CN112105371A - 脂多糖控制性肠道细菌及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供下述(1)与(2)的组合：(1)包含由天然分离的普通拟杆菌(Bacteroides vulgatus)的活菌的组合物；(2)包含由天然分离的多氏拟杆菌(Bacteroides dorei)的活菌的组合物。

Description

脂多糖控制性肠道细菌及其用途

技术领域

本发明涉及脂多糖(以下，有时简记为“LPS”。)控制(调控)性肠道细菌及其用途。更详细而言，本发明涉及：可控制肠道细菌的LPS产生及其向血中的转移的属于拟杆菌属的两种特定细菌(即，普通拟杆菌(Bacteroides vulgatus)和多氏拟杆菌(Bacteroides dorei))的组合；包含该组合而构成的药品、食品等、特别是LPS所参与的疾病(例如，循环系统疾病、炎症性疾病、代谢性疾病)的预防和/或改善剂；以肠道菌群中的该细菌的存在量为指标的上述疾病的诊断方法等。

背景技术

通过增进对肠道菌群及其在宿主的代谢和免疫中的作用的理解，对于针对多种疾病的与肠道菌群相关的诊断和治疗目标的开发倾注了前所未有的关注。下一代测序技术或综合组学分析的普及急剧地扩展了我们对微生物界的了解。越来越多的证据暗示肠道菌群与心血管疾病之间的密切关系。例如，已知饮食性磷脂酰胆碱的通过肠道菌群产生的代谢物即三甲胺(TMA)和三甲胺-N-氧化物(TMAO)与心血管疾病、特别是动脉硬化的进程有关。

然而，最近的临床试验结果显示了：摄取鱼类会使血中TMAO水平短暂性地但却急剧地增加的矛盾结果，突显了目前在该领域关于饮食与肠道菌群的关系的理解有限。

已知拟杆菌属(Bacteroides)包含在人体内占优势的若干肠道细菌，对维持健康的肠道生态系统发挥重要作用。被分类为以拟杆菌属为低水平来表征的肠型3的个体，其症状性动脉硬化的发病频率高(非专利文献1)。而且，已查明在动脉硬化性的缺血性脑梗塞和短暂性脑缺血发作患者中拟杆菌属的存在量减少(非专利文献2)。与这些观察相一致，通过本发明人以前的利用了末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)分析的研究确认到：与具有动脉硬化的风险因子但未发生动脉硬化性疾病的患者或健康志愿者相比，在冠状动脉疾病(CAD)患者中拟杆菌门(Bacteroidetes)的存在量低(非专利文献3、4)。而且，通过基于鸟枪法测序技术的肠道细菌宏基因组分析，同样显示出CAD患者中的拟杆菌菌种的减少(非专利文献5)，这些认知强烈暗示了拟杆菌属与CAD的关系。

然而，关于是哪一种特定的拟杆菌种参与、且它们在CAD中的真正作用如何，还尚不清楚。

已知作为革兰氏阴性菌的细胞壁外膜成分的脂多糖(LPS)会激活巨噬细胞等免疫细胞，显示出代谢性内毒素血症与慢性炎症或糖尿病、动脉硬化等心血管-代谢性疾病有关(非专利文献6)。本发明人以前发现了：与常规条件下饲养的相同小鼠相比，在无菌ApoE缺陷小鼠中主动脉窦的动脉硬化病变的形成得到抑制；血中LPS水平或巨噬细胞和主动脉中的炎症性细胞因子水平也随之显示出低值(非专利文献7)。

另一方面，在专利文献1中公开了口服(经口)给予用的胶囊组合物，该组合物包含源自包括普通拟杆菌(Bacteroides vulgatus)在内的3种拟杆菌属细菌的成分(例如，LPS)，并记载了该组合物可用于各种炎症性疾病或自身免疫疾病等的治疗和发病延缓。然而，尚未证实这些组合物实际上具有该效能。

另外，在非专利文献8中记载了：源自多氏拟杆菌(Bacteroides dorei)的LPS与源自大肠杆菌的LPS结构不同，Toll样受体4 (TLR4)刺激能力弱，难以诱导自然免疫。

然而，完全没有关于拟杆菌属细菌会给包括其他肠道细菌在内的肠内的LPS产生整体带来影响的报道。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特表2013-527240号公报；

非专利文献

非专利文献1：Karlsson, F.H.等人, Nat Commun. 3, 1245 (2012)；

非专利文献2：Yin, J.等人, J Am Heart Assoc. 4, E002699 (2015)；

非专利文献3：Emoto, T.等人, J Atheroscler Thromb. 23, 908-921 (2016)；

非专利文献4：Emoto, T.等人, Heart Vessels. 32, 39-46 (2017)；

非专利文献5：Jie, Z.等人, Nat Commun. 18, 845 (2017)；

非专利文献6：Patel, P.N.等人, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 35, 525-534 (2015)；

非专利文献7：Kasahara, K.等人, J Lipid Res. 58, 519-528 (2017)；

非专利文献8：Vatanen, T.等人, Cell. 165, 842-853 (2016)。

发明内容

发明所要解决的课题

尽管在过去的10年间他汀类药物治疗得到普及，但在全世界CAD仍是主要死因之一。本发明的目的在于：鉴定新型且廉价的可作为CAD的预防和/或治疗策略的目标的肠道菌群的特定细菌种。

用于解决课题的手段

为了达到上述目的，本发明人首先进行16S核糖体RNA (rRNA)基因随机测序，比较了CAD患者和非CAD患者中的肠道菌群。其结果，发现在CAD患者中普通拟杆菌和多氏拟杆菌减少。而且，本发明人通过显示出动脉硬化倾向的ApoE缺陷小鼠中的一系列分析，阐明了连接这些拟杆菌种与动脉硬化的最根本的作用机制。即，发现了：这些拟杆菌种在显著抑制肠道细菌的LPS产生的同时强化肠道屏障的紧密连接，从而使该屏障的通透性(透过性)降低，抑制LPS向血中转移(即，诱发内毒素血症)，从而抑制炎症诱发性免疫应答，阻碍动脉硬化病变的形成。

本发明人根据这些认知进一步反复研究，结果得出以下结论：摄取普通拟杆菌和多氏拟杆菌对预防和/或改善以动脉硬化为代表的循环系统疾病或炎症性疾病、代谢性疾病有效，另外，以肠道菌群中的该拟杆菌种的存在量为指标可诊断上述疾病，从而完成了本发明。

即，本发明提供以下内容。

[1] 下述(1)和(2)的组合：

(1) 包含由天然分离的普通拟杆菌的活菌的组合物；以及

(2) 包含由天然分离的多氏拟杆菌的活菌的组合物。

[2] [1]所述的组合，其中，上述(1)的组合物和上述(2)的组合物为同一物质。

[3] [1]或[2]所述的组合，该组合为药品或药品添加剂。

[4] [1]或[2]所述的组合，该组合为食品或饲料或用于其的添加剂。

[5] [1]～[4]中任一项所述的组合，该组合用于预防和/或改善与血中或肠内脂多糖水平亢进有关的疾病。

[6] [5]所述的组合，其中，上述疾病为循环系统疾病、炎症性疾病或代谢性疾病。

[7] [5]所述的组合，其中，上述疾病为选自心房颤动、心功能不全、缺血性心脏病、心肌梗塞、心绞痛、高血压、动脉硬化、主动脉瘤、主动脉夹层、闭塞性动脉硬化、主动脉瓣狭窄的循环系统疾病。

[8] [5]所述的组合，其中，上述疾病为选自肝炎、非酒精性脂肪肝炎、脂肪肝、肝癌、肠道炎症、过敏性肠综合征(肠易激综合症)、胃炎、胶原病、慢性类风湿性关节炎、慢性肾炎、IgA肾病、支气管哮喘、间质性肺炎、药物性肺损伤、嗜酸粒细胞性肺浸润综合征、非典型耐酸菌病、过敏性鼻炎、特应性皮炎和败血症的炎症性疾病。

[9] [5]所述的组合，其中，上述疾病为选自糖尿病、肥胖、代谢综合征、生活习惯病(生活方式病)、脂质异常症和骨质疏松症的代谢性疾病。

[10] 与血中或肠内脂多糖水平亢进有关的疾病的预防和/或改善方法，该方法包括：口服摄取由天然分离的普通拟杆菌的活菌和由天然分离的多氏拟杆菌的活菌。

[11] [10]所述的方法，其中，上述疾病为循环系统疾病、炎症性疾病或代谢性疾病。

[12] 与血中或肠内脂多糖水平亢进有关的疾病的检查方法，该检查方法包括：测定受试者的肠道菌群中的普通拟杆菌和多氏拟杆菌的存在量。

[13] [12]所述的方法，其中，上述疾病为循环系统疾病、炎症性疾病或代谢性疾病。

[14] [12]或[13]所述的方法，该方法包括：检测下述(1)和(2)的16S rRNA基因：

(1) 包含与SEQ ID NO: 1或2所表示的核苷酸序列具有98%以上的同源性的核苷酸序列的16S rRNA基因；以及

(2) 包含与SEQ ID NO: 3或4所表示的核苷酸序列具有98%以上的同源性的核苷酸序列的16S rRNA基因。

[15] 与血中或肠内脂多糖水平亢进有关的疾病的发病风险的检查用试剂，该试剂包含：可检测普通拟杆菌和多氏拟杆菌的16S rRNA基因的引物组或探针。

[16] [15]所述的试剂，其中，上述疾病为循环系统疾病、炎症性疾病或代谢性疾病。

[17] [15]或[16]所述的试剂，其中，16S rRNA基因包含下述(1)和(2)的核苷酸序列：

(1) 与SEQ ID NO: 1或2所表示的核苷酸序列具有98%以上的同源性的核苷酸序列；以及

(2) 与SEQ ID NO: 3或4所表示的核苷酸序列具有98%以上的同源性的核苷酸序列。

发明效果

根据本发明，通过口服摄取可大量发酵生产的微生物(益生菌)，可预防和/或改善以动脉硬化为代表的循环系统疾病或伴有慢性炎症的疾病、伴有糖脂质代谢等的代谢异常的代谢性疾病，因此可提供这些疾病的廉价且简便的控制策略，也有助于老龄化社会中的医疗经济。另外，根据本发明，通过粪便中的微生物组分析，可进行上述疾病的诊断/发病风险预测，提供非侵袭性的临床检查方法。

附图说明

[图1]是显示CAD患者或非CAD患者中的肠道微生物的变化的图。在源自30名对照(虽然未发生CAD，但却具有冠状动脉的风险因子)患者和30名CAD患者的粪便样品中，对细菌16S rRNA的V3-V4区进行测序。(a)根据肠道微生物群中的属的存在量将参加者分类为3个簇。(b)簇间的各主要属的分布。为了比较各属的簇间分布，采用了单因素方差分析(One-way ANOVA)。(c)各簇中的对照和CAD患者的分布。为了比较3个簇，采用了卡方检验。(d)对照和CAD患者中的拟杆菌属的相对存在量(肠道总微生物群的百分比)。(e)对照和CAD患者中的拟杆菌种的相对存在量(相对于总拟杆菌属的百分比)。(f)普通拟杆菌和普通拟杆菌的相对存在量(肠道总微生物群的百分比)。*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001。为了确定统计学的显著性，采用了Mann-Whitney的U检验(b、d、f)。数据以中央值±四分位距(第1～第3四分位距)来显示(b、d、f)。

[图2]是显示动脉粥样硬化和斑块炎症的发病中的、伴有活的普通拟杆菌和多氏拟杆菌的胃管营养的影响的图。将用活的普通拟杆菌ATCC 8482^T株和多氏拟杆菌DSM17855^T株或媒介(对照)进行了处理的6周龄的雌Apoe^-/-小鼠在16周龄时宰杀，评价由动脉粥样硬化引起的病变。(a)主动脉窦中的动脉粥样硬化的病变区域(area，面积)的油红O染色的代表性的显微镜照片和定量分析(每组8-9个样品)。黑棒表示200μm。(b)主动脉的粥样硬化性斑块区域的油红O染色的代表性的显微镜照片和定量分析(每组7-9个样品)。白棒表示1.5mm。(c)主动脉窦中的巨噬细胞的代表性的荧光染色和MOMA-2阳性染色的定量分析(每组7个样品)。黑棒表示100μm。(d)主动脉窦中的CD4⁺ T细胞的代表性的切片和定量分析(每组8-9个样品)。黑棒表示50μm。(e)粥样硬化性主动脉中的mRNA水平。将数据相对于持家GAPDH基因进行标准化，以平均值显示(每组4-5个样品)。(f)整个实验期间的体重变化(每组8-9个样品)。(g)血浆脂质分布型的比较(每组8-9个样品)。LB：用活的普通拟杆菌ATCC8482^T株和多氏拟杆菌DSM 17855^T株进行了处理；T-Cho：总胆固醇；TG：甘油三酯；LDL：低密度脂蛋白胆固醇；HDL：高密度脂蛋白胆固醇。*P＜0.05、Student的双侧t检验。数据以平均±平均的标准误差来显示。

[图3]是显示肠道的免疫应答中的变化和肠道微生物的脂多糖(LPS)产生的图。由用普通拟杆菌ATCC 8482^T株和多氏拟杆菌DSM 17855^T株或媒介(对照)进行了处理的16周龄的雌Apoe^-/-小鼠切除结肠和肠系膜淋巴结(MLNs)。(a)结肠中的免疫细胞标志物和趋化因子/趋化因子受体的mRNA表达水平(每组7-8个样品)。(b)结肠中的炎症诱发性细胞因子的mRNA表达水平(每组7-8个样品)。(c) MLN中的特异性细胞标志物的流式细胞术分析(每组4-5个样品)。(d) MLN中的细胞因子的mRNA表达水平(每组5个样品)。(e)通过鲎变形细胞溶解物(裂解物)测定进行的粪便LPS水平的定量(每组7-8个样品)。(f)通过鲎变形细胞溶解物测定进行的血浆LPS水平的定量(每组5个样品)。(g)利用细胞因子/微珠阵列进行的血浆细胞因子水平的定量(每组4-5个样品)。LB：用活的普通拟杆菌ATCC 8482^T株和多氏拟杆菌DSM 17855^T株进行了处理；MFI：平均荧光强度。为了检测两组间的显著差异，采用了Student的双侧t检验。数据以平均±平均的标准误差来表示(a-g)。*P＜0.05、**P＜0.01。

[图4]是显示在紧密连接形成中活的拟杆菌处理的影响的图。(a)小鼠经口胃管营养后4小时的、血清的异硫氰酸荧光素(FITC)标记葡聚糖浓度的测定(每组4-5个样品)。(b)小鼠结肠中的紧密连接基因的mRNA表达水平(每组7-8个样品)。(c)通过免疫荧光染色可见化的紧密连接蛋白ZO-1 (每组4-5个样品)。白棒表示250μm。(d)用粪便上清刺激的HT29细胞中的紧密连接基因的mRNA水平(每组5个样品)。(e)用粪便上清刺激的HT29细胞中的ZO-1表达的蛋白质印迹分析(相对于β肌动蛋白进行标准化)(每组8个样品)。LB：用活的普通拟杆菌ATCC 8482^T株和多氏拟杆菌DSM 17855^T株进行了处理；LPS：脂多糖；MFI：平均荧光强度。*P＜0.05、**P＜0.01、Student的双侧t检验。数据以平均±平均的标准误差来表示。

[图5]是显示具有或不具有CAD的患者中的肠道微生物LPS产生的图。(a)在与16SrRNA基因测序中使用的样品相同的样品中，通过鲎变形细胞溶解物测定来定量粪便LPS水平(每组29-30个样品)。为了确定显著性，采用了Student的双侧t检验。*P＜0.05。数据以中央值±四分位距(第1～第3四分位距)显示。(b)关于普通拟杆菌和多氏拟杆菌的粪便LPS水平和相对量之间的统计学相关，通过确定Pearson的相关系数，计算单纯的线性相关(59个样品；29名对照和30名CAD)。CAD：冠状动脉疾病患者。

[图6]是显示CAD患者或非CAD患者中的肠道微生物群分布型的图。为了比较肠道微生物群的分布，实施了按种水平的主成分分析。在主成分中显示更重要的菌种。

[图7]是显示具有动脉粥样硬化倾向的小鼠的肠道微生物群中的、伴有活的普通拟杆菌和多氏拟杆菌的胃管营养的影响的图。由摄取普通饲料、以及用活的普通拟杆菌ATCC 8482^T株和多氏拟杆菌DSM 17855^T株或媒介进行了处理的饲料达10周的雌Apoe^-/-小鼠采集粪便。对细菌16S rRNA的V3-V4区进行测序。(a)在处理前后存在量最多的15个微生物属的相对存在量。(b)按属水平的主成分分析(PCA)评分图。(c)从Shannon-Wiener指标的角度确定的肠道微生物的多样性。(d)处理后的革兰氏阳性株与革兰氏阴性株之比。(e)处理后的普通拟杆菌和多氏拟杆菌DNA在粪便中的存在量相对增加(每组n=3)。LB：伴有活的普通拟杆菌ATCC 8482^T株和多氏拟杆菌DSM 17855^T株的胃管营养；before：实验前；after：胃管营养后10周。

[图8]是显示通过用小鼠粪便上清进行体外刺激而引起的细胞增殖和细胞因子产生的抑制的图。历经10周使用源自用活的普通拟杆菌ATCC 8482^T株和多氏拟杆菌DSM17855^T株或媒介(对照)进行了处理的小鼠的粪便上清刺激RAW264.7细胞。(a)代表性的流式细胞术的直方图(左图)和Ki-67表达的定量分析(右图)(每组5个样品)。(b)用源自各组小鼠的粪便上清刺激经对照siRNA或TLR4 siRNA转染的RAW264.7细胞。通过细胞因子/微珠阵列定量细胞因子水平(每组7个样品)。LB：用活的普通拟杆菌ATCC 8482^T株和多氏拟杆菌DSM 17855^T株进行了处理；MFI：平均荧光强度。为了检测两组间的显著差异，采用了Student的双侧t检验(a)或Mann-Whitney的U检验(b)。数据以平均±平均的标准误差(a)或中央值±四分位距(第1～第3四分位距)(b)来表示。*P＜0.05、**P＜0.01。

[图9]是显示活的拟杆菌处理和脾脏中的免疫应答的图。由用普通拟杆菌ATCC8482^T株和多氏拟杆菌DSM 17855^T株或媒介(对照)进行了处理的16周龄Apoe^-/-小鼠采集脾细胞。(a)脾细胞中的表达的免疫细胞的百分比(每组4-5个样品)。(b) CD11c^high抗原提示细胞中的免疫细胞标志物的表达(每组4-5个样品)。(c) CD4⁺T细胞数。(d) CD4⁺T细胞数中的免疫细胞标志物(每组5个样品)。(e) CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺Tregs中的CTLA4表达(每组5个样品)。LB：用活的普通拟杆菌ATCC 8482^T株和多氏拟杆菌DSM 17855^T株进行了处理；Tregs：调节性T细胞；MFI：平均荧光强度。*P＜0.05。为了检测两组间的显著差异，采用了Student的双侧t检验。数据以平均±平均的标准误差来表示。

[图10]是显示活的普通拟杆菌ATCC 8482^T株或多氏拟杆菌DSM 17855^T株的单独给予对ApoE缺陷小鼠产生的效果的图。对照组仅口服摄取媒介。上段左显示主动脉窦的动脉硬化病变的大小，上段右显示肠道内(粪便中) LPS浓度。下段左上显示大肠中的紧密连接相关基因的表达，下段右上显示大肠中的细胞因子基因的表达，下段左下显示血中细胞因子浓度。

[图11]是显示普通拟杆菌ATCC 8482^T株的16S rRNA基因与多氏拟杆菌JCM 13471^T株的16S rRNA基因的比对的图。

[图12]是显示普通拟杆菌(ATCC 8482^T株(v)和NTZ002株(Nv))与多氏拟杆菌(DSM17855^T株(d)和NTZ001株(Nd))的各种组合对动脉硬化小鼠模型中的粪便中LPS水平的改善效果的图。

[图13]是显示给予了普通拟杆菌ATCC 8482^T株和多氏拟杆菌DSM 17855^T株的活菌或死菌的动脉硬化小鼠中的肠内LPS水平的图。图中左侧和右侧分别显示给予了拟杆菌的小鼠的粪便中和盲肠便中的LPS水平，中央显示给予了抗生素(AVNM)的小鼠的粪便中的LPS水平。

[图14-1]图14-1和图14-2显示给予了普通拟杆菌ATCC 8482^T株和多氏拟杆菌DSM17855^T株(B)或普通拟杆菌NTZ002株和多氏拟杆菌NTZ001株(NB)的活菌的肥胖小鼠模型中的肥胖的各种症状的改善。A示意性地显示各组的给予方案。B和C分别显示小鼠的体重变化和体重增加量的变化。D显示OGTT试验的结果(左起为血糖值、血糖值的AUC和胰岛素抵抗性(HOMA-IR))。

[图14-2] E显示附睾脂肪标本的HE、MAC3和天狼星红染色图像(左)、以及从上起显示脂肪细胞的大小、每单位细胞的冠状结构数和纤维化区域的比例(右)。F显示附睾周围的脂肪中的炎症细胞标志物或巨噬细胞标志物的mRNA表达(左)和细胞因子IFNγ和TNFα的mRNA表达。

[图15-1]图15-1和图15-2显示给予了普通拟杆菌ATCC 8482^T株和多氏拟杆菌DSM17855^T株的活菌的NASH小鼠模型中的NASH的各种症状的改善。上图显示17周龄的肝脏切片的HE染色图像。中图显示NAFLD活动性评分(NAS)，下图从左起显示血中AST水平和AST/ALT比。

[图15-2]显示切除的肝脏的整体图像。

具体实施方式

1. 脂多糖(LPS)控制性肠道细菌

本发明提供作为属于拟杆菌属的细菌的普通拟杆菌和多氏拟杆菌的组合(以下，也称为“本发明的组合”。)。这里，“组合”是指可作为混合有两者的1种组合物而存在，或者可分别作为单个的组合物而存在，但为了某种目的(例如，药品、食品或食品添加剂、饲料或饲料添加剂)而组合使用的成套(kit)的状态的物质。本发明的组合通过在人或其他动物的肠内共存，可降低肠内的LPS水平，强化肠道屏障的紧密连接以降低血中LPS水平，抑制在肠内、血管内和脏器内的炎症应答/免疫应答(在本说明书中，有时将这些作用效果总括地称为“脂多糖(LPS)控制性)。

更具体而言，“本发明的组合”是组合下述的(1)和(2)而形成的：

(1) 包含由天然分离的普通拟杆菌的活菌的组合物；以及

(2) 包含由天然分离的多氏拟杆菌的活菌的组合物。

拟杆菌属(Bacteroides)是分类为拟杆菌门、拟杆菌纲、拟杆菌目、拟杆菌科的真正细菌的革兰氏阴性的专性厌氧性非芽孢形成杆菌，现在已知有92个种和5个亚种。拟杆菌属包括在人体中占优势的若干肠道细菌，认为其对维持健康的肠道生态系统发挥重要的作用。

普通拟杆菌(Bacteroides vulgatus)是最常由人消化道分离的细菌，通常认为其是有益的偏利共栖菌。多氏拟杆菌(Bacteroides dorei)于2006年从人粪便中分离，通过16S rRNA基因测序鉴定为与普通拟杆菌最接近的(具有约96%的同源性)新菌种(Int J SysEvol Microbiol. 56, 1639-1643, 2006)。

在本说明书中，“由天然分离”是指施行人为操作使菌体密度较自然界本来存在的状态高的分离，不仅包括完全纯化(分离纯化)的情形，还包括包含有其他夹杂物的状态的情形。另一方面，在仅采集像粪便或盲肠内容物等这样的天然物的情况下，不包括在“由天然分离”的情形中。

作为本发明的组合的活性成分的普通拟杆菌和多氏拟杆菌只要是由天然分离的细菌即可，可通过任何的方法提供，例如可使用由天然的分离源(例如，粪便、盲肠等的消化道内容物、土壌、水)新分离的细菌。作为分离源，优选为人或其他哺乳动物的粪便。例如，可将粪便样品悬浮在无菌的磷酸缓冲生理盐水(PBS)等中，将所得悬浮液用白金接种环(白金环)等接种在适合培养拟杆菌属细菌的平板培养基中，根据出现的菌落的菌学特征(形态学特征、生物化学特征等)选择普通拟杆菌和多氏拟杆菌的菌落。以下，显示两菌种的代表性的菌学特征。

(1) 肉眼特征

(1-1) 在添加有5%马血的Eggerth Gagnon (EG)琼脂培养基上形成圆形、白色、隆起成凸状的菌落。

(1-2) 显微镜学特征：杆菌没有活动性，没有形成芽孢。

(2) 生长条件

(2-1) 温度：在25～40℃下生长。最适温度为37℃；

(2-2) 专性厌氧性；

(3) 生理学/生物化学特征

(3-1) 革兰氏染色性：阴性；

(3-2) 其他生物化学特征见表1 [表中，1显示多氏拟杆菌JCM13471^T株，2显示多氏拟杆菌JCM13472株，3显示普通拟杆菌JCM5826^T株。生物化学试验使用API 20 A和API快速ID32 A试纸(bioMerieux)来进行。](摘录自Int J Sys Evol Microbiol. 56, 1639-1643,2006)。

[表1]

由分离源分离的细菌是否是属于普通拟杆菌或多氏拟杆菌的菌株，例如可如下判别：以由该菌株提取的基因组DNA为模板，对16S rRNA基因的全部或一部分进行PCR扩增，确定该扩增片段的核苷酸序列，与已知的普通拟杆菌和多氏拟杆菌的序列数据进行比较，并进行系统分析，即可判别。系统分析和系统树的制作方法例如可按照以下的顺序进行。

首先，由细菌提取作为模板的基因组DNA。由细菌提取DNA的方法是已知的，可采用任一种方法。通常采用下述方法：使用溶菌酶等细胞壁分解酶对细胞进行处理的方法、使用玻璃珠进行物理破坏的方法、反复进行冻融的处理方法等。另外，还可使用市售的DNA提取用试剂。基因组DNA可未必以完整的状态提取。因此，可适当选择样品污染的可能性低、操作简单、并可快速进行的方法。

接下来，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增编码16S rRNA的靶DNA。PCR中使用的引物的序列可适当设计成至少编码属于普通拟杆菌和/或多氏拟杆菌的所有已知细菌的16SrRNA的靶DNA被扩增，通常使用由超越生物种保存的序列构成的引物(通用引物；例如，扩增V1～V2区的约350个碱基的27F和357R的引物组、或后述的实施例中使用的扩增V3～V4区的约460个碱基的342F和806R的引物组等)。另外，对PCR的条件没有特别限定，可在通常使用的范围内适当选择。可使用市售的PCR用试剂，按照附带的说明书进行反应。

通过PCR扩增的DNA片段在根据需要使用旋转柱等进行纯化后，确定其核苷酸序列。核苷酸序列的确定可按照常规方法进行。

所确定的核苷酸序列通过使用适当的基因序列数据库和同源性检索程序进行与已知的细菌16S核糖体DNA序列的同源性检索，即可提取显示出最高同源性的已知序列。例如，通过日本DNA数据库(DDBJ)的首页，可利用BLAST或FASTA。如果选择blastn或fasta作为程序，以所确定的核苷酸序列作为待查序列(Query)，选择16S rRNA (Prokaryotes)作为检索对象数据库实施检索，则可提取显示出高同源性的已知序列并输出。只要包含细菌的16SrRNA基因的核苷酸序列的数据集即可，还可利用任何的其他基因序列数据库(例如，RDP(http://rdp.cme.msu.edu)、Silva (http://www.arb-silva.de)等)。另外，还可使用除上述以外的自身已知的同源性检索程序。

通常，对于细菌，在按属水平的鉴定中需要95%以上的16S rRNA基因序列的同源性，而在按种水平的鉴定中需要98%以上的16S rRNA基因序列的同源性(Science 2005,307, 1915-1920)。因此，同源性检索的结果，在所分离的细菌的16S rRNA基因的序列与属于普通拟杆菌或多氏拟杆菌的细菌的已知序列具有98%以上的同源性的情况下，可将该细菌鉴定为属于上述任一种拟杆菌种的细菌。

作为判别标准的已知的16S rRNA基因序列，在普通拟杆菌的情况下，例如可列举：源自在GenBank中以检索号NR_074515注册的普通拟杆菌ATCC 8482^T株的序列(SEQ ID NO:1)、源自以检索号NR_112946注册的普通拟杆菌JCM5826^T株的序列(SEQ ID NO: 2)等，但并不限于这些。另一方面，作为多氏拟杆菌的已知16S rRNA基因序列，例如可列举：源自在GenBank中以检索号AB242142注册的多氏拟杆菌JCM13471^T株的序列(SEQ ID NO: 3)、源自以检索号AB242143注册的多氏拟杆菌JCM13472株的序列(SEQ ID NO: 4)等，但并不限于这些。

因此，在上述PCR扩增片段的核苷酸序列与SEQ ID NO: 1或2所表示的核苷酸序列具有98%以上的同源性的情况下，所分离的细菌可鉴定为属于普通拟杆菌的细菌。另外，在上述扩增片段的核苷酸序列与SEQ ID NO: 3或4所表示的核苷酸序列具有98%以上的同源性的情况下，所分离的细菌可鉴定为属于多氏拟杆菌的细菌。

另外，还可根据已扩增的DNA的核苷酸序列推断分子进化系统树，特定所分离的细菌的分类学位置。分子进化系统树分析软件在互联网等中也有公开，可利用这些软件(CLUSTAL W等)。系统树分析的结果，在所分离的细菌定位在与属于普通拟杆菌或多氏拟杆菌的细菌相同的簇内的情况下，可将该细菌鉴定为属于任一个拟杆菌种的细菌。

或者，本发明的组合中使用的普通拟杆菌和多氏拟杆菌可以是已经分离并市售、或者保存在保藏机关并可分让的菌株。作为这样的菌株，在普通拟杆菌的情况下，例如可列举：ATCC 8482^T株、DSM 1447^T株、JCM 5826^T株、NBRC 14291^T株、NCTC 11154^T株、NTZ002株等，在多氏拟杆菌的情况下，例如可列举：DSM 17855^T株、JCM 13471^T株、JCM 13472株、NTZ001株等，但并不限于这些。NTZ002株和NTZ001株于2019年1月15日分别被赋予NITE BP-02863和NITE BP-02862的保藏号，国际保藏在独立行政法人制品评价技术基盘机构 专利微生物保藏中心(〒292-0818 日本千叶县木更津市上总镰足2-5-8 122号室)。

本发明的组合中使用的普通拟杆菌和多氏拟杆菌只要是通过在人或其他动物的肠内共存，而可降低肠内的LPS水平，强化肠道屏障的紧密连接以降低血中LPS水平，抑制在肠内、血管内和脏器内的炎症应答/免疫应答(即，具有LPS控制性)即可，可以是任何菌株的组合。在一个优选实施方案中，可列举普通拟杆菌ATCC 8482^T株或NTZ002株与多氏拟杆菌DSM 17855^T株或NTZ001株的组合，但并不限于此。

本发明的组合中使用的普通拟杆菌或多氏拟杆菌只要在分别与作为并用菌的多氏拟杆菌或普通拟杆菌组合的情况下可发挥LPS控制性即可，不仅可以是通过上述的任一种方法得到的来自天然分离源的分离株(野生株)，还可以是对这些分离株施行诱变处理而得到的突变体。作为诱变处理，例如可列举：暴露在亚硝基化合物(例如，亚硝基胺、亚硝基胍)、烷基化剂(例如，甲磺酸乙酯(EMS))等化学物质中的方法；或紫外线照射、放射线照射等，但并不限于这些。关于所得的突变株在与并用菌组合的情况下是否显示出LPS控制性，例如可对疾病动物模型(例如，ApoE缺陷动脉硬化小鼠模型、肥胖小鼠模型、NASH小鼠模型等)给予该突变株和并用菌，在可见症状的改善、各种参数(例如，血中或肠内LPS水平、血中细胞因子水平、肠道屏障功能、体重、脏器重量、病理组织检查等)的改善的情况下，可判定为该突变株具有LPS控制性。或者，在用该动物模型的粪便上清来刺激巨噬细胞等免疫细胞的情况下，添加该突变株和并用菌，在显示出该细胞的增殖或炎症性细胞因子的产生抑制作用的情况下，可判定为该突变株具有LPS控制性。

如此操作而得到的普通拟杆菌和多氏拟杆菌可在自身已知的培养条件下进行培养，并维持扩增。

作为培养基，可使用ATCC培养基2107 (10g蛋白胨、10g牛肉提取物、3g酵母提取物、5g葡萄糖、5g NaCl、1g可溶性淀粉、0.5g L-半胱氨酸盐酸盐、3g乙酸钠、4mL 0.025%的刃天青、1L蒸馏水)、ATCC培养基260 (15g胰胨、5g大豆胨、5g NaCl、50mL脱纤维羊血、950mL蒸馏水)、添加有5%马血的EG培养基等。这些培养基既可用作液体培养基，也可添加例如1.5%的琼脂而用作固体培养基。

由于普通拟杆菌和多氏拟杆菌为专性厌氧性细菌，所以培养在厌氧条件下(氧浓度为1ppm以下)进行。例如，可在厌氧气室内、在10% CO₂、10% H₂和80% N₂混合气体环境下进行培养。培养温度为25～40℃、优选约37℃。作为培养期间，例如可列举12～72小时、优选24～48小时，但没有特别限定。

普通拟杆菌和多氏拟杆菌只要彼此不给生长或生物活性带来不良影响即可，还可在同一培养基中进行混合培养。另外，本发明的组合中所包含的普通拟杆菌和多氏拟杆菌可分别为单一菌株，也可以是2个以上的菌株的混合物。

如此操作而得到的普通拟杆菌和多氏拟杆菌的培养物，在使用之前，例如可按照自身已知的方法以GLYCEROL STOCK的形式在-80℃以下冷冻保存、或者按照自身已知的方法冻干并在2～8℃下保存。

2. 本发明的组合

普通拟杆菌和多氏拟杆菌只要是活的状态(活菌)即可，可将上述培养物(菌体)直接、或者以通过自身已知的方法、例如离心分离、过滤、磁性分离等方法由该培养物回收的湿菌体或其洗涤物(可利用灭菌水、培养基、PBS等洗涤)或它们的冻干粉末等的“菌体处理物”的状态掺混在包含这些菌的组合物中。尚需说明的是，在本说明书中，以下只要没有特别说明，则“菌体”或“菌体处理物”以不包含死菌或菌体破碎物、菌体提取物、菌体成分等的“非活的”状态的成分的意义使用。

关于普通拟杆菌的菌体或菌体处理物和多氏拟杆菌的菌体或菌体处理物，它们可单独或者与药品上或食品或饲料加工上可接受的添加剂一起制成制剂。或者，该菌体或菌体处理物可作为药品添加剂或者食品或饲料添加剂掺混在药品组合物或食品或饲料中。在本发明的组合中，普通拟杆菌的菌体或菌体处理物和多氏拟杆菌的菌体或菌体处理物可作为单个的组合物制成制剂，再以成套制剂的形式使用，但优选掺混在同一组合物中，可用作单一的制剂。

在将普通拟杆菌的菌体或菌体处理物和多氏拟杆菌的菌体或菌体处理物以单个的组合物的形式提供的情况下，这些组合物可同时或间隔时间差以同一途径或不同途径进行接种。

在将本发明的组合作为药品或药品添加剂来提供的情况下，掺混该药品或该添加剂的药品例如可制成散剂、颗粒剂、丸剂、软胶囊、硬胶囊、片剂、咀嚼片、速崩片、糖浆、溶液剂、悬浮剂、栓剂、注入剂等制剂。

例如，作为用于口服给予的组合物，可列举固体或液体的剂型，具体而言，有片剂(包括糖衣片、薄膜包衣片)、丸剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂(包括软胶囊剂)、糖浆剂、乳剂、悬浮剂等。这样的组合物可通过已知的方法来制备，可含有制剂领域通常使用的添加剂、例如赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂等。作为赋形剂，例如可列举：大豆油、藏红花油、橄榄油、胚芽油、葵花油、牛油、沙丁鱼油等动植物性油；聚乙二醇、丙二醇、甘油、山梨醇等多元醇；脱水山梨糖醇脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯、聚甘油脂肪酸酯等表面活性剂；纯净水、乳糖、淀粉、结晶纤维素、D-甘露醇、卵磷脂、阿拉伯胶、山梨醇溶液、糖液等。作为粘合剂，例如可列举：羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、明胶、α化淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇等。作为崩解剂，例如可列举：羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮、低取代度羟丙基纤维素、玉米淀粉等。作为润滑剂，例如可列举：滑石、氢化植物油、蜡类、轻质硅酸酐等天然物来源及其衍生物等；硬脂酸、硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸铝等。

在上述组合物中，还可进一步添加甜味剂、着色剂、pH调节剂、香料、各种氨基酸等。另外，片剂、颗粒剂可通过已知的方法包衣。如果是液体制剂，则可以是在服用时溶解或悬浮于水或其他适当的介质的形式。

作为用于胃肠外给予的组合物，例如使用注入剂、栓剂等。作为注入剂的调制方法，例如可通过将普通拟杆菌和多氏拟杆菌的菌体或菌体处理物在通常注入剂所使用的无菌水性溶液或油性溶液中悬浮或乳化来调制。作为注入用的水性溶液，例如使用生理盐水、含有葡萄糖或其他辅药的等渗溶液等。作为油性溶液，例如使用芝麻油、大豆油等。用于直肠给予的栓剂可通过将普通拟杆菌和多氏拟杆菌的菌体或菌体处理物混合在普通的栓剂用基质(基剂)中来调制。

而且，在作为药品或药品添加剂来提供的情况下，本发明的组合可根据对象疾病与其他药剂、例如抗炎药、抗动脉硬化药、抗糖尿病药等并用。本发明的组合和并用剂可作为单一的组合物(合剂)制成制剂，也可作为单个的组合物来提供。在作为单个的组合物来提供的情况下，本发明的组合和并用剂可同时或间隔时间差以同一途径或不同途径向对象进行给予。

在将本发明的组合作为食品(或饲料)或食品添加剂(或饲料添加剂)来提供的情况下，掺混该食品(或饲料)或该添加剂的食品(或饲料)只要是溶液、悬浮物、粉末、固体成型物等可口服摄取的形态即可，没有特别限定。作为具体例子，可列举：补充剂(散剂、颗粒剂、软胶囊、硬胶囊、片剂、咀嚼片、速崩片、糖浆、溶液剂等)、饮料(碳酸饮料、乳酸饮料、运动饮料、果汁饮料、蔬菜饮料、豆乳饮料、咖啡饮料、茶饮料、粉末饮料、浓缩饮料、营养饮料、酒精饮料等)、乳产品(酸奶、黄油、奶酪、冰淇淋等)、点心(软糖、果冻、口香糖、巧克力、曲奇、糖果、焦糖、日式点心、零食等)、方便食品类(方便面、方便食品(灭菌袋装食品)、罐头、微波炉食品、方便汤/味噌汁类、冻干食品等)、油、油脂食品(蛋黄酱、调味汁、奶油、人造黄油等)、小麦粉产品(面包、意大利面、面条、蛋糕混合粉、面包粉等)、调味料(酱汁、番茄加工调味料、风味调味料、烹饪混合料、高汤类等)、畜产加工品(畜肉火腿/香肠等)。

在上述食品(或饲料)中，根据需要可掺混各种营养素、各种维生素类(维生素A、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K等)、各种矿物质类(镁、锌、铁、钠、钾、硒等)、食物纤维、分散剂、乳化剂等稳定剂、甜味剂、呈味成分(柠檬酸、苹果酸等)、香精、蜂王浆、蜂胶、落叶松蕈等。

作为本发明的组合中所含的普通拟杆菌和多氏拟杆菌的活菌数，以每天的摄取量计，例如为10⁴～10¹²菌落形成单元(cfu)，优选10⁶～10¹⁰cfu。

在本发明的组合中，还可进一步掺混其他有效的微生物的菌体或菌体处理物。作为这样的其他的微生物，例如可列举：属于乳杆菌属(Lactobacillus)、链球菌属(Streptococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、足球菌属(Pediococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)等的乳酸菌、酵母、芽孢杆菌属(Bacillus)、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)、曲霉菌等，但并不限于这些。这些并用微生物只要可见有效性即可，不仅以活菌的状态、还能以死菌或菌体破碎物、菌体提取物、菌体成分等形态掺混在本发明的组合中。

作为并用微生物的掺混量，以每天的摄取量计，例如为10⁴～10¹²菌落形成单元(cfu)，优选为10⁶～10¹⁰cfu。

3. 本发明的组合的用途

如上所述，普通拟杆菌和多氏拟杆菌通过在肠内共存，可降低肠内的LPS水平，强化肠道屏障的紧密连接以降低血中LPS水平，抑制在肠内、血管内和脏器内的炎症应答/免疫应答(即，具有LPS控制性)，因此通过在肠道菌群中富集两菌种，可预防和/或改善与血中或肠内的LPS水平亢进有关的疾病。因此，本发明的组合可用作用于预防和/或改善这些疾病的药品或药品添加剂、或者功能性食品(或饲料)或食品(或饲料)添加剂。

作为与血中或肠内的LPS水平亢进有关的疾病，例如可列举：心房颤动、心功能不全、缺血性心脏病、心肌梗塞、心绞痛、高血压、动脉硬化、主动脉瘤、主动脉夹层、闭塞性动脉硬化、主动脉瓣狭窄等循环系统疾病；或者，例如肝炎、非酒精性脂肪肝炎、脂肪肝、肝炎进展而引起的肝癌、肠道炎症、过敏性肠综合征、胃炎、胶原病、慢性类风湿性关节炎、慢性肾炎、IgA肾病、支气管哮喘、间质性肺炎、药物性肺损伤、嗜酸粒细胞性肺浸润综合征、非典型耐酸菌病、过敏性鼻炎、特应性皮炎、败血症等炎症性疾病；或者，糖尿病、肥胖、代谢综合征、生活习惯病、脂质异常症、骨质疏松症等的代谢性疾病等。

可将本发明的组合对人或其他哺乳动物(例如，狗、猫、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、猪、牛、山羊、马、羊、猴等)以1日1次或分成几次口服摄取上述的每天的摄取量。或者，还可进行直肠给予。

在将本发明的组合作为食品来提供的情况下，该食品可附带用于预防和/或改善与血中或肠内的LPS水平亢进有关的疾病的宗旨的表示(标签)来进行销售。这里，“表示”是指用于让需要者了解上述用途的所有行为，如果是可联想/类推上述用途这样的表示，则无论表示的目的、表示的内容、进行表示的对象物/介质等如何，均相当于本发明中的“表示”。然而，优选通过需要者可直接识别上述用途这样的表现形式来表示。具体而言，可例示下述行为：在本发明的食品所涉及的商品或商品的包装上记载上述用途的行为；将在商品或商品的包装上记载有上述用途的物品进行转让、交货、为了转让或交货而进行展示、输入的行为；在与商品有关的广告、价格表或交易书上记载上述用途以进行展示、或者颁布，或者在以这些为内容的资料上记载上述用途，通过电磁(互联网等)的方法来提供的行为等。

另一方面，作为表示，优选为被行政(行政机关)等认可的表示(例如，根据行政所规定的各种制度取得认可，以基于这样的认可的方案进行的表示)，特别是优选在包装、容器、目录、小册子、POP等销售现场的宣传材料、其他文件等上表示。

另外，例如可例示：作为健康食品、功能性食品、经肠营养食品、特殊用途食品、营养功能食品、准药品等的表示，此外还可例示：被厚生劳动省认可的表示、例如特定保健用食品、在与其类似的制度下认可的表示。作为后者的例子，可例示：作为特定保健用食品的表示、作为附条件的特定保健用食品的表示、对身体的结构或功能产生影响的宗旨的表示、疾病风险降低表示等，详细而言，作为典型例子，可列举：作为健康促进法实施细则(平成15年4月30日(2003年4月30日)日本厚生劳动省条例第86号)中规定的特定保健用食品的表示(特别是保健用途的表示)和与其相似的表示。

4. 本发明的检查方法和用于该方法的试剂

本发明还提供：与血中或肠内LPS水平亢进有关的疾病(以下，也称为“LPS相关疾病”。)的发病风险的检查方法(以下，也称为“本发明的检查方法”。)和用于该检查方法的试剂(以下，也称为“本发明的检查药”。)，所述检查方法包括：测定受试者的肠道菌群中的普通拟杆菌和多氏拟杆菌的存在量。如后述的实施例中所示，普通拟杆菌和多氏拟杆菌在冠状动脉疾病(CAD)患者的肠道菌群中存在量显著减少，另外，若让动脉硬化小鼠模型口服摄取两菌种，则在改善动脉硬化症状的同时降低肠内的LPS水平，强化肠道屏障的紧密连接以降低血中LPS水平，可抑制在肠内和血管内的炎症应答/免疫应答(即，具有LPS控制性)。而且，若让肥胖小鼠模型口服摄取两菌种，则在改善肥胖症状的同时抑制在脏器内的炎症应答/免疫应答。而且，若让非酒精性脂肪肝炎模型小鼠口服摄取两菌种，则在改善非酒精性脂肪肝炎的症状的同时可抑制在脏器内的炎症应答/免疫应答。因此，通过测定受试者的肠道菌群中的普通拟杆菌和多氏拟杆菌的存在量，并与正常值进行比较，可判定该受试者会发生LPS相关疾病、或者将来发病的风险高。尚需说明的是，在本说明书中，“发病风险检查”以不仅预测将来发病的可能性高、还包括用于诊断已发病的检查在内的意义使用。另外，在本说明书中，术语“检测”以不仅判定是否存在目标细菌、还包括定量地测定其存在量在内的意义使用，但那样解释是明显错误的情形除外。

对作为本发明的检查方法的检查对象的受试者没有特别限定。例如还可包含：根据临床所见怀疑是循环系统疾病或炎症性疾病、代谢性疾病等LPS相关疾病者；或判明已罹患这些疾病的患者。这是由于：如果知道在肠道菌群中普通拟杆菌和多氏拟杆菌的存在量减少，则肠道菌群中的该菌种的富集可作为该患者的治疗目标之一。尚需说明的是，作为用于该检查的源自受试者的样品，从采集的容易度方面考虑，优选粪便，但只要是可反映该受试者的肠道菌群的样品即可，没有特别限定，例如可以是肠内容物(例如，盲肠内容物)等。

普通拟杆菌和多氏拟杆菌的检测例如可通过检测该菌种所具有的16S rRNA基因来进行，具体而言，在普通拟杆菌的情况下，可通过检测包含与SEQ ID NO: 1或2所表示的核苷酸序列具有98%以上的同源性的核苷酸序列的16S rRNA基因来进行；在多氏拟杆菌的情况下，可通过检测包含与SEQ ID NO: 3或4所表示的核苷酸序列具有98%以上的同源性的核苷酸序列的16S rRNA基因来进行。

在检测普通拟杆菌和多氏拟杆菌的16S rRNA基因时，首先由样品回收总DNA。由受试者的粪便样品分离/纯化DNA的方法在该技术领域是已知的，例如可通过苯酚/氯仿提取、使用市售的DNA提取试剂的提取、或利用市售的柱试剂盒进行的纯化等来进行。

将由样品回收的DNA溶解于适当的缓冲液、例如TE (10mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH8.0)等中，供于16S rRNA基因的检测。

在一个方案中，16S rRNA基因的检测如下实施：通过使用可特异性地扩增普通拟杆菌的16S rRNA基因、即包含与SEQ ID NO: 1或2所表示的核苷酸序列具有98%以上的同源性的核苷酸序列的16S rRNA基因和/或多氏拟杆菌的16S rRNA基因、即包含与SEQ ID NO:3或4所表示的核苷酸序列具有98%以上的同源性的核苷酸序列的16S rRNA基因的引物，以由样品回收的DNA为模板进行PCR来实施检测。

上述引物只要是设计成可特异性地PCR扩增上述16S rRNA基因的一部分或全部区域的引物即可，可以是任何引物。这里，“特异性地”是指，引物会对普通拟杆菌和/或多氏拟杆菌的16S rRNA基因的一部分或全部区域进行PCR扩增，而不会对该菌种以外的16S rRNA基因进行PCR扩增。

作为上述引物，例如是下述的两个多核苷酸的组合：和与SEQ ID NO: 1或2所表示的核苷酸序列具有98%以上的同源性的核苷酸序列(优选SEQ ID NO: 1或2所表示的核苷酸序列)的互补序列的连续的部分序列和/或与SEQ ID NO: 3或4所表示的核苷酸序列具有98%以上的同源性的核苷酸序列(优选SEQ ID NO: 3或4所表示的核苷酸序列)的互补序列的连续的部分序列杂交、且包含约15～约50个碱基、优选约18～约30个碱基的核苷酸序列的多核苷酸；以及与从该杂交位点起3’侧的上述核苷酸序列的连续的部分序列杂交、且包含约15～约50个碱基、优选约18～约30个碱基的核苷酸序列的多核苷酸，可列举由它们扩增的核酸的片段长度为约50～约1,000个碱基、优选约100～约500个碱基的一对多核苷酸。

引物优选包含：与SEQ ID NO: 1或2所表示的核苷酸序列具有98%以上的同源性的核苷酸序列(优选SEQ ID NO: 1或2所表示的核苷酸序列)和/或与SEQ ID NO: 3或4所表示的核苷酸序列具有98%以上的同源性的核苷酸序列(优选SEQ ID NO: 3或4所表示的核苷酸序列)的连续的15～50个碱基(优选18～30个碱基)的部分序列、或者它们的互补序列的连续的15～50个碱基(优选18～30个碱基)的部分序列。

从特异性的角度考虑，作为优选的引物组，至少其中之一为具有下述的核苷酸序列的引物：在SEQ ID NO: 1或2所表示的核苷酸序列和/或SEQ ID NO: 3或4所表示的核苷酸序列中，位于在16S rRNA基因内所包含的菌种间序列不同的9处可变区(V1～V9)中的任一处的核苷酸序列、或者与其互补链序列互补的核苷酸序列。

在本发明的检查方法中，可将普通拟杆菌的16S rRNA基因和多氏拟杆菌的16SrRNA基因区分开来进行检测，也可不区分两者而一并检测。如后述的比较例中所示，即使将普通拟杆菌或多氏拟杆菌的任一者单独地让动脉硬化小鼠模型口服摄取，动脉硬化的症状也有改善的倾向，但未见显著差别，另外，无法降低肠内LPS水平。因此，期望将普通拟杆菌和多氏拟杆菌区分开来进行检测，但现实中难以想象在肠道菌群中仅其中任一者的存在量显著变化，因此即使将两者一并检测，也不会对判定结果产生实质性影响。

例如，若利用BLAST(NCBI)在默认条件下比对普通拟杆菌ATCC 8482^T株的16SrRNA基因(SEQ ID NO: 1)和多氏拟杆菌JCM 13471^T株的16S rRNA基因(SEQ ID NO: 3)，则如图11所示(Query(待查序列)显示SEQ ID NO: 1、Sbjct(目标序列)显示SEQ ID NO: 3)。两个序列有1493个核苷酸(SEQ ID NO: 1的12～1497位、SEQ ID NO: 3的1～1490位；间隙数为10)重叠，显示出约97%(1449/1493)同源的高同源性。因此，可将普通拟杆菌和多氏拟杆菌的16S rRNA基因区分开来进行扩增的普通拟杆菌特异性引物和多氏拟杆菌特异性引物的设计区域有限定。例如，SEQ ID NO: 1的181～210位与SEQ ID NO: 3的对应区域仅有约73%(22/30)的同源性，而SEQ ID NO: 1的1001～1028位与SEQ ID NO: 3的对应区域仅有约60%(18/30)的同源性，因此通过在这些区域内设计任意一个或两个引物，可将普通拟杆菌的16S rRNA基因和多氏拟杆菌的16S rRNA基因区分开来进行扩增。

另一方面，在将普通拟杆菌和多氏拟杆菌的16S rRNA基因一并扩增的情况下，例如，如果使用光冈知足编“腸内フローラ的分子生態学的検出·同定(肠道菌群的分子生态学的检测/鉴定)”第109-121页(2000年)中作为普通拟杆菌特异性引物而记载(当时还未鉴定多氏拟杆菌)的引物组(扩增SEQ ID NO: 1的136～608位、SEQ ID NO: 3的125～599位)，则可将两菌种的16S rRNA基因一并扩增，并且不会扩增其他的肠道细菌的16S rRNA基因。

而且，在使用该引物组的情况下，虽然SEQ ID NO: 1的扩增片段中存在1处TaqI限制位点(TCGA；SEQ ID NO: 1的288～291位)，但在SEQ ID NO: 3的扩增片段中不存在TaqI限制位点，所以如果将扩增片段经TaqI消化后进行电泳，则在假定只存在普通拟杆菌的情况下会检测到153bp和320bp这两条谱带，但在只存在多氏拟杆菌的情况下会检测到475bp这一条谱带。在存在两菌种的情况下会检测到上述三条谱带。因此，也可通过在可一并扩增普通拟杆菌和多氏拟杆菌的16S rRNA基因的引物中组合RFLP分析，而将两菌种区分开来进行检测。

PCR中的温度设定、反应时间和循环数可根据使用的模板DNA的量、引物的种类等适当设定。PCR中的退火温度可根据引物的GC含量适当设定。

所得的PCR产物通过电泳(例如，琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等)进行分离。电泳后，使用溴化乙啶溶液等自身已知的染色液对凝胶进行染色，使用透照仪(透射仪)等检测PCR产物。然后，以特异性PCR产物的有无或量作为指标，判定样品中是否存在普通拟杆菌和/或多氏拟杆菌或存在量。

本发明的检查方法中采用的PCR可以是定量PCR。定量PCR可通过已知方法进行，已知有2种分析方法。第1种方法是利用在PCR反应中反应产物呈指数函数增加直至达到某种程度的量、之后达到稳定的特征，在呈指数函数增加期间分析反应产物量，算出初期模板量。第2种方法是通过实时监测反应产物，确定反应产物量超过某一定的值(阈值)的PCR循环数(Ct)。这两种分析方法均需要变更已知浓度的DNA量进行PCR，分析各循环数中的反应产物，由其动力学确定具定量性的PCR循环数范围。根据其结果估算未知样品中的目标基因的存在量。由此，可定量样品中的普通拟杆菌和/或多氏拟杆菌的存在量，在估算为受试样品中仅包含1拷贝的目标基因的情况下，也可判定为存在目标细菌。

在另一方案中，16S rRNA基因的检测可如下进行：使可特异性地杂交普通拟杆菌的16S rRNA基因、即包含与SEQ ID NO: 1或2所表示的核苷酸序列具有98%以上的同源性的核苷酸序列的16S rRNA基因和/或多氏拟杆菌的16S rRNA基因、即包含与SEQ ID NO: 3或4所表示的核苷酸序列具有98%以上的同源性的核苷酸序列的16S rRNA基因的探针与样品中的总DNA或总RNA接触，并检测该杂交种，从而可进行16S rRNA基因的检测。接触的条件可适当设定，使探针与16S rRNA或编码其的基因杂交而形成核酸复合物。然后，检测该复合物，作为显示普通拟杆菌和/或多氏拟杆菌的存在的标志。

上述探针为下述的多核苷酸：在严格条件下和与SEQ ID NO: 1或2所表示的核苷酸序列具有98%以上的同源性的核苷酸序列(优选SEQ ID NO: 1或2所表示的核苷酸序列)和/或与SEQ ID NO: 3或4所表示的核苷酸序列具有98%以上的同源性的核苷酸序列(优选SEQ ID NO: 3或4所表示的核苷酸序列)中所含的约15个碱基以上、优选约18～约500个碱基、更优选约18～约200个碱基、进一步优选约18～约50个碱基的连续的核苷酸序列或其互补序列杂交的多核苷酸。

杂交可按照自身已知的方法或基于其的方法、例如分子克隆(MolecularCloning)第2版(J. Sambrook等人, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989)中记载的方法等来进行。作为严格条件，例如可列举：在6×SSC (氯化钠/柠檬酸钠)中、45℃下的杂交反应后，在0.2×SSC/0.1%SDS中、65℃下洗涤一次以上等。本领域技术人员通过适当变更杂交溶液的盐浓度、杂交反应的温度、探针浓度、探针长度、错配数、杂交反应的时间、洗涤液的盐浓度、洗涤的温度等，即可容易地调节至所期望的严格度。

优选探针为下述的核酸：包含与SEQ ID NO: 1或2所表示的核苷酸序列具有98%以上的同源性的核苷酸序列(优选SEQ ID NO: 1或2所表示的核苷酸序列)和/或与SEQ IDNO: 3或4所表示的核苷酸序列具有98%以上的同源性的核苷酸序列(优选SEQ ID NO: 3或4所表示的核苷酸序列)中所含的约15个碱基以上、优选约18～约500个碱基、更优选约18～约200个碱基、进一步优选约18～约50个碱基的连续的核苷酸序列或其互补序列的核酸。

从特异性的角度考虑，作为优选的探针，可列举下述的核酸：在严格条件下与SEQID NO: 1或2所表示的核苷酸序列或者SEQ ID NO: 3或4所表示的核苷酸序列中位于16SrRNA基因内所含的在菌种间序列不同的9处可变区(V1～V9)的任1处的核苷酸序列或其互补序列杂交的核酸。具体而言，可同样列举：在图11所示的SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 3的比对中可见同源性较低的、关于上述引物的设计区域而例示的区域。或者，同样可列举包含作为可特异性地且一并扩增普通拟杆菌的16S rRNA基因和多氏拟杆菌的16S rRNA基因的引物而例示的区域的核酸作为可特异性地检测普通拟杆菌和多氏拟杆菌的探针。

构成本发明的检查药的引物或探针可在特异性的检测不会发生障碍的范围内包含添加序列(与检测对象的多核苷酸不互补的核苷酸序列)。

用作上述引物或探针的多核苷酸可以是脱氧核糖核酸(DNA)也可以是核糖核酸(RNA)。在核糖核酸的情况下，核苷酸序列中的胸苷残基(T)可适当读取为尿苷残基(U)。另外，还可以是包含将任意位置的T改为U而合成的尿苷残基的DNA。同样也可以是包含将任意位置的U改为T而合成的胸苷残基的RNA。另外，只要不降低杂交的特异性即可，在多核苷酸中可存在缺失、插入或取代等点突变或修饰核苷酸。

另外，引物或探针可用适当的标记物(標識剤)、例如放射性同位素(例：¹²⁵I、¹³¹I、³H、¹⁴C、³²P、³³P、³⁵S等)、酶(例：β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、碱性磷酸酶、过氧化物酶、苹果酸脱氢酶等)、荧光物质(例：荧光胺、异硫氰酸荧光素等)、发光物质(例：鲁米诺、鲁米诺衍生物、荧光素、光泽精等)、生物素等进行标记。

上述用作引物或探针的核酸例如可使用通用的DNA合成装置进行化学合成。该核酸可利用该技术领域中所熟知的其他方法中的任一种来进行合成。

本发明的检查药可进一步包含核酸合成酶(DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶等)、其他的酶、与酶相称的底物(dNTP、rNTP等)等作为其他成分。另外，还可包含标记检测物质或缓冲液等。

在又一实施方案中，普通拟杆菌和/或多氏拟杆菌的检测还可使用特异性地识别该细菌的抗体(以下，也称为“本发明的抗体”。)，通过自身已知的免疫学方法来进行。特异性地识别普通拟杆菌和/或多氏拟杆菌的抗体是指，识别特异性地存在于该细菌的细胞表层的表面抗原并与其结合的抗体。作为这样的表面抗原，例如可列举：细胞壁上存在的多糖、肽聚糖或蛋白等。或者，并不限于表面抗原，还可以是识别普通拟杆菌和/或多氏拟杆菌的特异性的构成成分并与其结合的抗体。这样的特异性抗体可如下获得：以普通拟杆菌或多氏拟杆菌或其菌体处理物作为免疫原，通过自身已知的制造方法制作多克隆抗体或单克隆抗体，从所得的抗体克隆中选择不与普通拟杆菌和/或多氏拟杆菌以外的近缘种发生交叉反应的克隆，从而可获得特异性抗体。本发明的抗体除包含天然型抗体以外，还包含具有特异性的结合活性的抗体片段，具体而言，例如包含F(ab’)₂、Fab’、Fab、Fv、sFv、dsFv、sdAb等。对抗体的类别(class)没有特别限定，还包含具有IgG、IgM、IgA、IgD或IgE等的任一种同种型的抗体。优选为IgG或IgM，若考虑到纯化的容易性等，更优选为IgG。

通过使用本发明的抗体，可利用免疫学方法进行普通拟杆菌和/或多氏拟杆菌的检测、定量等。作为免疫学方法，可列举：流式细胞术分析、放射性同位素免疫测定法(RIA法)、ELISA法(Methods in Enzymol. 70: 419-439 (1980))、蛋白质印迹法、免疫组织染色等，但并不限于这些。

在利用上述的任一种方法确认到在受试者的肠道菌群中有普通拟杆菌和多氏拟杆菌的存在量低于正常值(例如，根据健康人群的肠道菌群中的该细菌的量确定的截断值(例如，平均值-2SD等))的量的该细菌存在的情况下，可判定为该受试者正发生LPS相关疾病、或者将来发生该疾病的风险高。反之，在这两个菌种为截断值以下的情况下，还可判定为该受试者没有发生LPS、且将来发病的风险也小。

这里，作为LPS相关疾病，例如可列举：心房颤动、心功能不全、缺血性心脏病、心肌梗塞、心绞痛、高血压、动脉硬化、主动脉瘤、主动脉夹层、闭塞性动脉硬化、主动脉瓣狭窄等循环系统疾病；或者，例如肝炎、非酒精性脂肪肝炎、脂肪肝、肝炎进展而引起的肝癌、肠道炎症、过敏性肠综合征、胃炎、胶原病、慢性类风湿性关节炎、慢性肾炎、IgA肾病、支气管哮喘、间质性肺炎、药物性肺损伤、嗜酸粒细胞性肺浸润综合征、非典型耐酸菌病、过敏性鼻炎、特应性皮炎、败血症等炎症性疾病；或者，糖尿病、肥胖、代谢综合征、生活习惯病、脂质异常症、骨质疏松症等的代谢性疾病等。

通过以下的实施例来更具体地说明本发明，但实施例不过是本发明的例示而已，对本发明的范围没有任何限定。

实施例

材料和方法

CAD患者和对照的招募录用

所有参加者在注册后提供了书面知情同意书。研究按照《赫尔辛基宣言》的准则来实施。本研究得到了神户大学伦理委员会的批准(批准号1595)，在UMIN临床试验登记处注册(试验注册号000015703, URL: http://www.umin.ac.jp/ctr/)。

从2014年10月到2015年7月通过神户大学附属医院招募录用了30名CAD患者和30名具有冠状动脉风险因子的非CAD对照。CAD组包括稳定型心绞痛患者和在本研究的至少6个月前接受了经皮冠状动脉介入治疗或冠状动脉旁路移植术且具有所保存的左心室射血分数(＞40%)的陈旧性心肌梗塞患者。急性冠状动脉综合征患者除外。从诊断的冠状动脉造影中显示出超过75%的狭窄的主要冠状动脉数的角度定义是单支血管病变还是多支血管病变。

招募录用了30名虽然具有高血压、糖尿病和/或脂质异常症等冠状动脉风险因子但现在和过去均没有冠状动脉疾病或其他血管疾病的患者作为年龄和性别吻合的对照。冠状动脉疾病或其他血管疾病的既往病史以所确认的血管疾病、显示出心绞痛的症状、显示出陈旧性心肌梗塞或心绞痛的心电图上的异常、或胸部X射线上的异常来定义。

具有包含肝病、肾病(血清肌酐水平＞2.0mg/dL)、胶原病或癌症在内的全身性疾病的患者从研究中排除在外。经抗生素治疗的患者也排除在外。糖尿病是根据全美糖化血红蛋白标准化程序的指标，在糖化血红蛋白值＞6.5%、使用口服抗糖尿病药或正接受胰岛素治疗的情况下定义为糖尿病。将血压＞140/90mmHg或使用降压药定义为高血压。根据日本动脉硬化学会发行的准则，将低密度脂蛋白胆固醇水平＞140mg/dL、甘油三酯水平＞150mg/dL或使用抗脂质异常症药定义为脂质异常症。

由粪便样品提取DNA

让受试者住院，在摄取医院膳食的同时采集源自受试者的粪便样品。源自小鼠的粪便样品在6周龄和16周龄时采集。粪便样品在-80℃下保存。由粪便样品提取DNA是按照以前确立的顺序(Appleid and Environmental Microbiology 63, 2802-2813 (1997); ApplEnviron Microbiol 71, 4153-4155 (2005); FEMS Microbiology Ecology 68, 351-362(2009))由日本基因研究所来实施。对于各样品，使用G’NOMEs试剂盒(BIO 101, La Jolla,CA)，按照生产厂家的指示进行少许改变，由0.2～0.3g粪便材料提取细胞DNA。简而言之，将粪便样品在所提供的细胞悬浮液中匀浆，之后加入细胞溶解/变性溶液，将样品在55℃下培养30分钟。为了增加细胞的溶解，添加750mL二氧化硅株(直径为0.1mm)，在BeadBeater装置(BioSpec、Bartlesville、OK)内以最大速度振荡10分钟。添加15mg聚乙烯吡咯烷酮，确实地除去可抑制之后的定量PCR的多酚的污染。将样品涡旋，在20,000g下离心3分钟，回收上清。用400mL的TENP缓冲液(50mM的Tris缓冲液 pH8、20mM EDTA pH8、100mM NaCl、1%聚乙烯聚吡咯烷酮)洗涤残余物的颗粒，在20,000g下离心3分钟。再一次重复洗涤步骤，合并所得的上清。加入等容量的异丙醇使核酸沉淀，在-20℃下保存10分钟后，在20,000g下离心5分钟。将颗粒再次悬浮于400mL蒸馏水和100mL盐析剂的混合液中，在4℃下培养10分钟。将样品在20,000g下离心10分钟，将含有DNA的上清转移到1.5mL清洁的离心管中。加入2倍容量的100%乙醇，在室温下静置5分钟使DNA沉淀，之后在20,000g下离心5分钟。将DNA重新溶解于150mL的TE缓冲液中，将该DNA溶液在-20℃下保存直至进行后面的分析。

16S rRNA基因扩增和焦磷酸测序

使用342F和806R的未变性通用引物组(表2)对一部分16S rRNA基因(V3-V4区、相当于大肠杆菌编号系统的342～806位)进行PCR扩增(引物组和PCR条件的详情参照DNA Res.21, 217-227 (2014))。添加测序适配体后，使用Illumina MiSeq platform (IlluminaInc., San Diego, CA)，按照生产厂家的方案由Takara Bio公司对扩增子进行测序。

使用USEARCH 10.0.240版(Bioinformatics. 26, 2460-2461 (2010)) 0.33版(参数：LEADING:17 TRAILING:17 AVGQUAL:25 MINLEN:100)制作细菌组成基质。另外，采用以前的方案，选择使用Trimmomatic (Bioinformatics. 30, 2114-2120 (2014))而生成的高品质的16S rRNA基因扩增子序列。剩下的读数使用USEARCH的-fastq_mergepairs命令(参数：默认值)。接下来，使用Tagcleaner (BMC Bioinformatics. 11, 341 (2010))0.16版(参数：-tag5 CTACGGGGGGCAGCAG -mm5 3 -tag3 AGATACCCCGGTAGTCC -mm3 3 -nomatch3)除去无引物区的序列。之后，使用内部的python script除去具有N的序列。使用USEARCH的-filter_phix命令除去Phix读数。使用USEARCH的命令-sort_by_length (参数：-minseqlength 300)除去短序列。最后，使用UPARSE算法(-fastx_unique命令和otu_cluster命令(参数：-minsize 1))生成OTU表(Nat Meth. 10, 996-998 (2013))。使用RDPClassifier 2.12版，以自展值

0.5在细菌的属中注释各OTU的代表性序列(Appl EnvironMicrobiol. 73, 5261-5267 (2007))。再使用BLASTN 2.2.25版以identity threshold(同源性阈值)

97%和coverage(覆盖度)

80%在参照数据库silva Living Tree Project123版(Syst Appl Microbiol. 31, 241-250 (2008))中注释各OTU的各代表性序列。

粪便样品中的短链脂肪酸的分析

让受试者在医院内摄取医院指定的饮食，之后采集粪便样品。将该样品用作为内部对照的含有2-乙基丁酸的灭菌水稀释后，使用YMC-Pack FA试剂盒(#XSRFAR01, YMC, Kyoto,Japan)，用2-硝基苯肼进行标记。通过液相色谱法(Prominence LC-20AD; Shimadzu,Kyoto, Japan)定量该样品中的短链脂肪酸。

动物

所有的载脂蛋白E缺陷(Apoe^-/-)小鼠均使用C57BL/6背景的小鼠。所有小鼠均用神户大学研究所内的SPF级的动物设施进行饲养。在严密的12小时明期循环下对动物给予普通饮食(日本CLEA)，并随意饮水。将6周龄小鼠分成3个处置组，让对照组的小鼠口服摄取培养基，分别以2.5×10⁹ cfu/100μl的用量、每周5次让拟杆菌属活菌组的小鼠口服摄取活的普通拟杆菌和多氏拟杆菌、而让拟杆菌属菌加热死菌组的小鼠口服摄取已加热杀菌的普通拟杆菌和多氏拟杆菌。所有实验均在神户大学医学部按照有效的动物实验相关准则(准则No.P160701)来实施。

肥胖小鼠模型和非酒精性脂肪肝炎(NASH)小鼠模型是使用C57BL/6J小鼠(日本Charles River公司)按照后面详述的方法来制作。

普通拟杆菌和多氏拟杆菌的培养和调制

普通拟杆菌(#8482; 美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection), Manassas(马纳萨斯州), VA和NTZ002株(保藏号：NITE BP-02863))和多氏拟杆菌(#17855; Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Braunschweig, Germany和NTZ001株(保藏号：NITE BP-02862))是在Difco^TM强化型梭菌培养基(#218081; BDBioscience, San Jose, CA)中、在37℃下进行厌氧培养。在所有的厌氧微生物步骤中均使用包含10%CO₂、10%氢和80%氮的厌氧室(Coy Laboratory Products, Grass Lake, MI)。将普通拟杆菌和多氏拟杆菌在121℃下处理15分钟，进行加热杀菌。通过接种已加热处理的细菌、且其没有生长，确认加热杀菌已顺利进行。

血浆中的生物化学参数和细胞因子水平的评价

让动物禁食一夜，通过在麻醉下进行心穿刺，将血液采集到肝素管中。将血液样品在4℃、3,000rpm下离心10分钟，测定之前在-80℃下保存。使用自动化化学分析装置(SRL公司)，以酶的方式测定血浆中的总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇和甘油三酯的浓度。使用流式微珠阵列试剂盒(Cytometric bead array kit) (BDBioscience)，按照生产厂家的指示分析血浆中细胞因子水平。

动脉硬化病变的评价

将小鼠麻醉，用生理盐水灌流主动脉，切除左心室中央～髂动脉的分支点的这一段。为了分析主动脉基部的病变，得到了近端升主动脉部分～主动脉窦的这一段样品。将该样品包埋在冷冻组织切片制作样包埋剂OCT化合物(#4583, Tissue-Tek; Sakura Finetek, 东京)中。由各小鼠采集遍布550μm的主动脉窦的5片连续切片(厚度为10μm)，用油红O (#154-02072; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)或苏木精(#3000; 武藤化学, 东京)染色。使用一体化荧光显微镜(#BZ-8000; Keyence, 大阪)通过数字处理捕捉染色切片。为了定量分析动脉硬化的程度，如已报道的那样，使用ImageJ (注册商标)软件(Circulation. 120,1996-2005 (2009))算出由各小鼠得到的5个单个切片的总病变面积。为了en face病变分析，切除近端升主动脉～总髂动脉分支的主动脉片段，在10%福尔马林缓冲液中固定。小心翼翼地除去外膜组织后，将主动脉沿纵向切开，用油红O染色，钉在黑蜡表面上，用数码相机进行捕捉。染色病变面积以相对于总面积的百分比显示，如已报道中所记载(Circulation.120, 1996-2005 (2009))，使用ImageJ (注册商标)软件进行测定。

动脉硬化病变的免疫组织化学分析

使用巨噬细胞检测用抗体(MOMA-2, #T-2029, 1:400; BMA Biomedicals, Augst,Switzerland)和T细胞检测用抗体(CD4, #550278, 1:100; BD Biosciences)，在丙酮固定或福尔马林固定的小鼠主动脉基部的10μm冷冻切片上实施动脉硬化病变的免疫组织化学分析。使用生物素化二次抗体(#ab102250, 1:500; abcam, Cambridge, UK)和链霉亲和素标记辣根过氧化物酶(#P0397, 1:500; Dako Co., Carpinteria, CA)进行检测。使用一体化荧光显微镜，通过数字处理捕捉已染色的切片。在MOMA-2染色中，算出染色面积相对于总动脉硬化病变面积的百分比。CD4阳性T细胞的定量通过计数各切片中的染色细胞数来实施。

小鼠结肠的组织学分析

将各小鼠在16周龄时切除升结肠，包埋在OCT化合物中。使用缀合有Cy3的二次抗体(#405408, 1:200; BioLegend, San Diego, CA)进行检测，所述Cy3已使用检测紧密连接蛋白的抗体(抗-ZO-1, #sc-33725, 1:100; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)在丙酮固定的10μm冷冻切片上实施了免疫荧光染色。使用DAPI (#H-1200; VectorLaboratories Inc., Burlingame, CA)进行核染色。使用一体化荧光显微镜，通过数字处理捕捉已染色的切片。使用ImageJ (注册商标)软件分析ZO-1的表达强度。

流式细胞术

将肠系膜淋巴结(MLN)细胞、脾细胞和RAW264.7细胞与抗CD16/CD32抗体(克隆2.4G2;#553142; BD Biosciences)进行培养，来封闭Fc受体。为了检测表面抗原，将50μL含有2%胎牛血清(FBS)的磷酸缓冲生理盐水(PBS)中的10×10⁵个MLN细胞或脾细胞用以下的抗体((BD Biosciences或eBioscience)进行染色。

・抗CD4(克隆RM4-5; Cat 557871)；

・抗CD11b (克隆M1/70; #557396)；

・抗CD11c (克隆HL3; #558079)；

・抗CD44 (克隆IM7; #553134)；

・抗CD62L (克隆MEL-14; #553150)；

・抗CD69 (克隆FN50; #555533)；

・抗CD80 (克隆16-10A1; #560016)；

・抗CD86 (克隆GL1; #553692)；

・抗CD273 (克隆TY25; #560086)；

・抗CD274 (克隆MIH5; #558091)；

・抗F4/80 (克隆BM8; #17-4801-82)；

・抗Ly6G (克隆RB6-8C5; #12-5931-82)；

・抗TLR4 (克隆MTS510, #17-9924-82)。

使用Foxp3/转录因子染色缓冲液组(Foxp3/Transcription Factor StainingBuffer Set ) (#00-5523-00, eBioscience, San Diego, CA)或固定/透化溶液试剂盒(Fixation/Permeabilization Solution Kit) (#554714, BD Biosciences)、抗Foxp3抗体(克隆FJK-16; #17-5773-82; eBioscience)和抗CTLA-4抗体(克隆UC10; BDBiosciences; #553720)，按照生产厂家的指示实施细胞内染色。使用同种型一致的抗体作为对照。使用抗-Ki67组(克隆B56; #556027)，按照生产厂家的指示就RAW264.7细胞的增殖进行试验。流式细胞术分析使用Attune (注册商标)声波聚焦流式细胞仪(AcousticFocusing Cytometer) (Life Technologies, Grand Island, NY)和FlowJo软件(TreeStar, Inc., Ashland, OR)来实施。

体内肠道通透性测定

禁食一夜后，让小鼠口服摄取异硫氰酸荧光素(FITC)标记葡聚糖(FD4, 500 mg/kg体重; Sigma-Aldrich)。4小时后，使用荧光分光光度计(EnSpire; PerkinElmer, Inc.,Waltham, MA)在激发波长490nm、荧光波长520nm下测定血浆中FD4浓度。

粪便上清的调制

在LPS测定和16S rRNA基因测序中使用相同的人粪便样品。小鼠粪便样品是在最后的口服摄取的24小时后由16周龄的对照小鼠和拟杆菌属菌处理小鼠、或6周龄的抗生素(AVNM)给予小鼠采集。对已报道的操作方案(PLoS One. 7, e47713 (2012); Gut. 63,1069-1080 (2014); BMC Microbiol. 16, 9 (2016) )作少许改变，得到了粪便上清。简而言之，将粪便样品悬浮在无菌PBS中使达到50mg/500μL的浓度，平稳地进行涡旋使细菌细胞不会破碎。在3,000rpm下离心15分钟后回收上清，用0.45μm的滤器、接着用0.22μm的滤器进行过滤、灭菌，在70℃下培养15分钟使其失活，之后在-80℃下保存。另外，按照常规方法由16周龄的对照小鼠和拟杆菌属菌处理小鼠采集小鼠盲肠便样品。

血浆和粪便上清中的LPS水平的分析

使用鲎变形细胞溶解物(Limulus Amebocyte Lysate)测定试剂盒(#K50-643J; LonzaInc., Basel, Switzerland)，按照生产厂家的指示测定血浆中和粪便中的LPS水平。在无热原水中将血浆稀释10倍、将粪便上清稀释10,000倍，在70℃下失活15分钟。LSP测定在无热原的玻璃管、Eppendorf管和平板(Plate)中实施。

在体外的粪便上清刺激和siRNA测定

在含有10%FBS的RPMI-1640培养基中培养RAW264.7巨噬细胞。将1×10⁵个RAW264.7细胞接种在24-孔板(平底) (Corning Costar, Corning, NY)中，在粪便上清的存在下、在37℃、5%CO₂的环境中培养5小时以进行增殖。为了分析细胞因子的产生，使用针对TLR4的siRNA (#4390771; Invitrogen, Carlsbad, CA)，利用RNAiMAX试剂(#13778030,Invitrogen)进行TLR4的击倒。使用Silencer^TM选择阴性对照No. 1 siRNA (SilencerTMSelect Negative Control No. 1 siRNA) (#4390843, Invitrogen)作为对照。从美国典型培养物保藏中心(ATCC)购入HT29人肠道上皮细胞，在含有10%FBS的RPMI-1640培养基中培养。将该HT29细胞接种在24-孔板(平底)中，在粪便上清的存在下、在37℃、5%CO₂环境中培养24小时。

RNA提取和实时PCR分析

使用TRIzol^TM试剂(#15596018; Thermo Scientific, Waltham, MA)，按照生产厂家的指示由组织或细胞样品提取总RNA。使用PrimeScript逆转录试剂试剂盒(PrimeScriptreverse transcription reagent kit) (#RR037A; Takara, 滋贺)合成cDNA。使用SYBERPremix Ex Taq (#RR820; Takara)和LightCycler (注册商标) 96系统(#05815916001;Roche, Mannheim, Germany)，按照生产厂家的指示实施定量RT-PCR。表2中示出对各基因特异性的引物。表达数据用作为对照持家基因的GAPDH进行校正，通过ΔΔT法进行分析。

[表2]

蛋白质印迹法

以Sci. Rep. 7, 12989 (2017)中所详述的方式进行操作，实施了蛋白质印迹分析。简而言之，用PBS冲洗细胞2次，收集在冰冷的溶解缓冲液(20mM HEPES, pH 7.4; 1%NP40; 1%SDS; 和150mM NaCl)中。将由总溶解物提取的蛋白进行6%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，使用iBlot (注册商标)凝胶转印装置(Thermo Scientific)将其转印到聚偏二氟乙烯膜(#IB401002; Thermo Scientific)上。用5%牛奶(#31149-75; NacalaiTesque, 京都)封闭该膜，与一次抗体在4℃下培养一夜后，与缀合有辣根过氧化物酶的二次抗体在室温下培养1小时。与Immobilon Western HRP底物(#WBKLS0500; MerckMillipore, Billerica, MA)进行培养后，使用V3 Western Workflow系统(Bio-Rad,Hercules, CA)检测信号。在该实验中使用了以下的一次抗体。

・抗ZO-1 (#8193, 1:1,000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA)；

・抗β-肌动蛋白 (#A5441, 1:5,000; Sigma-Aldrich)。

谱带强度使用ImageJ (注册商标)软件来定量。

统计分析

使用R软件 3.1.0版(http://www.r-project.org/)、JMP 10版(SAS Institute,Cary, NC)和Prism 7.0版(GraphPad软件; San Diego, CA)进行统计分析。利用Shapiro-Wilk检验确定数据是否显示正态分布。正态分布数据的结果以平均值±该平均值的标准误差或平均值±正态分布数据的标准偏差表示，非正态分布数据的结果以中间值±四分位距(第1～第3四分位距)表示。对于正态分布数据利用Student的双侧t-检验评价两组间的显著差异，而对于非正态分布数据利用Mann-Whitney U-检验评价两组间的显著差异。利用Fisher的精确检验或卡方检验比较分类变量。所有检验均将P<0.05的数值视为统计学上显著。为了评价2个参数间的统计学相关，利用最小二乘法计算单回归/单相关，结果以Pearson的相关系数表示。利用单因素方差分析(ANOVA)检测3组间的显著差异。利用Benjamini-Hochberg法算出q值，调整多重比较的p值。以Arthritis Rheumatol. 68,2646-2661 (2016)所记载的方式进行操作，按属水平实施来自30名CAD患者和30名对照的数据的聚类。

结果

CAD患者中的肠道菌群分布型

招募录用30名CAD患者、以及年龄和性别吻合且具有高血压、糖尿病或脂质异常症等冠状动脉风险因子的30名非CAD患者作为受试者。利用粪便样品中的16S rRNA基因测序，详细比较了这些受试者的肠道细菌分布型。受试者的背景见表3。

[表3]

为了分析受试者的肠道细菌分布型，按照已报道(Nature. 473, 174-180 (2011))的顺序将样品按属水平分成3个簇(图1a)，各簇通过丰富地存在以下所示的特定属来表征(图1b)。

簇1：拟杆菌属；

簇2：普雷沃氏菌属(Prevotella)；

簇3：普拉梭菌属(Faecalibacterium)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)或双歧杆菌属(Bifidobacterium)；

非CAD对照更多地归类为簇1，相对于此，CAD患者几乎没有被归类为该簇(图1c)。α多样性、拟杆菌门/厚壁菌门(Firmicutes)比、革兰氏阳性菌/革兰氏阴性菌比和粪便中短链脂肪酸浓度在两组间均无显著差异。在CAD组和非CAD组之间按属和种的水平网罗地比较存在量，结果可知：与对照相比，在CAD患者中拟杆菌属的相对存在量处于低的倾向(图1d)。主成分分析的结果可知：两组中肠道微生物组的主要种的存在量不同，在CAD患者中普通拟杆菌和多氏拟杆菌相对减少，而普氏栖粪杆菌(Faecalibacterium prausnitzii)和粪便普雷沃氏菌(Prevotella copri)富集(图6)。考虑到在以前的报道中显示了在动脉硬化患者中拟杆菌属的存在量低，本发明人将焦点放在作为拟杆菌种的普通拟杆菌和多氏拟杆菌上。这些菌种参与抗炎症应答(Cell. 165, 842-853 (2016))，在拟杆菌属中是存在最丰富的菌种(图1e)，在CAD患者中它们的存在量显著低(图1f)。由于这两种菌具有类似的16S rRNA测序图案(Int J Syst Evol Microbiol. 56, 1639-1643 (2006))，所以按照本发明人所使用的方法论无法区分两者。于是，本发明人构建让显示出动脉硬化倾向的小鼠口服摄取普通拟杆菌和多氏拟杆菌而得到的小鼠模型，使用该模型确认这些菌种与动脉硬化的因果关系，以试图阐明其基本机制。

口服摄取普通拟杆菌和多氏拟杆菌的活菌会抑制动脉硬化性斑块的形成

为了判定普通拟杆菌和多氏拟杆菌给动脉硬化的发病带来的效果，让6周龄的雌载脂蛋白E缺陷(Apoe^-/-))小鼠每周5次口服摄取普通拟杆菌ATCC 8482^T株和多氏拟杆菌DSM17855^T株的活菌或加热死菌达10周。对照小鼠按照相同方案仅给予媒介(培养基)。在16周龄时使小鼠安乐死，进行几种分析，来评价动脉硬化和肠道菌群。与对照小鼠相比，口服摄取了拟杆菌属的活菌的小鼠在体重(图2f)或血浆胆固醇水平(图2g)上没有显著差异，但在主动脉基部和胸部主动脉的en face分析中病变尺寸显著减少(图2a、b)。与对照小鼠相比，口服摄取了加热杀菌的拟杆菌属的小鼠在动脉硬化病变尺寸上未见显著差异。而且，主动脉窦中的动脉硬化病变的免疫组织染色和之后的形态学分析的结果可知：与对照相比，在口服摄取了拟杆菌属的小鼠中巨噬细胞和CD4阳性T细胞显著减少(图2c、d)。接下来，为了评价小鼠的动脉硬化性主动脉中的免疫细胞标志物和趋化因子/趋化因子受体的mRNA表达，实施定量RT-PCR分析。其结果，在口服摄取了拟杆菌属的小鼠中几种粥样硬化形成性免疫细胞标志物和趋化因子/趋化因子受体均减少(图2e)。这些结果暗示了：通过口服摄取进行的活的普通拟杆菌和多氏拟杆菌的补充可减轻斑块的炎症，由此抑制动脉硬化病变的形成。

小鼠粪便样品的16S rRNA基因测序的结果可知：对普通拟杆菌和多氏拟杆菌的口服摄取作出应答，肠道菌群的组成发生大幅变化(图7a、b)。而且，肠道细菌的多样性在对照小鼠中有所下降、但在口服摄取了活的拟杆菌属的小鼠中得到维持(图7c)。令人惊讶的是，与对照小鼠相比，在口服摄取了活的拟杆菌属的小鼠中革兰氏阳性菌/革兰氏阴性菌比呈高的倾向(图7d)。在口服摄取了活的拟杆菌属的小鼠中普通拟杆菌和多氏拟杆菌的存在量大幅提高(图7e)。

通过活的拟杆菌处理使结肠脂多糖(LPS)水平降低，结果是肠道和全身的免疫应答降低

本发明人以前报道了：通过调节肠道免疫应答可预防动脉硬化(Circulation. 120,1996-2005 (2009);.Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30, 2495-2503 (2010))，因此为了研究拟杆菌处理会减少斑块形成的机制，本发明人首先就口服摄取普通拟杆菌ATCC8482^T株和多氏拟杆菌DSM 17855^T株给肠道免疫带来的影响进行了试验。其结果，与对照小鼠相比，在口服摄取了拟杆菌属的小鼠中，某特定的抗原呈递细胞标志物(CD11c、共刺激分子CD80)和炎症诱发性细胞因子在结肠中的mRNA表达实质上降低(图3a、b)，而且，对抗原呈递细胞从肠道固有层向肠系膜淋巴结(MLN)的迁移至关重要的CCR7的mRNA表达，在口服摄取了拟杆菌属的小鼠中显著降低(图3a)。于是，本发明人接下来就MLN中的自然免疫应答进行试验。通过MLN的流式细胞术分析，在口服摄取了拟杆菌属的小鼠中，不仅CD11c高度表达细胞的存在量显著降低，就连CD11c高度表达细胞中的Toll样受体4 (TLR4)、MHC II类和CD80的表达也显著降低(图3c)。另外，与对照小鼠相比，在口服摄取了拟杆菌属的小鼠中MLN中的细胞因子mRNA的表达也处于低的倾向(图3d)。这些结果暗示了：活的拟杆菌处理通过抑制与TLR4表达的下调有关的抗原呈递细胞的活化，会抑制肠道免疫应答。

由于LPS会通过TLR4刺激细胞，并上调抗原呈递细胞上的共刺激分子，所以本发明人测定了粪便中LPS水平，作为由肠道菌群引起的结肠LPS产生的指标。令人惊讶的是，与对照小鼠相比，在口服摄取了拟杆菌属的小鼠中粪便中LPS水平急剧降低(图3e)。本发明人进一步使用粪便上清进行体外刺激测定，研究活的拟杆菌属处理后的结肠LPS浓度的降低是否直接反映在结肠的炎症水平上。在用粪便上清刺激RAW264.7巨噬细胞时，用源自口服摄取了拟杆菌属的小鼠的粪便上清处理的细胞的增殖得到显著抑制(图8a)。而且，为了验证LPS/TLR4信号是否是控制结肠炎症的主要途径，导入siRNA制作击倒了TLR4的RAW264.7巨噬细胞，用粪便上清刺激该细胞。其结果，通过导入非特异性的siRNA，与使用源自对照小鼠的粪便上清处理的RAW264.7巨噬细胞相比，在使用源自用活的拟杆菌属处理的小鼠的粪便上清处理的巨噬细胞中炎症诱发性细胞因子IL-1b、IL-6和TNF-α的分泌显著降低。导入了TLR siRNA的RAW264.7巨噬细胞只分泌极少量的炎症诱发性细胞因子，与导入了非特异性的siRNA的RAW264.7巨噬细胞相比显著低(图8b)。这些认知暗示了：结肠LPS浓度经由LPS/TLR4依赖性的信号传导控制结肠的炎症。

已知内毒素血症会诱发全身性炎症，引起自然免疫和适应性免疫(获得性免疫)的破坏和动脉硬化的发病(Nat Commun.7, 13436 (2016); Circulation. 133, 2434-2446(2016); Nat Immunol. 12, 204-212 (2011))。实际上，与对照小鼠相比，在用拟杆菌属处理的小鼠中血浆LPS浓度显著降低(图3f)，血浆中IL-2、IL-4、IL-6、IL-17A、IFN-γ和TNF-α等粥样硬化形成性细胞因子的浓度也降低(图3g)。本发明人进一步通过脾细胞的流式细胞术测定研究这些细胞因子的来源。其结果，CD11b高度表达/F4/80高度表达巨噬细胞、CD11b高度表达/Ly6G高度表达嗜中性粒细胞和CD11c高度表达树突状细胞的比例在两组间没有显著差异(图9a)，但口服摄取了拟杆菌属的小鼠，可见MHC II类和共刺激分子CD86的表达降低、以及脾CD11c高度表达树突状细胞上的共抑制分子程序性死亡配体1 (PD-L1)和PD-L2的表达上升(图9b)。脾CD11c高度表达树突状细胞上的TLR4表达在两组间无显著差异。在与树突状细胞的高度的耐受原性一致、且用活的拟杆菌属处理的小鼠中，CD4阳性T细胞数也降低(图9c)。在口服摄取了活的拟杆菌属的小鼠中，效应子CD44高度表达/CD62L低度表达/CD4阳性T细胞数减少，但具有高水平的细胞内CTLA4的CD4阳性/CD25阳性/Foxp3阳性控制性T细胞的比例显著高(图9d、e)。这显示免疫平衡向抑制方向转移。这些数据暗示：全身性自然免疫细胞的活化和与动脉硬化的发病机制有关的Th1驱动性炎症的抑制是由通过活的拟杆菌属处理所诱发的血浆LPS浓度降低而引起的。

活的拟杆菌处理在体外和体内强化了肠屏障

若继肠道的渗漏性之后肠道菌群组成发生变化，则会促进内毒素血症或动脉硬化(Circulation. 133, 2434-2446 (2016))，因此本发明人接下来研究了活的拟杆菌属处理对肠道的紧密连接通透性是否有效果。其结果，与对照小鼠相比，口服摄取了普通拟杆菌ATCC 8482^T株和多氏拟杆菌DSM 17855^T株的小鼠显示出FITC标记葡聚糖的肠道通透性的显著下降(图4a)和紧密连接基因zo1的mRNA表达的显著上升(图4b)，这反映为结肠中的ZO-1的平均荧光强度的上升(图4c)。这些数据显示：与对照小鼠中的状态相比，活的拟杆菌属处理可强化紧密连接的屏障。为了明确结肠LPS浓度的变化对紧密连接的形成是否有影响，本发明人使用粪便上清刺激具有上皮细胞形态的HT29人结肠直肠腺癌细胞。其结果，与体内的结果一致，与用源自对照小鼠的粪便上清刺激的HT29细胞相比，在使用源自用活的拟杆菌属处理的小鼠的粪便上清刺激的HT29细胞中观察到了(在mRNA和蛋白水平)显著高的zo1(ZO-1)的表达水平(图4d、e)。这些结果暗示了：由肠道菌群所诱发的结肠LPS浓度的变化可能会直接影响到由紧密连接介导的细胞旁通透性。

在CAD患者中粪便中LPS水平上升

为了进一步研究CAD发生率与人体内肠道细菌引起的LPS产生的关系，本发明人测定了与16S rRNA基因测序中使用的样品相同的粪便样品中的LPS水平。其结果，CAD患者的粪便中LPS水平显著高于非CAD对照中的水平(图5a)。很有意思的是，拟杆菌种的存在量与粪便中LPS水平显著负相关(R=-0.30、P=0.023)。而且，在粪便中LPS水平与普通拟杆菌和多氏拟杆菌的%存在量之间可见显著的负相关(R=-0.29、P=0.027) (图5b)。这些结果强烈暗示了：普通拟杆菌和多氏拟杆菌可控制由肠道细菌引起的LPS的产生，这些活性可对人的动脉硬化的进展产生影响。

比较例 普通拟杆菌或多氏拟杆菌的单独给予不会显著改善动脉硬化小鼠模型的症状和肠内LPS水平

利用与上述两菌种并用给予的情形同样的方法，让Apo^-/-小鼠分别单独口服摄取普通拟杆菌ATCC 8482^T株或多氏拟杆菌DSM 17855^T株。

结果见图10。与对照(媒介给予)组相比，在所有的单独给予组中主动脉窦中的动脉硬化病变均处于改善倾向，但未见显著差异。而且，粪便中(肠内) LPS水平也没有因任一种菌种的单独给予而降低。与对照组相比在多氏拟杆菌单独给予组中大肠的紧密连接相关基因的表达处于增加倾向，与对照组相比在普通拟杆菌单独给予组中大肠中的细胞因子基因的表达下降，但血中细胞因子浓度在所有给予组中均未见显著差异。

以上的结果暗示了：普通拟杆菌和多氏拟杆菌分别通过不同的作用机制，在肠内共存的情况下它们的效果协同地起作用，发挥显著的LPS控制性。

普通拟杆菌和多氏拟杆菌的各种组合均改善了动脉硬化小鼠模型中的肠内LPS水平

对Apoe-/-雌小鼠或Apoe-/-雄小鼠分别每周5次口服给予菌的各种组合(活菌分别为2.5×10⁹CFU/100μl)。对Apoe-/-雌小鼠在6周龄～16周龄的10周间进行给予，测定16周龄的粪便中LPS。对Apoe-/-雄小鼠在6周龄～13周龄的7周间进行给予，测定13周龄的粪便中LPS。

结果见图12。不仅标准株(v、d)就连NT株(Nv、Nd)也会使粪便中LPS量降低。

在动脉硬化小鼠模型中活的拟杆菌处理改善了肠内LPS水平

对Apoe-/-雌小鼠分别每周5次口服给予普通拟杆菌ATCC8482^T和多氏拟杆菌DSM17855^T的菌的组合(活菌或死菌。以活菌计为2.5×10⁹CFU/100μl)。在6周龄～16周龄的10周间进行给予，测定16周龄的粪便中和盲肠便中的LPS。另外，在5周龄～6周龄间给予AVNM(氨苄青霉素、万古霉素、新霉素、甲硝唑)，测定6周龄的粪便中LPS。

结果见图13。图中右侧和左侧显示进行了拟杆菌处理的Apoe-/-雌小鼠的各自粪便中和盲肠便中LPS水平。另外，图中中央显示给予了抗生素的Apoe-/-雌小鼠的粪便中LPS水平。在粪便中和盲肠便中，在给予活菌的情况下LPS量下降，但在给予死菌的情况下与对照(NC)没有变化。

在肥胖小鼠模型中拟杆菌处理改善了肥胖的各种症状

对C57BL/6J雄小鼠在6周龄～18周龄的12周间每周给予5次。NC组给予普通饮食，Ctrl组以200μl/次口服给予高脂饮食HFD (东方酵母(Oriental Yeast)工业制造；含有60%的脂肪)和在培养普通拟杆菌或多氏拟杆菌时使用的液体培养基，B组给予高脂饮食和活菌普通拟杆菌ATCC8482^T和活菌多氏拟杆菌DSM 17855^T，NB组给予高脂饮食和活菌普通拟杆菌NTZ002株和活菌多氏拟杆菌NTZ001株(图14-1A)。

其结果，与Ctrl组相比，除了给予高脂饮食还给予了标准株的两种菌(B)或NT株的两种菌(NB)的组的体重增加得到抑制(图14-1B、C)。

在实施1g OGTT试验时，给予了标准株的两种菌(B)或NT株的两种菌(NB)的组负荷后的血糖值的急剧上升得到抑制(图14-1D左)，AUC值低(图14-1D中央)，胰岛素抵抗性(HOMA-IR)低(图14-1D右)，可确认到耐糖能力的改善。

在对附睾脂肪进行HE染色、MAC3染色或天狼星红染色时(图14-2E左)，在给予了标准株的两种菌(B)或NT株的两种菌(NB)的组中，脂肪细胞的尺寸小，冠状结构的数目少，纤维形成率少(图14-2E右)。

在测定内脏脂肪(附睾周围脂肪)的mRNA量时，在给予了标准株的两种菌(B)或NT株的两种菌(NB)的组中，作为炎症细胞标志物的MCP1、F4/80、iNOS、CCR5、TLR4的mRNA表达较Ctrl组降低(图14-2F左)，Fizzi1 (在M2巨噬细胞标志物中高时视为抗炎)的mRNA表达量呈增加倾向(图14-2F左)。而且，细胞因子IFNγ和TNFα的mRNA表达降低(图14-2F右)。

在NASH小鼠模型中拟杆菌处理改善了NASH的各种症状

对C57BL/6J雄小鼠在8周龄～17周龄间每周给予5次。Ctrl组给予超高脂肪胆碱缺乏且蛋氨酸减量饮食(EPS益新株式会社制造的NASH模型制作用饲料)作为食物，拟杆菌组进一步给予活菌普通拟杆菌ATCC8482^T和活菌多氏拟杆菌DSM 17855^T。

在17周龄解剖，将肝脏进行HE染色，结果在Ctrl组中可见脂肪肝、炎症细胞浸润和肝细胞的气球样变，但在标准株的两种菌给予组中炎症细胞浸润得到显著抑制，未见气球样变(图15-1上)。在标准株的两种菌给予组中进一步可见NAFLD活动性评分(NAS)的改善、血中AST、AST/ALT比的显著降低，肝功能障碍得到显著抑制(图15-1中央、下和图15-2)。

虽然对优选方案加以强调来说明本发明，但优选方案可进行变更，这对本领域技术人员而言是显而易见的。

本文中所述的包括专利和专利申请说明书在内的所有出版物中记载的内容均被引用于本文中，从而将其全部内容以与所明示的内容为同等程度地纳入本说明书中。

本申请以于2018年2月9日在日本申请的日本特愿2018-022578为基础，通过在本文中提及，而将其内容全部包含在本说明书中。

产业实用性

本发明的组合可用作用于预防和/或改善以动脉硬化为代表的循环系统疾病或伴有慢性炎症的疾病、伴有糖脂质代谢等代谢异常的代谢性疾病的药品或功能性食品。另外，本发明的检查方法和检查药，通过粪便中的微生物组分析可进行上述疾病的诊断/发病风险预测，因此在提供非侵袭性的临床检查方法方面有效。

<110> 日东药品工业株式会社

<120> 脂多糖控制性肠道细菌及其用途

<130> 092848

<150> JP 2018-022578

<151> 2018-02-09

<160> 50

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1510

<212> DNA

<213> 普通拟杆菌

<400> 1

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agtggatgcc aatccctaaa acccctctca gttcggactg gagtctgcaa cccgactcca 1320

cgaagctgga ttcgctagta atcgcgcatc agccacggcg cggtgaatac gttcccgggc 1380

cttgtacaca ccgcccgtca agccatggga gccgggggta cctgaagtgc gtaaccgcga 1440

ggatcgccct agggtaaaac tggtgactgg ggctaagtct aaccaaggta acc 1493

<210> 4

<211> 1490

<212> DNA

<213> 多氏拟杆菌

<400> 4

agagtttgat cctggctcag gatgaacgct agctacaggc ttaacacatg caagtcgagg 60

ggcagcatgg tcttagcttg ctaaggctga tggcgaccgg cgcacgggtg agtaacacgt 120

atccaacctg ccgtctactc ttggccagcc ttctgaaagg aagattaatc caggatggga 180

tcatgagttc acatgtccgc atgattaaag gtattttccg gtagacgatg gggatgcgtt 240

ccattagata gtaggcgggg taacggccca cctagtcaac gatggatagg ggttctgaga 300

ggaaggtccc ccacattgga actgagacac ggtccaaact cctacgggag gcagcagtga 360

ggaatattgg tcaatgggcg atggcctgaa ccagccaagt agcgtgaagg atgactgccc 420

tatgggttgt aaacttcttt tataaaggaa taaagtcggg tatgcatacc cgtttgcatg 480

tactttatga ataaggatcg gctaactccg tgccagcagc cgcggtaata cggaggatcc 540

gagcgttatc cggatttatt gggtttaaag ggagcgtaga tggatgttta agtcagttgt 600

gaaagtttgc ggctcaaccg taaaattgca gttgatactg gatgtcttga gtgcagttga 660

ggcaggcgga attcgtggtg tagcggtgaa atgcttagat atcacgaaga actccgattg 720

cgaaggcagc ctgctaagct gcaactgaca ttgaggctcg aaagtgtggg tatcaaacag 780

gattagatac cctggtagtc cacacggtaa acgatgaata ctcgctgttt gcgatatacg 840

gcaagcggcc aagcgaaagc gttaagtatt ccacctgggg agtacgccgg caacggtgaa 900

actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggaggaac atgtggttta attcgatgat 960

acgcgaggaa ccttacccgg gcttaaattg cactcgaatg atccggaaac ggttcagcta 1020

gcaatagcga gtgtgaaggt gctgcatggt tgtcgtcagc tcgtgccgtg aggtgtcggc 1080

ttaagtgcaa cgagcgcaac ccttgttgtc agttactaac aggtgatgct gaggactctg 1140

acaagactgc catcgtaaga tgtgaggaag gtggggatga cgtcaaatca gcacggccct 1200

tacgtccggg gctacacacg tgttacaatg gggggtacag agggccgcta ccacgcgagt 1260

ggatgccaat ccctaaaacc cctctcagtt cggactggag tctgcaaccc gactccacga 1320

agctggattc gctagtaatc gcgcatcagc cacggcgcgg tgaatacgtt cccgggcctt 1380

gtacacaccg cccgtcaagc catgggagcc gggggtacct gaagtgcgta accgcgagga 1440

tcgccctagg gtaaaactgg tgactggggc taagtcgtaa caaggtaacc 1490

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 5

gcatccacgt gttggctca 19

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 6

ctccagccta ctcattggga tca 23

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 7

ccgagagtgc tgcctggatt a 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 8

agcttgccct ggacagtcag a 21

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 9

ccaacttgca gctgtccatc tc 22

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 10

catcactgcc ttgggtccag 20

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 11

ggtggtggct ctccttgtca tt 22

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 12

acaccgactc gtacagggtg tagtc 25

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 13

agacgtgcca gtcagcatca ac 22

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 14

ctattccgat agcattgggt gagtg 25

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 15

agtttccatg tccaaggctc attc 24

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 16

ttgtaacggc aaggcagcaa ta 22

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 17

tggcatatga ccgttgtgtg tg 22

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 18

acgtttgagc agatggaaac tcttg 25

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 19

tctacgaggg actgtggatg 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 20

tcagattcag caaggagtcg 20

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 21

ctttggctat gggcttccag tc 22

<210> 22

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 22

gcaaggagga cagagtttat cgtg 24

<210> 23

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 23

ctcatgatag tgcctgtgtc ctcaa 25

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 24

agggccagca taggtgcaag 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 25

tgtgtccgtc gtggatctga 20

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 26

ttgctgttga agtcgcagga g 21

<210> 27

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 27

tgaacgggaa gctcactgg 19

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 28

tccaccaccc tgttgctgta 20

<210> 29

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 29

caattcacac tgaatgccag ctc 23

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 30

caagcagtcc gtctcgtcca 20

<210> 31

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 31

tccaggatga ggacatgagc ac 22

<210> 32

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 32

gaacgtcaca caccagcagg tta 23

<210> 33

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 33

ccacttcaca agtcggaggc ttta 24

<210> 34

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 34

gcaagtgcat catcgttgtt catac 25

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 35

acgcgcaaac atgagtccag 20

<210> 36

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 36

ctcagcagca gcaacagcat c 21

<210> 37

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 37

atgtccggcc gatgctctc 19

<210> 38

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 38

tttggctgct cttgggtctg tat 23

<210> 39

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 39

gggcctaaac ccagtctgtt tg 22

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 40

gcccggtaag gtccatgcta 20

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 41

aaactggtcg ggcaattctg 20

<210> 42

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 42

agggttggac acctgaatgc ta 22

<210> 43

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 43

ctacgggggg cagcag 16

<210> 44

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 44

ggactaccgg ggtatct 17

<210> 45

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 45

tgccggcata tacgagtgtg a 21

<210> 46

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 46

cccgatggca ggtattacca ag 22

<210> 47

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 47

tttttgacag ggggagtgg 19

<210> 48

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 48

tgctgcagag gtcaaagttc aag 23

<210> 49

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 49

gaatgatggt tggtatggtg cg 22

<210> 50

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 50

tcagaagtgt gtctactgtc cg 22

Claims (17)

1. 下述(1)和(2)的组合：

(1) 包含由天然分离的普通拟杆菌(Bacteroides vulgatus)的活菌的组合物；以及

(2) 包含由天然分离的多氏拟杆菌(Bacteroides dorei)的活菌的组合物。

2.权利要求1所述的组合，其中，上述(1)的组合物和上述(2)的组合物为同一物质。

3.权利要求1或2所述的组合，该组合为药品或药品添加剂。

4.权利要求1或2所述的组合，该组合为食品或饲料或用于其的添加剂。

5.权利要求1～4中任一项所述的组合，该组合用于预防和/或改善与血中或肠内脂多糖水平亢进有关的疾病。

6.权利要求5所述的组合，其中，上述疾病为循环系统疾病、炎症性疾病或代谢性疾病。

7.权利要求5所述的组合，其中，上述疾病为选自心房颤动、心功能不全、缺血性心脏病、心肌梗塞、心绞痛、高血压、动脉硬化、主动脉瘤、主动脉夹层、闭塞性动脉硬化、主动脉瓣狭窄的循环系统疾病。

8.权利要求5所述的组合，其中，上述疾病为选自肝炎、非酒精性脂肪肝炎、脂肪肝、肝癌、肠道炎症、过敏性肠综合征、胃炎、胶原病、慢性类风湿性关节炎、慢性肾炎、IgA肾病、支气管哮喘、间质性肺炎、药物性肺损伤、嗜酸粒细胞性肺浸润综合征、非典型耐酸菌病、过敏性鼻炎、特应性皮炎和败血症的炎症性疾病。

9.权利要求5所述的组合，其中，上述疾病为选自糖尿病、肥胖、代谢综合征、生活习惯病、脂质异常症和骨质疏松症的代谢性疾病。

10.与血中或肠内脂多糖水平亢进有关的疾病的预防和/或改善方法，该方法包括：口服摄取由天然分离的普通拟杆菌的活菌和由天然分离的多氏拟杆菌的活菌。

11.权利要求10所述的方法，其中，上述疾病为循环系统疾病、炎症性疾病或代谢性疾病。

12.与血中或肠内脂多糖水平亢进有关的疾病的检查方法，该检查方法包括：测定受试者的肠道菌群中的普通拟杆菌和多氏拟杆菌的存在量。

13.权利要求12所述的方法，其中，上述疾病为循环系统疾病、炎症性疾病或代谢性疾病。

14. 权利要求12或13所述的方法，该方法包括：检测下述(1)和(2)的16S rRNA基因：

(1) 包含与SEQ ID NO: 1或2所表示的核苷酸序列具有98%以上的同源性的核苷酸序列的16S rRNA基因；以及

(2) 包含与SEQ ID NO: 3或4所表示的核苷酸序列具有98%以上的同源性的核苷酸序列的16S rRNA基因。

15. 与血中或肠内脂多糖水平亢进有关的疾病的发病风险的检查用试剂，该试剂包含：可检测普通拟杆菌和多氏拟杆菌的16S rRNA基因的引物组或探针。

16.权利要求15所述的试剂，其中，上述疾病为循环系统疾病、炎症性疾病或代谢性疾病。

17. 权利要求15或16所述的试剂，其中，16S rRNA基因包含下述(1)和(2)的核苷酸序列：

(1) 与SEQ ID NO: 1或2所表示的核苷酸序列具有98%以上的同源性的核苷酸序列；以及

(2) 与SEQ ID NO: 3或4所表示的核苷酸序列具有98%以上的同源性的核苷酸序列。

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