｏｎｉｂａｃｔｅｒ　ｐａｍｅｌａｅａｅ、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ　ｌｅｎｔａ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｅｍｅｒｇｅｎｃｉａ　ｔｉｍｏｎｅｎｓｉｓ、又はＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅが挙げられる。
　より具体的には、
配列番号：１又は２に記載のヌクレオチド配列に対して極めて高い同一性を有するポリヌクレオチドを有するＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｇｏｌｄｓｔｅｉｎｉｉ、
配列番号：３に記載のヌクレオチド配列に対して極めて高い同一性を有するポリヌクレオチドを有するＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｍｅｒｄａｅ、
配列番号：６又は７に記載のヌクレオチド配列に対して極めて高い同一性を有するポリヌクレオチドを有するＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｄｏｒｅｉ、
配列番号：８又は９に記載のヌクレオチド配列に対して極めて高い同一性を有するポリヌクレオチドを有するＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、
配列番号：１０～１３のうちのいずれかに記載のヌクレオチド配列に対して極めて高い同一性を有するポリヌクレオチドを有するＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ、
配列番号：１９又は２０に記載のヌクレオチド配列に対して極めて高い同一性を有するポリヌクレオチドを有するＯｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ　ｌａｎｅｕｓ、
配列番号：２１～２４のうちのいずれかに記載のヌクレオチド配列に対して極めて高い同一性を有するポリヌクレオチドを有するＯｄｏｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、
配列番号：４又は５に記載のヌクレオチド配列に対して極めて高い同一性を有するポリヌクレオチドを有するＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ、
配列番号：１５又は１６に記載のヌクレオチド配列に対して極めて高い同一性を有するポリヌクレオチドを有するＡｌｉｓｔｉｐｅｓ　ｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ、
配列番号：１７又は１８に記載のヌクレオチド配列に対して極めて高い同一性を有するポリヌクレオチドを有するＡｌｉｓｔｉｐｅｓ　ｏｎｄｅｒｄｏｎｋｉｉ、
配列番号：２９に記載のヌクレオチド配列に対して極めて高い同一性を有するポリヌクレオチドを有するＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｔｒｉａｔｕｍ、
配列番号：３２に記載のヌクレオチド配列に対して極めて高い同一性を有するポリヌクレオチドを有するＧｏｒｄｏｎｉｂａｃｔｅｒ　ｐａｍｅｌａｅａｅ、
配列番号：３３～３５のうちのいずれかに記載のヌクレオチド配列に対して極めて高い同一性を有するポリヌクレオチドを有するＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ　ｌｅｎｔａ、
配列番号：４２、４３及び４５のうちのいずれかに記載のヌクレオチド配列に対して極めて高い同一性を有するポリヌクレオチドを有するＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、
配列番号：４８又は４９に記載のヌクレオチド配列に対して極めて高い同一性を有するポリヌクレオチドを有するＥｍｅｒｇｅｎｃｉａ　ｔｉｍｏｎｅｎｓｉｓ、又は
配列番号：５６～５８のうちのいずれかに記載のヌクレオチド配列に対して極めて高い同一性を有するポリヌクレオチドを有するＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ
が挙げられる。
　本発明に係る「５ＡＲをコードするポリヌクレオチド及び３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチドを有する細菌」は、上述の本発明に係る５ＡＲをコードするポリヌクレオチド及び３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチドを有する細菌である限り、特に制限はなく、例えば、これらのポリヌクレオチドを有する、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｇｏｌｄｓｔｅｉｎｉｉ、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｍｅｒｄａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｄｏｒｅｉ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ　ｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ、Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ　ｏｎｄｅｒｄｏｎｋｉｉ、Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ　ｌａｎｅｕｓ、又はＯｄｏｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅが挙げられる。
　より具体的には、
配列番号：１又は２に記載のヌクレオチド配列に対して極めて高い同一性を有するポリヌクレオチドを有するＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｇｏｌｄｓｔｅｉｎｉｉ、
配列番号：３に記載のヌクレオチド配列に対して極めて高い同一性を有するポリヌクレオチドを有するＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｍｅｒｄａｅ、
配列番号：６又は７に記載のヌクレオチド配列に対して極めて高い同一性を有するポリヌクレオチドを有するＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｄｏｒｅｉ、
配列番号：８又は９に記載のヌクレオチド配列に対して極めて高い同一性を有するポリヌクレオチドを有するＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、
配列番号：１０～１３のうちのいずれかに記載のヌクレオチド配列に対して極めて高い同一性を有するポリヌクレオチドを有するＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ、
配列番号：１５又は１６に記載のヌクレオチド配列に対して極めて高い同一性を有するポリヌクレオチドを有するＡｌｉｓｔｉｐｅｓ　ｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ、
配列番号：１７又は１８に記載のヌクレオチド配列に対して極めて高い同一性を有するポリヌクレオチドを有するＡｌｉｓｔｉｐｅｓ　ｏｎｄｅｒｄｏｎｋｉｉ、
配列番号：１９又は２０に記載のヌクレオチド配列に対して極めて高い同一性を有するポリヌクレオチドを有するＯｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ　ｌａｎｅｕｓ、又は
配列番号：２１～２４のうちのいずれかに記載のヌクレオチド配列に対して極めて高い同一性を有するポリヌクレオチドを有するＯｄｏｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ
が挙げられる。
　本発明に係る「５ＢＲをコードするポリヌクレオチドを有する細菌」は、上述の本発明に係る５ＢＲをコードするポリヌクレオチドを有する限り、特に制限はなく、例えば、当該ポリヌクレオチドを有する、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｇｏｌｄｓｔｅｉｎｉｉ、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｍｅｒｄａｅ、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｄｏｒｅｉ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ　ｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ、Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ　ｏｎｄｅｒｄｏｎｋｉｉ、Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ　ｌａｎｅｕｓ、Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｒａｏｕｌｔｉｂａｃｔｅｒ　ｔｉｍｏｎｅｎｓｉｓ、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎｅｌｌａｃｅａｅ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ　Ｅｍｅｒｇｅｎｃｉａ　ｔｉｍｏｎｅｎｓｉｓ、又はＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅが挙げられる。
　より具体的には、
配列番号：１又は２に記載のヌクレオチド配列に対して極めて高い同一性を有するポリヌクレオチドを有するＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｇｏｌｄｓｔｅｉｎｉｉ、
配列番号：３に記載のヌクレオチド配列に対して極めて高い同一性を有するポリヌクレオチドを有するＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｍｅｒｄａｅ、
配列番号：４又は５に記載のヌクレオチド配列に対して極めて高い同一性を有するポリヌクレオチドを有するＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ、
配列番号：６又は７に記載のヌクレオチド配列に対して極めて高い同一性を有するポリヌクレオチドを有するＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｄｏｒｅｉ、
配列番号：８又は９に記載のヌクレオチド配列に対して極めて高い同一性を有するポリヌクレオチドを有するＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、
配列番号：１０～１３のうちのいずれかに記載のヌクレオチド配列に対して極めて高い同一性を有するポリヌクレオチドを有するＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ、
配列番号：１５又は１６に記載のヌクレオチド配列に対して極めて高い同一性を有するポリヌクレオチドを有するＡｌｉｓｔｉｐｅｓ　ｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ、
配列番号：１７又は１８に記載のヌクレオチド配列に対して極めて高い同一性を有するポリヌクレオチドを有するＡｌｉｓｔｉｐｅｓ　ｏｎｄｅｒｄｏｎｋｉｉ、
配列番号：１９又は２０に記載のヌクレオチド配列に対して極めて高い同一性を有するポリヌクレオチドを有するＯｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ　ｌａｎｅｕｓ、
配列番号：２１～２４のうちのいずれかに記載のヌクレオチド配列に対して極めて高い同一性を有するポリヌクレオチドを有するＯｄｏｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、
配列番号：３０又は３１に記載のヌクレオチド配列に対して極めて高い同一性を有するポリヌクレオチドを有するＲａｏｕｌｔｉｂａｃｔｅｒ　ｔｉｍｏｎｅｎｓｉｓ、
配列番号：３６又は３７に記載のヌクレオチド配列に対して極めて高い同一性を有するポリヌクレオチドを有するＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎｅｌｌａｃｅａｅ、
配列番号：４０、４１及び４５のうちのいずれかに記載のヌクレオチド配列に対して極めて高い同一性を有するポリヌクレオチドを有するＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、
配列番号：４８又は４９に記載のヌクレオチド配列に対して極めて高い同一性を有するポリヌクレオチドを有するＥｍｅｒｇｅｎｃｉａ　ｔｉｍｏｎｅｎｓｉｓ、又は
配列番号：５８、６１及び６２のうちのいずれかに記載のヌクレオチド配列に対して極めて高い同一性を有するポリヌクレオチドを有するＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ
が挙げられる。
　本発明に係る「５ＡＲをコードするポリヌクレオチド、３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチド、及び５ＢＲをコードするポリヌクレオチドを有する細菌」は、上述の本発明に係る５ＡＲをコードするポリヌクレオチド、３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチド、及び５ＢＲをコードするポリヌクレオチドを有する限り、特に制限はなく、例えば、これらのポリヌクレオチドを有する、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｇｏｌｄｓｔｅｉｎｉｉ、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｍｅｒｄａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｄｏｒｅｉ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ　ｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ、Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ　ｏｎｄｅｒｄｏｎｋｉｉ、Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ　ｌａｎｅｕｓ、又はＯｄｏｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅが挙げられる。
　より具体的には、
配列番号：１又は２に記載のヌクレオチド配列に対して極めて高い同一性を有するポリヌクレオチドを有するＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｇｏｌｄｓｔｅｉｎｉｉ、
配列番号：３に記載のヌクレオチド配列に対して極めて高い同一性を有するポリヌクレオチドを有するＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｍｅｒｄａｅ、
配列番号：６又は７に記載のヌクレオチド配列に対して極めて高い同一性を有するポリヌクレオチドを有するＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｄｏｒｅｉ、
配列番号：８又は９に記載のヌクレオチド配列に対して極めて高い同一性を有するポリヌクレオチドを有するＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、
配列番号：１０～１３のうちのいずれかに記載のヌクレオチド配列に対して極めて高い同一性を有するポリヌクレオチドを有するＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ、
配列番号：１５又は１６に記載のヌクレオチド配列に対して極めて高い同一性を有するポリヌクレオチドを有するＡｌｉｓｔｉｐｅｓ　ｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ、
配列番号：１７又は１８に記載のヌクレオチド配列に対して極めて高い同一性を有するポリヌクレオチドを有するＡｌｉｓｔｉｐｅｓ　ｏｎｄｅｒｄｏｎｋｉｉ、
配列番号：１９又は２０に記載のヌクレオチド配列に対して極めて高い同一性を有するポリヌクレオチドを有するＯｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ　ｌａｎｅｕｓ、又は
配列番号：２１～２４のうちのいずれかに記載のヌクレオチド配列に対して極めて高い同一性を有するポリヌクレオチドを有するＯｄｏｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅが挙げられる。
　なお、本発明において「極めて高い同一性」とは、好ましくは９５％以上（９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）、特に好ましくは１００％である。ヌクレオチド配列の「同一性」も、ＢＬＡＳＴ等のアラインメントプログラムを利用して決定できる。例えば、ヌクレオチド配列の同一性とは、ｂｌａｓｔｎを用いて算出されるヌクレオチド配列間の同一性が挙げられ、より具体的には、ｂｌａｓｔｎをデフォルトのパラメータを用いて（すなわち初期設定のパラメータを用いて）算出されるヌクレオチド配列間の同一性が挙げられる。
　また、本発明に係る細菌は、上述の各酵素に加え、各酵素の基質及び／又は各酵素が触媒する反応によって生成される胆汁酸のトランスポーターをコードするポリヌクレオチドを有していることが好ましい（図１２　参照）。
　さらに、本発明に係る細菌は、本発明に係る酵素をコードするポリヌクレオチドを有する限り特に制限はなく、生来的に有している細菌であってもよく、上述の本発明に係るＤＮＡ又はベクターを外来的に導入することによって保有する細菌等の宿主細胞（形質転換体）であってもよい。
　本発明に係るＤＮＡ又はベクターが導入される細菌は特に限定されず、例えば、上述の腸内細菌、他の微生物（大腸菌、出芽酵母、分裂酵母、枯草菌、放線菌、糸状菌等）が挙げられる。また、本発明においては、前記細菌の代わりに、細胞に、上述の本発明に係るＤＮＡ又はベクターを外来的に導入することによって得られる形質転換体も用いることができる。かかる細胞としては、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞等が挙げられる。
　本発明に係るＤＮＡ又はベクターの導入も、この分野で慣用されている方法に従い実施することができる。例えば、大腸菌等の細菌への導入方法としては、ヒートショック法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、接合法が挙げられ、植物細胞への導入方法としては、アグロバクテリウムを用いる方法やパーティクルガン法が挙げられ、昆虫細胞への導入方法としては、バキュロウィルスを用いる方法やエレクトロポレーション法が挙げられ、動物細胞への導入方法としては、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法が挙げられる。
　このようにして細菌又は細胞内に導入されたＤＮＡ等は、当該細菌内等において、一過的に保有されるものであってもよく、また恒常的に保有されるものであってもよく（例えば、そのゲノムＤＮＡにランダムに挿入されることによって保持されてもよく、相同組み換えによって保持されてもよく）、またベクターであれば、そのゲノムＤＮＡ外の独立体として複製され保持し得る。
　＜組成物＞
　次に、本発明の組成物について説明する。後述の実施例において示すとおり、百寿等に関与する胆汁酸の生成経路に、上述の本発明に係る細菌が関与することが、本発明者らによって明らかとなった。したがって、本発明は、以下の態様の組成物を提供する。
（１）本発明に係る５ＡＲをコードするポリヌクレオチドを有する細菌を有効成分とする、３－オキソ－Δ４－ＬＣＡを３－オキソアロＬＣＡに変換するための組成物。
（２）　本発明に係る３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチドを有する細菌を有効成分とする、３－オキソアロＬＣＡをイソアロＬＣＡに変換するための組成物。
（３）　本発明に係る５ＡＲをコードするポリヌクレオチドを有する細菌と本発明に係る３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチドを有する細菌とを有効成分とする、３－オキソ－Δ４－ＬＣＡからイソアロＬＣＡを生成するための組成物。
（４）　本発明に係る５ＡＲをコードするポリヌクレオチド及び本発明に係る３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチドを有する細菌を有効成分とする、３－オキソ－Δ４－ＬＣＡからイソアロＬＣＡを生成するための組成物。
（５）　本発明に係る５ＢＲをコードするポリヌクレオチドを有する細菌を有効成分とする、３－オキソ－Δ４－ＬＣＡを３－オキソＬＣＡに変換するための組成物。
（６）　本発明に係る５ＡＲをコードするポリヌクレオチド、本発明に係る３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチド、及び本発明に係る５ＢＲをコードするポリヌクレオチドを有する細菌を有効成分とする、イソＬＣＡ又は３－オキソＬＣＡからイソアロＬＣＡを生成するための組成物。
　また、後述の実施例において示すとおり、胆汁酸（イソアロＬＣＡ又はイソＬＣＡ）、それら胆汁酸の生成に関与する酵素（５ＡＲ、３βＨＳＤＨ、５ＢＲ）、及びそれら酵素を産生する細菌は、グラム陽性菌に対して抗菌効果を発揮することが明らかになった。したがって、本発明は、以下の態様の組成物も提供する。
（７）　グラム陽性菌に対する抗菌用組成物である、前記（１）～（４）及び（６）のうちのいずれか一項に記載の組成物。
（８）　イソアロＬＣＡ又はイソＬＣＡを有効成分とする、グラム陽性菌に対する抗菌用組成物。
（９）　本発明に係る５ＡＲ、本発明に係る３βＨＳＤＨ、及び本発明に係る５ＢＲから選択される少なくとも１の酵素を有効成分とする、グラム陽性菌に対する抗菌用組成物。
　また、後述の実施例において示すとおり、本発明に係る酵素（５ＡＲ、３βＨＳＤＨ）及びそれら酵素を産生する細菌は、テストステロン等の代謝に関与することが明らかになった。したがって、本発明は、以下の態様の組成物も提供する。
（１０）　本発明に係る３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチドを有する細菌を有効成分とする、５α－ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）を３β－アンドロスタンジオールに変換するための組成物。
（１１）　本発明に係る５ＡＲをコードするポリヌクレオチドを有する細菌と本発明に係る３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチドを有する細菌とを有効成分とする、テストステロンから３β－アンドロスタンジオールを生成するための組成物。
（１２）　本発明に係る５ＡＲをコードするポリヌクレオチド及び本発明に係る３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチドを有する細菌を有効成分とする、テストステロンから３β－アンドロスタンジオールを生成するための組成物。
（１３）　本発明に係る３βＨＳＤＨを有効成分とする、ＤＨＴから３β－アンドロスタンジオールを生成するための組成物。
（１４）　本発明に係る５ＡＲ及び本発明に係る３βＨＳＤＨを有効成分とする、テストステロンから３β－アンドロスタンジオールを生成するための組成物。
（１５）　下記疾患群から選択される少なくとも１の疾患を、治療又は予防するための組成物である、前記（１０）～（１４）のうちのいずれか一項に記載の組成物
　疾患群：
前立腺がん、男性ホルモン性脱毛症、多嚢胞性卵巣症候群、にきび、男性型多毛症、卵巣内皮がん、神経炎症、及びＧＡＢＡＡ受容体を介したてんかん。
　本発明に係る「細菌」としては、上述のとおりであるが、本発明の組成物において有効成分として含有される「細菌」としては、生菌であっても死菌体であってもよく、生菌及び死菌体の両方であってもよい。「死菌体」としては、例えば、加熱処理体、焼成処理体、蒸煮処理体、放射線（γ線等）照射処理体、酵素処理体、薬物（抗生物質等）処理体、化学物質（ホルマリン等）処理体、超音波処理体が挙げられる。また、本発明に係る細菌の形態は特に限定されず、液体又は固体の何れでもよいが、当該形態は乾燥形態（例えば、粉体状、菌末状等）が、製造時や保管時の取扱いが容易である観点から好適である。乾燥物は、菌体を溶媒（水等）に分散させた懸濁液を乾燥させることによって調製することができる。乾燥方法は、特に制限はなく、例えば、噴霧乾燥（スプレードライ）法、凍結乾燥法が挙げられる。滅菌方法は、特に制限はなく、レトルト殺菌法、ＵＨＴ殺菌法、空気殺菌法、加圧殺菌法、高圧蒸気滅菌法、乾熱滅菌法、流通蒸気消毒法、電磁波殺菌法、電子線滅菌法、高周波滅菌法、放射線滅菌法、紫外線殺菌法、酸化エチレンガス滅菌法、過酸化水素プラズマ滅菌法、化学的殺菌法（アルコール殺菌法、ホルマリン固定法、電解水処理法）等が挙げられる。また、場合によっては、加熱等による殺菌処理の前後、あるいは、乾燥処理の前後に、界面活性剤処理、磨砕・粉砕処理、酵素処理、分画処理等を行うこともでき、これらの処理により得られるものも、本発明の組成物に含有し得る。
　本発明の組成物において有効成分として含有される細菌は、前述の菌体のみならず、当該細菌による生成物（例えば、当該細菌の分泌産物、当該細菌による代謝産物）、構成物質（細菌自体の成分。所謂、菌体成分。例えば、当該細菌を構成する、アミノ酸、ペプチド、核酸、糖、脂質、ビタミン、ホルモン、及びそれらの複合体、さらには、それらとリン・硫黄金属元素との複合体等）であってもよい。
　また、本発明の組成物が含有する有効成分は、本発明に係る細菌の培養物であってもよい。培養物は、当該細菌を含むもの（増殖した当該細菌を含む培養液、固形培地等）であってもよく、当該培養物の形態は、特に限定されず、液体又は固体の何れでもよいが、当該形態は乾燥形態（例えば培養乾燥物等）が、製造時や保管時の取扱いが容易な観点から、好適である。なお、かかる培養乾燥物等も、当業者であれば、上述の乾燥方法を用い、適宜調製し得る。
　本発明の組成物において有効成分として含有される「酵素」としては、上述のとおりである。また、本発明の組成物において有効成分として含有される「胆汁酸」としては、後述の実施例のとおりであるが、その活性を有する限り、薬理学上許容される塩、水和物又は溶媒和物も含まれる。このような薬理学上許容される塩としては、特に制限はなく、各化合物の構造等に応じて適宜選択することができ、例えば、酸付加塩（例えば、塩酸塩、臭化水素塩、硫酸塩、硫酸水素塩、硝酸塩、炭酸塩、炭酸水素塩、リン酸塩、リン酸一水素塩、リン酸二水素塩等の無機酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩等の有機酸塩）、塩基付加塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩、亜鉛塩、アルミニウム塩、アンモニウム塩、テトラメチルアンモニウム塩）、有機アミン付加塩（例えば、モルホリン、ピペリジン等の付加塩）、アミノ酸付加塩（例えば、リジン、グリシン、フェニルアラニン等の付加塩）が挙げられる。また、水和物又は溶媒和物としては、特に制限はなく、例えば、胆汁酸又はその塩１分子に対し、０．１～１０分子の水又は溶媒が付加したものが挙げられる。
　さらに、本発明に係る「胆汁酸」には、その抑制活性を有する限り、互変異性体、幾何異性体、不斉炭素に基づく光学異性体、立体異性体等の総ての異性体及び異性体混合物が含まれる。さらにまた、前記物質が生体内で酸化、還元、加水分解、アミノ化、脱アミノ化、水酸化、リン酸化、脱水酸化、アルキル化、脱アルキル化、抱合等の代謝を受けてなおその阻害活性を示す化合物をも包含し、また本発明は生体内で酸化、還元、加水分解等の代謝を受けて前記物質を生成する化合物をも包含する。
　本発明の組成物は、医薬組成物（医薬品、医薬部外品等）、食品組成物（飲食品、動物用飼料等）、あるいはモデル動物実験等に用いられる試薬の形態であり得る。
　本発明における組成物は、有効成分である物質（胆汁酸、酵素、細菌等）の形態に応じて、公知の製剤学的方法により製剤化することができる。例えば、カプセル剤、錠剤、丸剤、液剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、フィルムコーティング剤、ペレット剤、トローチ剤、舌下剤、咀嚼剤、バッカル剤、ペースト剤、シロップ剤、懸濁剤、エリキシル剤、乳剤、塗布剤、軟膏剤、硬膏剤、パップ剤、経皮吸収型製剤、ローション剤、吸引剤、エアゾール剤、注射剤、坐剤等として、経口的又は非経口的（例えば、腸管内、筋肉内、静脈内、気管内、鼻内、経皮、皮内、皮下、眼内、膣、腹腔内、直腸若しくは吸入）、又はこれらの複数の組み合わせからなる経路による投与用に使用することができる。
　これら製剤化においては、薬理学上若しくは飲食品として許容される担体、具体的には、生理食塩水、滅菌水、培地、植物油、溶剤、賦形剤、基剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、芳香剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤、希釈剤、等張化剤、無痛化剤、増量剤、崩壊剤、緩衝剤、コーティング剤、滑沢剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等と適宜組み合わせることができる。
　また、これら製剤化においては、本発明に係る細菌が腸内細菌であるという点を鑑み、特に経口投与を目的とする製剤においては、本発明の組成物を腸管内に効率良く送達することを可能にする組成物と組み合わせてもよい。このような腸管内への送達を可能とする組成物については特に制限されることなく、公知の組成物を適宜採用することができ、例えば、ｐＨ感受性組成物、腸管までの放出を抑制する組成物（セルロース系ポリマー、アクリル酸重合体及び共重合体、ビニル酸重合体及び共重合体等）、腸管粘膜特異的に接着する生体接着性組成物（例えば、米国特許第６．３６８．５８６号明細書に記載のポリマー）、プロテアーゼ阻害剤含有組成物、腸管内酵素によって特異的に分解される組成物が挙げられる。
　本発明の組成物を食品組成物として用いる場合、例えば、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品、栄養補助食品、病者用食品、あるいは動物用飼料であり得る。なお、機能性食品は、通常、その作用メカニズムに基づき、プロバイオティクス、バイオジェニクス、プレバイオティクス、シンバイオティクスの４つに分類され、本発明においては、プロバイオティクス、バイオジェニクス、シンバイオティクス、プレバイオティクスの態様をとり得る。
　本発明の飲食品は、上記のような組成物として摂取することができる他、種々の飲食品として摂取することもできる。飲食品の具体例としては、機能性飲料、ドリンク剤、ゼリー状飲料、清涼飲料水、乳飲料、茶飲料、アルコール飲料、スープ類等の液状食品；ヨーグルト、ドリンクヨーグルト等の発酵食品、発酵飲料；食用油、ドレッシング、マヨネーズ、マーガリン等の油分を含む製品；飯類、麺類、パン類等の炭水化物含有食品；ハム、ソーセージ等の畜産加工食品；かまぼこ、干物、塩辛等の水産加工食品；漬物等の野菜加工食品；ゼリー等の半固形状食品；みそ等の発酵食品；洋菓子類、和菓子類、キャンディー類、ガム類、グミ、冷菓、氷菓等の各種菓子類；カレー、あんかけ、中華スープ等のレトルト製品；インスタントスープ、インスタントみそ汁等のインスタント食品や電子レンジ対応食品等が挙げられる。さらには、粉末、穎粒、錠剤、カプセル剤、液状、ペースト状又はゼリー状に調製された健康飲食品も挙げられる。なお、本発明における飲食品の製造は、当該技術分野に公知の製造技術により実施することができる。
　また本発明で提起される飲食品組成物において、保健用途が表示された飲食品として提供・販売されることも可能である。「表示」行為には、需要者に対して前記用途を知らしめたる全ての行為が含まれ、前記用途を直接的に認識できる表現、あるいは前記用途を想起・類推させうるような表現を、組成物自体に付したものであってもよいし、組成物が含入する容器、包装材又は添付文書に付したものであってもよい。また「表示」は、本発明組成物の関連する情報として、チラシ、パンフレット、ポップ、カタログ、ポスター、書籍、ＤＶＤ等の記憶媒体、電子掲示板やインターネット等の広告等で、本発明の組成物が効果的であることを表示・広告するものであってもよい。
　本発明の組成物（７）～（９）に関し、それらの対象となる「グラム陽性菌」としては、グラム染色により紺青色あるいは紫色に染色される細菌であれば良く、特に制限はないが、例えば、図４Ａ及び４Ｅに示されるグラム陽性菌が挙げられる。本発明において「抗菌」とは、グラム陽性菌の増殖を抑制すること及び／又は殺菌を意味する。また、本発明の組成物（７）～（９）は、グラム陽性菌の感染症を治療又は予防するための組成物としても用いられ得る。かかる「感染症」としては、特に制限はないが、例えば、クロストリジウム・ディフィシルの感染症、敗血症、敗血症を基礎疾患として有する急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ／ＡＬＩ）が挙げられる。
　また、本発明の組成物（１５）に関し、対象とする疾患については上述のとおりであるが、こと「前立腺がん」の治療又は予防には、後述の実施例に示すとおり、前立腺がんの進行及び／又は転移の抑制も含まれる。
　＜治療又は予防方法＞
　本発明はまた、本発明に係る５ＡＲ、本発明に係る３βＨＳＤＨ、及び本発明に係る５ＢＲから選択される少なくとも１の酵素の有効量を、対象に投与する、グラム陽性菌の感染症を治療又は予防する方法に関する。
　さらに本発明は、本発明に係る５ＡＲをコードするポリヌクレオチドを有する細菌、本発明に係る３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチドを有する細菌、本発明に係る５ＡＲをコードするポリヌクレオチドを有する細菌と本発明に係る３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチドを有する細菌、本発明に係る５ＡＲをコードするポリヌクレオチド及び本発明に係る３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチドを有する細菌、並びに、本発明に係る５ＡＲをコードするポリヌクレオチド、本発明に係る３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチド、及び本発明に係る５ＢＲをコードするポリヌクレオチドを有する細菌からなる群から選択される少なくとも１の細菌の有効量を、対象に投与する、グラム陽性菌の感染症を治療又は予防する方法に関する。
　さらにまた、本発明は、イソアロＬＣＡ又はイソＬＣＡの有効量を、対象に投与する、グラム陽性菌の感染症を治療又は予防する方法に関する。
　また、本発明に係る３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチドを有する細菌、本発明に係る５ＡＲをコードするポリヌクレオチドを有する細菌と本発明に係る３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチドを有する細菌、本発明に係る５ＡＲをコードするポリヌクレオチド及び本発明に係る３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチドを有する細菌、本発明に係る３βＨＳＤＨ、並びに、本発明に係る５ＡＲ及び本発明に係る３βＨＳＤＨからなる群から選択される少なくとも１の物質の有効量を、対象に投与する、上記疾患群から選択される少なくとも１の疾患を、治療又は予防する方法に関する。
　本発明において、「予防」には、感染の抑制及び遅延、がん等の発症の抑制、遅延及びその再発を抑制することが含まれる。「治療」には、感染症及びがん等からの完全な回復のみならず、それらの症状を緩和又は改善し、その進行を抑制し、またその再発を抑制することが含まれる。
　本発明の治療等における「対象」は、ヒトを含む動物である。ヒト以外の動物としては特に制限はなく、種々の家畜、家禽、ペット、実験用動物等を対象とすることができる。具体的には、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、カモ、ダチョウ、アヒル、イヌ、ネコ、ウサギ、ハムスター、マウス、ラット、サル等が挙げられるが、これらに制限されない。また、本発明にかかる対象は、上述の感染症及びがん等の罹患者であってもよいが、これら疾患と診断されている必要はなく、例えば、これら疾患に罹患したおそれがある者、これら疾患に罹患したと感じている者が挙げられる。また、健常者であっても、これら疾患の予防等を目的として日常的に摂取することができる。
　また本技術は、治療的目的であっても、非治療目的使用であってもよい。「非治療目的使用」とは、医療行為、すなわち治療による人体への処置行為を含まない概念である。例えば、健康増進等が挙げられる。
　本発明に係る細菌、酵素及び胆汁酸の投与又は摂取方法としては、特に制限はなく、経口投与であってもよく、また非経口投与（例えば、腸管内への投与）であってもよいが、経口投与である場合には、本発明に係る細菌等の効果をより向上させるという観点から、対象は、プロトンポンプ阻害剤（ＰＰＩ）等の摂取により胃酸の産生を減少させておくことが好ましい。また、これら物質の投与又は摂取において、上述の組成物の態様が好適に用いられ得る。
　本発明に係る細菌、酵素及び胆汁酸等を投与又は摂取する場合、その投与量又は摂取量は、対象の年齢、体重、上記疾患の症状、健康状態、組成物の種類（医薬品、飲食品等）、有効成分の種類及びその形態等に応じて、適宜選択される。また、１日当り１回又は複数回（例えば、２回、３回）に分けて投与又は摂取させてもよい。さらに、投与又は摂取の期間は、改善の程度に応じて中止することもできるが、予防の観点から、中止することなく継続して投与又は摂取させても良い。なお、「継続」については、毎日継続でもよく、間隔を空けての継続でもよいが、効果の点で毎日継続して投与又は摂取することが好ましい。
　＜診断方法等＞
　本発明は、下記疾患群から選択される少なくとも１の疾患の評価方法であって、
　疾患群：
前立腺がん、男性ホルモン性脱毛症、多嚢胞性卵巣症候群、にきび、男性型多毛症、卵巣内皮がん、神経炎症、及びＧＡＢＡＡ受容体を介したてんかん、
（１）被検者糞便中、３βＨＳＤＨを産生する細菌を定量する工程、
（２）工程（１）で定量して得られた値を、百寿者の前記細菌を定量して得られる対応値と比較する工程、及び
（３）工程（２）における比較の結果、
　被検者糞便中の前記定量値が、前記対応値と同等又はそれより高い場合に、前記被検者は前記疾患に罹患する可能性は低いと判定し、
　被検者糞便中の前記定量値が、前記対応値より低い場合に、前記被検者は前記疾患に罹患する可能性が高い、又は罹患している可能性が高いと判定する工程を、含む方法を、提供する。
　さらに、本発明は、前記疾患群から選択される少なくとも１の疾患の予防方法又は治療方法であって、
　前記方法にて、前記疾患に罹患する可能性が高い、又は罹患している可能性が高いと判定された前記被検者に、３βＨＳＤＨを産生する細菌を投与する方法をも、提供する。
　本発明はまた、百歳以上生存する可能性を評価する方法であって、
（１）被検者糞便中、３－オキソＬＣＡ、イソアロＬＣＡ、３－オキソアロＬＣＡ、アロＬＣＡ、３－オキソＬＣＡ及びイソＬＣＡからなる群から選択される少なくとも１の胆汁酸を定量する工程、
（２）工程（１）で定量して得られた値を、百寿者の前記胆汁酸を定量して得られる対応値と比較する工程、及び
（３）工程（２）における比較の結果、
　被検者糞便中の前記定量値が、前記対応値と同等又はそれより高い場合に、前記被検者は百歳以上生存する可能性が高いと判定し、
　被検者糞便中の前記定量値が、前記対応値より低い場合に、前記被検者は百歳以上生存する可能性が低いと判定する工程を、含む方法を、提供する。
　また、本発明は、百歳以上生存する可能性を評価する方法であって、
（１）被検者糞便中、５ＡＲ、３βＨＳＤＨ、及び５ＢＲから選択される少なくとも１の酵素を産生する細菌（好ましくは、３βＨＳＤＨ２を少なくとも産生する細菌）を定量する工程、
（２）工程（１）で定量して得られた値を、百寿者の前記細菌を定量して得られる対応値と比較する工程、及び
（３）工程（２）における比較の結果、
　被検者糞便中の前記定量値が、前記対応値と同等又はそれより高い場合に、前記被検者は百歳以上生存する可能性が高いと判定し、
　被検者糞便中の前記定量値が、前記対応値より低い場合に、前記被検者は百歳以上生存する可能性が低いと判定する工程を、含む方法をも、提供する。
　さらに、本発明は、百歳以上生存する可能性を向上させる方法であって、
　前記の方法にて、百歳以上生存する可能性が低いと判定された前記被検者に、３－オキソＬＣＡ、イソアロＬＣＡ、並びに、５ＡＲ、３βＨＳＤＨ、及び５ＢＲから選択される少なくとも１の酵素を産生する細菌（好ましくは、３βＨＳＤＨ２を少なくとも産生する細菌）からなる群から選択される少なくとも１の物質を投与する方法をも、提供する。
　本発明はまた、グラム陽性菌に対する抵抗性を評価する方法であって、
（１）被検者糞便中、３－オキソＬＣＡ及びイソアロＬＣＡからなる群から選択される少なくとも１の胆汁酸を定量する工程、
（２）工程（１）で定量して得られた値を、百寿者の前記胆汁酸を定量して得られる対応値と比較する工程、及び
（３）工程（２）における比較の結果、
　被検者糞便中の前記定量値が、前記対応値と同等又はそれより高い場合に、前記被検者はグラム陽性菌に対する抵抗性が高いと判定し、
　被検者糞便中の前記定量値が、前記対応値より低い場合に、前記被検者はグラム陽性菌に対する抵抗性が低いと判定する工程を、含む方法。
　また、本発明は、グラム陽性菌に対する抵抗性を評価する方法であって、
（１）被検者糞便中、５ＡＲ、３βＨＳＤＨ、及び５ＢＲから選択される少なくとも１の酵素を産生する細菌（好ましくは、３βＨＳＤＨ２を少なくとも産生する細菌）を定量する工程、
（２）工程（１）で定量して得られた値を、百寿者の前記細菌を定量して得られる対応値と比較する工程、及び
（３）工程（２）における比較の結果、
　被検者糞便中の前記定量値が、前記対応値と同等又はそれより高い場合に、前記被検者はグラム陽性菌に対する抵抗性が高いと判定し、
　被検者糞便中の前記定量値が、前記対応値より低い場合に、前記被検者はグラム陽性菌に対する抵抗性が低いと判定する工程を、含む方法を、提供する。
　さらに、本発明は、グラム陽性菌の感染症を予防する方法であって、
　前記方法にて、グラム陽性菌に対する抵抗性が低いと判定された前記被検者に、３－オキソＬＣＡ、イソアロＬＣＡ、並びに、５ＡＲ、３βＨＳＤＨ、及び５ＢＲから選択される少なくとも１の酵素を産生する細菌（好ましくは、３βＨＳＤＨ２を少なくとも産生する細菌）からなる群から選択される少なくとも１の物質を投与する方法をも、提供する。
　本発明の各評価方法における「被検者」については特に制限はなく、上述の治療方法等における「対象」と同様であるが、ヒトに限られる。
　本発明の各評価方法において、定量対象となる細菌は少なくとも１種類であればよいが、好ましくは２種類以上（例えば、３種類以上、４種類以上）、より好ましくは５種類以上（例えば、６種類以上、７種類以上、８種類以上、９種類以上）、さらに好ましくは１０種類以上（例えば、１５種類以上、２０種類以上、２５種類以上、３０種類以上）である。
　「糞便中の細菌の定量」は、当該細菌の量（数）そのものではなくともよく、例えば、当該細菌の量（数）を反映する当該細菌特有の物質の量を測定することによって行なうことができる。かかる物質としては、前記細菌特異的なオリゴヌクレオチド（例えば、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子、及びその転写物）、前記細菌特有の構成物質（当該細菌を構成する、ペプチド、核酸、糖、脂質、及びそれらの複合体等）、当該細菌による生成物（例えば、当該細菌の分泌産物、当該細菌による代謝産物）が挙げられる。
　物質がオリゴヌクレオチドである場合には、例えば、ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、定量ＰＣＲ）、ＤＮＡマイクロアレイ解析法、ノーザンブロッティング、次世代シーケンシング法（合成シーケンシング法（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、例えば、イルミナ社製Ｓｏｌｅｘａゲノムアナライザー又はＨｉｓｅｑ（登録商標）２０００によるシーケンシング）、パイロシーケンシング法（例えば、ロッシュ・ダイアグノステックス（４５４）社製のシーケンサーＧＳＬＸ又はＦＬＸによるシーケンシング（所謂４５４シーケンシング））、リガーゼ反応シーケンシング法（例えば、ライフテクノロジー社製のＳｏｌｉＤ（登録商標）又は５５００ｘｌによるシーケンシング）、Ｔ－ＲＦＬＰ法、ビーズアレイ法、ｉｎ　ｓｉｔｕ　ハイブリダイゼーション、ドットブロット、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ法、質量分析法、ゲノムＰＣＲ法、サザンブロッティングを用いて、定量することができる。
　その他の物質については、例えば、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ法）、ＣＬＥＩＡ（化学発光酵素免疫測定法）、ラテックス凝集法、抗体アレイ、イムノブロッティング、イムノクロマトグラフィー、イメージングサイトメトリー、フローサイトメトリー、ラジオイムノアッセイ、免疫沈降法、免疫組織化学的染色法等の抗体を用いて検出する方法（免疫学的方法）や、質量分析法が挙げられる。
　「免疫学的方法」では、各物質に結合する抗体が使用され、当該抗体を各々の抗体が結合する各物質に接触させ、当該抗体の各物質への結合性を指標として、各物質量が検出される。
　「質量分析（ＭＳ）法」とは、試料を、イオン源を用いてイオン化し、分析部において、真空中で運動させ電磁気力を用いて、あるいは飛行時間差によりイオン化した試料を質量電荷比に応じて分離し、検出できる質量分析計を用いた測定方法のことをいい、イオン源を用いてイオン化する方法としては、ＥＩ法、ＣＩ法、ＦＤ法、ＦＡＢ法、ＭＡＬＤＩ法、ＥＳＩ法等の方法を適宜選択することができる。また、分析部において、イオン化した試料を分離する方法としては、磁場偏向型、四重極型、イオントラップ型、飛行時間（ＴＯＦ）型、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型等分離方法を適宜選択することができる。また、２以上の質量分析法を組み合わせたタンデム型質量分析（ＭＳ／ＭＳ）やトリプル四重極型質量分析を利用することができる。特に、トリプル四重極型質量分析計による選択反応モニタリング（ＳＲＭ：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ，ＳＲＭ）又は多重反応モニタリング（ＭＲＭ：Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）によって、１回の測定で多種の物質を同時に測定することができる。また、質量分析計は単独で用いられてもよいし、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）や高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を組み合わせることにより、対象物質を分離・精製して試料とすることができる。
　また、かかる「免疫学的方法」及び「質量分析法」は、「糞便中の酵素の定量」及び「糞便中の胆汁酸の定量」にも用いられ得る。また、「糞便中の胆汁酸の定量」においては、各種クロマトグラフィー（ガスクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、ＬＣ／ＭＳ、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ、薄層クロマトグラフィー等）が好適に用いられ得る。
　そして、このように定量して得られる値は、絶対量のみならず、相対値であってもよい。相対値としては、例えば、検出に用いる測定方法又は測定装置に基づく量比（所謂、任意単位（ＡＵ）で表される数値）が挙げられる。
　また、細菌量における相対値としては、例えば、後述の実施例に示すとおり、腸内細菌叢全体におけるその細菌の割合を示す値（相対存在量、占有率）であってもよい。また、参照腸内細菌の量を基準として算出した値を用いてもよい。本発明にかかる「参照腸内細菌」は、糞便試料において安定して存在しており、また異なる生体試料間において、その量の差が小さい細菌であればよい。
　本発明の各評価方法においては、このようにして定量して得られた値と、同物質の対応値とを比較する。なお、「対応値」としては、百歳以上のヒト個体における定量値であり、本発明の各方法においてカットオフ値又は基準値として機能する値であればよく、例えば、百歳以上のヒト個体群において検出された各物質量の中央値又は平均値が挙げられる。また、「対応値」は、あらかじめ設定した定量値（固定値）であってもよく、該評価方法に関するキットの説明書等にかかる固定値が記載されていることが好ましい。さらに、比較対象となる百歳以上のヒト個体は、前記被検者と、性別、人種、及び国籍のうちの少なくとも一の特徴が同様である者が好ましい。また、かかる「比較」は、当業者であれば、上記検出方法に合った統計学的解析方法を適宜選択して行うことができる。統計学的解析方法としては、例えば、マン・ホイットニーのＵ検定、ｔ検定、分散分析（ＡＮＯＶＡ）、クラスカル・ウォリス検定、ウィルコクソン検定、オッズ比、ハザード比、フィッシャーの正確検定、受信者動作特性解析（ＲＯＣ解析）、分類木と決定木解析（ＣＡＲＴ解析）が挙げられる。また、比較の際には、正規化された又は標準化かつ正規化されたデータを用いることもできる。
　「対応値より高い」又は「対応値より低い」とは、当業者であれば上記統計学的解析方法に基づき適宜判断することができる。例えば、検出された物質量が対応値より高く又は低く、その差が統計的に有意と認められること（例えば、Ｐ＜０．０５）が挙げられる。また、例えば、検出された物質量が対応値の２倍以上（好ましくは、５倍以上、１０倍以上）又は０．５倍以下（好ましくは、０．２倍以下、０．１倍以下）であることも挙げられる。一方、「対応値と同等」とは、例えば、検出された物質量と対応値との差が統計的に有意と認められないこと（例えば、Ｐ＞０．０５）が挙げられる。また例えば、検出された物質量が対応値の０．５倍超、２倍未満であることが挙げられる。
　「可能性が高い」及び「可能性が低い」とは各々、例えば、８０％以上及び２０％未満であることが挙げられ、好ましくは９０％以上及び１０％未満であり、さらに好ましくは９５％以上及び５％未満である。また同様に、「グラム陽性菌に対する抵抗性が高い」及び「グラム陽性菌に対する抵抗性が低い」とは各々、例えば、グラム陽性菌に感染する確率が８０％以上及び２０％未満であることが挙げられ、好ましくは、前記確率が９０％以上及び１０％未満であり、さらに好ましくは、前記確率が９５％以上及び５％未満である。
　本発明の各評価方法における上記判定は、通常、医師（医師の指示を受けた者も含む）によって行われるが、上述の定量値等に関するデータは、医師による治療のタイミング等の判断も含めた診断に役立つものである。よって、本発明の方法は、医師による診断のために上述の定量値に関するデータを収集する方法、当該データを医師に提示する方法、上述の定量値と前記対応値とを比較し分析する方法、患者の臨床症状及び／又は他の検査結果を考慮した上で医師による診断を補助するための方法とも表現し得る。
　また、上記判定に基づく、投与については特に制限はなく、上述の治療方法等と同様である。
　＜イソアロＬＣＡの製造方法＞
　後述の実施例において示すとおり、本発明者らによって、イソアロＬＣＡを誘導する生化学合成経路が見出された。したがって、本発明は、以下のイソアロＬＣＡの製造方法を提供する。
　３－オキソアロＬＣＡの存在下、本発明に係る３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチドを有する細菌を培養し、該細菌及び／又はその培養物において生成されたイソアロＬＣＡを採取する工程を含む、イソアロＬＣＡの製造方法。
　３－オキソ－Δ４－ＬＣＡの存在下、本発明に係る５ＡＲをコードするポリヌクレオチドを有する細菌と本発明に係る３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチドを有する細菌とを培養し、該細菌及び／又はその培養物において生成されたイソアロＬＣＡを採取する工程を含む、イソアロＬＣＡの製造方法。
　３－オキソ－Δ４－ＬＣＡの存在下、本発明に係る５ＡＲをコードするポリヌクレオチドと本発明に係る３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチドとを有する細菌を培養し、該細菌及び／又はその培養物において生成されたイソアロＬＣＡを採取する工程を含む、イソアロＬＣＡの製造方法。
　イソＬＣＡ又は３－オキソＬＣＡの存在下、本発明に係る５ＡＲをコードするポリヌクレオチド、本発明に係る３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチド、及び本発明に係る５ＢＲをコードするポリヌクレオチドを有する細菌を培養し、該細菌及び／又はその培養物において生成されたイソアロＬＣＡを採取する工程を含む、イソアロＬＣＡの製造方法。
　本発明に係る３βＨＳＤＨの存在下、３－オキソアロＬＣＡからイソアロＬＣＡを生成し、当該イソアロＬＣＡを採取する工程を含む、イソアロＬＣＡの製造方法。
　本発明に係る５ＡＲ及び本発明に係る３βＨＳＤＨの存在下、３－オキソ－Δ４－ＬＣＡからイソアロＬＣＡを生成し、当該イソアロＬＣＡを採取する工程を含む、イソアロＬＣＡの製造方法。
　本発明に係る５ＡＲ、本発明に係る３βＨＳＤＨ及び本発明に係る５ＢＲの存在下、イソＬＣＡ又は３－オキソＬＣＡからイソアロＬＣＡを生成し、当該イソアロＬＣＡを採取する工程を含む、イソアロＬＣＡの製造方法。
　本発明において、培養する「細菌」としては上述のとおりであるが、本発明の製造方法においても、当該細菌の代わりに、本発明に係るＤＮＡ又はベクターが外来的に導入された宿主細胞も用いることができる。
　「細菌（宿主細胞）を培養する」条件は、当該細菌等がイソアロＬＣＡを製造できる条件であればよく、当業者であれば、細菌等の種類、用いる培地等に合わせて、温度、空気の添加の有無、酸素の濃度、二酸化炭素の濃度、培地のｐＨ（例えば、ｐＨ７～９）、培養温度（通常２０～４０℃であり、好ましくは２５～３７℃）、培養時間、湿度等を適宜調整し、設定することができる。また培地としては、細菌等が資化し得るものが含有されていればよく、炭素源、窒素源、硫黄源、無機塩類、金属、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、カゼイン加水分解物、血清等が含有物として挙げられる。また、かかる培地には、例えば、本発明に係る酵素をコードするポリヌクレオチドの発現を誘導するためのＩＰＴＧや、本発明に係るベクターがコードし得る薬剤耐性遺伝子に対応する抗生物質（例えば、アンピシリン）や、本発明に係るベクターがコードし得る栄養要求性を相補する遺伝子に対応する栄養物（例えば、アルギニン、ヒスチジン）を添加してもよい。
　本発明において、「培養物」とは、細菌等を培地で培養することによって得られる、増殖した細菌等、該細菌等の分泌産物及び該細菌等の代謝産物等を含有する培地のことであり、それらの希釈物、濃縮物を含む。
　本発明において用いる「酵素」としては上述のとおりであるが、本発明に係る酵素の存在下、イソアロＬＣＡを生成させる条件については、当該生成反応が促進される条件であればよく、当業者であれば、反応液の組成（例えば、緩衝液）、反応液のｐＨ（例えば、ｐＨ７～９）、反応温度（通常２０～４０℃であり、好ましくは２５～３７℃）、反応時間等を適宜調整し、設定することができる。
　このような細菌、その培養物又は反応液等からのイソアロＬＣＡの採取についても、特に制限はなく、公知の回収、精製方法により行うことができる。かかる採取方法としては、例えば、溶媒による抽出、各種クロマトグラフィー（ガスクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、ＬＣ－ＭＳ、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ、薄層クロマトグラフィー等）が挙げられる。さらに、これらの方法は単独にて行ってもよく、また適宜組み合わせて多段階的に実施し得る。また、採取の時期としては、用いる細菌、酵素等の種類に合わせて適宜調整され、イソアロＬＣＡが生成し得る時間であればよいが、通常１時間～１４日であり、好ましくは１２時間～７日である。
　以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。また、本実施例は、以下に示す方法を用いて行なった。なお、本［実施例］の記載において、［　］内の数字は、最後に列挙してある引用文献の番号に対応する。
　（ヒト検体の収集）
　若年者、高齢者、百歳以上の長寿者、その直系親族、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）患者からの糞便サンプルの収集は、慶應義塾大学医学部倫理委員会に承認された下記プロトコルに従って実施した。
若年健常者ドナー及びＩＢＤ患者については、承認番号：２０１５００７５に基づく。
高齢者コホートについては、承認番号：２０１６０２９７（川崎市における高齢者の暮らし方と健康に関する学術調査の一部として）に基づく。
百歳以上の長寿者とその直系親族については、承認番号２００２２０２０（全国超百寿者研究［１５］の一部として）に基づく。
　なお、参加前に、それぞれのドナーからインフォームドコンセントを得ている。また、全ての実験は、これらの審査委員会によって要求された規則に従い実施した。全ての研究手順は、関連する倫理規制を遵守して実施した。全国超百寿者研究［１５］と川崎市における高齢者の暮らし方と健康に関する学術調査は、大学病院医療情報ネットワーク臨床試験登録システムに観察研究として登録されている。（ＩＤ：ＵＭＩＮ００００４０４４７及びＵＭＩＮ００００２６０５３）。
　（ヒト糞便検体についてのメタゲノムシーケンシング、及び１６ＳｒＲＮＡ遺伝子についてのパイロシーケンシング）
　糞便サンプルを２０％グリセロールと１０ｍＭ　ＥＤＴＡを含むＰＢＳに懸濁し、使用するまで－８０℃に保管した。融解後、１００μＬの懸濁液を、ＲＮａｓｅ　Ａ（終濃度　１００μｇ／ｍＬ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とリゾチーム（終濃度　１５ｍｇ／ｍＬ，Ｓｉｇｍａ）を含む８００μＬのＴＥ１０（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１０ｍＭ　ＥＤＴＡ）バッファーに穏やかに混合し、３７℃で１時間インキュベーションした。精製アクロモペプチダーゼ（終濃度　２，０００Ｕ／ｍＬ，Ｗａｋｏ）を加え、更に３７℃で１時間インキュベーションした。ＳＤＳ（終濃度　１％）とプロテイナーゼ　Ｋ（終濃度１ｍｇ／ｍＬ，Ｒｏｃｈｅ）を、前記混合液にさらに加え、５５℃で１時間インキュベーションした。次いで、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１　ａｔ　ｐＨ７．９）により、高分子量ＤＮＡを抽出し、イソプロパノール（水相と等量）を用いて沈殿させ、１ｍＬの７０％エタノールで洗浄し、３０μＬのＴＥバッファーで穏やかに懸濁させた。
　１６ＳｒＲＮＡシーケンシングは、Ｉｌｌｕｍｉｎａのプロトコルに従い、ＭｉＳｅｑを用いて行った。ＰＣＲは、２７Ｆｍｏｄプライマー　５’－ＡＧＲＧＴＴＴＧＡＴＹＭＴＧＧＣＴＣＡＧ－３’（配列番号：１６６）と３３８Ｒプライマー　５’－ＴＧＣＴＧＣＣＴＣＣＣＧＴＡＧＧＡＧＴ－３’ （配列番号：１６７）を用い、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のＶ１－Ｖ２領域に対して実施した。それぞれのサンプルから得られたアンプリコン（～３３０ｂｐ）は、ＡＭＰｕｒｅ　ＸＰ　ｍａｇｎｅｔｉｃ　ｂｅａｄｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて精製した。
　ＤＮＡは、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ　Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ　ｄｓＤＮＡ　ａｓｓａｙ　ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とＩｎｆｉｎｉｔｅ　Ｍ　Ｐｌｅｘ　ｐｌａｔｅ　ｒｅａｄｅｒ（Ｔｅｃａｎ）を用いて定量した。精製したＤＮＡは、－２０℃で保管した。
　２つのペアエンドリードは、重なり合うシーケンスを基にｆａｓｔｑ－ｊｏｉｎ　ｐｒｏｇｒａｍを用いて結合した。平均クオリティバリューが２５未満となる、両方のユニバーサルプライマーに対して不一致なリードを、除去した。両方のプライマーシーケンスを除去し、クオリティーフィルターをパスした３０００リードをクオリティバリューに従って降順に並べ、ペアワイズの配列一致度についてカットオフ９７％で、ＵＣＬＵＳＴ　ｐｒｏｇｒａｍ（Ｅｄｇａｒ　２０１０）ｖｅｒｓｉｏｎ　５．２．３２を用いてクラスタリングし、ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ　ｔａｘｏｎｏｍｉｃ　ｕｎｉｔ（ＯＴＵ）とした。
　Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ　Ｄａｔａｂａｓｅ　Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＲＤＰ）とＮａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）　ｇｅｎｏｍｅ　ｄａｔａｂａｓｅに対する相同性をＧＬＳＥＡＲＣＨプログラムにより検索することで、それぞれのＯＴＵの分類学上の割当を行った。
　メタゲノムシーケンシングライブラリーは、Ｎｅｘｔｅｒａ　ＸＴ　ＤＮＡ　Ｌｉｂｒａｒｙ　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用い、製造元推奨のプロトコルに従って、２ｎｇのインプットＤＮＡから調製したライブラリーを等量でプールし、それぞれのプールされたライブラリーのインサートサイズと濃度は、Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ　ＤＮＡ　１０００　ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて決定した。シーケンシングは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ　ＮｏｖａＳｅｑ　６０００で１５１ｂｐのペアエンドリードを用い、１サンプル当たりおよそ１０００万のペアエンドリードが得られるよう実施した。データは、Ｂｒｏａｄ　Ｐｉｃａｒｄ　Ｐｉｐｅｌｉｎｅを用いて、分離や集約等を解析した（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｇｉｔｈｕｂ．ｉｏ／ｐｉｃａｒｄ）。メタゲノムデータのためのクオリティーコントロールは、シーケンシングアダプター（最小５ｂｐの重なり）を検出して除去するためにＴｒｉｍ　Ｇａｌｏｒｅ！を、ヒトＤＮＡのコンタミネーションの除去と低クオリティのシーケンス（ＨＥＡＤＣＲＯＰ：１５，ＳＬＩＤＩＮＧＷＩＮＤＯＷ：１：２０）を除去するために、ｋｎｅａｄＤａｔａ　ｖ０．７．２を用いて実施した。そして、５０ｂｐ未満の長さの配列を除いた。メタゲノムリードは、ＭＥＧＡＨＩＴ［４６］を用いてそれぞれのサンプルで個々にアセンブルしてコンティグとし、オープンリーディングフレームの予測は、Ｐｒｏｄｉｇａｌ［４７］を用いて、予測される遺伝子がスタートコドンとストップコドン両方を保持するように行った。予測した遺伝子を、より短いシーケンスの９５％配列同一性、９０％カバレッジの配列相同性を基準に、ＣＤ－ＨＩＴ［４８、４９］を用いてクラスタリングすることで、非冗長遺伝子カタログを作成した。リードは、リードの長さに対して少なくとも９５％の配列同一性のある、ユニークで強力なマッピングを条件とするＢＷＡ［５０］を用い、遺伝子カタログに対してマッピングし、組織内のスクリプトを用いてカウントし（ｃｏｕｎｔ　ｍａｔｒｉｘ）、ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ－ｐｅｒ－ｍｉｌｌｉｏｎ（ＴＰＭ　ｍａｔｒｉｘ）に規格化した。Ｃｏｕｎｔ　ｍａｔｒｉｘは、ＭＳＰｍｉｎｅｒをデフォルト設定で用いて遺伝子をビニングし、メタゲノムの種パンゲノム（コア遺伝子とアクセサリー遺伝子）にするためのインプットとして使用した［５１］。そして、一つのサンプル内の全てのメタゲノム種の存在量を、ＭＳＰｍｉｎｅｒにより出力されたトップ３０の代表的なコア遺伝子のＴＰＭ中央値として表した。アセンブルされた遺伝子を、これまでの報告の通り、種、属、門レベルでＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ（ｖｅｒｓｉｏｎ　Ｍａｙ　２０１８）を用いてアノテーションした［５２］。ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑのどの種にもマッチしないメタゲノムの種を、系統発生学的にアノテーションするために、Ｐｈｙｌｏｐｈｌａｎをデフォルト設定で使用した［５３］。種レベルでの相対的な存在量を基に、α多様性はＳｈａｎｎｏｎ指数を用い、β多様性はＢｒａｙ－Ｃｕｒｔｉｓ非類似度を用いて算出した（Ｒのｖｅｇａｎパッケージ）。クエリ配列に対して少なくとも４０％の配列一致度と８０％のカバレッジをもつホモログタンパクの同定とアノテーションを行うために、Ｃ．ｓｃｉｎｄｅｎｓのｂａｉオペロン中のタンパク質［２６］、又は、５ＡＲ、５ＢＲ、３βＨＳＤＨＩ、若しくは３βＨＳＤＨＩＩとしてここに報告されている単離菌の中のタンパク質を用い、非冗長遺伝子カタログに対し、ＵＳＥＡＲＣＨ　ｕｂｌａｓｔでクエリを実行した。同一の処理パイプラインは、サルデーニャの百歳以上の長寿者の腸内細菌のデータセットに適用されている［８］。
　続く解析では、クオリティコントロールステップの後で少なくとも４００万リードあるサンプルのみを使用した。加えて、被験者が抗生剤治療を受けている間に採取されたサンプルは使用しなかった。種又は門において差異のある存在量やＳｈａｎｎｏｎ多様性指数の違いを検証するために、Ｒのｌｍｅｒ（）関数やｌｍ（）関数の中で実行されるように、線形変量効果モデリング（百歳以上の長寿者と、若年者若しくは高齢者のコントロール）、又は、固定効果モデリング（高齢者と若年者コントロール）を使用した。さらに、種の異なる存在量を解析するために、少なくとも１０％のサンプル中に存在しているメタゲノム種に解析を限定し、ゼロの値はそれぞれ最も小さいゼロでない測定の半量値に置き換え、正規性のためにｌｏｇ１０の変換を相対存在量に適用した。線形モデリングは、固定効果の共変量、すなわち、性別（男性又は女性）やコホート情報（百歳以上の長寿者、高齢者又は若年者）を含む。変量効果は、少数の百歳以上の長寿者間で一つ以上のサンプルの被験者情報を含む。全体として腸内細菌組成とコホートや性別情報との相関を同定するため、（Ｒのｖｅｇａｎパッケージでａｄｏｎｉｓ（）関数で実行されるように）ＰＥＲＭＡＮＯＶＡを、Ｂｒａｙ－Ｃｕｒｔｉｓ非類似度に適用した。高齢者や若年者コントロールと比較した百歳以上の長寿者の中のｂａｉオペロンホモログの相対存在量の違いを評価するために、ペアワイズのＷｉｌｃｏｘｏｎの順位和検定を使用した。５ＡＲ、５ＢＲ、３βＨＳＤＨＩ又は３βＨＳＤＨＩＩ遺伝子をコードするＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓの種の相対存在量と糞便中の二次胆汁酸の存在量の間の相関関係の傾向を評価するために、Ｓｐｅａｒｍａｎの順位相関を使用した。全ての名目上のｐ値は、多重検定のためにＢｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法を用いて調整し、（特に断りがない限り）ＦＤＲ＜０．０５の関連性で有意差ありとみなした。
　（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いた糞便中胆汁酸の定量）
　正確に１０ｍｇ秤量した凍結乾燥糞便サンプルを、２００μＬの水に懸濁した。次いで、２５０μＬの糞便懸濁液を、３μＬの重水素ラベル化された内部標準及び７４７μＬの０．２７Ｎ　ＮａＯＨを含むスクリューキャップのガラスバイアル中にて、１時間超音波をかけることにより、ホモジナイズした（重水素ラベル化された内部標準：ｄ４－ＣＡ，ｄ４－ＧＣＤＣＡ，ｄ４－ＴＣＤＣＡ，ｄ５－ＣＤＣＡ－３Ｓ，ｄ４－ＬＣＡを各々５０μＭ）。１時間室温でインキュベーションした後、８Ｎ　ＨＣｌを用いてｐＨが８．０になるよう調整し、１１０μＬの０．５Ｍ　ＥＤＴＡ／０．５Ｍ　Ｔｒｉｓを混合した。そして、当該溶液を１５０００ｒｐｍの遠心処理に供し、その上清を固相抽出カートリッジ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｂｏｎｄ　Ｅｌｕｔ　Ｃ１８，１００ｍｇ／３ｍＬ，あらかじめ１ｍＬのメタノールと３ｍＬの水で３回処理）に移した。カートリッジを１ｍＬの水で洗浄し、捕捉された胆汁酸を３００μＬの９０％エタノールで溶出した。５μＬをＬＣ／ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ（Ｔｒｉｐｌｅ　Ｑｕａｄ　６５００＋　ｔａｎｄｅｍ　ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ，ｅｑｕｉｐｐｅｄ　ｗｉｔｈ　ａｎ　ＥＳＩ　ｐｒｏｂｅ　ａｎｄ　Ｅｘｉｏｎ　ＬＣ　ＡＤ　ｕｌｔｒａ－ｈｉｇｈ　ｐｒｅｓｓｕｒｅ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　ｓｙｓｔｅｍ；ＳＣＩＥＸ）にインジェクションした。分離カラム　ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ　Ｃ１８（１５０ｍｍ×２．１ｍｍ　ＩＤ，３μｍ　ｐａｒｔｉｃｌｅ　ｓｉｚｅ；ＧＬ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｉｎｃ．）は４０℃で使用した。１０ｍＭの酢酸アンモニウムとアセトニトリルとの混合溶液を、溶離液として使用し、分離は直線グラジエントにより０．２ｍＬ／ｍｉｎの流速で実施した。
移動相組成は、次のように徐々に変化させた。
酢酸アンモニウム：アセトニトリル（８６：１４，ｖ／ｖ）０．５分、（７８：２２，ｖ／ｖ）０．５－５分、（７２：２８，ｖ／ｖ）５－２８分、（４６：５４，ｖ／ｖ）２８－５５分、（２：９８，ｖ／ｖ）５５－６６分、（２：９８，ｖ／ｖ）６６分－７０分。トータルの稼働時間を７０分間とした。
ＬＣ／ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳを稼働するために、陽イオンＭＲＭモードとして以下のＭＳパラメータを使用した。
ｉｏｎ　ｓｐｒａｙ　ｖｏｌｔａｇｅ；５，５００　Ｖ，ｉｎｔｅｒｆａｃｅ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ；　５００℃，ｃｕｒｔａｉｎ　ｇａｓ；３０ｐｓｉ，ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ　ｇａｓ（ｎｉｔｒｏｇｅｎ）；９ｐｓｉ，ｎｅｂｕｌｉｚｉｎｇ　ｇａｓ；８０ｐｓｉ，ａｎｄ　ｈｅａｔｅｒ　ｇａｓ；８０ｐｓｉ。
陰イオンＭＲＭモードとして、以下のＭＳパラメータを使用した。
ｉｏｎ　ｓｐｒａｙ　ｖｏｌｔａｇｅ；－４，５００Ｖ，ｉｎｔｅｒｆａｃｅ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ；５００℃，ｃｕｒｔａｉｎ　ｇａｓ；３０ｐｓｉ，ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ　ｇａｓ（ｎｉｔｒｏｇｅｎ）；９ｐｓｉ，ｎｅｂｕｌｉｚｉｎｇ　ｇａｓ；８０ｐｓｉ，ａｎｄ　ｈｅａｔｅｒ　ｇａｓ；８０ｐｓｉ。
サンプルは、Ａｎａｌｙｓｔ　ソフトウェア　ｖｅｒ１．７１を用いて取得し、ＳＣＩＥＸ　ＯＳ－ＭＱ　ソフトウェア　ｖｅｒ１．７．０．３６６０６を用いて解析した。
　（糞便の短鎖脂肪酸、ｐＨ及びアンモニアの測定）
　糞便中の短鎖脂肪酸の濃度は、ＰＡＬ　ＲＴＣ　ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ（ＣＴＣ　Ａｎａｌｙｔｉｃｓ）を備えたＧＣ－ＭＳ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ　ＱＰ２０２０　ｓｙｓｔｅｍ　ｗｉｔｈ　ａ　ｆｌａｍｅ　ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ　ｄｅｔｅｃｔｏｒ）により決定した。ヘリウムをキャリアガスとして使用し、０．２５μｍの膜厚でコートされた溶融シリカキャピラリーカラム３０ｍｘ０．２５ｍｍを使用した。注入口温度を２５０℃とした。初期オーブン温度を６０℃、２分とし、それから３３０℃まで１５℃／分で上昇させた。
ＭＳパラメータは次のように設定した。
ｉｏｎ　ｓｏｕｒｃｅ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅは２００℃、ｉｎｔｅｒｆａｃｅ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅは２８０℃、ｌｏｏｐ　ｔｉｍｅは０．３秒。
ＧＣ－ＭＳ測定のために、０．５μｇ／μＬと２０μｇ／μＬとの濃度になるようエタノールにて調製した５０μＬの糞便サンプルを、１０μＬの酢酸－ｄ４（８０μＭ）と混合した。
ＰＡＬ　ＲＴＣ　ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒを用い、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４メチルモルフォリニウム（ＤＭＴ－ＭＭ）とｎ－オクチルアミン（８０μＭの濃度のそれぞれの試薬１０μＬ）を、それぞれの糞便サンプルに加え、ＧＣ－ＭＳへインジェクションする前に９時間反応させた。サンプルは、ＬａｂＳｏｌｕｔｉｏｎｓ　Ｉｎｓｉｇｈｔ　ＧＣ－ＭＳ　ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）を用いて解析し、定量した。
　糞便のｐＨは、蒸留水に懸濁した０．１ｍｇ／μＬの糞便分散液の上清を、ｐＨメーター（Ｈｏｒｉｂａ　Ｌｔｄ．）に供し、測定した。また、同じ糞便懸濁液から、ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ａｍｍｏｎｉａ　ＥＬＩＳＡ　ａｓｓａｙ　ｋｉｔ（Ａｂｃａｍ）を用い、同製造元のプロトコルに従い、糞便アンモニアレベルを定量した。
　（百十歳以上の長寿者からの細菌株の単離）
　百十歳以上の長寿者からの糞便サンプル（ｃｅｎｔｅｎａｒｉａｎ　９１（ＣＥ９１）、日本人、女性、年齢＞１１０）を等量（ｗ／ｖ）の２０％グリセロールを含むＰＢＳに分散し、液体窒素中で瞬時に冷凍し、使用まで－８０℃で保存した。２００μＬの融解した糞便懸濁液をＰＢＳで段階希釈し、１００μＬを非選択アガロースプレート（Ｂｒｕｃｅｌｌａ　ａｇａｒ　ｐｌａｔｅ　ｗｉｔｈ　ｈａｅｍｉｎ，Ｖｉｔａｍｉｎ　Ｋ１，ｌｙｓｅｄ　ｒａｂｂｉｔ　ｂｌｏｏｄ　ａｎｄ　ｄｅｆｉｂｒｉｎａｔｅｄ　ｓｈｅｅｐ　ｂｌｏｏｄ（ＢＨＫ－ＲＳ），Ｋｙｏｋｕｔｏ）と、選択アガロースプレート（グラム陰性細菌に対して：Ｐａｒａｍｏｍｙｃｉｎ　ａｎｄ　ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ　ＢＨＫ，Ｋｙｏｋｕｙｏ、クロストリジウム細菌に対して：Ｏｘｏｉｄ　Ｒｅｉｎｆｏｒｃｅｄ　Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ（ＲＣ）Ａｇａｒ，Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）に播種し、嫌気チャンバー（Ｃｏｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）内で、嫌気条件下（８０％　Ｎ２，１０％　Ｈ２、及び１０％　ＣＯ２）、３７℃で培養した。７２時間から１０日までインキュベーションした際に出現した個々のコロニーを、ピックアップした。単離した株は、サンガーシーケンシングのために、ユニバーサルプライマー（２７Ｆｍｏｄ：５’－ＡＧＲＧＴＴＴＧＡＴＹＭＴＧＧＣＴＣＡＧ－３’（配列番号：１６６）、１４９２Ｒ：５’－ＧＧＹＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ－３’（配列番号：１６８））を用いたＰＣＲにて、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子領域を増幅し、ＮＣＢＩ　ｇｅｎｏｍｅ　ｄａｔａｂａｓｅを用いて同定した。カルチャーコレクション中の個々の単離菌は、１６ＳｒＲＮＡシーケンスの相同性＞９８．０％で種を、相同性＞９４．５％で科を、相同性＞８６．５％で目を命名した。単離菌は、２０％のグリセロールを含む最適な培地中、－８０℃で冷凍保存した。
　（細菌における胆汁酸代謝についてのＩｎ　ｖｉｔｒｏスクリーニング）
　胆汁酸代謝をスクリーニングするために、単離した細菌株を、５０μＭのＣＤＣＡ、３－ｏｘｏ－Δ４－ＬＣＡ又はＬＣＡと共に、ガス透過性膜（Ｂｒｅａｔｈｅ－ｅａｓｉｅｒＴＭ，Ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｅｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）でカバーした９６－ｄｅｅｐ　ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅ（Ｔｒｅｆｆ　Ｌａｂ）中、嫌気性条件で培養した。対数期から静止期の細菌懸濁液２０μＬを、ｐＨ７に調整（ＭＯＰＳバッファー使用、Ｄｏｊｉｎｄｏ）された、又はｐＨ９に調整（ＴＡＰＳバッファー使用、Ｄｏｊｉｎｄｏ）されたＷｉｌｋｉｎｓ－Ｃｈａｌｇｒｅｎ　Ａｎａｅｒｏｂｅ（ＷＣＡ，Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）培地１ｍＬに植菌した。いくつかの細菌株は、追加の栄養素を添加したＲＣ又はＷＣＡ培地中で増殖させた。Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ　Ｓｔ４２－４３及び４５、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ　Ｓｔ４７、並びにＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ　Ｓｔ５６は、ＲＣ培地中で培養した。一方、Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆａｅｃｉｕｍ　Ｓｔ５２－５３は、コハク酸ナトリウムを添加したＲＣ培地中（２０ｍｍｏｌ／Ｌ）で培養した。Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ　ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ　Ｓｔ２６－２７の培養においては、塩化アンモニウム（１．０ｇ／Ｌ）、Ｌ－システイン（１．０ｇ／Ｌ）、ビタミンＫ（０．５ｍｇ／Ｌ）、ヘミン（５ｍｇ／Ｌ）及び０．２９％揮発性脂肪酸溶液を添加したＷＣＡ培地（ＤＳＭＺ　１６１１　ＹＣＦＡ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｍｅｄｉｕｍをベース）を使用した。Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ　ｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ　Ｓｔ１６、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｕｒｅｏｌｙｔｉｃｕｓ　Ｓｔ２５、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎｅｌｌａｃｅａｅ　Ｓｔ３６－３７、及びＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ　Ｓｔ４４は、４％塩溶液（０．２ｇ／Ｌ塩化カルシウム、０．２ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム、１ｇ／Ｌリン酸水素二カリウム、１ｇ／Ｌリン酸二水素カリウム、１０ｇ／Ｌ炭酸水素ナトリウム、２ｇ／Ｌ塩化ナトリウム）、塩化アンモニウム（１．０ｇ／Ｌ）、Ｌ－システイン（１．０ｇ／Ｌ）、ビタミンＫ（０．５ｍｇ／Ｌ）、ヘミン（５ｍｇ／Ｌ）、酢酸ナトリウム（１．０ｇ／Ｌ）、ギ酸ナトリウム（０．１５ｇ／Ｌ）、フマル酸ナトリウム（０．１５ｇ／Ｌ）、チオグリコール酸ナトリウム（０．３ｇ／Ｌ）、１％ＡＴＣＣ　ｖｉｔａｍｉｎ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ、並びに１％ＡＴＣＣ　Ｔｒａｃｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ　ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加したＷＣＡ培地中で培養した。Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ　ｓｍｉｔｈｉｉ　Ｓｔ６７－６８の培養においては、上記の改良されたＷＣＡ培地に、更に重炭酸ナトリウム（０．２５ｇ／Ｌ）と硫化ナトリウム（０．０５ｇ／Ｌ）、ギ酸ナトリウム（１．３６ｇ／Ｌ）を添加して用いた［５４］。嫌気性条件下で３７℃、４８時間インキュベーションした後、培養上清を回収し、解析のためのサンプル調製まで－２０℃で保管した。
　サンプル調製のために、１００μＬの培養上清を１０μＬの重水素ラベル化した内部標準（ｄ４－ＣＡとｄ４－ＣＤＣＡ、ｄ４－ＬＣＡ、それぞれ１ｎｍｏｌ／ｍＬ）を含むスクリューキャップガラスバイアルに移した。４００μＬの水を加え、１０分間超音波をかけ、それから固相抽出カートリッジ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｂｏｎｄ　Ｅｌｕｔ　Ｃ１８、１００ｍｇ／１ｍＬ、あらかじめ１ｍＬのメタノールと３ｍＬの水で処理）に供した。カートリッジを１ｍＬの水で洗浄し、捕捉した胆汁酸を１ｍＬの９０％エタノールで溶出した。溶媒を蒸発させた後、残留物を１００μＬの５０％エタノールに溶解し、５μＬをＬＣ／ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ（ＬＣ－ＭＳ８０４０　ｔａｎｄｅｍ　ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ，ｅｑｕｉｐｐｅｄ　ｗｉｔｈ　ａｎ　ＥＳＩ　ｐｒｏｂｅ　ａｎｄ　Ｎｅｘｅｒａ　Ｘ２　ｕｌｔｒａ－ｈｉｇｈ－ｐｒｅｓｓｕｒｅ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　ｓｙｓｔｅｍ；Ｓｈｉｍａｄｚｕ）にインジェクションした。分離カラム　ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ　Ｃ１８（１５０ｍｍ×２．１ｍｍ　ＩＤ，２μｍ　ｐａｒｔｉｃｌｅ　ｓｉｚｅ；ＧＬ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｉｎｃ．）は４０℃で使用した。混合液Ａ（１０ｍＭ酢酸アンモニウム、０．０１％ギ酸、２０％アセトニトリル）と混合液Ｂ（３０％アセトニトリル、７０％メタノール）を溶離液として使用し、分離は直線グラジエントにより０．２ｍＬ／ｍｉｎの流速で行った。
移動相組成を次のように徐々に変化させた。
混合液Ａ：Ｂ（８０：２０，ｖ／ｖ）０．１分、（４８：５２，ｖ／ｖ）０．１－１分、（３０：７０，ｖ／ｖ）１－２７分、（０：１００，ｖ／ｖ）２７－２７．１分、（０：１００，ｖ／ｖ）２７．１－３３分、（８０：２０，ｖ／ｖ）３３－３３．１分、（８０：２０，ｖ／ｖ）３３．１－８３分。トータル稼働時間は８３分間とした。
ＬＣ／ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳを稼働するために、次のＭＳパラメータを使用した。
ｓｐｒａｙ　ｖｏｌｔａｇｅ；３０００Ｖ、ｈｅａｔｉｎｇ　ｂｌｏｃｋ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ；４００℃、ｎｅｂｕｌｉｚｉｎｇ　ｇａｓ　ｆｌｏｗ；３Ｌ／ｍｉｎ、ｄｒｙｉｎｇ　ｇａｓ　ｆｌｏｗ；１５Ｌ／ｍｉｎ，ｉｎｔｅｒｆａｃｅ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　３００℃、ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ　ｇａｓ（ａｒｇｏｎ）ｐｒｅｓｓｕｒｅ；２３０ｋＰａ、ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ　ｅｎｅｒｇｙ；ｎｅｇａｔｉｖｅ（１１　ｔｏ　－３５ｅＶ）；ａｎｄ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ（－１６　ｔｏ　－１９ｅＶ）　ｉｏｎ　ｍｏｄｅｓ。
サンプルは、ＬａｂＳｏｌｕｔｉｏｎｓ　Ｉｎｓｉｇｈｔ　ＬＣ－ＭＳ　ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）を用いて解析し、定量した。
　（細菌の全ゲノムシーケンシング）
　６８単離株の抽出ゲノムを断片化した。ゲノム配列は、ＰａｃＢｉｏ　ＳｅｑｕｅｌとＩｌｌｕｍｉｎａ　ＭｉＳｅｑシーケンサーを用い、全ゲノムショットガンシーケンシング法により決定した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ　Ｍｉｓｅｑ　２ｘ３００ｂｐペアエンドシーケンシングのライブラリーを、ＴｒｕＳｅｑ　ＤＮＡ　ＰＣＲ－Ｆｒｅｅ　ｋｉｔ（ｔａｒｇｅｔ　ｌｅｎｇｔｈ＝５５０ｂｐ）を用いて調製し、全てのＭｉｓｅｑのリードは、ＦＡＳＴＸ－ｔｏｏｌｋｉｔ（ｖ．０．０．１３，ｈａｎｎｏｎｌａｂ．ｃｓｈｌ．ｅｄｕ／ｆａｓｔｘ＿ｔｏｏｌｋｉｔ）を用い、クオリティバリュー＞２０にてトリミングとフィルタリングを行った。ＰａｃＢｉｏ　Ｓｅｑｕｅｌのシーケンシングライブラリーを、ＳＭＲＴｂｅｌｌ　ｔｅｍｐｌａｔｅ　ｐｒｅｐ　ｋｉｔ　２．０（ｔａｒｇｅｔ　ｌｅｎｇｔｈ＝１０－１５ｋｂｐ）を用い、ＤＮＡの断片化をせずに調製した。Ｓｅｑｕｅｌによる内部コントロールの除去とアダプタートリミングの後、追加オプション（ｃｏｒＯｕｔＣｏｖｅｒａｇｅ＝１００００，ｃｏｒＭｉｎＣｏｖｅｒａｇｅ＝０，ｃｏｒＭｈａｐＳｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ＝ｈｉｇｈ）を設定したＣａｎｕ（ｖ１．８）を用いて、トリミングされたリードのエラー修正を実行した。フィルターパスしたＭｉｓｅｑのリードと修正されたＳｅｑｕｅｌのリードのｄｅ　ｎｏｖｏハイブリッドアセンブリを、Ｕｎｉｃｙｃｌｅｒ（ｖ．０．４．８）により実施した。なお、これには、環状コンティグを生成する重なりと環化のチェックが含まれる。生成したコンティグの遺伝子の予測とゲノムのアノテーションは、Ｒａｐｉｄ　Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎｓ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　Ｓｕｂｓｙｓｔｅｍ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＲＡＳＴ）　Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ　Ｓｅｒｖｅｒ［５５］とＰｒｏｋｋａ：ｒａｐｉｄ　ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｇｅｎｏｍｅ　ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ　ｓｏｆｔｗａｒｅ　ｔｏｏｌ［５６］を用いて実施した。なお、特に断りがない限り、デフォルトパラメータを使用した。
　（変異体作製）
　Ｐ．ｍｅｒｄａｅ　Ｓｔ３の欠失変異体（Δ５ＡＲ、Δ５ＢＲ、Δ３βＨＳＤＨ）は、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ変異体の作製方法［２９］を改良して、作製した。簡潔に説明すると、コーディング領域の両側のおよそ２ｋｂの配列をＰＣＲにより増幅した。なお、この増幅に用いたＰＣＲプライマーの配列等は下記表５を参照のほど。そして、製造元のプロトコルに従い、ＨｉＦｉ　ＤＮＡ　Ａｓｓｅｍｂｌｙ（ＮＥＢ）を用いて、自殺ベクターｐＬＧＢ３０のＰｓｔＩとＳａｌＩの位置に組み込んだ。１μＬの反応液をＥ．ｃｏｌｉ　ＭＦＤｐｉｒのエレクトロコンピテントセルに形質転換した。形質転換細胞を、以下のようにして、Ｐ．ｍｅｒｄａｅ　Ｓｔ３と接合させた。
　供与体（Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＦＤｐｉｒ）と受容体（Ｐ．ｍｅｒｄａｅ　Ｓｔ３）を、それぞれＬＢ培地とＢＨＩ培地でＯＤ６００が０．５となるまで増殖させ、１：１の割合で混合した。混合液をＢＨＩアガロースプレート上に滴下し、嫌気条件下で３７℃、１６時間インキュベーションした。テトラサイクリン（６μｇ／ｍＬ）を含むＢＨＩアガロースプレート上で接合完了体のコロニーを形成させた。
　続いて、二回目の相同組み換えによりゲノムからプラスミドを失った株を選定するために、接合完了体を０．２５％（ｗｔ／ｖｏｌ）グルコースと５０ｍｇ／Ｌ　Ｌ－システイン、５ｍｇ／Ｌヘミン、２．５μｇ／ＬビタミンＫ１、２ｍｇ／Ｌ　ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、５μｇ／ＬビタミンＢ１２、１０ｍＭラムノースを添加したＭ９アガロースプレートに播種した。遺伝子欠失の成否を、ＰＣＲとサンガーシーケンシングにより確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　（細菌増殖抑制評価）
　Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ　ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ　ｓｔｒａｉｎ　６３０（ＡＴＣＣ　ＢＡＡ－１３８２）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ　ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ　ＶＰＩ　１０４６３（ＡＴＣＣ　４３２５５）、ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃｉｕｍ（ＡＴＣＣ　７００２２１）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ　ｓｕｂｓｐ．ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ　１２３９４）、ｃａｒｂａｐｅｎｅｍａｓｅ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＡＴＣＣ　ＢＡＡ－１７０５）、及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｅｎｔｅｒｉｃａ　ｓｕｂｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ（ＡＴＣＣ　１４０２８）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）より購入した。
　Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ（ＪＣＭ　１２９０Ｔ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ（ＪＣＭ　２１５２Ｔ）、ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ（ＪＣＭ　１６５５５）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＪＣＭ　５６７４Ｔ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓａｎｇｕｉｎｉｓ（ＪＣＭ　５７０８Ｔ）、Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｍｉｒａｂｉｌｉｓ（ＪＣＭ　１６６９Ｔ）、及びＰｒｏｔｅｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ（ＪＣＭ　２００１３）は、国立研究開発法人理化学研究所バイオリソースセンター微生物材料開発室（ＪＣＭ）より購入した。
　腸管接着性侵入性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉは、Ｎｉｃｏｌａｓ　Ｂａｎｉｃｈ教授から提供された。
　腸内共生菌に関し、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｃｉｎｄｅｎｓ（ＡＴＣＣ　３５７０４Ｔ）とＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ（ＡＴＣＣ　１５５７９）、Ｄｏｒｅａ　ｆｏｒｍｉｃｉｇｅｎｅｒａｎｓ（ＡＴＣＣ　２７７５５Ｔ）、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔａｒｉｓ（ＡＴＣＣ　２９１７６　Ｔ）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ　２５２８５Ｔ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｉｎｄｏｌｉｓ（ＪＣＭ　１３８０Ｔ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｈｉｒａｎｏｎｉｓ（ＪＣＭ　１０５４１Ｔ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｈｙｌｅｍｏｎａｅ（ＪＣＭ　１０５３９Ｔ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｎｅｘｉｌｅ（ＪＣＭ　３１５００Ｔ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ（ＪＣＭ　１３９１Ｔ）、Ｄｏｒｅａ　ｌｏｎｇｉｃａｔｅｎａ（ＪＣＭ　１１２３２Ｔ）、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｈａｌｌｉｉ　（ＪＣＭ　３１２６３）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　（ＪＣＭ　１７８３４Ｔ）、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ　ｇｎａｖｕｓ（ＪＣＭ　６５１５Ｔ）、Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ　ｃｏｌｉｈｏｍｉｎｉｓ（ＪＣＭ　１５６３１Ｔ）、Ｂｌａｕｔｉａ　ｐｒｏｄｕｃｔａ（ＪＣＭ　１４７１Ｔ）、Ｂｌａｕｔｉａ　ｏｂｅｕｍ（ＪＣＭ　３１３４０）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｉｆｉｄｕｍ（ＪＣＭ　１２５４）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｒｅｖｅ（ＪＣＭ　１１９２Ｔ）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｏｎｇｕｍ　ｓｕｂｓｐ．ｌｏｎｇｕｍ（ＪＣＭ　１２１７Ｔ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃａｓｅｉ（ＪＣＭ　１１３４Ｔ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐａｒａｇａｓｓｅｒｉ（ＪＣＭ　１１３０）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｒｅｕｔｅｒｉ（ＪＣＭ　１１１２Ｔ）、Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ　ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ（ＪＣＭ　１０１８８Ｔ）、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ　ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ（ＪＣＭ　１７５８３Ｔ）、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ　ｌｅｎｔａ（ＪＣＭ　９９７９Ｔ）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｃａｃｃａｅ（ＪＣＭ　９４９８Ｔ）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ（ＪＣＭ　１３３４５Ｔ）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ（ＪＣＭ　１３２６５Ｔ）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｏｖａｔｕｓ（ＪＣＭ　５８２４Ｔ）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｓｔｅｒｃｏｒｉｓ（ＪＣＭ　９４９６Ｔ）、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ（ＪＣＭ　１３４０６Ｔ）、及びＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｃｏｐｒｉ（ＪＣＭ　１３４６４Ｔ）は、ＡＴＣＣとＪＣＭから入手した。
　本発明者らが所属する研究室が以前報告した下記Ｔｒｅｇ誘導株もまた、共生菌パネルの中に含めた。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｙｍｂｉｏｓｕｍ（ＶＥ２０２－１６）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｒａｍｏｓｕｍ（ＶＥ２０２－１８）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｂｏｌｔｅａｅ　（ＶＥ２０２－７）及びＦｌａｖｉｎｏｆｒａｃｔｏｒ　ｐｌａｕｔｉｉ（ＶＥ２０２－３）。加えて、本発明者らが所属する研究室でヒト糞便から単離したＨｕｎｇａｔｅｌｌａ　ｈａｔｈｅｗａｙｉと　Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｅｃｔａｌｅ、Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ　ｐｕｔｒｅｄｉｎｉｓも使用した。
　下記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ＨＧＦ２（ｉｎｎｏｃｕｕｍ）ＨＭ２８７は、Ｈｕｍａｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ　Ｐｒｏｊｅｃｔの一部として、ＢＥＩ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，ＮＩＡＩＤ，ＮＩＨを通して入手した：Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐ．，Ｓｔｒａｉｎ　ＨＧＦ２，ＨＭ－２８７。
　ＢＨＫ　ｂｌｏｏｄ　ａｇａｒ　ｐｌａｔｅｓ（Ｋｙｏｋｕｔｏ）上に新規に形成したコロニーから、ＷＣＡ培地中でＯＤ６００が０．６３となるように調整した一次懸濁液を調製した。続いて、１００μＬの一次懸濁液を最終２．４ｍＬとなるように培地中に希釈することで二次懸濁液を調製した。１０μＬの二次懸濁液を、最終２００μＬとなるように様々な濃度（３．１７５，６．２５，１２．５，２５，及び５０μＭ）の、次に示す胆汁酸を含む培地に植菌した；ＤＣＡ、ＬＣＡ、３－ｏｘｏＬＣＡ、３－ｏｘｏａｌｌｏＬＣＡ、ｉｓｏＬＣＡ、ａｌｌｏＬＣＡ、ｉｓｏａｌｌｏＬＣＡ。菌の増殖は、３７℃に設定したマイクロプレートリーダー（Ｓｕｎｒｉｓｅ　Ｔｈｅｒｍｏ，Ｔｅｃａｎ）で、測定ポイントの前に６０秒間振とうさせ、ＯＤ６００を測定することにより０．５から１時間毎にモニタリングした。最小発育阻止濃度を決定するために、１０μＬの二次懸濁液を最終２００μＬとなるように０．２５から５０μＭのｉｓｏａｌｌｏＬＣＡを含む培地に植菌した。
　（電子顕微鏡法（ＥＭ））
　電子顕微鏡法に供するサンプル調製のため、ＩｓｏａｌｌｏＬＣＡ添加又は無添加下にて５時間培養した後、細菌の培養液を採取した。走査型電子顕微鏡法に供するため、１０－３０μＬの培養液をＮａｎｏ　ｐｅｒｃｏｌａｔｏｒ　ｍｅｍｂｒａｎｅ（ＪＥＯＬ）にスポットし、新しく調製した２．５％グルタルアルデヒド溶液で固定した。４℃一晩固定した後、サンプルは０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４，Ｍｕｔｏ　Ｐｕｒｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）で洗浄し、１．０％四酸化オスミウム（ＴＡＡＢ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で４℃２時間固定し、エタノール濃度を増やしていく一連の溶液を用いて処理した。サンプルは、臨界点乾燥機（ＣＰＤ３００，Ｌｅｉｃａ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて乾燥し、導電性のオスミウムコーター（Ｎｅｏｃ－ＳＴ，Ｍｅｉｗａｆｏｓｉｓ）を使って、およそ２ｎｍ厚にオスミウムをコートした。ＳＥＭ画像はＳＵ６６００（Ｈｉｔａｃｈｉ　Ｈｉｇｈ　Ｔｅｃｈ）を用い、５ｋｅＶの電子ボルトで撮像した。
　透過電子顕微鏡法に供するため、２５ｍＬの細菌培養液を遠心することにより（１３，０００ｒｐｍ，２分間）、細菌のペレットを作製した。ペレットは２．５％グルタルアルデヒド溶液で４℃一晩固定した。０．１Ｍリン酸緩衝液で洗浄後、サンプルは１．０％の四酸化オスミウムで４℃２時間固定し、蒸留水で洗浄、低ゲル化温度Ｔｙｐｅ　ＶＩＩ－Ａ　アガロース（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）に包埋した。サンプルは、無水エタノールまでエタノール濃度を上げていく一連の溶液を用いて脱水し、アセトン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ｎ－ブチルグリシジルエーテル（Ｏｋｅｎｓｈｏｊｉ　Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）、段階的な濃度のエポキシ樹脂に浸漬し、１００％エポキシ樹脂（１００ｇ　Ｅｐｏｎ（商品名）は２７．０ｇ　ＭＮＡ，５１．３ｇ　ＥＰＯＫ－８１２、２１．９ｇ　ＤＤＳＡ及び１．１ｍＬ　ＤＭＰ－３０を含む。Ｏｋｅｎｓｈｏｊｉ　Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）にも４℃で４８時間浸漬した。純エポキシ樹脂の重合を、６０℃、７２時間で完了した。超ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ　ＵＣ７，Ｌｅｉｃａ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、超薄膜片（７０ｎｍ）を銅のグリッド（Ｖｅｃｏ　Ｓｐｅｃｉｍｅｎ　Ｇｒｉｄｓ，Ｎｉｓｓｈｉｎ－ＥＭ）上に作製し、酢酸ウラニルとクエン酸鉛でそれぞれ１０分間染色した。ＴＥＭ画像は、ＪＥＭ－１４００ｐｌｕｓ（ＪＥＯＬ）を用い、８０－１００ｋｅＶの電子ボルトで撮像した。
　（胆汁酸を添加したヒト糞便の培養）
　ヒト糞便の培養は、９６－ｄｅｅｐ　ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅｓ（Ｔｒｅｆｆ　Ｌａｂ）中で、若年者と健常者ドナーから得られた糞便サンプルを用いて実施した。ヒト糞便バッチ培養に以前使用した培地［５９，６０］をベースにした、４％塩溶液（０．２ｇ／Ｌ塩化カルシウム、０．２ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム、１ｇ／Ｌリン酸水素二カリウム、１ｇ／Ｌリン酸二水素カリウム、１０ｇ／Ｌ炭酸水素ナトリウム、２ｇ／Ｌ塩化ナトリウム）、塩化アンモニウム（１．０ｇ／Ｌ）、Ｌ－システイン（１．０ｇ／Ｌ）、ビタミンＫ（０．５ｍｇ／Ｌ）、ヘミン（５ｍｇ／Ｌ）、酢酸ナトリウム（１．０ｇ／Ｌ）、ギ酸ナトリウム（０．１５ｇ／Ｌ）、フマル酸ナトリウム（０．１５ｇ／Ｌ）、チオグリコール酸ナトリウム（０．３ｇ／Ｌ）、１％　ＡＴＣＣ　ｖｉｔａｍｉｎ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ及び１％　ＡＴＣＣ　Ｔｒａｃｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ　ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加した、ＷＣＡ培地１ｍＬに５ｍｇの糞便を加えて、培養に用いた。糞便培養は、終濃度５０μＭの胆汁酸（ＬＣＡ、３－ｏｘｏＬＣＡ、ｉｓｏａｌｌｏＬＣＡ）の存在下、嫌気性条件、３７℃にて４８時間行った。１６Ｓメタゲノムシーケンシングのために、糞便培養液から上述のようにＤＮＡを抽出した。
　（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ　ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いたステロイドホルモンの定量）
　ＣＥ９１より単離したＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｍｅｒｄａｅ　Ｓｔ３及びＯｄｏｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ　Ｓｔ２１－２４株を、５０μＭのテストステロン又は５α‐ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）と共に，ガス透過性膜（Ｂｒｅａｔｈｅ－ｅａｓｉｅｒＴＭ，Ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｅｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）で被覆した９６穴プレート（Ｔｒｅｆｆ　Ｌａｂ）中で嫌気的に培養した。対数増殖期から定常期までの２０μＬの細菌培養液を、ｐＨを７に調整した（ＭＯＰＳ緩衝液を使用、Ｄｏｊｉｎｄｏ）Ｗｉｌｋｉｎｓ－Ｃｈａｌｇｒｅｎ　Ａｎａｅｒｏｂｅ（ＷＣＡ、サーモフィッシャー社）培地１ｍＬに接種した。３時間、６時間、９時間及び１２時間培養後に、ＬＣ‐ＭＳ／ＭＳ定量のために、各培養上清を採取した。
　試料調製のために、４０μＬの培養上清を、１６０μＬの重水素標識内部標準物質（ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ－ｄ３，１２．５ｎＭのメタノール溶液）及び８００μＬの８０％メタノールと混合した。試料を室温で１０分間超音波処理した後、孔径０．４５μｍ（Ｐｕｒｅ　Ｃｌｅａｎ　ｆｏｒ　Ｓｏｌｖｅｎｔ　０．４５μｍ，ＫＵＲＡＢＯ）のフィルターに通した。２μＬの溶液をＬＣ／ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ（ＥＳＩプローブとＥｘｉｏｎ　ＬＣ　ＡＤ　ｕｌｔｒａ－ｈｉｇｈ　ｐｒｅｓｓｕｒｅ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　ｓｙｓｔｅｍ；ＳＣＩＥＸを備えたＴｒｉｐｌｅ　Ｑｕａｄ　６５００＋　ｔａｎｄｅｍ　ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）に注入した。分離カラムＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ　Ｃ１８（内径　１５０ｍｍ×２．１ｍｍ、粒径　２μｍ；ＧＬ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｉｎｃ．）は４０℃で使用した。混合物Ａ（蒸留水中の５ｍＭギ酸アンモニウム）と混合物Ｂ（メタノール中の５ｍＭギ酸アンモニウム）とをグラジエントとして使用し、０．２ｍＬ／分の流速で線形勾配溶出によって分離を行った。移動相組成を以下のように徐々に変化させた。
混合物Ａ：Ｂ（６０：４０、ｖ／ｖ）を０分時点、（１００：０、ｖ／ｖ）を２０～２５分時点、（６０：４０、ｖ／ｖ）を２５．１～３０分時点。全運転時間は３０分間とした。
ＬＣ‐ＥＳＩ‐ＭＳ／ＭＳを操作するために、以下のＭＳパラメータを使用した。ｉｏｎ　ｓｐｒａｙ　ｖｏｌｔａｇｅ；５，５００　Ｖ，ｉｎｔｅｒｆａｃｅ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ；　５００℃，ｃｕｒｔａｉｎ　ｇａｓ；３０ｐｓｉ，ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ　ｇａｓ（ｎｉｔｒｏｇｅｎ）；９ｐｓｉ，ｎｅｂｕｌｉｚｉｎｇ　ｇａｓ；８０ｐｓｉ，　ａｎｄ　ｈｅａｔｅｒ　ｇａｓ；８０ｐｓｉ。サンプルはＡｎａｌｙｓｔソフトウェア　ｖｅｒ１．７１を用いて採取し、ＳＣＩＥＸ　ＯＳ－ＭＱソフトウェア　ｖｅｒ１．７．０．３６６０６を用いて分析した。
　（統計解析）
　全ての統計解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ　Ｐｒｉｓｍ　ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧｒａｐｈＰａｄ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）を用いて実施した。Ｔｕｋｅｙ検定を伴う一元配置分散分析（パラメトリック）とＤｕｎｎ検定を伴うＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定（ノンパラメトリック）を、多重比較のために使用した。二群間の全ての比較のために、Ｗｅｌｃｈ’ｓ補正を伴うＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定（ノンパラメトリック）を使用した。Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正を伴うＷｉｌｃｏｘｏｎ　ｓｉｇｎｅｄ－ｒａｎｋ　ｔｅｓｔの事後検定（ノンパラメトリック）を、群の平均を比較するために使用した。２変数間の相関を調べるために、Ｓｐｅａｒｍａｎの順位相関を使用した。
　（実施例１）　百寿者の腸内細菌叢シグネチャ
　３つの年齢層（百寿者（ｎ＝１６０）、高齢者（ｎ＝１１２）、及び若年者（ｎ＝４４））を解析対象とした。百寿者は、全て、日本百寿者研究の一環として募集され［１５］、そのほとんどは介護施設に入居（８５％）しており、その他は自宅に居住（９．４％）、医療施設に入院（５．６％）している。百寿者は、日常生活動作（ＡＤＬ）やミニメンタルステート検査値（ＭＭＳＥ）、赤血球数や血清アルブミン値が低い事が報告されている。
　百寿者の一部は、血清Ｃ反応性タンパク質と糞便リポカリンのレベルの上昇によって証明されるように軽度の炎症の兆候を示し［９，１２，１３］、これは、老化が、バリアの完全性の低下と免疫老化に起因する慢性炎症を伴うという既定概念と一致している（図５Ｃ及び５Ｄ）。それにもかかわらず、百寿者の大多数において、肥満、糖尿病、高血圧、がん等の慢性疾患は認められず、これらの疾患の有病率は、高齢者グループと比較して有意に増加していない（図５Ｅ及び５Ｆ、並びに表６）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　３つのグループから糞便サンプルを収集し、１６ＳｒＲＮＡアンプリコンと全メタゲノムショットガンシーケンシングの両方を用い、細菌叢を解析した。その結果、ブレイ・カーチス距離に基づく主座標分析（ＰＣｏＡ）により、百寿者と両方の対照群の間で細菌叢の組成に有意差があることが明らかになった（ＰＥＲＭＡＮＯＶＡ　ＦＤＲ＜０．０５、図１Ａ）。門レベルでは、対照群と比較して、百寿者でＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａとＳｙｎｅｒｇｉｓｔｅｔｅｓの有意な増加、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａの中程度の増加、及びＡｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ（放線菌）の減少が観察された（図１Ｃ及び図６）。
　このようなＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａの増殖は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の患者によく見られるが、ＩＢＤ患者で一般的に観察される腸内細菌の多様性の減少とは対照的に、百寿者の腸内菌叢においては、若年者と比較してても、平均して高いシャノン指数であり、多様性が認められた（図１Ｂ）。さらに、百寿者の細菌叢の構成は、ＩＢＤ患者のそれとは異なり、主要因分析で異なる集合として分類された（図７Ａ）。
　また、いくつかの分類群は、百寿者グループと対照グループで相対的な存在量の差が認められた（図１Ｄ～１Ｆ、及び図７Ｂ～７Ｄ）。これらは、加齢軌跡に基づいて３つの特徴群にグループ化された。
　最初の特徴群は、年齢とともに存在量が増加又は減少した分類群である（図１Ｄ）。例えば、未知のＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓ種（ｍｓｐ＿１６１）又はＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｉｒａｅｕｍは、百寿者に最も多く、次に高齢者、その次に若年者であった。一方、Ｂｌａｕｔｉａ　ｗｅｘｌｅｒａｅは反対の傾向を示し、若年者に最も多く、次に百寿者、その次に高齢者であった。また、Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ　ｓｈａｈｉｉは、若年者と比較して、高齢者と百寿者のグループの両方で比較的多かった。これらの調査結果は、これらの分類群の相対的な存在量が加齢への適応を反映しており、身体活動、環境、及び食事に関連している可能性があることを示唆する以前の研究と一致していた［４～６，８］。
　２番目の特徴群は、百寿者と若年者でその存在量が類似しているが、高齢者とは異なる分類群である（図１Ｅ）。これらの種は、若さの維持に貢献したり、抗老化作用を持っている可能性がありうる。特に、未知のＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓ（ｍｓｐ＿１９７）、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ　ｇｎａｖｕｓ、及びＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ　ｌｅｎｔａは、百寿者と若年者の両方で比較的多かった。興味深いことに、後者の２つの種は胆汁酸代謝に関与しており、宿主の腸内でのイソ胆汁酸の生合成に関与している可能性がある［１８］。
　３番目の特徴群は、百寿者に特異的な分類群で、百寿者と対照群（高齢者と若年者）間ではその存在量が有意に異なっており、２つの対照群の中間に位置付けられるわけではない（図１Ｆ）。この群では、Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種、及び人間の腸内の主要な古細菌であるＭｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒが、対照群と比較して百寿者に特に富んでいた。百寿者に最も豊富な種の１つはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｃｉｎｄｅｎｓで、一次胆汁酸を二次胆汁酸に変換するのに必要な、比較的まれな７α－ｄｅｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎの能力を持っていることが知られている［１９，２０］。対照的に、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｅｃｔａｌｅ等の主要な酪酸生産菌は、百寿者で選択的に枯渇していた（図１Ｆ）。
　また、百寿者の直系の子孫と兄弟姉妹から便を収集し、１６ＳｒＲＮＡシーケンスによって分析した（ｎ＝２２　ｆｒｏｍ　１４ｃｅｎｔｅｎａｒｉａｎｓ、４８－９５ｙｏ、図７Ａ～７Ｄ及び表６）。Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆａｅｃｉｕｍやＡｌｉｓｔｉｐｅｓ　ｐｕｔｒｅｄｉｎｉｓ等の一部の細菌種は、対照群と比較して、百寿者とその家族に豊富に含まれていた（図７Ｄ）。百寿者とその直系の子孫におけるこれらの分類群の増加は、遺伝、生活習慣、及び食事による可能性がある。例えば、アブラナ科の野菜の消費は、前述の分類群の拡大に有利に働くことが報告されている［２１］。
　（実施例２）　百寿者特有の胆汁酸プロファイル
　次に、高齢者及び若年者の対照と比較して、百寿者糞便中の代謝物分析結果を評価した。先ず、糞便中の短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）を分析し、百寿者のプロピオン酸と酪酸の両方のレベルが低下していることが明らかになった（図８Ａ）。その一方で、イソ酪酸やイソ吉草酸等の分岐短鎖脂肪酸、及びアンモニアは、百寿者で上昇していた（図８Ａ及び８Ｂ）。
　これらの代謝変化は、Ｒ．ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓやＦ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ等のＳＣＦＡ生産菌の同時減少（［２２］、図１Ｆ）、及びＡｌｉｓｔｉｐｅｓ　ｐｕｔｒｅｄｉｎｉｓ等のタンパク質発酵生物の増加に起因している可能性がある（［２３］、図１Ｆ）。アミノ酸を利用する細菌のこの増加は、百寿者に一般的に観察される上部消化管のタンパク質分解能力の低下の結果である可能性がある。
　さらに、糞便ｐＨは、百寿者の方が対照よりも有意に高く（図８Ｃ）、これは、ＳＣＦＡ濃度が低く、加齢に特徴的な胃液産生が減少したことが一因である可能性がある。
　百寿者において胆汁酸を代謝する可能性のある種が増加することを考慮して、次に糞便中の胆汁酸の分布に焦点を合わせ、解析した。
　一次胆汁酸は肝臓のコレステロールから合成され、グリシン又はタウリンのいずれかに結合し、胆管に分泌される［２４，２５］。これらの一次胆汁酸は、次に、腸内細菌叢によって脱共役され、様々な二次胆汁酸に変換される［１９，２５］。主だった生化学変換は、一次胆汁酸（ｃｈｏｌｉｃ　ａｃｉｄ（ＣＡ）とｃｈｅｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ　ａｃｉｄ（ＣＤＣＡ））の７α－脱ヒドロキシル化であり、それによって、それらは二次胆汁酸（ｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ　ａｃｉｄ（ＤＣＡ）とｌｉｔｈｏｃｈｏｌｉｃ　ａｃｉｄ（ＬＣＡ））に変換される。
　細菌叢を介した胆汁酸代謝は、下記に示すとおり、胆汁酸誘導性（ｂａｉ）オペロン遺伝子（ＢａｉＢ、ＢａｉＣＤ、ＢａｉＡ２、ＢａｉＥ、ＢａｉＦ、及びＢａｉＨ）によってコードされる酵素によって触媒される複数の酸化還元反応で構成される［１９，２６］。７α－脱ヒドロキシル化に加えて、胆汁酸は、酸化及びエピマー化を受けて、オキソ－（ケト－）、イソ－（３β－ヒドロキシ）及びアロ－（５α－Ｈ－）、並びにシス－及びトランス異性体に変換される［２５］。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　メタゲノム分析では、百寿者のｂａｉオペロンに相同な遺伝子の相対的な存在量の増加が確認された（図１Ｇ）。しかしながら、サルデーニャの百寿者のメタゲノムでは同様の結果を導き出させなかった（図９）。
　百寿者の胆汁酸分布を調べるために、高感度のターゲット液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）を行った。予備検討において、標的となる１３２の胆汁酸のうち９５が、百寿者糞便中の微量成分（＜０．５μｍｏｌ／ｇ）である事が明らかになった。したがって、定量分析のために残りの３７種の胆汁酸化合物を選択した（表７）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　その結果、濾過後、重み正規化された便懸濁液中の総胆汁酸量は、百寿者と対照群間で有意差はなかった。しかしながら、百寿者の糞便中胆汁酸において、独特の分布が認められた（図２Ａ～２Ｆ、並びに図１０Ａ及び１０Ｂ）。例えば、百寿者は、一次胆汁酸のレベルが低く、それに伴い、ＣＤＣＡ代謝物レベルが高くなった（図２Ｄ～２Ｆ）。特に、ｉｓｏ－ＬＣＡ、３－ｏｘｏＬＣＡ、ｉｓｏａｌｌｏＬＣＡ、ａｌｌｏ－ＬＣＡ及び３－ｏｘｏａｌｌｏ－ＬＣＡのレベルは、百寿者で有意に上昇していたが、高齢者と若年者の間でこの上昇は見られず、単に老化の副産物ではないことが示唆される（図２Ａ及び２Ｆ）。さらに、ａｌｌｏＬＣＡ、３－ｏｘｏａｌｌｏ－ＬＣＡ及びｉｓｏａｌｌｏＬＣＡの濃度は、糞便ｐＨと正の相関があり（図８Ｄ）、百寿者におけるこれらの胆汁酸量の増加は、食事と消化機能の変化、及びその結果としての腸管メタボローム変化を反映している可能性があることが示唆される。このような腸内環境は、特定の細菌種の増殖及び／又はｉｓｏＬＣＡ、３－ｏｘｏＬＣＡ、及びｉｓｏａｌｌｏＬＣＡの生成に関与する酵素の発現を促進する可能性がある。あるいは、ｉｓｏＬＣＡ産生細菌、３－ｏｘｏＬＣＡ産生細菌、及びｉｓｏａｌｌｏＬＣＡ産生細菌の腸への定着は、腸内細菌叢の他のメンバー及びそれらの代謝プロセスに因果的に影響を与える可能性がある。
　（実施例３）　ｉｓｏＬＣＡ産生細菌株、３－ｏｘｏＬＣＡ産生細菌株、及びｉｓｏａｌｌｏＬＣＡ産生細菌株の同定
　次に、百寿者の細菌叢におけるｉｓｏＬＣＡ、３－ｏｘｏＬＣＡ、及びｉｓｏａｌｌｏＬＣＡの生合成に関与する細菌株と酵素の特定を試みた。
　以前の報告では、３－ｏｘｏ－Δ４－ＤＣＡ（３－ｏｘｏ－４、５－ｄｅｈｙｄｒｏ－ＤＣＡとも称される）から、Ｃ４－Ｃ５二重結合のＣ５のベータ位を水素化（ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｉｏｎ）することで３－ｏｘｏＤＣＡを生成できることが示されている。この反応は、Ｃ．ｓｃｉｎｄｅｎｓ及びＣ．ｈｙｌｅｍｏｎａｅを含む少数のクロストリジウム種が保有しているＢａｉＣＤ遺伝子によってコードされる３－ｏｘｏ－５β－ｓｔｅｒｏｉｄ　４－ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（５β　ｒｅｄｕｃｔａｓｅ、５ＢＲとも称される）によって触媒されると報告されている［２６，２７］。
　さらに、Ｅ．ｌｅｎｔａとＲ．ｇｎａｖａｓは、それぞれ３α－ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（３αＨＳＤＨ）と３βＨＳＤＨの作用により、ＤＣＡから３－ｏｘｏＤＣＡを生成し、３－ｏｘｏＤＣＡからｉｓｏＤＣＡを生成できることが報告されている［１８］。
　そこで、３－ｏｘｏＬＣＡ及びｉｓｏＬＣＡの生成は、３－ｏｘｏＤＣＡ及びｉｓｏＤＣＡ同様に、５ＢＲ、３αＨＳＤＨ及び３βＨＳＤＨが関与すると、下記に示すように仮定した。
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　一方、イソアロ胆汁酸の生成につながる生合成経路はこれまで報告されていない。本発明者らは、ｉｓｏａｌｌｏＬＣＡが３－ｏｘｏ－ａｌｌｏＬＣＡ中間体を介した５α－ｒｅｄｕｃｔａｓｅ（５ＡＲ）類似体と３βＨＳＤＨの連続作用によって３－ｏｘｏ－Δ４－ＬＣＡから生成される可能性があると予測した。５ＡＲは、Ｃ４－Ｃ５二重結合を水素化することにより、テストステロンから５α－ｄｉｈｙｄｒｏｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅへの変換を仲介し、それによってＡ及びＢステロイド環を平面（トランス）立体配座に歪めることが知られている（［２８］、下記　参照）。３－ｏｘｏａｌｌｏＬＣＡ（トランス胆汁酸）は、類似の経路を介して３－ｏｘｏ－Δ４－ＬＣＡから生じる可能性があると考えた。
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　また、３－ｏｘｏａｌｌｏＬＣＡからｉｓｏａｌｌｏＬＣＡへのその後の変換には、既に調べられている３－ｏｘｏＤＣＡからｉｓｏＤＣＡへの変換を担う３βＨＳＤＨが関与する可能性があることも予測した［１８］。
　ｉｓｏＬＣＡ、３－ｏｘｏＬＣＡ、及びｉｓｏａｌｌｏＬＣＡの生合成経路を検証し、加えて、それらの二次胆汁酸を産生する細菌株を特定するために、血液検査で大きな異常を示さず、便中のｉｓｏＬＣＡ、３－ｏｘｏＬＣＡ、及びｉｓｏａｌｌｏＬＣＡが高濃度を示した百寿者（ＣＥ９１、１１０歳以上）に絞り詳細な調査を行なった（図２Ａ）。
　具体的には先ず、ＣＥ９１の便検体を様々な培地で培養し、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子シーケンシングによって細菌コロニーを分析し、ＣＥ９１の細菌叢構造を大まかに再現した６８の特徴的な菌株の集合体を調製した（図３Ａ、及び表８～１１）。
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　次に、ＣＤＣＡ、ＬＣＡ、及び３－ｏｘｏ－Δ４－ＬＣＡのいずれかを出発基質として、個々の分離株をｐＨ７又はｐＨ９で培養し、４８時間後に培養上清を回収し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳで胆汁酸を定量した（図３Ｂ及び３Ｃ、並びに図１１Ａ～１１Ｆ）。
　その結果、ＣＤＣＡを基質とする培養では、どの培養上清においてもｉｓｏ－、３－ｏｘｏ－、又はｉｓｏａｌｌｏ－ＬＣＡは検出されなかったが、低レベルではあるが、既報［２７］にあるＣ．ｓｃｉｎｄｅｎｓ株５９－６０（Ｓｔ５９－６０）及びＣ．ｈｙｌｅｍｏｎａｅ　Ｓｔ６３がＬＣＡを産生することが確認出来た（図１１Ａ及び１１Ｂ）。
　ＬＣＡを基質として培養した場合、Ｇｏｒｄｏｎｉｂａｃｔｅｒ　ｐａｍｅｌａｅａｅ　Ｓｔ３２及びＥ．ｌｅｎｔａ　Ｓｔ３３－３５は、３－ｏｘｏＬＣＡ及びｉｓｏＬＣＡを生成したことから（図３Ｂ、並びに図１１Ｃ及び１１Ｄ）、以前の研究［１８］で予測されたように、これら菌株は、３αＨＳＤＨ及び３βＨＳＤＨを保有すると考えられた。
　さらに、Ｒａｏｕｌｉｂａｃｔｅｒ　ｔｉｍｏｎｅｎｓｉｓ　Ｓｔ３０－３１及びＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ　ｓｐｐ．Ｓｔ５７は、ＬＣＡを３－ｏｘｏＬＣＡに変換することもでき、これらの種がＥ．ｌｅｎｔａと同様に３αＨＳＤＨを持っていることが示唆された。
　３－ｏｘｏ－Δ４－ＬＣＡを基質として使用した場合、３－ｏｘｏＬＣＡは、Ｈｕｎｇａｔｅｌｌａ　ｈａｔｈｅｗａｙｉ　Ｓｔ５４－５５及びＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ　ｓｐｐ．Ｓｔ６２の培養上清で高レベルに蓄積したことから、これらの菌株が５ＢＲを持っていることが示唆された（図３Ｃ、並びに図１１Ｅ及び１１Ｆ）。
　同様に、ｉｓｏＬＣＡは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｉｎｎｏｃｕｕｍ　Ｓｔ５１及びＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ　ｓｐｐ．Ｓｔ５８の培養上清で３－ｏｘｏ－Δ４－ＬＣＡから高レベルで生成されたことから（図３Ｃ、並びに図１１Ｅ及び１１Ｆ）、これらの株が５ＢＲ及び３βＨＳＤＨを保有していることが示唆された。
　Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ　Ｓｔ４－５が、ＬＣＡを、３－ｏｘｏＬＣＡを経由して３－ｏｘｏ－Δ４－ＬＣＡに変換し（図３Ｂ、並びに図１１Ｃ及び１１Ｄ）、さらに、３－ｏｘｏ－Δ４－ＬＣＡからｉｓｏＬＣＡ及びＬＣＡに変換したこと（図３Ｃ、並びに図１１Ｅ及び１１Ｆ）は注目に値し、これらの株が３αＨＳＤＨ、３βＨＳＤＨ及び５ＢＲを保有していることが示唆された。
　以上のとおり、前記６８株において、少なくとも１２株が強力な３－ｏｘｏＬＣＡ生成能を有していることが明らかになった。また、８株は、ＬＣＡ又は３－ｏｘｏ－Δ４－ＬＣＡからｉｓｏＬＣＡへの生成能を有していることが明らかになった。
　驚くべきことに、３－ｏｘｏ－Δ４－ＬＣＡを基質とした培養で、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｍｅｒｄａｅ　Ｓｔ３、Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ　ｌａｎｅｕｓ　Ｓｔ１９、Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ　ｓｐｐ．Ｓｔ２１－２４で、ｉｓｏａｌｌｏＬＣＡの顕著な蓄積が認められ、加えて、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｄｏｒｅｉ　Ｓｔ６－７においても低いレベルではあるがｉｓｏａｌｌｏＬＣＡの蓄積が観察され（図３Ｃ、並びに図１１Ｅ及び１１Ｆ）、これらの菌株が５ＡＲ及び３βＨＳＤＨ活性の両方を保有していることが示唆される。
　さらに、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｇｏｌｄｓｔｅｉｎｉｉ　Ｓｔ１－２、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ　Ｓｔ９、Ｂ．Ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ　Ｓｔ１０－１３、Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ　ｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ　Ｓｔ１５－１６、Ａ．ｏｎｄｅｒｄｏｎｋｉｉ　Ｓｔ１７－１８、及びＯ．ｌａｎｅｕｓ　Ｓｔ２０の培養物は全て、推定される中間体である３－ｏｘｏａｌｌｏＬＣＡの十分な蓄積を示したが、その一方で、ｉｓｏａｌｌｏＬＣＡの蓄積レベルは非常に低かった（図３Ｃ、並びに図１１Ｅ及び１１Ｆ）、これらの菌株は、おそらく５ＡＲを保有している一方で、この培養条件では３βＨＳＤＨの活性を有していないか、又は不活性であると考えられる。
　したがって、合計２０のバクテロイデス株（Ｓｔ４、５、８、及び１４株を除くＳｔ１－２４株）は、３－ｏｘｏ－Δ４－ＬＣＡを３－ｏｘｏａｌｌｏＬＣＡに変換できることが明らかとなり、そのうちの８株は、ｉｓｏａｌｌｏＬＣＡを確実に生成できるということが判明した。
　注目すべきことに、ｐＨ７での培養と比較して、百寿者の腸環境を表すｐＨ９での培養は、３－ｏｘｏａｌｌｏＬＣＡ、ｉｓｏａｌｌｏＬＣＡ、ｉｓｏＬＣＡ、及び３－ｏｘｏＬＣＡの蓄積を増強したことから（図１１Ａ～１１Ｆ）、アルカリ性の環境が、これらの胆汁酸の生成に関与する酵素の活性又は発現を促進する可能性がある。
　（実施例４）　５ＡＲ及び３βＨＳＤＨが関与する、３－ｏｘｏ－Δ４－ＬＣＡからｉｓｏａｌｌｏＬＣＡへの変換
　予測される生合成経路、特に５ＢＲと３α－／３β－ＨＳＤＨとが、３－ｏｘｏ－Δ４－ＬＣＡから３－ｏｘｏＬＣＡとｉｓｏＬＣＡへの変換に関与し、５ＡＲと３βＨＳＤＨとが、ｉｓｏａｌｌｏＬＣＡの生成に関与するという仮説を検証するため、Ｍｉｓｅｑ及びＰａｃＢｉｏを統合的に用い、６８株全ての遺伝子をシーケンスした。
　これらのゲノム配列を照会すると、既報［１８］通り、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ株が、３αＨＳＤＨ遺伝子を保有することが明らかになった（図３Ｂ及び３Ｃ）。Ｐ．ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ　Ｓｔ４、５株は、３αＨＳＤＨと予測される遺伝子を保有していることが明らかになった。この結果は、胆汁酸代謝のｉｎ　ｖｉｔｒｏの評価結果と整合している。
　さらに、ヒト５ＡＲ（ｓｔｅｒｏｉｄ　５　ａｌｐｈａ－ｒｅｄｕｃｔａｓｅ　１，ＳＲＤ５Ａ１）と３０％以上のアミノ酸配列類似性を有する、オルソロガスな配列が、２１種のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ株で同定された（図３Ｂ～３Ｄ（カラー表示下、赤色で示す）、及び図１２）。
　次に、予測された５ＡＲ遺伝子座に直接隣接する遺伝子を解析した。その結果、２１株全てで、５ＢＲであると予測されるＮＡＤＨ：ｆｌａｖｉｎ　ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ配列を含む、胆汁酸代謝機能に関連する遺伝子のクラスターが見つかった（図３Ｂ～３Ｄ（カラー表示下、青色で示す）、及び図１２）。
　また、３βＨＳＤＨであると予測されるｓｈｏｒｔ－ｃｈａｉｎ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＳＤＲ）の配列も特定した。これらのＳＤＲ配列は２つのグループで構成されていた。グループＩはＰ．ｍｅｒｄａｅ　Ｓｔ３の３βＨＳＤＨと高い配列類似性（＞４０％）を示した。一方、グループＩＩは相互に関連していたが、Ｐ．ｍｅｒｄａｅ　Ｓｔ３の３βＨＳＤＨとは関連していなかった（図３Ｂ～３Ｄ（カラー表示下、グループＩは緑色で示し、グループ２は紫色で示す）、及び図１２）。
　さらに、遺伝子クラスターの近くに胆汁酸トランスポーターをコードしていると思われる配列を見出した（図１２）。
　以上のことから、Ｓｔ８株を除いて、５ＡＲ及び３βＨＳＤＨと予想される遺伝子の保有は、３－ｏｘｏ－Δ４－ＬＣＡからの３－ｏｘｏａｌｌｏＬＣＡ及び／又はｉｓｏａｌｌｏＬＣＡ産生に明らかに関連していることが判明した（図３Ｃ）。
　関連する生合成経路をさらに解明するために、３－ｏｘｏａｌｌｏＬＣＡ、３－ｏｘｏＬＣＡ又はｉｓｏＬＣＡを基質として２４種のＢａｃｔｅｒｏｉｄａｌｅｓ分離株を培養し、それぞれの胆汁酸変換能力をｉｎ　ｖｉｔｒｏで調べた（図１３Ａ～１３Ｄ）。
　その結果、胆汁酸の転換効率は、基質特異性と菌株間とで差がみられたが、胆汁酸転化のパターンは、基本的に予測された経路と一致していた。例えば、Ｐ．ｍｅｒｄａｅ　Ｓｔ３、Ｐ．ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ　Ｓｔ４－５、Ｂ．ｄｏｒｅｉ　Ｓｔ７及びＯｄｏｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ　Ｓｔ２１は、強力な３βＨＳＤＨ活性を示し、３－ｏｘｏａｌｌｏＬＣＡからのｉｓｏａｌｌｏＬＣＡ産生と３－ｏｘｏＬＣＡからのｉｓｏＬＣＡ生成を示す一方で（図１３Ｂ）、Ｂ．ｄｏｒｅｉ　Ｓｔ６やＢ．ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ　Ｓｔ１０－１３等の他のいくつかの株の活性は、推定３βＨＳＤＨ遺伝子の有無に関わらず、低かった（図１３Ａ及び１３Ｂ）。
　５ＢＲ活性の強さも菌株間で異なった。Ｐ．ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ　Ｓｔ４－５及びＢ．ｄｏｒｅｉ　Ｓｔ７は、３－ｏｘｏＬＣＡを３－ｏｘｏ－Δ４－ＬＣＡに効率的に変換したが、他の菌株は中程度から弱い活性を示した（図１３Ｂ）。
　Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｓｏｍｅｒａｅ　Ｓｔ１４は、推定５ＡＲ及び３βＨＳＤＨ遺伝子を欠いている一方で、３－ｏｘｏａｌｌｏＬＣＡからｉｓｏａｌｌｏＬＣＡを生成することができるため（図１３Ａ）、３βＨＳＤＨ活性を有する株特異的遺伝子を保有していることが示唆される。
　異なる遺伝子を持つ分離株が、胆汁酸を協調的に代謝できるかどうかを調べるために、ＬＣＡの存在下、Ｅ．ｌｅｎｔａ　Ｓｔ３４（３αＨＳＤＨ、３βＨＳＤＨを持つ）又はＰ．ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ　Ｓｔ４（３αＨＳＤＨ、３βＨＳＤＨ、５ＢＲを持つ）と、Ｐ．ｍｅｒｄａｅ　Ｓｔ３又はＯｄｏｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ　Ｓｔ２１（５ＢＲ、５ＡＲ、３βＨＳＤＨを持つ）との共培養を行なった。
　その結果、全ての組み合わせにおいて、ｉｓｏａｌｌｏＬＣＡが協調的に生産され、Ｅ．ｌｅｎｔａ　Ｓｔ３４とＰ．ｍｅｒｄａｅ　Ｓｔ３との共培養で最高の収量が認められた（図１３Ｄ）。
　以上のことから、酵素活性、基質特異性、及び遺伝子座において、株間に差が認められたものの、上記で特定されたバクテロイデスの遺伝子群は、胆汁酸の協調的産生に寄与する可能性があり、少なくとも、百寿者にみられる独特の糞便中胆汁酸の組成分布に関与している可能性がある。
　細菌叢を介した胆汁酸代謝における５ＡＲ及び３βＨＳＤＨの役割をさらに確認するために、Ｐ．ｍｅｒｄａｅとＯｄｏｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅの変異株を作製した。
　Ｐ．ｍｅｒｄａｅ　Ｓｔ３株に関して、接合を介したプラスミド導入とｒｈａｍｎｏｓｅ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｓｓＢｆｅ１　ｃａｓｓｅｔｔｅを用いたｄｏｕｂｌｅ－ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ　ｒｅｓｏｌｖｅｎｔｓの選択により推定５ＡＲ（ＰＭ３８０６）、３βＨＳＤＨ（ＰＭ３８０４）、又は５ＢＲ（ＰＭ３８０５）をコードする遺伝子を欠く３つの変異体の作製に成功した（［２９］、　図１４Ａ及び１４Ｂ）。
　その結果、予想通り、３－ｏｘｏ－Δ４－ＬＣＡを基質として培養した場合、Ｐ．ｍｅｒｄａｅΔ５ＡＲは、３－ｏｘｏａｌｌｏＬＣＡ、ｉｓｏａｌｌｏＬＣＡのいずれも生成することができなかった。Ｐ．ｍｅｒｄａｅΔ３βＨＳＤＨは、３－ｏｘｏａｌｌｏＬＣＡを生成する一方でｉｓｏａｌｌｏＬＣＡは生成できなかった（図３Ｆ）。
　３－ｏｘｏａｌｌｏＬＣＡを基質とした場合、Ｐ．ｍｅｒｄａｅΔ５ＡＲは、その親株（野生株）同様にｉｓｏａｌｌｏＬＣＡを生成したが、Ｐ．ｍｅｒｄａｅΔ３βＨＳＤＨはｉｓｏａｌｌｏＬＣＡを生成しなかった（図３Ｆ）。
　さらに、Ｐ．ｍｅｒｄａｅΔ３βＨＳＤＨは、３－ｏｘｏＬＣＡをｉｓｏＬＣＡに変換できなかったことがら、３βＨＳＤＨがｔｒａｎｓ－とｃｉｓ－両方の胆汁酸を基質として利用できることが確認された。Ｐ．ｍｅｒｄａｅΔ５ＢＲは、３－ｏｘｏ－Δ４－ＬＣＡ又は３－ｏｘｏａｌｌｏＬＣＡからｉｓｏａｌｌｏＬＣＡを生成したが、３－ｏｘｏＬＣＡから３－ｏｘｏ－Δ４－ＬＣＡに変換することができなかった（図３Ｆ）。
　以上のことから、ヒト腸内細菌叢によるｉｓｏａｌｌｏＬＣＡ、３－ｏｘｏＬＣＡ、及びｉｓｏＬＣＡの生成に、５ＡＲ、３βＨＳＤＨ、及び５ＢＲが関与していることが裏付けられた。
　（実施例５）　グラム陽性病原菌に対する、ｉｓｏａｌｌｏＬＣＡの殺菌効果
　二次胆汁酸は、宿主の代謝及び免疫応答の調節（制御性Ｔ細胞の誘導を含む、［２５，３０～３５］）や腸管における病原菌の増殖の防止［３６～３９］等、いくつかの生物学的に重要な役割を果たすことが知られている。特に、ＤＣＡ、ＬＣＡ、及びｉｓｏＬＣＡは、最も緊急対策が必要な抗生物質耐性菌であるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ　ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの増殖の阻害に関与することが知られている［３６，４０，４１］。
　そこで次に、３－ｏｘｏＬＣＡとｉｓｏａｌｌｏＬＣＡが、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの増殖を阻害する能力を有するかどうかを調べた。具体的には、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ　６３０を、様々な濃度のｉｓｏＬＣＡ、３－ｏｘｏＬＣＡ、ｉｓｏａｌｌｏＬＣＡ、３－ｏｘｏａｌｌｏＬＣＡ、ＬＣＡ、ＤＣＡ、又は対照群存在下で培養し、光学密度測定を用いてｉｎ　ｖｉｔｒｏでの増殖を経時的に追跡した。
　その結果、驚くべきことに、ｉｓｏａｌｌｏＬＣＡは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ　６３０の増殖を強力に阻害した（図４Ａ及び４Ｂ、並びに図１３Ａ及び１３Ｂ）。ＷＣＡ培地で９０％以上の増殖を防ぐために必要な最小発育阻止濃度（ＭＩＣ９０）は２．０μＭであり、試験を行った他の胆汁酸の濃度をはるかに下回っていた（図４Ａ及び４Ｂ、並びに図１３Ａ）。ｉｓｏａｌｌｏＬＣＡによる強力な増殖阻害は、毒素産生性Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ　ＶＰＩ１０４６３及びバンコマイシン耐性Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃｉｕｍ（ＶＲＥ）でも認められた（図４Ａ及び４Ｂ、並びに図１３Ａ及び１３Ｂ）。
　また、走査型及び透過型電子顕微鏡を用いた観察によって、ｉｓｏａｌｌｏＬＣＡは殺菌性を有し、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ　６３０及びＶＲＥにおける、細胞壁の崩壊、腫れ、及び複数の壁貫通を含む、形態学的変化及び超微細構造の変化をもたらすことが明らかになった（図４Ｃ）。なお、これらの損傷のパターンは、β－ラクタム系抗生物質でしばしば観察される［４２］。
　３－ｏｘｏ－Δ４－ＬＣＡを補給した状態での、Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ　Ｓｔ２１との共培養では、ｉｓｏａｌｌｏＬＣＡ処理同様に、有意なＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ６３０及びＶＲＥの増殖阻害をもたらした（図４Ｄ）。
　対照的に、Ｃ．ｉｎｎｏｃｕｕｍ　Ｓｔ５１（ｉｓｏＬＣＡ産生菌）又はＰ．　ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ　Ｓｔ４（ｉｓｏＬＣＡ及びＬＣＡ産生菌）と共培養を行った場合、制菌効果は観察されなかった。
　次に、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ　ｓｕｂｓｐ．　ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ（ＳＤＳＥ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓａｎｇｕｉｎｉｓ、及びＢａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ　を含むグラム陽性の病原菌、並びに、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｅｎｔｅｒｉｃａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ、及びＰｒｏｔｅｕｓ　ｍｉｒａｂｉｌｉｓを含むグラム陰性の病原菌に対するｉｓｏａｌｌｏＬＣＡの効果を調べた。なお、Ｓ．ａｕｒｅｕｓは有名な皮膚病原菌であるが、腸にコロニーを形成することが多く、殆どの胆汁酸に耐性があることが知られてる［４３］。
　ＩｓｏａｌｌｏＬＣＡは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓを含む、試験した全てのグラム陽性の病原菌の増殖を強く阻害し、ＭＩＣ９０値は、ＷＣＡ培地で０．５～３μＭ、ＢＨＩ培地で３～６．２５μＭの範囲となった（図４Ａ及び４Ｂ、並びに図１５Ａ及び１５Ｂ）。
　対照的に、グラム陰性病原菌パネルの全ての細菌は、試験した最高濃度（５０μＭ）でもｉｓｏａｌｌｏＬＣＡに対する耐性が認められた（図４Ａ及び４Ｂ、並びに図１５Ａ及び１５Ｃ）。
　以上の結果から、ｉｓｏａｌｌｏＬＣＡは、特にグラム陽性の病原菌に対して細菌の細胞壁に干渉することで、強力な殺菌／静菌効果を発揮することが示唆される。また、ｉｓｏａｌｌｏＬＣＡはＳ．ａｕｒｅｕｓを病原菌とするアトピー性皮膚炎等の皮膚疾患への予防、治療効果を発揮することも示唆される。
　（実施例６）　片利共生的な腸内細菌叢へのｉｓｏａｌｌｏＬＣＡの影響
　腸内代謝物は、腸内の病原菌だけでなく、共生細菌にも遭遇するため、ｉｓｏａｌｌｏＬＣＡがヒト腸内細菌叢の一般的な細菌にどのように影響するかを調べた。
　グラム陽性菌とグラム陰性菌の双方からなる合計４２の一般的な腸内細菌叢を構成する細菌を培養コレクションから選択し、それぞれをＷＣＡ及びＢＨＩ培地でｉｓｏａｌｌｏＬＣＡの濃度を上げながら培養した。
　その結果、ＩｓｏａｌｌｏＬＣＡは、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ等の殆どのグラム陰性共生菌の成長にそれほど影響を与えなかった（図４Ｅ及び図１６Ａ）。
　対照的に、グラム陽性共生菌の成長を確実に妨害した（図４Ｅ及び図１６Ａ）。ただし、共生菌株のＭＩＣ９０値は、一般に病原菌の値よりも高くＣ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ、Ｃ．ｉｎｄｏｌｉｓ、及びＣ．ＨＧＦ２（ｉｎｎｏｃｕｕｍ）は２．５μＭのｉｓｏａｌｌｏＬＣＡ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ　１．２５倍のＭＩＣ９０値）で培養した場合でも、走査型電子顕微鏡観察において、共生菌の細胞壁構造は維持されていることがはっきりと認められた（図１６Ｂ）。特に、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株は、ｉｓｏａｌｌｏＬＣＡの阻害効果に対して非常に耐性を有していることが明らかになった（図４Ｅ）。
　さらに、ペプトン及びアミノ酸が豊富なＢＨＩ培地で共生菌株を培養すると、ＷＣＡ培地で培養した場合と比較して、ｉｓｏａｌｌｏＬＣＡに対する耐性が増加したが、病原菌は、培地に関係なく感受性を概して維持していた（図４Ａ、４Ｅ、及び図１７）。
　以上の結果から、ｉｓｏａｌｌｏＬＣＡが、グラム陽性菌に対して殺菌効果を発揮する濃度は環境条件に依存するものの、病原菌は、常に共生菌よりも感受性が高いことが示された。
　さらに、複雑な通常の腸内細菌叢に対するｉｓｏａｌｌｏＬＣＡの影響を評価するために、ｉｓｏａｌｌｏＬＣＡ、３－ｏｘｏＬＣＡ、ＬＣＡ、又は対照系を使用して、若くて健康な試料提供者からのヒト糞便細菌叢を培養し、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子シーケンシングにより菌叢の変化を分析した。
　その結果、α多様性は大きな影響を受けなかったが、ｉｓｏａｌｌｏＬＣＡは、門レベルで細菌のコミュニティー構造に明らかな幅広い変化をもたらした（図４Ｆ及び４Ｇ）。
　他の胆汁酸化合物と比較して、ｉｓｏａｌｌｏＬＣＡとの培養後、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍやＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ等のグラム陽性菌のより顕著な減少と、それに対応するＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓやＡｌｉｓｔｉｐｅｓ等のグラム陰性菌の増加が観察された。（図４Ｇ）。
　これらの結果は、百寿者の腸内細菌叢に見られるＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓとＡｌｉｓｔｉｐｅｓの相対的な存在量の増加と一致しており、ｉｓｏａｌｌｏＬＣＡが腸内細菌のコミュニティー構造に直接影響を与える可能性があることが示される。
　５ＡＲ、５ＢＲ、及び３βＨＳＤＨが特徴的な二次胆汁酸誘導体の生産に重要な役割を果たすことが確認できたことから、日本の百寿者のメタゲノム配列データに戻り、これらの遺伝子を持つ他の種を調べた。その結果、５ＡＲ、５ＢＲ、及び３βＨＳＤＨ遺伝子群は、３５種の細菌（全てＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）で検出された（図１８）。そして、これらの細菌種の存在量を、ｉｓｏＬＣＡ、３－ｏｘｏＬＣＡ、及びｉｓｏａｌｌｏＬＣＡの存在量に関連付けて評価した。
　その結果、ｉｓｏａｌｌｏＬＣＡの場合、多数のＡｌｉｓｔｉｐｅｓ　ｓｐ．、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｉｔｙｃｕｓ、Ｂ．ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、及びＰ．ｇｏｌｄｓｔｅｉｎｉｉとの有意な正の相関が認められた。さらに、これらの種は、ｉｓｏＬＣＡ及び３－ｏｘｏＬＣＡのレベルとも正の相関が認められた（図１８）。
　対照的に、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｖｕｌｇａｔｕｓとＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｏｖａｔｕｓについては、試験した３つの二次胆汁酸と有意に負の相関が認められた。Ｏ．ｌａｎｅｕｓは、３－ｏｘｏＬＣＡ、ｉｓｏＬＣＡ、及びｉｓｏａｌｌｏＬＣＡと有意又はトレンドレベルの正の相関を示したが、Ｐ．ｍｅｒｄａｅとこれらの胆汁酸との有意な関連は認められなかった（図１８）。
　これらの結果から、同定された遺伝子の発現と活性が、ｉｎ　ｖｉｖｏでの種特異的及び腸内環境依存的（おそらく細菌間及び細菌－宿主相互作用を含む）な複雑な機序を介して調節されていることが示唆される。
　上述のとおり、本実施例において、百歳以上の腸内細菌叢のシグネチャを識別し、ｉｓｏＬＣＡ、３－ｏｘｏＬＣＡ、及びｉｓｏａｌｌｏＬＣＡの生成を促進する細菌種と遺伝子／経路を同定することに成功した。
　ｉｓｏａｌｌｏＬＣＡは、Ｔｒｅｇ細胞を誘導し、３－ｏｘｏＬＣＡ及びｉｓｏＬＣＡはＴｈｅｌｐｅｒ１７（ＴＨ１７）細胞を抑制することが報告されており［３０］、これらの胆汁酸の蓄積は、過剰な免疫反応や炎症から保護する可能性がある。
　今回及び以前の研究［１～３］に参加した百寿者は、免疫系の異常な活性化と免疫老化に関連すると考えられている代謝性疾患やがん等の慢性疾患を患っていないことは、前記可能性を裏付けるものである［１２］。
　また、既報の抗炎症特性に加え、ｉｓｏａｌｌｏＬＣＡはグラム陽性病原菌に対して非常に強力な抗菌効果も発揮することが、本実施例において明らかになった。胆汁酸が腸内病原性細菌感染に対する防御に寄与することが報告されている［３６，４４，４５］。しかしながら、ｉｓｏａｌｌｏＬＣＡは、多剤耐性病原菌を含むグラム陽性菌に対し、高い特異性を示す最も強力な抗菌剤として機能することが明らかになった。
　本実施例から、ｉｓｏａｌｌｏＬＣＡがグラム陽性病原菌に対する定着阻害を促進することが、寿命に寄与する潜在的な要因となり得ることが示唆される。
　ｉｓｏａｌｌｏＬＣＡ、ｉｓｏＬＣＡ、又は３－ｏｘｏＬＣＡを生成する細菌の増加が長寿の結果、寿命に寄与するかに関係なく、これらの胆汁酸は健康状態を監視し、寿命を予測するバイオマーカーとして使用できる。
　さらに、本実施例で特定された細菌株のユニークな胆汁酸代謝能力を利用して、胆汁酸プールを論理的に操作し、究極的には、抗生物質耐性Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、ＶＲＥ、ＭＲＳＡ等のグラム陽性病原菌によって引き起こされる感染症を改善することが可能となる。
　（実施例７）　腸内細菌のテストステロン代謝への影響
　本発明者らは、上述のとおり、３－ｏｘｏ－Δ４－ＬＣＡから３－ｏｘｏａｌｌｏＬＣＡへの還元に関与する、細菌及びそれらが産生する酵素（５ＡＲ）を見出した。また、（実施例３）にて示したとおり、ヒトの５ＡＲは、テストステロン（ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ）から５α－ｄｉｈｙｄｒｏｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ（ＤＨＴ）への酵素的還元を触媒することが知られており、前記３－ｏｘｏａｌｌｏＬＣＡへの還元に類似している。そこで、本発明者らは、この類似性に着目し、下記に示すとおり、上述の細菌由来の酵素は、テストステロンの代謝にも関与し得るのではないかと予測した。
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　そこで、上述の細菌由来酵素の、ステロイドホルモン（テストステロン等）代謝能について、上述のＰ．ｍｅｒｄａｅ　Ｓｔ３、Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ　Ｓｔ２１－２４、及びそれらの酵素欠失変異体を用いて検証した。
　その結果、テストステロンの添加によって、野生型株においては、ＤＨＴと３β－ａｎｄｒｏｓｔａｎｅｄｉｏｌ（ｉｓｏａｌｌｏＬＣＡに相当）の産生がもたらされた。しかしながら、Ｐ．ｍｅｒｄａｅΔ５ＡＲはそれらを産生することができなかった。その代わり、Ｐ．ｍｅｒｄａｅΔ５ＡＲにおいては、アンドロステンジオンの蓄積が検出された（図１９Ａ）。
　また、テストステロン存在下、Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ　Ｓｔ２１－２４をｉｎ　ｖｉｔｒｏで培養すると、テストステロンは直ちにＤＨＴに変換され、その後インキュベーション３～１２時間以内に３β－ａｎｄｒｏｓｔａｎｅｄｉｏｌに変換されることが明らかになった（図１９Ｂ）。
　Ｐ．ｍｅｒｄａｅと比較して、Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ　Ｓｔ２１－２４の強い３βＨＳＤＨ酵素活性が、ＤＨＴの添加により検出された。Ｐ．ｍｅｒｄａｅは代謝産物を産生しなかったが、Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ　Ｓｔ２１－２はインキュベーション３時間以内に多量の代謝産物の産生を示した（図１９Ｃ）。
　また、試験した全ての株で、ＤＨＴから、３α－ａｎｄｒｏｓｔａｎｅｄｉｏｌよりも３β－ａｎｄｒｏｓｔａｎｅｄｉｏｌへの優先的な代謝反応が観察された（図１９Ａ～１９Ｃ）。加えて、テストステロンは、１７βＨＳＤＨの機能を有する酵素の存在が推定されるＰ．ｍｅｒｄａｅとＯｄｏｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ　Ｓｔ２１－２４によって、アンドロステンジオンに酸化された。
　前立腺がんは男性のがんによる死亡原因の第５位であり、２０１８年には全世界で推定１２０万例の新たな発症が報告されている［６１］。前立腺がんにおける腫瘍の進行は、腺細胞におけるアンドロゲン受容体（ＡＲ）シグナル伝達を介する。現在、アンドロゲン遮断療法は、前立腺がん細胞を抑制するために精巣のアンドロゲン濃度を低下させる主要な治療法として用いられているが、患者の大部分は最終的にホルモン不応性腫瘍を発症する［６２］。テストステロンとＤＨＴはともにＡＲのリガンドであるが、ＤＨＴはより強力なアンドロゲンであり、高い親和性でＡＲに結合する［２８］。３βＨＳＤＨにより代謝される３β‐アンドロスタンジオールはＡＲに結合せずにエストロゲン受容体β（ＥＲβ）を活性化し、Ｅ‐カドヘリン発現を低下させることにより前立腺がん細胞移動を阻害することが報告されている［６３，６４］。
　腸内細菌叢とステロイドホルモン代謝におけるその役割に関し、上記のとおり、本発明者らは、百歳以上の長寿者から分離したＯｄｏｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ株が、テストステロンとＤＨＴを３β‐アンドロスタンジオールに迅速に代謝する能力を有していることを証明した。
　このように、Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ株は、おそらく転移抵抗性である３β－アンドロスタンジオールを生成しながら、腫瘍誘発性テストステロン及びＤＨＴを枯渇させることによって、前立腺がんにおける治療的役割を有する可能性がある。
　Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ株によるＤＨＴの迅速な変換は、男性ホルモン性脱毛症、多嚢胞性卵巣症候群、にきび、男性型多毛症等の抗アンドロゲン治療を必要とする様々な疾患の治療の可能性が存在する［６５］。
　さらに、ＥＲβの３β－アンドロスタンジオールの活性化は、卵巣内皮がんに対して増殖阻害作用と化学療法増強作用を有し［６６］、乳がん細胞におけるＥＲβの活性化については、一般的に疾患の進行に対して抗増殖作用を有すると考えられている［６７］。
　Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ株のホルモン作用の他に、これらの株が産生する３β‐アンドロスタンジオールは神経ステロイドとしての治療の可能性も有している［６８，６９］。
　結論として、Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ株のような特定の腸内細菌叢により生成されるテストステロン由来代謝産物のホルモン及び神経化学的効果が期待でき、それがヒトの健康を改善するための形質転換療法（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｖｅ　ｔｈｅｒａｐｙ）につながる可能性がある。
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９．Ｎｉｃｏｌｅｔｔｉ，　Ｃ．　Ａｇｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｂａｒｒｉｅｒ：　Ｌｏｃａｌ　ａｎｄ　ｓｙｓｔｅｍｉｃ　ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．　Ｅｘｐｅｒｔ　Ｒｅｖ．　Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．　Ｈｅｐａｔｏｌ．　９，　１４６７～１４６９　（２０１５）．
１０．Ｈｕａｎｇ，　Ｚ．　＆　Ｋｒａｕｓ，　Ｖ．　Ｂ．　Ｄｏｅｓ　ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ　ｈａｖｅ　ａ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ＯＡ？　Ｎａｔ．　Ｒｅｖ．　Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．　１２，　１２３～１２９　（２０１６）．
１１．Ｍｏｒａｉｓ，　Ｌ．　Ｈ．，　Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，　Ｈ．　Ｌ．　＆　Ｍａｚｍａｎｉａｎ，　Ｓ．　Ｋ．　Ｔｈｅ　ｇｕｔ　ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ‐ｂｒａｉｎ　ａｘｉｓ　ｉｎ　ｂｅｈａｖｉｏｕｒ　ａｎｄ　ｂｒａｉｎ　ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．　Ｎａｔ．　Ｒｅｖ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　（２０２０）．
１２．Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉ，　Ｃ．，　Ｇａｒａｇｎａｎｉ，　Ｐ．，　Ｐａｒｉｎｉ，　Ｐ．，　Ｇｉｕｌｉａｎｉ，　Ｃ．　＆　Ｓａｎｔｏｒｏ，　Ａ．　Ｉｎｆｌａｍｍａｇｉｎｇ：　ａ　ｎｅｗ　ｉｍｍｕｎｅ～ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　ｖｉｅｗｐｏｉｎｔ　ｆｏｒ　ａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄ　ｄｉｓｅａｓｅｓ．　Ｎａｔ．　Ｒｅｖ．　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．　１４，　５７６～５９０　（２０１８）．
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２１．Ｌｉ，　Ｆ．，　Ｈｕｌｌａｒ，　Ｍ．　Ａ．　Ｊ．，　Ｓｃｈｗａｒｚ，　Ｙ．　＆　Ｌａｍｐｅ，　Ｊ．　Ｗ．　Ｈｕｍａｎ　ｇｕｔ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ　ａｒｅ　ａｌｔｅｒｅｄ　ｂｙ　ａｄｄｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｒｕｃｉｆｅｒｏｕｓ　ｖｅｇｅｔａｂｌｅｓ　ｔｏ　ａ　ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　ｆｒｕｉｔ－　ａｎｄ　ｖｅｇｅｔａｂｌｅ－ｆｒｅｅ　ｄｉｅｔ．　Ｊ．　Ｎｕｔｒ．　１３９，　１６８５～１６９１　（２００９）．
２２．Ｄｕｎｃａｎ，　Ｓ．　Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｒｅｄｕｃｅｄ　ｄｉｅｔａｒｙ　ｉｎｔａｋｅ　ｏｆ　ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ　ｂｙ　ｏｂｅｓｅ　ｓｕｂｊｅｃｔｓ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｉｎ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｂｕｔｙｒａｔｅ　ａｎｄ　ｂｕｔｙｒａｔｅ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｉｎ　ｆｅｃｅｓ．　Ａｐｐｌ．　Ｅｎｖｉｒｏｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　７３，　１０７３～１０７８　（２００７）．
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２５．Ｗａｈｌｓｔｒｏｍ，　Ａ．，　Ｓａｙｉｎ，　Ｓ．　Ｉ．，　Ｍａｒｓｃｈａｌｌ，　Ｈ．－Ｕ．　Ｕ．　＆　Ｂａｃｋｈｅｄ，　Ｆ．　Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｃｒｏｓｓｔａｌｋ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｂｉｌｅ　ａｃｉｄｓ　ａｎｄ　ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ　ａｎｄ　Ｉｔｓ　ｉｍｐａｃｔ　ｏｎ　ｈｏｓｔ　ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．　Ｃｅｌｌ　Ｍｅｔａｂ．　２４，　４１～５０　（２０１６）．
２６．Ｆｕｎａｂａｓｈｉ，　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．　Ａ　ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　ｐａｔｈｗａｙ　ｆｏｒ　ｂｉｌｅ　ａｃｉｄ　ｄｅｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｇｕｔ　ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ．　Ｎａｔｕｒｅ　５８２，　５６６～５７０　（２０２０）．
２７．Ｒｉｄｌｏｎ，　Ｊ．　Ｍ．，　Ｋａｎｇ，　Ｄ．　Ｊ．　＆　Ｈｙｌｅｍｏｎ，　Ｐ．　Ｂ．　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｂｉｌｅ　ａｃｉｄ　ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　７α－ｄｅｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｎｇ　ｏｐｅｒｏｎ　ｉｎ　Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｈｙｌｅｍｏｎａｅ　ＴＮ２７１．　Ａｎａｅｒｏｂｅ　（２０１０）．
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３１．Ｃａｍｐｂｅｌｌ，　Ｃ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　ｏｆ　ｂｉｌｅ　ａｃｉｄｓ　ｐｒｏｍｏｔｅｓ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｔ　ｃｅｌｌｓ．　Ｎａｔｕｒｅ　５８１，　４７５～４７９　（２０２０）．
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３５．Ｃｈｅｎ，　Ｍ．　Ｌ．，　Ｔａｋｅｄａ，　Ｋ．　＆　Ｓｕｎｄｒｕｄ，　Ｍ．　Ｓ．　Ｅｍｅｒｇｉｎｇ　ｒｏｌｅｓ　ｏｆ　ｂｉｌｅ　ａｃｉｄｓ　ｉｎ　ｍｕｃｏｓａｌ　ｉｍｍｕｎｉｔｙ　ａｎｄ　ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．　Ｍｕｃｏｓａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１２，　８５１～８６１　（２０１９）．
３６．Ｂｕｆｆｉｅ，　Ｃ．　Ｇ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ　ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ　ｒｅｓｔｏｒｅｓ　ｂｉｌｅ　ａｃｉｄ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｔｏ　Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ．　Ｎａｔｕｒｅ　５１７，　２０５～２０８　（２０１５）．
３７．Ｂｅｇｌｅｙ，　Ｍ．，　Ｇａｈａｎ，　Ｃ．　Ｇ．　Ｍ．　＆　Ｈｉｌｌ，　Ｃ．　Ｔｈｅ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ａｎｄ　ｂｉｌｅ．　ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｒｅｖ．　２９，　６２５～６５１　（２００５）．
３８．Ｓｕｎｇ，　Ｊ．　Ｙ．，　Ｓｈａｆｆｅｒ，　Ｅ．　Ａ．　＆　Ｃｏｓｔｅｒｔｏｎ，　Ｊ．　Ｗ．　Ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｂｉｌｅ　ｓａｌｔｓ　ａｇａｉｎｓｔ　ｃｏｍｍｏｎ　ｂｉｌｉａｒｙ　ｐａｔｈｏｇｅｎｓ　－　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ　ａｎｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｒｅｓｅｎｃｅ　ｏｆ　ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ．　Ｄｉｇ．　Ｄｉｓ．　Ｓｃｉ．　３８，　２１０４～２１１２　（１９９３）．
３９．Ｕｒｄａｎｅｔａ，　Ｖ．　＆　Ｃａｓａｄｅｓｕｓ，　Ｊ．　Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ａｎｄ　ｂｉｌｅ　ｓａｌｔｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ａｎｄ　ｈｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙ　ｔｒａｃｔｓ．　Ｆｒｏｎｔ．　Ｍｅｄ．　４，　１６３　（２０１７）．
４０．Ｔｈａｎｉｓｓｅｒｙ，　Ｒ．，　Ｗｉｎｓｔｏｎ，　Ｊ．　Ａ．　＆　Ｔｈｅｒｉｏｔ，　Ｃ．　Ｍ．　Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｐｏｒｅ　ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ，　ｇｒｏｗｔｈ，　ａｎｄ　ｔｏｘｉｎ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ　ｒｅｌｅｖａｎｔ　Ｃ．　ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｂｙ　ｇｕｔ　ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｓｅｃｏｎｄａｒｙ　ｂｉｌｅ　ａｃｉｄｓ．　Ａｎａｅｒｏｂｅ　４５，　８６～１００　（２０１７）．
４１．Ａｂｔ，　Ｍ．　Ｃ．，　ＭｃＫｅｎｎｅｙ，　Ｐ．　Ｔ．　＆　Ｐａｍｅｒ，　Ｅ．　Ｇ．　Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ　ｃｏｌｉｔｉｓ：　Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ　ａｎｄ　ｈｏｓｔ　ｄｅｆｅｎｃｅ．　Ｎａｔ．　Ｒｅｖ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　１４，　６０９～６２０　（２０１６）．
４２．Ｃｕｓｈｎｉｅ，　Ｔ．　Ｐ．　Ｔ．，　Ｏ’Ｄｒｉｓｃｏｌｌ，　Ｎ．　Ｈ．　＆　Ｌａｍｂ，　Ａ．　Ｊ．　Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｎｄ　ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｉｎ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｃｅｌｌｓ　ａｓ　ａｎ　ｉｎｄｉｃａｔｏｒ　ｏｆ　ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ａｃｔｉｏｎ．　Ｃｅｌｌ．　Ｍｏｌ．　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉ．　７３，　４４７１～４４９２　（２０１６）．
４３．Ｐｉｅｗｎｇａｍ，　Ｐ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｐａｔｈｏｇｅｎ　ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ　ｂｙ　ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｖｉａ　ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ．　Ｎａｔｕｒｅ　５６２，　５３２～５３７　（２０１８）．
４４．Ｔｈｅｒｉｏｔ，　Ｃ．　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｓｈｉｆｔｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｍｏｕｓｅ　ｇｕｔ　ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ　ａｎｄ　ｍｅｔａｂｏｌｏｍｅ　ｉｎｃｒｅａｓｅ　ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ　ｔｏ　Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．　Ｎａｔ．　Ｃｏｍｍｕｎ．　５，　３１１４　（２０１４）．
４５．Ａｌａｖｉ，　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｉｎｔｅｒｐｅｒｓｏｎａｌ　Ｇｕｔ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ　Ｖａｒｉａｔｉｏｎ　Ｄｒｉｖｅｓ　Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ　ａｎｄ　Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｔｏ　Ｃｈｏｌｅｒａ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．　Ｃｅｌｌ　１８１，　１５３３－１５４６．ｅ１３　（２０２０）．
４６．Ｌｉ，　Ｄ．，　Ｌｉｕ，　Ｃ．　Ｍ．，　Ｌｕｏ，　Ｒ．，　Ｓａｄａｋａｎｅ，　Ｋ．　＆　Ｌａｍ，　Ｔ．　Ｗ．　ＭＥＧＡＨＩＴ：　Ａｎ　ｕｌｔｒａ－ｆａｓｔ　ｓｉｎｇｌｅ－ｎｏｄｅ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｌａｒｇｅ　ａｎｄ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃｓ　ａｓｓｅｍｂｌｙ　ｖｉａ　ｓｕｃｃｉｎｃｔ　ｄｅ　Ｂｒｕｉｊｎ　ｇｒａｐｈ．　Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　３１，　１６７４～１６７６　（２０１５）．
４７．Ｈｙａｔｔ，　Ｄ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｐｒｏｄｉｇａｌ：　Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｇｅｎｅ　ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ　ｓｉｔｅ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ．　ＢＭＣ　Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　１１，　１１９　（２０１０）．
４８．Ｆｕ，　Ｌ．，　Ｎｉｕ，　Ｂ．，　Ｚｈｕ，　Ｚ．，　Ｗｕ，　Ｓ．　＆　Ｌｉ，　Ｗ．　ＣＤ－ＨＩＴ：　Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ　ｆｏｒ　ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｄａｔａ．　Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　２８，　３１５０～３１５２　（２０１２）．
４９．Ｑｉｎ，　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．　Ａ　ｈｕｍａｎ　ｇｕｔ　ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｇｅｎｅ　ｃａｔａｌｏｇｕｅ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ｂｙ　ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．　Ｎａｔｕｒｅ　４６４，　５９～６５　（２０１０）．
５０．Ｌｉ，　Ｈ．　＆　Ｄｕｒｂｉｎ，　Ｒ．　Ｆａｓｔ　ａｎｄ　ａｃｃｕｒａｔｅ　ｓｈｏｒｔ　ｒｅａｄ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｗｉｔｈ　Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍ．　Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　２５，　１７５４～１７６０　（２００９）．
５１．Ｏｎａｔｅ，　Ｆ．　Ｐ．　ｅｔ　ａｌ．　ＭＳＰｍｉｎｅｒ：　Ａｂｕｎｄａｎｃｅ－ｂａｓｅｄ　ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｐａｎ－ｇｅｎｏｍｅｓ　ｆｒｏｍ　ｓｈｏｔｇｕｎ　ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ　ｄａｔａ．　Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　３５，　１５４４～１５５２　（２０１９）．
５２．Ｌｉ，　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．　Ａｎ　ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ｃａｔａｌｏｇ　ｏｆ　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　ｇｕｔ　ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ．　Ｎａｔ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　３２，　８３４～８４１　（２０１４）．
５３．Ｓｅｇａｔａ，　Ｎ．，　Ｂｏｒｎｉｇｅｎ，　Ｄ．，　Ｍｏｒｇａｎ，　Ｘ．　Ｃ．　＆　Ｈｕｔｔｅｎｈｏｗｅｒ，　Ｃ．　ＰｈｙｌｏＰｈｌＡｎ　ｉｓ　ａ　ｎｅｗ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ａｎｄ　ｔａｘｏｎｏｍｉｃ　ｐｌａｃｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｍｉｃｒｏｂｅｓ．　Ｎａｔ．　Ｃｏｍｍｕｎ．　４，　２３０４　（２０１３）．
５４．Ｋｈｅｌａｉｆｉａ，　Ｓ．，　Ｒａｏｕｌｔ，　Ｄ．　＆　Ｄｒａｎｃｏｕｒｔ，　Ｍ．　Ａ　ｖｅｒｓａｔｉｌｅ　ｍｅｄｉｕｍ　ｆｏｒ　ｃｕｌｔｉｖａｔｉｎｇ　ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｃ　ａｒｃｈａｅａ．　ＰＬｏＳ　Ｏｎｅ　８，　ｅ６１５６３　（２０１３）．
５５．Ａｚｉｚ，　Ｒ．　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｔｈｅ　ＲＡＳＴ　Ｓｅｒｖｅｒ：　Ｒａｐｉｄ　ａｎｎｏｔａｔｉｏｎｓ　ｕｓｉｎｇ　ｓｕｂｓｙｓｔｅｍｓ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．　ＢＭＣ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　９，　７５　（２００８）．
５６．Ｓｅｅｍａｎｎ，　Ｔ．　Ｐｒｏｋｋａ：　Ｒａｐｉｄ　ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｇｅｎｏｍｅ　ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ．　Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　３０，　２０６８～２０６９　（２０１４）．
５７．Ｆｅｒｒｉｅｒｅｓ，　Ｌ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｓｉｌｅｎｔ　ｍｉｓｃｈｉｅｆ：　Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ　Ｍｕ　ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓ　ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｏｆ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｒａｎｄｏｍ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ｓｕｉｃｉｄａｌ　ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ　ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ｐｌａｓｍｉｄｓ　ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　ｂｙ　ｂｒｏａｄ－ｈｏｓｔ－ｒａｎｇｅ　ＲＰ４　ｃｏｎｊｕｇａｔｉｖｅ　ｍａｃｈｉｎｅｒｙ．　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．　１９２，　６４１８～６４２７　（２０１０）．
５８．Ａｔａｒａｓｈｉ，　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｔｒｅｇ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｂｙ　ａ　ｒａｔｉｏｎａｌｌｙ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ｍｉｘｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ．　Ｎａｔｕｒｅ　５００，　２３２～２３６　（２０１３）．
５９．Ｑｕｉｎｎ，　Ｒ．　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｇｌｏｂａｌ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ　ｉｎｃｌｕｄｅ　ｎｅｗ　ｂｉｌｅ－ａｃｉｄ　ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎｓ．　Ｎａｔｕｒｅ　５７９，　１２３～１２９　（２０２０）．
６０．ＭｃＤｏｎａｌｄ，　Ｊ．　Ａ．　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ　ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ，　ｓｔａｂｉｌｉｔｙ　ａｎｄ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｉｎ　ａ　ｈｕｍａｎ　ｄｉｓｔａｌ　ｇｕｔ　ｃｈｅｍｏｓｔａｔ　ｍｏｄｅｌ．　Ｊ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　９５，　１６７～１７４　（２０１３）．
６１．Ｂｒａｙ，　Ｆ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｇｌｏｂａｌ　ｃａｎｃｅｒ　ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ　２０１８：　ＧＬＯＢＯＣＡＮ　ｅｓｔｉｍａｔｅｓ　ｏｆ　ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ　ａｎｄ　ｍｏｒｔａｌｉｔｙ　ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ　ｆｏｒ　３６　ｃａｎｃｅｒｓ　ｉｎ　１８５　ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ．　ＣＡ．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　（２０１８）．　ｄｏｉ：１０．３３２２／ｃａａｃ．２１４９２
６２．Ｋａｒａｎｔａｎｏｓ，　Ｔ．，　Ｃｏｒｎ，　Ｐ．　Ｇ．　＆　Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，　Ｔ．　Ｃ．　Ｐｒｏｓｔａｔｅ　ｃａｎｃｅｒ　ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ　ａｆｔｅｒ　ａｎｄｒｏｇｅｎ　ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ　ｔｈｅｒａｐｙ：　Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ｏｆ　ｃａｓｔｒａｔｅ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ａｎｄ　ｎｏｖｅｌ　ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ．　Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　（２０１３）．
６３．Ｇｕｅｒｉｎｉ，　Ｖ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｔｈｅ　ａｎｄｒｏｇｅｎ　ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ　５α－ａｎｄｒｏｓｔａｎｅ－３β，１７β－ｄｉｏｌ　ｉｎｈｉｂｉｔｓ　ｐｒｏｓｔａｔｅ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌ　ｍｉｇｒａｔｉｏｎ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｓｔｒｏｇｅｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　β　ｓｕｂｔｙｐｅ．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　（２００５）．
６４．Ｄｏｎｄｉ，　Ｄ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｅｓｔｒｏｇｅｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　β　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｓｔａｔｅ　ｃａｎｃｅｒ：　Ｒｏｌｅ　ｏｆ　５α－ａｎｄｒｏｓｔａｎｅ－３β，１７β－ｄｉｏｌ．　Ｅｎｄｏｃｒ．　Ｒｅｌａｔ．　Ｃａｎｃｅｒ　（２０１０）．
６５．Ｋａｒｒｅｒ－Ｖｏｅｇｅｌｉ，　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．　Ａｎｄｒｏｇｅｎ　ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ　ｏｆ　ｈｉｒｓｕｔｉｓｍ，　ａｃｎｅ，　ａｎｄ　ａｌｏｐｅｃｉａ　ｉｎ　ｗｏｍｅｎ　ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　２２８　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ　ｆｏｒ　ｈｙｐｅｒａｎｄｒｏｇｅｎｉｓｍ．　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）．　（２００９）．
６６．Ｐｉｎｔｏｎ，　Ｇ．，　Ｎｉｌｓｓｏｎ，　Ｓ．　＆　Ｍｏｒｏ，　Ｌ．　Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ｅｓｔｒｏｇｅｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｂｅｔａ　（ＥＲβ）　ｆｏｒ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ｏｖａｒｉａｎ　ｃａｎｃｅｒ：　Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ　ｏｆ　ＫＤＭ６Ｂ　ａｎｄ　ＳＩＲＴ１　ｆｏｒ　ＥＲβ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ．　Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓｉｓ　（２０１８）．
６７．Ｚｈｏｕ，　Ｙ．　＆　Ｌｉｕ，　Ｘ．　Ｔｈｅ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｅｓｔｒｏｇｅｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｂｅｔａ　ｉｎ　ｂｒｅａｓｔ　ｃａｎｃｅｒ．　Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　（２０２０）．
６８．Ｒｅｄｄｙ，　Ｄ．　Ｓ．　＆　Ｊｉａｎ，　Ｋ．　Ｔｈｅ　ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ　ｎｅｕｒｏｓｔｅｒｏｉｄ　ａｎｄｒｏｓｔａｎｅｄｉｏｌ　ｉｓ　ａ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ　ｍｏｄｕｌａｔｏｒ　ｏｆ　ＧＡＢＡＡ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．　Ｊ．　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　Ｅｘｐ．　Ｔｈｅｒ．　（２０１０）．
６９．Ｈｕａｎｇ，　Ｑ．，　Ｚｈｕ，　Ｈ．，　Ｆｉｓｃｈｅｒ，　Ｄ．　Ｆ．　＆　Ｚｈｏｕ，　Ｊ．　Ｎ．　Ａｎ　ｅｓｔｒｏｇｅｎｉｃ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　５α－ａｎｄｒｏｓｔａｎｅ－３β，　１７β－ｄｉｏｌ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｔｏ　ｓｔｒｅｓｓ　ａｎｄ　ｏｎ　ＣＲＨ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．　Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　（２００８）。
　以上説明したように、本発明によれば、グラム陽性細菌の感染や前立腺がん等のリスクを低減させることが可能となる。したがって、本発明は、これら疾患の医薬品の開発等において有用である。

Claims (31)

  1. 　３－オキソ－５α－ステロイド－４－デヒドロゲナーゼ（５ＡＲ）をコードするポリヌクレオチドを有する細菌を有効成分とする、３－オキソ－Δ４－ＬＣＡを３－オキソアロＬＣＡに変換するための組成物。
  2. 　３βヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（３βＨＳＤＨ）をコードするポリヌクレオチドを有する細菌を有効成分とする、３－オキソアロＬＣＡをイソアロＬＣＡに変換するための組成物。
  3. 　５ＡＲをコードするポリヌクレオチドを有する細菌と３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチドを有する細菌とを有効成分とする、３－オキソ－Δ４－ＬＣＡからイソアロＬＣＡを生成するための組成物。
  4. 　５ＡＲをコードするポリヌクレオチド及び３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチドを有する細菌を有効成分とする、３－オキソ－Δ４－ＬＣＡからイソアロＬＣＡを生成するための組成物。
  5. 　３－オキソ－５β－ステロイド－４－デヒドロゲナーゼ（５ＢＲ）をコードするポリヌクレオチドを有する細菌。
  6. 　５ＢＲをコードするポリヌクレオチドを有する細菌を有効成分とする、３－オキソ－Δ４－ＬＣＡを３－オキソＬＣＡに変換するための組成物。
  7. 　５ＡＲをコードするポリヌクレオチド、３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチド、及び５ＢＲをコードするポリヌクレオチドを有する細菌を有効成分とする、イソＬＣＡ又は３－オキソＬＣＡからイソアロＬＣＡを生成するための組成物。
  8. 　グラム陽性菌に対する抗菌用組成物である、請求項１～７のうちのいずれか一項に記載の組成物。
  9. 　イソアロＬＣＡ又はイソＬＣＡを有効成分とする、グラム陽性菌に対する抗菌用組成物。
  10. 　５ＡＲ、３βＨＳＤＨ、及び５ＢＲから選択される少なくとも１の酵素を有効成分とする、グラム陽性菌に対する抗菌用組成物。
  11. 　グラム陽性菌の感染症を治療又は予防するための組成物である、請求項８～１０のうちのいずれか一項に記載の組成物。
  12. 　クロストリジウム・ディフィシルの感染症を治療又は予防するための組成物である、請求項８～１０のうちのいずれか一項に記載の組成物。
  13. 　敗血症及び敗血症を基礎疾患として有する急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ／ＡＬＩ）からなる群から選択される少なくとも１の疾患を、治療又は予防するための組成物である、請求項８～１０のうちのいずれか一項に記載の組成物。
  14. 　３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチドを有する細菌を有効成分とする、５α－ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）を３β－アンドロスタンジオールに変換するための組成物。
  15. 　５ＡＲをコードするポリヌクレオチドを有する細菌と３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチドを有する細菌とを有効成分とする、テストステロンから３β－アンドロスタンジオールを生成するための組成物。
  16. 　５ＡＲをコードするポリヌクレオチド及び３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチドを有する細菌を有効成分とする、テストステロンから３β－アンドロスタンジオールを生成するための組成物。
  17. 　３βＨＳＤＨを有効成分とする、ＤＨＴから３β－アンドロスタンジオールを生成するための組成物。
  18. 　５ＡＲ及び３βＨＳＤＨを有効成分とする、テストステロンから３β－アンドロスタンジオールを生成するための組成物。
  19. 　下記疾患群から選択される少なくとも１の疾患を、治療又は予防するための組成物である、請求項１４～１８のうちのいずれか一項に記載の組成物
    　疾患群：
    前立腺がん、男性ホルモン性脱毛症、多嚢胞性卵巣症候群、にきび、男性型多毛症、卵巣内皮がん、神経炎症、及びＧＡＢＡＡ受容体を介したてんかん。
  20. 　下記疾患群から選択される少なくとも１の疾患の評価方法であって、
    　疾患群：
    前立腺がん、男性ホルモン性脱毛症、多嚢胞性卵巣症候群、にきび、男性型多毛症、卵巣内皮がん、神経炎症、及びＧＡＢＡＡ受容体を介したてんかん、
    （１）被検者糞便中、３βＨＳＤＨを産生する細菌を定量する工程、
    （２）工程（１）で定量して得られた値を、百寿者の前記細菌を定量して得られる対応値と比較する工程、及び
    （３）工程（２）における比較の結果、
    　被検者糞便中の前記定量値が、前記対応値と同等又はそれより高い場合に、前記被検者は前記疾患に罹患する可能性は低いと判定し、
    　被検者糞便中の前記定量値が、前記対応値より低い場合に、前記被検者は前記疾患に罹患する可能性が高い、又は罹患している可能性が高いと判定する工程を、含む方法。
  21. 　下記疾患群から選択される少なくとも１の疾患の予防方法又は治療方法であって、
    　疾患群：
    前立腺がん、男性ホルモン性脱毛症、多嚢胞性卵巣症候群、にきび、男性型多毛症、卵巣内皮がん、神経炎症、及びＧＡＢＡＡ受容体を介したてんかん、
    　請求項２０に記載の方法にて、前記疾患に罹患する可能性が高い、又は罹患している可能性が高いと判定された前記被検者に、３βＨＳＤＨを産生する細菌を投与する方法。
  22. 　百歳以上生存する可能性を評価する方法であって、
    （１）被検者糞便中、３－オキソＬＣＡ、イソアロＬＣＡ、３－オキソアロＬＣＡ、アロＬＣＡ、３－オキソＬＣＡ及びイソＬＣＡからなる群から選択される少なくとも１の胆汁酸を定量する工程、
    （２）工程（１）で定量して得られた値を、百寿者の前記胆汁酸を定量して得られる対応値と比較する工程、及び
    （３）工程（２）における比較の結果、
    　被検者糞便中の前記定量値が、前記対応値と同等又はそれより高い場合に、前記被検者は百歳以上生存する可能性が高いと判定し、
    　被検者糞便中の前記定量値が、前記対応値より低い場合に、前記被検者は百歳以上生存する可能性が低いと判定する工程を、含む方法。
  23. 　百歳以上生存する可能性を評価する方法であって、
    （１）被検者糞便中、５ＡＲ、３βＨＳＤＨ、及び５ＢＲから選択される少なくとも１の酵素を産生する細菌を定量する工程、
    （２）工程（１）で定量して得られた値を、百寿者の前記細菌を定量して得られる対応値と比較する工程、及び
    （３）工程（２）における比較の結果、
    　被検者糞便中の前記定量値が、前記対応値と同等又はそれより高い場合に、前記被検者は百歳以上生存する可能性が高いと判定し、
    　被検者糞便中の前記定量値が、前記対応値より低い場合に、前記被検者は百歳以上生存する可能性が低いと判定する工程を、含む方法。
  24. 　百歳以上生存する可能性を向上させる方法であって、
    　請求項２２又は２３に記載の方法にて、百歳以上生存する可能性が低いと判定された前記被検者に、３－オキソＬＣＡ、イソアロＬＣＡ、並びに、５ＡＲ、３βＨＳＤＨ、及び５ＢＲから選択される少なくとも１の酵素を産生する細菌からなる群から選択される少なくとも１を投与する方法。
  25. 　グラム陽性菌に対する抵抗性を評価する方法であって、
    （１）被検者糞便中、３－オキソＬＣＡ及びイソアロＬＣＡからなる群から選択される少なくとも１の胆汁酸を定量する工程、
    （２）工程（１）で定量して得られた値を、百寿者の前記胆汁酸を定量して得られる対応値と比較する工程、及び
    （３）工程（２）における比較の結果、
    　被検者糞便中の前記定量値が、前記対応値と同等又はそれより高い場合に、前記被検者はグラム陽性菌に対する抵抗性が高いと判定し、
    　被検者糞便中の前記定量値が、前記対応値より低い場合に、前記被検者はグラム陽性菌に対する抵抗性が低いと判定する工程を、含む方法。
  26. 　グラム陽性菌に対する抵抗性を評価する方法であって、
    （１）被検者糞便中、５ＡＲ、３βＨＳＤＨ、及び５ＢＲから選択される少なくとも１の酵素を産生する細菌を定量する工程、
    （２）工程（１）で定量して得られた値を、百寿者の前記細菌を定量して得られる対応値と比較する工程、及び
    （３）工程（２）における比較の結果、
    　被検者糞便中の前記定量値が、前記対応値と同等又はそれより高い場合に、前記被検者はグラム陽性菌に対する抵抗性が高いと判定し、
    　被検者糞便中の前記定量値が、前記対応値より低い場合に、前記被検者はグラム陽性菌に対する抵抗性が低いと判定する工程を、含む方法。
  27. 　グラム陽性菌の感染症を予防する方法であって、
    　請求項２５又は２６に記載の方法にて、グラム陽性菌に対する抵抗性が低いと判定された前記被検者に、３－オキソＬＣＡ、イソアロＬＣＡ、並びに、５ＡＲ、３βＨＳＤＨ、及び５ＢＲから選択される少なくとも１の酵素を産生する細菌からなる群から選択される少なくとも１を投与する方法。
  28. 　３－オキソアロＬＣＡの存在下、３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチドを有する細菌を培養し、該細菌及び／又はその培養物において生成されたイソアロＬＣＡを採取する工程を含む、イソアロＬＣＡの製造方法。
  29. 　３－オキソ－Δ４－ＬＣＡの存在下、５ＡＲをコードするポリヌクレオチドを有する細菌と３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチドを有する細菌とを培養し、該細菌及び／又はその培養物において生成されたイソアロＬＣＡを採取する工程を含む、イソアロＬＣＡの製造方法。
  30. 　３－オキソ－Δ４－ＬＣＡの存在下、５ＡＲをコードするポリヌクレオチドと３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチドとを有する細菌を培養し、該細菌及び／又はその培養物において生成されたイソアロＬＣＡを採取する工程を含む、イソアロＬＣＡの製造方法。
  31. 　イソＬＣＡ又は３－オキソＬＣＡの存在下、５ＡＲをコードするポリヌクレオチド、３βＨＳＤＨをコードするポリヌクレオチド、及び５ＢＲをコードするポリヌクレオチドを有する細菌を培養し、該細菌及び／又はその培養物において生成されたイソアロＬＣＡを採取する工程を含む、イソアロＬＣＡの製造方法。
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