JP7325106B2 - リポ多糖制御性腸内細菌及びその用途 - Google Patents
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Description
しかし、最近の臨床試験の結果、魚の摂取が血中TMAOレベルを一時的ではあるが劇的に増加させるという矛盾する結果が示されており、食餌と腸内細菌叢との関係に関する現在の当該分野の理解に限界があることを浮き彫りにしている。
しかし、どの特定のバクテロイデス種が関与し、CADにおけるそれらの真の役割が何なのかについては未だ不明のままである。
その一方で、特許文献1には、バクテロイデス・ブルガタス(Bacteroides vulgatus)を含む3種のバクテロイデス属の細菌由来の成分(例、LPS)を含む経口投与用のカプセル組成物が開示されており、種々の炎症性疾患や自己免疫疾患等の治療及び発症遅延に使用できることが記載されている。但し、それらの組成物が実際に当該効能を有することは実証されていない。
また、非特許文献8には、バクテロイデス・ドレイ(Bacteroides dorei)由来のLPSは大腸菌由来のLPSとは構造が異なり、Toll様受容体4(TLR4)刺激能が弱く、自然免疫を誘導しにくいことが記載されている。
本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに検討を重ねた結果、バクテロイデス・ブルガタスとバクテロイデス・ドレイの摂取は、動脈硬化をはじめとする循環器系疾患や、炎症性疾患、代謝性疾患の予防及び/又は改善に有用であり、また、腸内細菌叢における該バクテロイデス種の存在量を指標として前記疾患の診断が可能であると結論して、本発明を完成するに至った。
[1]
(1)天然より分離されたバクテロイデス・ブルガタスの生菌を含む組成物と、
(2)天然より分離されたバクテロイデス・ドレイの生菌を含む組成物と
の組み合わせ物。
[2]前記(1)の組成物と前記(2)の組成物とが同一物である、[1]に記載の組み合わせ物。
[3]医薬品又は医薬品添加物である、[1]又は[2]に記載の組み合わせ物。
[4]食品もしくは飼料又はそのための添加物である、[1]又は[2]に記載の組み合わせ物。
[5]血中又は腸内リポ多糖レベルの亢進と関連する疾患の予防及び/又は改善のための、[1]~[4]のいずれかに記載の組み合わせ物。
[6]前記疾患が循環器系疾患、炎症性疾患又は代謝性疾患である、[5]に記載の組み合わせ物。
[7]前記疾患が、心房細動、心不全、虚血性心疾患、心筋梗塞、狭心症、高血圧症、動脈硬化症、大動脈瘤、大動脈解離、閉塞性動脈硬化症、大動脈弁狭窄症からなる群より選択される循環器系疾患である、[5]に記載の組み合わせ物。
[8]前記疾患が、肝炎、非アルコール性脂肪肝炎、脂肪肝、肝癌、腸管炎症、過敏性腸症候群、胃炎、膠原病、慢性関節リウマチ、慢性腎炎、IgA腎症、気管支喘息、間質性肺炎、薬剤性肺障害、好酸球性肺浸潤症候群、非定型性抗酸菌症、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎及び敗血症からなる群より選択される炎症性疾患である、[5]に記載の組み合わせ物。
[9]前記疾患が、糖尿病、肥満、メタボリックシンドローム、生活習慣病、脂質異常症及び骨粗鬆症からなる群より選択される代謝性疾患である、[5]に記載の組み合わせ物。
[10]天然より分離されたバクテロイデス・ブルガタスの生菌と、天然より分離されたバクテロイデス・ドレイの生菌とを経口摂取することを含む、血中又は腸内リポ多糖レベルの亢進と関連する疾患の予防及び/又は改善方法。
[11]前記疾患が循環器系疾患、炎症性疾患又は代謝性疾患である、[10]に記載の方法。
[12]被験者の腸内細菌叢におけるバクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイの存在量を測定することを含む、血中又は腸内リポ多糖レベルの亢進と関連する疾患の検査方法。
[13]前記疾患が循環器系疾患、炎症性疾患又は代謝性疾患である、[12]に記載の方法。
[14](1)配列番号1又は2で表されるヌクレオチド配列と98%以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む16S rRNA遺伝子、及び
(2)配列番号3又は4で表されるヌクレオチド配列と98%以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む16S rRNA遺伝子
を検出することを含む、[12]又は[13]に記載の方法。
[15]バクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイの16S rRNA遺伝子を検出し得るプライマーセット又はプローブを含む、血中又は腸内リポ多糖レベルの亢進と関連する疾患の発症リスクの検査用試薬。
[16]前記疾患が循環器系疾患、炎症性疾患又は代謝性疾患である、[15]に記載の試薬。
[17]16S rRNA遺伝子が、
(1)配列番号1又は2で表されるヌクレオチド配列と98%以上の同一性を有するヌクレオチド配列、及び
(2)配列番号3又は4で表されるヌクレオチド配列と98%以上の同一性を有するヌクレオチド配列
を含む、[15]又は[16]に記載の試薬。
本発明は、バクテロイデス属に属する細菌であるバクテロイデス・ブルガタスとバクテロイデス・ドレイとの組み合わせ物(以下、「本発明の組み合わせ物」ともいう。)を提供する。ここで「組み合わせ物」とは、両者が混合された1つの組成物として存在してもよいし、あるいは、それぞれ別個の組成物として存在するが、ある目的(例、医薬、食品もしくは食品添加物、飼料もしくは飼料添加物)のために組み合わせて使用される、キット化された状態のものであってもよいことを意味する。本発明の組み合わせ物は、ヒトや他の動物の腸内で共存することにより、腸内のLPSレベルを低減させ、腸管バリアのタイトジャンクションを強化して血中LPSレベルを低減させ、腸内、血管内、及び臓器内での炎症応答・免疫応答を抑制し得る(本明細書においては、これらの作用効果を「リポ多糖(LPS)制御性」と包括的にいう場合がある)。
(1)天然より分離されたバクテロイデス・ブルガタスの生菌を含む組成物と、
(2)天然より分離されたバクテロイデス・ドレイの生菌を含む組成物と
を組み合わせてなる。
バクテロイデス・ブルガタス(Bacteroides vulgatus)は、ヒト消化管から最もよく分離される細菌であり、一般的に有益な片利共生菌と考えられている。バクテロイデス・ドレイ(Bacteroides dorei)は、2006年に、ヒト糞便から分離され16S rRNA遺伝子シーケンシングによりバクテロイデス・ブルガタスに最も近縁な(約96%の同一性を有する)新菌種として同定された(Int J Sys Evol Microbiol. 56, 1639-1643, 2006)。
(1-1)5%ウマ血液添加Eggerth Gagnon(EG)寒天培地上で、円形で白色の凸状に隆起したコロニーを形成する。
(1-2)顕微鏡学的特徴:桿菌で運動性はなく、芽胞を形成しない。
(2)生育条件
(2-1)温度:25~40℃で生育する。至適温度は37℃
(2-2)偏性嫌気性
(3)生理学的・生化学的特徴
(3-1)グラム染色性:陰性
(3-2)他の生化学的特徴を表1に示す[表中、1はバクテロイデス・ドレイ JCM13471T株、2はバクテロイデス・ドレイJCM13472株、3はバクテロイデス・ブルガタス JCM5826T株をそれぞれ示す。生化学的試験は、API 20 A及びAPI rapid ID 32 Aストリップ(bioMerieux)を用いて行った。](Int J Sys Evol Microbiol. 56, 1639-1643, 2006より抜粋)
従って、前記PCR増幅断片のヌクレオチド配列が、配列番号1又は2で表されるヌクレオチド配列と98%以上の同一性を有する場合、分離された細菌はバクテロイデス・ブルガタスに属する細菌であると同定することができる。また、前記増幅断片のヌクレオチド配列が、配列番号3又は4で表されるヌクレオチド配列と98%以上の同一性を有する場合、分離された細菌はバクテロイデス・ドレイに属する細菌であると同定することができる。
培地としては、ATCC Medium 2107(ペプトン10g、牛肉エキス10g、酵母エキス3g、デキストロース5g、NaCl 5g、可溶性デンプン1g、L-システイン塩酸塩0.5g、酢酸ナトリウム3g、0.025% Resazurin 4mL、蒸留水1L)、ATCC Medium 260(トリプトン15g、ソイトン5g、NaCl 5g、脱線維素ヒツジ血50mL、蒸留水950mL)、5%ウマ血添加EG培地等を用いることができる。これらの培地は液体培地としても、例えば1.5%寒天を添加して固形培地としても使用できる。
バクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイは、生きた状態(生菌)である限り、上記培養物(菌体)をそのまま、あるいは、該培養物から自体公知の方法、例えば、遠心分離、ろ過、磁性分離等の方法により回収した湿菌体もしくはその洗浄物(滅菌水、培地、PBS等により洗浄することができる)又はそれらの凍結乾燥粉末等の「菌体処理物」の状態で、それらを含む組成物中に配合することができる。尚、本明細書において、以下、特にことわらない限り、「菌体」もしくは「菌体処理物」は、死菌や菌体破砕物、菌体抽出物、菌体成分等の「生きていない」状態のものを包含しない意味で用いられる。
バクテロイデス・ブルガタスの菌体もしくは菌体処理物と、バクテロイデス・ドレイの菌体もしくは菌体処理物とが、別個の組成物として提供される場合、それらの組成物は、同時に又は時間差をおいて、同一経路又は別経路で接種され得る。
併用微生物の配合量としては、1日あたりの摂取量として、例えば104~1012コロニー形成ユニット(cfu)、好ましくは106~1010cfuである。
上述のとおり、バクテロイデス・ブルガタスとバクテロイデス・ドレイとは、腸内で共存することにより、腸内のLPSレベルを低減させ、腸管バリアのタイトジャンクションを強化して血中LPSレベルを低減させ、腸内、血管内、及び臓器内での炎症応答・免疫応答を抑制し得る(即ち、LPS制御性を有する)ので、腸内細菌叢において両菌種を富化することにより、血中又は腸内のLPSレベルの亢進と関連する疾患を予防及び/又は改善することができる。したがって、本発明の組み合わせ物は、これらの疾患を予防及び/又は改善するための、医薬品又は医薬品添加物、あるいは、機能性食品(もしくは飼料)又は食品(もしくは飼料)添加物として有用である。
本発明はまた、被験者の腸内細菌叢におけるバクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイの存在量を測定することを含む、血中又は腸内LPSレベルの亢進と関連する疾患(以下、「LPS関連疾患」ともいう。)の発症リスクの検査方法(以下、「本発明の検査方法」ともいう。)及びそのための試薬(以下、「本発明の検査薬」ともいう。)を提供する。後述の実施例でも示されるとおり、バクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイは、冠動脈疾患(CAD)患者の腸内細菌叢において存在量が有意に減少しており、また、動脈硬化マウスモデルに両菌種を経口摂取させると、動脈硬化の症状を改善するとともに、腸内のLPSレベルを低減させ、腸管バリアのタイトジャンクションを強化して血中LPSレベルを低減させ、腸内及び血管内での炎症応答・免疫応答を抑制し得る(即ち、LPS制御性を有する)。さらに、肥満マウスモデルに両菌種を経口摂取させると、肥満の症状を改善するとともに、臓器内での炎症応答・免疫応答を抑制し得る。さらに、非アルコール性脂肪肝炎モデルマウスに両菌種を経口摂取させると、非アルコール性脂肪肝炎の症状を改善するとともに、臓器内での炎症応答・免疫応答を抑制し得る。従って、被験者の腸内細菌叢におけるバクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイの存在量を測定し、正常値と比較することにより、該被験者がLPS関連疾患を発症しているか、あるいは将来発症するリスクが高いと判定することができる。尚、本明細書において「発症リスクの検査」とは、将来の発症する蓋然性の高さを予測するだけでなく、既に発症していることを診断するための検査をも包含する意味で用いられる。また、本明細書において「検出」なる用語は、そう解釈することが明らかに誤りである場合を除き、目的の細菌の存在の有無を判定するだけでなく、その存在量を定量的に測定することも包含する意味で用いられる。
さらに、このプライマーセットを用いた場合、配列番号1の増幅断片にはTaqI制限部位(TCGA;配列番号1の288~291位)が1か所存在するが、配列番号3の増幅断片にはTaqI制限部位が存在しないので、増幅断片をTaqIで消化して電気泳動すれば、仮にバクテロイデス・ブルガタスしか存在しない場合には、153bpと320bpの2本のバンドが検出されるが、バクテロイデス・ドレイしか存在しない場合には、475bpの1本のバンドが検出される。両菌種が存在する場合には、上記3本のバンドが検出される。従って、バクテロイデス・ブルガタスとバクテロイデス・ドレイの16S rRNA遺伝子を一括増幅できるプライマーに、RFLP分析を組み合わせることにより、両菌種を区別して検出することもできる。
ここで、LPS関連疾患としては、例えば、心房細動、心不全、虚血性心疾患、心筋梗塞、狭心症、高血圧症、動脈硬化症、大動脈瘤、大動脈解離、閉塞性動脈硬化症、大動脈弁狭窄症等の循環器系疾患、あるいは、例えば、肝炎、非アルコール性脂肪肝炎、脂肪肝、肝炎の進行による肝癌、腸管炎症、過敏性腸症候群、胃炎、膠原病、慢性関節リウマチ、慢性腎炎、IgA腎症、気管支喘息、間質性肺炎、薬剤性肺障害、好酸球性肺浸潤症候群、非定型性抗酸菌症、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、敗血症等の炎症性疾患、あるいは、糖尿病、肥満、メタボリックシンドローム、生活習慣病、脂質異常症、骨粗鬆症などの代謝性疾患などが挙げられる。
CAD患者及び対照の募集採用
すべての参加者は、登録後に書面によるインフォームド・コンセントを提供した。研究はヘルシンキ宣言のガイドラインに則り実施した。本研究は神戸大学の倫理委員会の承認(承認番号1595)を得て、UMIN臨床試験レジストリに登録された(試験登録番号000015703, URL: http://www.umin.ac.jp/ctr/)。
30名のCAD患者と、30名の冠状動脈のリスクファクターを有する非CAD対照を、2014年10月から2015年7月にかけて神戸大学附属病院にて募集採用した。CAD群は、安定狭心症患者、及び本研究の少なくとも6か月前に経皮冠動脈インターベンション又は冠動脈バイパス移植術を受けた、保存された左室駆出率(>40%)を有する陳旧性心筋梗塞患者を含んだ。急性冠動脈症候群患者は除外した。一枝疾患か多枝疾患かは、診断的冠動脈造影において75%を超える狭窄を示す主要な冠状動脈の数という観点で定義した。
高血圧、糖尿病及び/又は脂質異常症等の冠状動脈のリスクファクターを有するが、冠動脈疾患又は他の血管の疾患を現在も既往歴も有しない30名の患者を年齢及び性別の合致した対照として募集採用した。冠動脈疾患又は他の血管の疾患の既往歴は、確認された血管疾患、狭心症を示す症状、陳旧性心筋梗塞又は狭心症を示す心電図上の異常、あるいは胸部X線上の異常として定義した。
肝疾患、腎疾患(血清クレアチニンレベル>2.0mg/dL)、コラーゲン疾患又はがんを含む全身性疾患を有する患者は研究から除外した。抗生物質で治療した患者も除外した。糖尿病は、全米グリコヘモグロビン標準化プログラムの指標により、糖化ヘモグロビン値 >6.5%、経口抗糖尿病薬の使用、又はインスリン治療を受けている場合、糖尿病と定義した。血圧 >140/90mmHg又は降圧薬の使用を高血圧症と定義した。日本動脈硬化学会が発行するガイドラインにより、低密度リポタンパク質コレステロールレベル >140mg/dL、トリグリセリドレベル >150mg/dL又は抗脂質異常症薬の使用を脂質異常症と定義した。
被験者を入院させ、病院食を摂取させながら、被験者由来の糞便サンプルを採取した。マウス由来の糞便サンプルは、6週齢及び16週齢時に採取した。糞便サンプルは-80℃で保存した。糞便サンプルからのDNA抽出は、以前に確立した手順(Appleid and Environmental Microbiology 63, 2802-2813 (1997); Appl Environ Microbiol 71, 4153-4155 (2005); FEMS Microbiology Ecology 68, 351-362 (2009))に従って、日本遺伝子研究所により実施された。各サンプルについて、0.2~0.3gの糞便材料から、G’NOMEsキット(BIO 101,La Jolla,CA)を用い、製造者の指示に従いつつ少し改変して、細胞DNAを抽出した。簡単にいえば、提供された細胞懸濁液中で糞便サンプルをホモジナイズした後、細胞溶解/変性溶液を加えてサンプルを55℃で30分間インキュベートした。細胞溶解を向上させるため、750mLのシリカビーズ(直径0.1mm)を添加し、BeadBeater装置(BioSpec,Bartlesville,OK)内で最大速度で10分間振とうした。ポリビニルピロリドン(15mg)を添加し、その後の定量的PCRを阻害し得るポリフェノールのコンタミの除去を確実にした。サンプルをボルテックスし、20,000gで3分間遠心し、上清を回収した。残渣のペレットを400mLのTENPバッファー(50mM トリスバッファー,pH8、20mM EDTA,pH8、100mM NaCl、1% ポリビニルポリピロリドン)で洗浄し、20,000gで3分間遠心した。洗浄工程をもう1回繰り返し、得られた上清をプールした。等容のイソプロパノールを加えて核酸を沈澱させ、-20℃で10分間保存した後、20,000gで5分間遠心した。ペレットを400mLの蒸留水と100mLの塩析剤混合液に再懸濁し、4℃で10分間インキュベートした。サンプルを20,000gで10分間遠心し、DNAを含む上清を清潔な1.5mL遠心管に移した。2倍容の100%エタノールを加え、室温で5分静置してDNAを沈澱させた後、20,000gで5分間遠心した。DNAを150mLのTEバッファーに再溶解し、該DNA溶液を後の分析まで-20℃で保存した。
16S rRNA遺伝子の一部(V3-V4領域、大腸菌ナンバリングシステムの342~806位に相当)を、342Fと806Rの非変性ユニバーサルプライマーセット(表2)を用いてPCR増幅した(プライマーセット及びPCR条件の詳細はDNA Res. 21, 217-227 (2014)を参照)。シーケンシングアダプターを付加した後、Illumina MiSeq platform (Illumina Inc., San Diego, CA) 用い、製造者のプロトコルに従い、タカラバイオ社にてアンプリコンをシーケンシングした。
USEARCH version 10.0.240(Bioinformatics. 26, 2460-2461 (2010))version 0.33(パラメータ:LEADING:17 TRAILING:17 AVGQUAL:25 MINLEN:100)を用いて、細菌組成マトリクスを作成した。また、以前のプロトコルを用い、Trimmomatic(Bioinformatics. 30, 2114-2120 (2014))を用いて生成した高品質な16S rRNA遺伝子アンプリコン配列を選択した。残りのリードは、USEARCHの-fastq_mergepairsコマンド(パラメータ:デフォルト値)を用いた。次に、Tagcleaner(BMC Bioinformatics. 11, 341 (2010))version 0.16(パラメータ:-tag5 CTACGGGGGGCAGCAG -mm5 3 -tag3 AGATACCCCGGTAGTCC -mm3 3 -nomatch 3)を用いて、プライマー領域のない配列を除いた。その後、内部のpython scriptを用いて、Nを有する配列を除いた。USEARCHの-filter_phixコマンドを用いて、Phixリードを除いた。USEARCHのコマンド-sort_by_length(パラメータ:-minseqlength 300)を用いて、短い配列を除いた。最後に、UPARSEアルゴリズム (-fastx_uniqueコマンド及びotu_clusterコマンド(パラメータ:-minsize 1))を用いて、OTUテーブルを生成した(Nat Meth. 10, 996-998 (2013))。各OTUの代表的な配列を、RDP Classifier version 2.12を用い、ブートストラップ値?0.5で、細菌の属にアノテーションした(Appl Environ Microbiol. 73, 5261-5267 (2007))。さらに、各OTUの各代表的な配列を、BLASTN version 2.2.25を用い、identity threshold ?97% 及び coverage ?80%で、参照データベースsilva Living Tree Project version 123(Syst Appl Microbiol. 31, 241-250 (2008))にアノテーションした。
被験者が病院内で病院指定の食事を摂るようになった後に糞便サンプルを採取した。該サンプルを、内部コントロールとして2-エチル酪酸を含む滅菌水で希釈した後、YMC-Pack FA kit (#XSRFAR01, YMC, Kyoto, Japan) を用いて、2-ニトロフェニルヒドラジンで標識した。該サンプル中の短鎖脂肪酸を液体クロマトグラフィー (Prominence LC-20AD; Shimadzu, Kyoto, Japan) により定量した。
すべてのアポリポ蛋白質E欠損(Apoe-/-)マウスはC57BL/6バックグラウンドのものを用いた。すべてのマウスは、神戸大学の研究所内のSPFグレードの動物施設で飼育した。動物には、厳密な12時間明期サイクル下で、通常食(日本クレア)を与え、自由摂水させた。6週齢マウスを3つの処置群に分け、対照群のマウスには培地を経口摂取させ、バクテロイデス属生菌群のマウスには生きたバクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイを、バクテロイデス属菌加熱死菌群のマウスには熱殺菌したバクテロイデス・ブルガタスおよびバクテロイデス・ドレイを、それぞれ2.5×109 cfu/100 μlの用量で週5回経口摂取させた。すべての実験は、神戸大学医学部で有効な動物実験に関するガイドライン(ガイドラインNo.P160701)に従って実施した。
肥満マウスモデル及び非アルコール性脂肪肝炎(NASH)マウスモデルは、C57BL/6Jマウス(日本チャールス・リバー社)を用い、後で詳述する方法にて作製した。
バクテロイデス・ブルガタス(#8482; American Type Culture Collection, Manassas, VA、及びNTZ002株(受託番号:NITE BP-02863)) 及びバクテロイデス・ドレイ(#17855; Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Braunschweig, Germany、及びNTZ001株(受託番号:NITE BP-02862))は、DifcoTM reinforced clostridial medium (#218081; BD Bioscience, San Jose, CA) 中で、37℃で嫌気的に培養した。10% CO2、10% 水素及び80% 窒素を含む嫌気チャンバー(Coy Laboratory Products, Grass Lake, MI)を、すべての嫌気的な微生物工程に使用した。バクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイは121℃で15分間処理して熱殺菌した。熱殺菌が首尾よく行われたことを、加熱処理した細菌をプレーティングし、生育しないことにより確認した。
動物を一晩絶食させ、麻酔下の心穿刺によりヘパリン管に血液を採取した。血液サンプルを4℃で10分間、3,000rpmで遠心し、測定まで-80℃で保存した。総コレステロール、高密度リポタンパク質コレステロール、低密度リポタンパク質コレステロール、及びトリグリセリドの血漿中濃度を、自動化化学分析装置(SRL社)を用いて酵素的に測定した。血漿中サイトカインレベルは、サイトメトリックビーズアレイキット(BDバイオサイエンス)を用いて、製造者の指示に従って分析した。
マウスに麻酔し、大動脈を生理食塩水で潅流し、左室中央から腸骨動脈の分岐点までを切除した。大動脈基部の病変を分析するため、近位上行大動脈部分から大動脈洞にかけてのサンプルを得た。該サンプルを、凍結組織切片作製様包埋剤OCTコンパウンド(#4583, Tissue-Tek; Sakura Finetek, 東京)に包埋した。大動脈洞の550μmにわたる5枚の連続切片(厚さ10μm)を各マウスから採取し、オイルレッドO(#154-02072; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)又はヘマトキシリン(#3000; 武藤化学,東京)で染色した。染色切片をオールインワン蛍光顕微鏡(#BZ-8000; Keyence, 大阪)を用いてデジタル処理でキャプチャーした。動脈硬化の程度を定量的に解析するため、ImageJ(登録商標)ソフトウェアを既報のとおり用いて(Circulation. 120, 1996-2005 (2009))、各マウスから得た5つの別個の切片について全病変面積を算出した。en face病変解析のために、近位上行大動脈から総腸骨動脈分岐までにわたる大動脈断片を切除し、10% ホルマリン緩衝液中で固定した。外膜組織を注意深く除去した後、大動脈を縦方向に切開し、オイルレッドOで染色し、黒ワックス表面上にピン留めしてデジタルカメラを用いてキャプチャーした。染色病変面積を全面積に対するパーセンテージとして示し、既報に記載のとおり(Circulation. 120, 1996-2005 (2009))、ImageJ(登録商標)ソフトウェアを用いて測定を行った。
マクロファージ検出用抗体(MOMA-2, #T-2029, 1:400; BMA Biomedicals, Augst, Switzerland)及びT細胞検出用抗体(CD4, #550278, 1:100; BD Biosciences)を用いて、動脈硬化病変の免疫組織化学分析を、アセトン固定又はホルマリン固定したマウス大動脈基部の10μm凍結切片上で実施した。ビオチン化二次抗体(#ab102250, 1:500; abcam, Cambridge, UK)及びストレプトアビジン標識西洋ワサビペルオキシダーゼ(#P0397, 1:500; Dako Co., Carpinteria, CA)を用いて検出を行った。染色した切片を、オールインワン蛍光顕微鏡を用いてデジタル処理でキャプチャーした。MOMA-2染色においては、全動脈硬化病変面積に対する染色面積のパーセンテージを算出した。CD4陽性T細胞の定量は、各切片中の染色細胞数を計数することにより実施した。
各マウスにおいて、16週齢時に上行結腸を切除し、OCTコンパウンド中に包埋した。タイトジャンクションタンパク質を検出する抗体(anti-ZO-1, #sc-33725, 1:100; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)を用いて、アセトン固定した10μm凍結切片上で免疫蛍光染色を実施したCy3をコンジュゲートした二次抗体(#405408, 1:200; BioLegend, San Diego, CA)を用いて検出を行った。DAPI(#H-1200; Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA)を用いて核染色を行った。染色した切片を、オールインワン蛍光顕微鏡を用いてデジタル処理でキャプチャーした。ZO-1の発現強度はImageJ(登録商標)ソフトウェアを用いて解析した。
腸間膜リンパ節(MLN)細胞、脾細胞及びRAW264.7細胞を抗CD16/CD32抗体(clone 2.4G2; #553142; BD Biosciences)とインキュベートし、Fcレセプターをブロッキングした。表面抗原の検出のため、2% 胎仔ウシ血清(FBS)を含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS)50μL中の10×105個のMLN細胞又は脾細胞を、以下の抗体((BD Biosciences又はeBioscience):
・抗CD4(clone RM4-5; Cat 557871)
・抗CD11b (clone M1/70; #557396)
・抗CD11c (clone HL3; #558079)
・抗CD44 (clone IM7; #553134)
・抗CD62L (clone MEL-14; #553150)
・抗CD69 (clone FN50; #555533)
・抗CD80 (clone 16-10A1; #560016)
・抗CD86 (clone GL1; #553692)
・抗CD273 (clone TY25; #560086)
・抗CD274 (clone MIH5; #558091)
・抗F4/80 (clone BM8; #17-4801-82)
・抗Ly6G (clone RB6-8C5; #12-5931-82)
・抗TLR4 (clone MTS510, #17-9924-82)
を用いて染色した。Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set (#00-5523-00, eBioscience, San Diego, CA) 又はFixation/Permeabilization Solution Kit (#554714, BD Biosciences)、抗Foxp3抗体(clone FJK-16; #17-5773-82; eBioscience)及び抗CTLA-4抗体(clone UC10; BD Biosciences; #553720)を用い、製造者の指示に従って細胞内染色を実施した。アイソタイプが一致する抗体を対照として使用した。RAW264.7細胞の増殖を、anti-Ki67 set (clone B56; #556027) を用い、製造者の指示に従って試験した。フローサイトメトリー解析は、Attune(登録商標)acoustic focusing cytometer (Life Technologies, Grand Island, NY) とFlowJo software (Tree Star, Inc., Ashland, OR) を用いて実施した。
一晩絶食後、マウスにフルオレセインイソチオシアネート(FITC)標識デキストラン(FD4, 500 mg/kg of body weight; Sigma-Aldrich)を経口摂取させた。4時間後、血漿中FD4濃度を、蛍光分光光度計(EnSpire; PerkinElmer, Inc., Waltham, MA)を、励起波長490nm、蛍光波長520nmで用いて測定した。
LPS測定と16S rRNA遺伝子シーケンシングには、同じヒト糞便サンプルを用いた。マウス糞便サンプルは、16週齢の対照マウス及びバクテロイデス属菌処理マウス、あるいは6週齢の抗生物質(AVNM)投与マウスから、最後の経口摂取の24時間後に採取した。既報のプロトコル(PLoS One. 7, e47713 (2012); Gut. 63, 1069-1080 (2014); BMC Microbiol. 16, 9 (2016))を少し改変して、糞便上清を得た。簡単にいうと、糞便サンプルを、50mg/500μLの濃度となるように無菌PBS中に懸濁し、細菌細胞が破砕しないように穏かにボルテックスした。3,000rpmで15分間遠心した後、上清を回収し、0.45μmのフィルター、次いで0.22μmのフィルターで濾過して滅菌し、70℃で15分間インキュベートして不活性化した後-80℃で保存した。また、マウス盲腸便サンプルは、16週齢の対照マウス及びバクテロイデス属菌処理マウスから、常法により採取した。
Limulus Amebocyte Lysate アッセイキット(#K50-643J; Lonza Inc., Basel, Switzerland)を用い、製造者の指示に従って、血漿中及び糞便中のLPSレベルを測定した。パイロジェンフリー水中に、血漿は10倍、糞便上清は10,000倍希釈し、70℃で15分間不活性化した。LSP測定は、パイロジェンフリーのガラス管、エッペンドルフチューブ及びプレート中で実施した。
RAW264.7マクロファージを10% FBS含有RPMI-1640培地中で培養した。増殖のために、RAW264.7細胞(1×105個)を24-ウェル平底プレート(Corning Costar, Corning, NY)に播種し、糞便上清の存在下、37℃、5% CO2雰囲気中で5時間インキュベートした。サイトカイン産生解析のため、TLR4に対するsiRNA(#4390771; Invitrogen, Carlsbad, CA)を用い、RNAiMAX reagent (#13778030, Invitrogen) によりTLR4のノックダウンを行った。SilencerTM Select Negative Control No. 1 siRNA (#4390843, Invitrogen) を対照として用いた。HT29ヒト腸管上皮細胞をAmerican Type Culture Collection(ATCC)から購入し、10% FBS含有RPMI-1640培地中で培養した。このHT29細胞を24-ウェル平底プレートに播種し、糞便上清の存在下、37℃、5% CO2雰囲気中で24時間インキュベートした。
TRIzolTM試薬(#15596018; Thermo Scientific, Waltham, MA)を用い、製造者の指示に従って、全RNAを組織又は細胞サンプルから抽出した。PrimeScript reverse transcription reagent kit (#RR037A; Takara, 滋賀) を用いてcDNAを合成した。SYBER Premix Ex Taq (#RR820; Takara) 及びLightCycler(登録商標)96 System (#05815916001; Roche, Mannheim, Germany) を用い、製造者の指示に従って定量的RT-PCRを実施した。各遺伝子に特異的なプライマーを表2に示す。発現データは対照ハウスキーピング遺伝子であるGAPDHで補正し、ΔΔT法により解析した。
Sci. Rep. 7, 12989 (2017) において詳述したようにして、ウェスタンブロット分析を実施した。簡単に言うと、細胞をPBSで2回リンスし、氷冷した溶解バッファー(20 mM HEPES, pH 7.4; 1% NP40; 1% SDS; 及び150 mM NaCl)中に集めた。全溶解物から抽出したタンパク質を6% SDS-PAGEにかけ、iBlot(登録商標)Gel Transfer Device(Thermo Scientific)を用いて、ポリビニリデンジフルオライドメンブレン(#IB401002; Thermo Scientific)上に転写した。該メンブレンを5%ミルク(#31149-75; ナカライテスク, 京都)でブロッキングし、一次抗体と4℃で一晩インキュベートした後、西洋ワサビペルオキシダーゼをコンジュゲートした二次抗体と室温で1時間インキュベートした。Immobilon Western HRP Substrate (#WBKLS0500; Merck Millipore, Billerica, MA) とインキュベーションした後、V3 Western Workflow system (Bio-Rad, Hercules, CA) を用いてシグナルを検出した。本実験では以下の一次抗体を使用した。
・抗ZO-1 (#8193, 1:1,000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA)
・抗β-アクチン (#A5441, 1:5,000; Sigma-Aldrich)
バンド強度はImageJ(登録商標)ソフトウェアを用いて定量した。
R software, version 3.1.0 (http://www.r-project.org/)、JMP version 10 (SAS Institute, Cary, NC) 及びPrism version 7.0 (GraphPad Software; San Diego, CA) を用いて、統計解析を行った。Shapiro-Wilk検定を用いてデータが正規分布を示すか否かを決定した。結果は、正規分布データについては、平均値±該平均値の標準誤差、又は平均値±正規分布データの標準偏差で、非正規分布データについては、中間値±四分位範囲(第1~第3四分位範囲)で表した。正規分布データについてはStudentの両側t-検定を、非正規分布データについてはMann-Whitney U-検定を用いて、2群間の有意差を評価した。Fisherの正確確率検定又はカイ二乗検定を用いて、カテゴリー変数を比較した。すべての検定について、P<0.05の数値を統計学的に有意であるとみなした。2つのパラメータ間の統計学的相関を評価するため、最小二乗法を用いて単回帰・単相関を計算し、結果をPearsonの相関係数で表現した。一元配置分散分析(ANOVA)を用いて3群間の有意差を検出した。Benjamini-Hochberg法を用いてq値を算出し、多重比較のp値を調整した。30名のCAD患者と30名の対照からのデータのクラスタリングは、Arthritis Rheumatol. 68, 2646-2661 (2016) に記載されるようにして、属レベルで実施した。
CAD患者における腸内細菌叢プロファイル
30名のCAD患者、並びに年齢及び性別が合致する、高血圧、糖尿病もしくは脂質異常症等の冠状動脈のリスクファクターを有する30名の非CAD患者を、被験者として募集採用した。糞便サンプルにおける16S rRNA遺伝子シーケンシングを用い、これらの被験者の腸内細菌プロファイルを詳細に比較した。被験者の背景を表3に示す。
クラスター1:バクテロイデス属
クラスター2:プレボテラ属
クラスター3:フィーカリバクテリウム属、ルミノコッカス属又はビフィドバクテリウム属
非CAD対照は、クラスター1により多くカテゴライズされたのに対し、CAD患者はほとんどこのクラスターにカテゴライズされなかった(図1c)。α多様性、バクテロイデス門/ファーミキューテス門比、グラム陽性菌/グラム陰性菌比及び糞便中短鎖脂肪酸濃度は両群間で有意差はなかった。CAD群と非CAD群との間で、属及び種レベルで存在量を網羅的に比較した結果、バクテロイデス属の相対存在量が、対照に比べてCAD患者において低い傾向にあることが分かった(図1d)。主成分解析の結果、両群は腸内マイクロバイオームの主要種の存在量が異なっており、CAD患者では、バクテロイデス・ブルガタスとバクテロイデス・ドレイが相対的に減少し、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ及びプレボテラ・コプリが富化していることが明らかとなった(図6)。以前の報告で、動脈硬化症患者においてバクテロイデス属の存在量が低いことが示されているのを考慮し、本発明者らは、バクテロイデス種であるバクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイに焦点を当てた。これらの種は、抗炎症応答に関与し(Cell. 165, 842-853 (2016))、バクテロイデス属の中で最も豊富に存在する種であり(図1e)、それらの存在量はCAD患者において有意に低かった(図1f)。これら2種は類似の16S rRNAシーケンシングパターンを有するため(Int J Syst Evol Microbiol. 56, 1639-1643 (2006))、本発明者らが用いた方法論では両者を区別できなかった。そこで、本発明者らは、動脈硬化の傾向を示すマウスにバクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイを経口摂取させたマウスモデルを構築し、それを用いて、これらの種と動脈硬化との因果関係を確認し、その根底にあるメカニズムを解明しようとした。
動脈硬化の発症に及ぼすバクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイの効果を判定すべく、6週齢の雌性アポリポタンパク質E欠損(Apoe-/-))マウスに、1週間あたり5回、10週間バクテロイデス・ブルガタスATCC 8482T株及びバクテロイデス・ドレイDSM 17855T株の生菌又は加熱死菌を経口摂取させた。対照マウスには、同じプロトコルに従ってビヒクル(培地)のみを与えた。16週齢時にマウスを安楽死させ、いくつかの分析を行って動脈硬化及び腸内細菌叢を評価した。対照マウスに比べて、バクテロイデス属の生菌を経口摂取したマウスは、体重(図2f)又は血漿コレステロールレベル(図2g)に有意な差はなかったが、大動脈基部及び胸部大動脈のen face解析において、病変サイズが有意に減少した(図2a、b)。加熱殺菌したバクテロイデス属を経口摂取したマウスでは、対照マウスに比べて動脈硬化病変サイズに有意差は認められなかった。さらに、大動脈洞における動脈硬化病変の免疫組織染色とその後の形態学的解析の結果、対照と比較して、バクテロイデス属を経口摂取したマウスにおいて、マクロファージ及びCD4陽性T細胞が顕著に減少することが明らかとなった(図2c、d)。次に、マウスの動脈硬化性大動脈における免疫細胞マーカー及びケモカイン/ケモカイン受容体のmRNA発現を評価すべく、定量的RT-PCR解析を実施した。その結果、いくつかのアテローム形成性の免疫細胞マーカー及びケモカイン/ケモカイン受容体が、バクテロイデス属を経口摂取したマウスで減少していた(図2e)。これらの結果は、経口摂取による生きたバクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイの補充がプラークの炎症を低減し、それによって動脈硬化病変の形成を抑制することを示唆するものである。
マウス糞便サンプルの16S rRNA遺伝子シーケンシングの結果、バクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイの経口摂取に応答して、腸内細菌叢の組成が大きく変化することが明らかとなった(図7a、b)。さらに、腸内細菌の多様性は、対照マウスで低下していたが、生きたバクテロイデス属を経口摂取したマウスでは維持されていた(図7c)。驚くべきことに、グラム陽性菌/グラム陰性菌比は、対照マウスよりも生きたバクテロイデス属を経口摂取したマウスにおいて高い傾向があった(図7d)。バクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイの存在量は、生きたバクテロイデス属を経口摂取したマウスにおいて大幅に高かった(図7e)。
本発明者らは以前、腸管免疫応答の調節により動脈硬化を予防し得ることを報告していたので(Circulation. 120, 1996-2005 (2009);.Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30, 2495-2503 (2010))、バクテロイデス処理がプラーク形成を減少させるメカニズムを調べるために、本発明者らはまず、バクテロイデス・ブルガタスATCC 8482T株及びバクテロイデス・ドレイDSM 17855T株の経口摂取の腸管免疫に及ぼす影響を試験した。その結果、対照マウスと比べて、バクテロイデス属を経口摂取したマウスでは、ある特定の抗原提示細胞マーカー(CD11c、共刺激分子CD80)及び炎症誘発性サイトカインの結腸におけるmRNA発現が実質的に低下していた(図3a、b)さらに、腸管固有層から腸間膜リンパ節(MLN)への抗原提示細胞の移動に決定的に重要なCCR7のmRNA発現が、バクテロイデス属を経口摂取したマウスにおいて有意に低下していた(図3a)。そこで、本発明者らは次に、MLNにおける自然免疫応答を試験した。MLNのフローサイトメトリー解析により、バクテロイデス属を経口摂取したマウスでは、CD11c高発現細胞の存在量が有意に低いだけでなく、CD11c高発現細胞におけるToll様受容体4(TLR4)、MHCクラスII及びCD80の発現も有意に低下していた(図3c)。MLNにおけるサイトカインmRNAの発現もまた、対照マウスよりもバクテロイデス属を経口摂取したマウスにおいて低い傾向にあった(図3d)。これらの結果は、生きたバクテロイデス処理がTLR4発現の下方制御と関連した抗原提示細胞の活性化阻害を通じて、腸管免疫応答を抑制することを示唆している。
腸の漏出性に続いて腸内細菌叢組成が変化するとエンドトキシン血症や動脈硬化を促進するので(Circulation. 133, 2434-2446 (2016))、本発明者らは次に、生きたバクテロイデス属処理が腸のタイトジャンクション透過性に効果があるか否かを調査した。その結果、バクテロイデス・ブルガタスATCC 8482T株及びバクテロイデス・ドレイDSM 17855T株を経口摂取したマウスは、対照マウスに比べて、FITC標識デキストランの腸透過性の有意な低下(図4a)と、タイトジャンクション遺伝子zo1のmRNA発現の有意な上昇(図4b)を示し、それは結腸におけるZO-1の平均蛍光強度の上昇(図4c)に反映されていた。これらのデータは、生きたバクテロイデス属処理が、対照マウスにおける状態と比べて、タイトジャンクションのバリアを強化することを示している。結腸LPS濃度の変化がタイトジャンクション形成に影響があるか否かを明らかにするため、本発明者らは、糞便上清を用いて、上皮細胞の形態を有するHT29ヒト結腸直腸腺がん細胞を刺激した。その結果、インビボでの結果と一致して、対照マウス由来の糞便上清で刺激したHT29細胞よりも、生きたバクテロイデス属で処理したマウス由来の糞便上清で刺激したHT29細胞において、(mRNA及びタンパク質レベルで)有意に高いzo1(ZO-1)の発現レベルが観察された(図4d、e)。これらの結果は、腸内細菌叢により誘起される結腸LPS濃度の変化が、タイトジャンクションを介した傍細胞透過性に直接影響する可能性を示唆している。
CAD発生率とヒトにおける腸内細菌によるLPS産生との関係をさらに調査すべく、本発明者らは、16S rRNA遺伝子シーケンシングに用いたのと同じ糞便サンプルにおけるLPSレベルを測定した。その結果、CAD患者における糞便中LPSレベルは、非CAD対照におけるレベルより有意に高かった(図5a)。興味深いことに、バクテロイデス種の存在量は、糞便中LPSレベルと有意に負相関していた(R=-0.30,P=0.023)。さらに、糞便中LPSレベルとバクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイの%存在量との間に有意な負相関が認められた(R=-0.29,P=0.027)(図5b)。これらの結果は、バクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイが腸内細菌によるLPS産生を制御しており、それらの活性がヒトにおける動脈硬化の進展に影響を及ぼし得ることを強く示唆している。
上記2菌種併用投与の場合と同様の方法により、Apo-/-マウスにバクテロイデス・ブルガタスATCC 8482T株又はバクテロイデス・ドレイDSM 17855T株をそれぞれ単独で経口摂取させた。
結果を図10に示す。いずれの単独投与群でも、対照(ビヒクル投与)群と比較して、大動脈洞における動脈硬化病変は改善傾向にあったが、有意差はみとめられなかった。さらに、糞便中(腸内)LPSレベルはいずれの菌種の単独投与によっても低下しなかった。バクテロイデス・ドレイ単独投与群では、大腸のタイトジャンクション関連遺伝子の発現が対照群に比べて増大傾向にあり、バクテロイデス・ブルガタス単独投与群では、大腸でのサイトカイン遺伝子の発現が対照群に比べて低下していたが、血中サイトカイン濃度については、いずれの投与群でも有意な差は認められなかった。
以上の結果は、バクテロイデス・ブルガタスとバクテロイデス・ドレイとは、それぞれが異なる作用機序により、腸内に共存した場合にそれらの効果が相乗的に作用して、顕著なLPS制御性を発揮することを示唆している。
それぞれの菌の組み合わせ(生菌2.5×109 CFU/100μlずつ)を、Apoe-/-♀マウスあるいApoe-/-♂マウスに、それぞれ週5回経口投与した。Apoe-/-♀マウスには、6週齢~16週齢まで10週間投与して、16週齢の糞便中LPSを測定した。Apoe-/-♂マウスには6週齢~13週齢まで7週間投与して、13週齢の糞便中LPSを測定した。
結果を図12に示す。基準株(v,d)だけでなく、NT株(Nv,Nd)も糞便中LPS量を低下させた。
バクテロイデス・ブルガタスATCC8482T及びバクテロイデス・ドレイDSM 17855Tの菌の組み合わせ(生菌あるいは死菌。生菌として2.5×109 CFU/100μlずつ)を、Apoe-/-♀マウスにそれぞれ週5回経口投与した。6週齢~16週齢まで10週間投与して、16週齢の糞便中及び盲腸便中のLPSを測定した。また、5週齢~6週齢までAVNM(アンピシリン,バンコマイシン,ネオマイシン,メトロニダゾール)投与して、6週齢の糞便中LPSを測定した。
結果を図13に示す。図中右側及び左側が、バクテロイデス処理したApoe-/-♀マウスの、それぞれ糞便中及び盲腸便中LPSレベルを示す。また、図中中央は、抗生物質を投与したApoe-/-♀マウスの糞便中LPSレベルを示す。糞便中及び盲腸便中にて、生菌投与の場合LPS量が低下したが、死菌投与の場合はコントロール(NC)と変化は無かった。
C57BL/6J♂マウスに6週齢~18週齢の12週間、週5回投与した。NC群は通常食を投与し、Ctrl群は高脂肪食HFD(オリエンタル酵母工業製;60%脂肪を含む)及びバクテロイデス・ブルガタスあるいはバクテロイデス・ドレイを培養する際に用いる液体培地を200μl/回経口投与し、B群は高脂肪食及び生菌バクテロイデス・ブルガタスATCC8482T及び生菌バクテロイデス・ドレイDSM 17855Tを投与し、NB群は高脂肪食及び生菌バクテロイデス・ブルガタスNTZ002株及び生菌バクテロイデス・ドレイNTZ001株を投与した(図14-1A)。
その結果、高脂肪食に加えて基準株の2菌(B)あるいはNT株の2菌(NB)を投与した方が、Ctrl群と比較して体重増加が抑制された(図14-1B,C)。
1g OGTT試験を実施したところ、基準株の2菌(B)あるいはNT株の2菌(NB)を投与した方が、負荷後の血糖値の急激な上昇が抑えられ(図14-1D左)、AUC値が低く(図14-1D中央)、インスリン抵抗性(HOMA-IR)が低く(図14-1D右)、耐糖能の改善が確認できた。
精巣上体脂肪をHE染色、MAC3染色、あるいはシリウスレッド染色したところ(図14-2E左)、基準株の2菌(B)あるいはNT株の2菌(NB)を投与した方が、脂肪細胞の大きさが小さく、王冠様構造の数が少なく、繊維形成率が少なかった(図14-2E右)。
内臓脂肪(精巣上体周囲脂肪)のmRNA量を測定したところ、基準株の2菌(B)あるいはNT株の2菌(NB)を投与した方が、炎症細胞マーカーであるMCP1、F4/80、iNOS、CCR5、TLR4のmRNA発現はCtrl群と比べて低下し(図14-2F左)、Fizzi1(M2マクロファージマーカーで高い方が抗炎症とされている)のmRNA発現量は増加傾向であった(図14-2F左)。さらに、サイトカインIFNγ及びTNFαのmRNA発現は低下した(図14-2F右)。
C57BL/6J♂マウスに8週齢~17週齢の間、週5回投与した。Ctrl群は餌として超高脂肪コリン欠乏メチオニン減量食(EPS益新株式会社製NASHモデル作製用飼料)を投与、Bacteroides群はさらに生菌バクテロイデス・ブルガタスATCC8482T及び生菌バクテロイデス・ドレイDSM 17855Tを投与した。
17週齢で解剖し、肝臓をHE染色した結果、Ctrl群では脂肪肝と炎症細胞浸潤と肝細胞の風船様腫大を認めたが、基準株の2菌投与群では炎症細胞浸潤が著明に抑制され、風船様腫大は認めなかった(図15-1上)。基準株の2菌投与群ではさらにNAFLD活動性スコア(NAS)の改善、血中AST、AST/ALT比の有意な低下を認め、肝障害が著明に抑制された(図15-1中央、下、及び図15-2)。
ここで述べられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
Claims (4)
- (1)天然より分離されたバクテロイデス・ブルガタスの生菌を含む組成物と、
(2)天然より分離されたバクテロイデス・ドレイの生菌を含む組成物と
の組み合わせ物であって、以下の(a)~(c)のいずれかの疾患の予防及び/又は改善のための、組み合わせ物:
(a)アテローム性動脈硬化症、アテローム性プラークを伴う心筋梗塞、アテローム性プラークを伴う狭心症、又はアテローム性プラークを伴う閉塞性動脈硬化症;
(b)肝炎、非アルコール性脂肪肝炎、脂肪肝、腸管炎症、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、又はアトピー性皮膚炎;
(c)肥満、又は糖尿病。 - 前記(1)の組成物と前記(2)の組成物とが同一物である、請求項1に記載の組み合わせ物。
- 医薬品又は医薬品添加物である、請求項1又は2に記載の組み合わせ物。
- 食品もしくは飼料又はそのための添加物である、請求項1又は2に記載の組み合わせ物。
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