WO2019156251A1 - リポ多糖制御性腸内細菌及びその用途 - Google Patents

リポ多糖制御性腸内細菌及びその用途 Download PDF

Info

Publication number
WO2019156251A1
WO2019156251A1 PCT/JP2019/004763 JP2019004763W WO2019156251A1 WO 2019156251 A1 WO2019156251 A1 WO 2019156251A1 JP 2019004763 W JP2019004763 W JP 2019004763W WO 2019156251 A1 WO2019156251 A1 WO 2019156251A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
bacteroides
disease
drei
nucleotide sequence
intestinal
Prior art date
Application number
PCT/JP2019/004763
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
智也 山下
拓央 江本
吉田　尚史
Original Assignee
日東薬品工業株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 日東薬品工業株式会社 filed Critical 日東薬品工業株式会社
Priority to JP2019571188A priority Critical patent/JP7325106B2/ja
Priority to US16/968,376 priority patent/US11730772B2/en
Priority to EP19750410.3A priority patent/EP3750548A4/en
Priority to CN201980012489.5A priority patent/CN112105371A/zh
Publication of WO2019156251A1 publication Critical patent/WO2019156251A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L31/00—Edible extracts or preparations of fungi; Preparation or treatment thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/135—Bacteria or derivatives thereof, e.g. probiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates
    • G01N2400/10—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • G01N2400/50—Lipopolysaccharides; LPS

Definitions

  • the present invention relates to a lipopolysaccharide (hereinafter sometimes abbreviated as “LPS”) control enterobacteria and uses thereof. More specifically, the present invention relates to a combination of two specific bacteria belonging to the genus Bacteroides (ie, Bacteroides bulgatus and Bacteroides drei) that can control LPS production by enterobacteria and their translocation into the blood. Presence and / or amelioration agent for diseases, such as medicines, foods, etc., particularly LPS-related diseases (eg, cardiovascular diseases, inflammatory diseases, metabolic diseases) comprising the combination, presence of the bacteria in the intestinal flora The present invention relates to a method for diagnosing the above diseases using the amount as an index.
  • LPS lipopolysaccharide
  • Bacteroides contains several enteric bacteria that predominate in humans and is known to play an important role in maintaining a healthy intestinal ecosystem. Individuals classified as enterotype 3 characterized by a low level of Bacteroides spp. Have a high incidence of symptomatic arteriosclerosis (Non-patent Document 1). Furthermore, it has been clarified that the abundance of Bacteroides is decreased in patients with arteriosclerotic ischemic cerebral infarction and transient ischemic stroke (Non-patent Document 2).
  • Lipopolysaccharide a cell wall outer membrane component of Gram-negative bacteria, is known to activate immune cells such as macrophages. Metabolic endotoxemia is caused by chronic inflammation, diabetes, arteriosclerosis, etc. It has been shown to be involved in cardiovascular-metabolic diseases (Non-Patent Document 6). The present inventors have previously observed that the formation of arteriosclerotic lesions in the aortic sinus is suppressed in sterile ApoE-deficient mice compared to the same mice bred under conventional conditions, and concomitantly, It has been found that LPS levels and inflammatory cytokine levels in macrophages and aorta are low (Non-patent Document 7).
  • Patent Document 1 discloses capsule compositions for oral administration containing components (eg, LPS) derived from three types of bacteria belonging to the genus Bacteroides, including Bacteroides vulgatus. It can be used to treat and delay the onset of inflammatory diseases and autoimmune diseases. However, it has not been demonstrated that these compositions actually have this effect.
  • Non-Patent Document 8 shows that LPS derived from Bacteroides dorei has a different structure from LPS derived from E. coli, has a weak ability to stimulate Toll-like receptor 4 (TLR4), and is less likely to induce innate immunity. Is described.
  • TLR4 Toll-like receptor 4
  • the object of the present invention is to identify specific bacterial species of the intestinal flora that can be targets for new and inexpensive CAD prevention and / or treatment strategies.
  • the present inventors first performed 16S ribosomal RNA (rRNA) gene random sequencing to compare the gut microbiota in CAD patients and non-CAD patients. As a result, it was found that Bacteroides bulgatas and Bacteroides drei are decreased in CAD patients. Furthermore, the present inventors have elucidated the underlying mechanism of action linking these Bacteroides species and arteriosclerosis by a series of analyzes in ApoE-deficient mice showing an arteriosclerotic tendency. That is, these Bacteroides species remarkably suppress the production of LPS by intestinal bacteria and reduce the permeability of the barrier by strengthening the tight junction of the intestinal barrier, thereby allowing LPS to enter the blood (ie, endotoxin).
  • rRNA ribosomal RNA
  • the present invention provides the following.
  • [1] (1) a composition comprising viable bacteria of Bacteroides bulgatus isolated from nature; (2) A combination with a composition containing viable bacteria of Bacteroides dreii isolated from nature.
  • [2] The combination according to [1], wherein the composition of (1) and the composition of (2) are the same.
  • [3] The combination according to [1] or [2], which is a pharmaceutical product or a pharmaceutical additive.
  • [4] The combination according to [1] or [2], which is food or feed or an additive therefor.
  • [5] The combination according to any one of [1] to [4], for preventing and / or ameliorating a disease associated with increased blood or intestinal lipopolysaccharide levels.
  • the disease comprises atrial fibrillation, heart failure, ischemic heart disease, myocardial infarction, angina, hypertension, arteriosclerosis, aortic aneurysm, aortic dissection, obstructive arteriosclerosis, aortic stenosis
  • the disease is hepatitis, nonalcoholic steatohepatitis, fatty liver, liver cancer, intestinal inflammation, irritable bowel syndrome, gastritis, collagen disease, rheumatoid arthritis, chronic nephritis, IgA nephropathy, bronchial asthma, interstitial
  • the inflammatory disease selected from the group consisting of pneumonia, drug-induced lung injury, eosinophilic pulmonary infiltration syndrome, atypical mycobacterial disease, allergic rhinitis, atopic dermatitis and sepsis [5] A combination.
  • the disease is a metabolic disease selected from the group consisting of diabetes, obesity, metabolic syndrome, lifestyle-related diseases, dyslipidemia, and osteoporosis.
  • Diseases associated with increased blood or intestinal lipopolysaccharide levels comprising orally ingesting viable bacteria of Bacteroides bulgatus isolated from nature and viable bacteria of Bacteroides drei isolated from nature How to prevent and / or improve
  • the method according to [10], wherein the disease is a cardiovascular disease, an inflammatory disease, or a metabolic disease.
  • a method for examining a disease associated with increased blood or intestinal lipopolysaccharide levels comprising measuring the abundance of Bacteroides bulgatus and Bacteroides drei in the intestinal flora of a subject.
  • the disease is a cardiovascular disease, an inflammatory disease, or a metabolic disease.
  • [14] (1) a 16S rRNA gene comprising a nucleotide sequence having 98% or more identity with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2, and (2) a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4
  • a reagent for testing the risk of developing a disease associated with increased blood or intestinal lipopolysaccharide levels comprising a primer set or probe capable of detecting Bacteroides bulgatas and Bacteroides drei 16S rRNA genes.
  • the 16S rRNA gene is (1) a nucleotide sequence having 98% or more identity with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2, and (2) having 98% or more identity with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4.
  • the reagent according to [15] or [16] comprising a nucleotide sequence.
  • cardiovascular diseases such as arteriosclerosis, diseases associated with chronic inflammation, and metabolic abnormalities such as glycolipid metabolism are involved. Since metabolic diseases can be prevented and / or improved, an inexpensive and simple control strategy for these diseases is provided, which contributes to the medical economy in an aging society.
  • diagnosis and risk prediction of the disease can be performed through microbiome analysis in stool, and a noninvasive clinical test method is provided.
  • FIG. 1 It is a figure which shows the change of the intestinal microorganisms in a CAD patient or a non-CAD patient.
  • the V3-V4 region of bacterial 16S rRNA was sequenced in stool samples from 30 control patients (not developing CAD but having coronary artery risk factors) and 30 CAD patients.
  • A Based on the genus abundance in the gut microbiota, participants were classified into three clusters.
  • B Distribution of each major genus between clusters. One-way ANOVA was used to compare the intercluster distribution of each genus.
  • C Distribution of control and CAD patients in each cluster. A chi-square test was used to compare the three clusters.
  • FIG. 2 shows changes in intestinal immune response and lipopolysaccharide (LPS) production of intestinal microorganisms.
  • Colon and mesenteric lymph nodes were excised from 16 week old female Apoe ⁇ / ⁇ mice treated with Bacteroides bulgatas ATCC 8482 T strain and Bacteroides drei DSM 17855 T strain, or vehicle (control).
  • A mRNA expression levels of immune cell markers and chemokine / chemokine receptors in the colon (7-8 samples per group).
  • B mRNA expression levels of pro-inflammatory cytokines in the colon (7-8 samples per group).
  • C Flow cytometric analysis of specific cell markers in MLN (4-5 samples per group).
  • D mRNA expression level of cytokines in MLN (5 samples per group).
  • E Quantification of fecal LPS levels by horseshoe crab modified cell lysate assay (7-8 samples per group).
  • F Quantification of plasma LPS levels by horseshoe crab modified cell lysate assay (5 samples per group).
  • G Quantification of plasma cytokine levels by cytokine bead array (4-5 samples per group).
  • LB treated with live Bacteroides bulgatus ATCC 8482 T strain and Bacteroides drei DSM 17855 T strain; MFI: mean fluorescence intensity. Student's two-tailed t-test was used to detect significant differences between the two groups. Data are expressed as mean ⁇ standard error of the mean (ag). * P ⁇ 0.05, ** P ⁇ 0.01.
  • FIG. 5 shows the effects of gavage with live Bacteroides bulgatus and Bacteroides drei in the gut microbiota of mice prone to atherosclerosis. Feces were collected for 10 weeks from female Apoe ⁇ / ⁇ mice fed normal diet and diets treated with live Bacteroides bulgatas ATCC 8482 T strain and Bacteroides drei DSM 17855 T strain, or vehicle. The V3-V4 region of bacterial 16S rRNA was sequenced.
  • A Relative abundance of 15 microbial genera with the highest abundance before and after treatment.
  • PCA Principal component analysis
  • (E) Relative increase in fecal abundance of Bacteroides bulgatas and Bacteroides drei DNA after treatment (n 3 per group).
  • LB gavage with live Bacteroides bulgatus ATCC 8482 T strain and Bacteroides drei DSM 17855 T strain; before: before experiment; after: 10 weeks after gavage. It is a figure which shows inhibition of cell proliferation and cytokine production by the in vitro stimulation in a mouse
  • RAW264.7 cells were stimulated with fecal supernatant from mice treated with live Bacteroides bulgatus ATCC 8482 T strain and Bacteroides drei DSM 17855 T strain, or vehicle (control) for 10 weeks.
  • A Representative flow cytometry histogram (left panel) and quantitative analysis of Ki-67 expression (right panel) (5 samples per group).
  • B RAW264.7 cells transfected with control siRNA or TLR4 siRNA were stimulated with fecal supernatant from each group of mice. Cytokine levels were quantified by cytokine bead arrays (7 samples per group).
  • LB treated with live Bacteroides bulgatus ATCC 8482 T strain and Bacteroides drei DSM 17855 T strain; MFI: mean fluorescence intensity.
  • Student's two-tailed t test (a) or Mann-Whitney U test (b) was used. Data are expressed as mean ⁇ standard error of the mean (a), or median ⁇ quartile range (first to third quartile range) (b). * P ⁇ 0.05, ** P ⁇ 0.01.
  • FIG. 5 shows live Bacteroides treatment and immune response in the spleen.
  • Spleen cells were collected from 16-week-old Apoe ⁇ / ⁇ mice treated with Bacteroides bulgatus ATCC 8482 T strain and Bacteroides drei DSM 17855 T strain, or vehicle (control).
  • A Percentage of indicated immune cells in splenocytes (4-5 samples per group).
  • B Expression of immune cell markers in CD11c high antigen presenting cells (4-5 samples per group).
  • C CD4 + T cell count.
  • D Immune cell marker in CD4 + T cell count (5 samples per group).
  • E CTLA4 expression in CD4 + CD25 + Foxp3 + Tregs (5 samples per group).
  • LB treated with live Bacteroides bulgatus ATCC 8482 T strain and Bacteroides drei DSM 17855 T strain; Tregs: regulatory T cells; MFI: mean fluorescence intensity. * P ⁇ 0.05. Student's two-tailed t-test was used to detect significant differences between the two groups. Data are expressed as mean ⁇ standard error of the mean. It is a figure which shows the effect of single administration of live Bacteroides bulgatus ATCC 8482 T strain or Bacteroides drei DSM 17855 T strain on ApoE deficient mice. The control group was orally ingested with vehicle alone.
  • the upper left shows the size of the arteriosclerotic lesion in the aortic sinus
  • the upper right shows the LPS concentration in the intestinal tract (in feces).
  • the lower left corner shows the expression of tight junction-related genes in the large intestine
  • the lower right corner shows the expression of cytokine genes in the large intestine
  • the lower left corner shows the blood cytokine concentration.
  • FIG. 14-1 and FIG. 14-2 were administered viable bacteria of Bacteroides bulgatas ATCC 8482 T strain and Bacteroides der DSM 17855 T strain (B) or Bacteroides bulgatus NTZ002 strain and Bacteroides drei NTZ001 strain (NB) 2 shows improvement of various symptoms of obesity in an obese mouse model.
  • a schematically shows the administration protocol of each group.
  • B and C show the transition of the body weight of the mouse and the transition of the body weight gain, respectively.
  • D shows the results of the OGTT test (from the left, blood glucose level, AUC of blood glucose level, and insulin resistance (HOMA-IR)).
  • E shows HE, MAC3 and Sirius red stained images of epididymal fat specimens (left), and adipocyte size, number of crown-like structures per unit cell, and percentage of fibrosis area (right) Indicates.
  • F shows inflammatory cell marker or macrophage marker mRNA expression (left) and cytokines IFN ⁇ and TNF ⁇ mRNA expression in fat around the epididymis.
  • 15-1 and 15-2 show improvement of various symptoms of NASH in a NASH mouse model to which live bacteria of Bacteroides bulgatus ATCC 8482 T strain and Bacteroides drei DSM 17855 T strain were administered.
  • the upper panel shows a HE-stained image of a liver section at 17 weeks of age.
  • the middle panel shows NAFLD activity score (NAS), and the lower panel shows blood AST levels and AST / ALT ratio from the left. An overall view of the resected liver is shown.
  • NAS NAFLD activity score
  • LPS Lipopolysaccharide
  • the present invention provides a combination of Bacteroides bulgatus and Bacteroides drei, which are bacteria belonging to the genus Bacteroides (hereinafter also referred to as “combination of the present invention”).
  • the “combination” may exist as one composition in which the two are mixed, or may exist as a separate composition, but for a certain purpose (eg, pharmaceutical, food, or food additive). , A feed or a feed additive), which is used in combination.
  • the combination of the present invention reduces the LPS level in the intestine by coexisting in the intestines of humans and other animals, strengthens the tight junction of the intestinal barrier and decreases the LPS level in the blood, Inflammatory and immune responses in blood vessels and organs can be suppressed (in this specification, these effects may be comprehensively referred to as “lipopolysaccharide (LPS) controllability”).
  • LPS lipopolysaccharide
  • the “combination of the present invention” (1) a composition comprising viable bacteria of Bacteroides bulgatus isolated from nature; (2) A combination with a composition containing viable bacteria of Bacteroides dreii isolated from nature.
  • Bacteroides is a Gram-negative obligate anaerobic non-spore-forming gonococcus classified into bacteroides, bacteroides, bacteroides, and bacteroides, and currently 92 and 5 subspecies are known. Yes.
  • the genus Bacteroides contains several enteric bacteria that predominate in humans and is believed to play an important role in maintaining a healthy intestinal ecosystem.
  • Bacteroides vulgatus is the most commonly isolated bacterium from the human digestive tract and is generally considered a beneficial commensal fungus.
  • Bacteroides dorei was isolated from human feces in 2006 and was identified as the newest strain (approximately 96% identical) to Bacteroides bulgatas by 16S rRNA gene sequencing (with about 96% identity). Int J Sys Evol Microbiol. 56, 1639-1643, 2006).
  • isolated from nature means that the cells have been artificially manipulated so that the density of the cells is higher than that originally existing in nature. It includes not only those that have been (isolated and purified) but also those that contain other contaminants. On the other hand, when a natural product such as stool or cecal contents is simply collected, it is not included in “separated from nature”.
  • the active ingredients of the combination of the present invention may be provided by any method as long as they are separated from nature.
  • natural sources eg, feces, What was newly separated from digestive tract contents such as cecum, soil, and water
  • the separation source is preferably human or other mammalian feces.
  • stool samples are suspended in sterile phosphate buffered saline (PBS) etc., and the resulting suspension is plated on a plate medium suitable for Bacteroides spp. From the mycological characteristics (morphological characteristics, biochemical characteristics, etc.) of the colonies obtained, colonies of Bacteroides bulgatus and Bacteroides drei can be selected. The following are representative mycological characteristics of both species.
  • the optimum temperature is 37 ° C (2-2) Obligate anaerobic (3) Physiological and biochemical characteristics (3-1) Gram staining: Negative (3-2) Other biochemical characteristics are shown in Table 1 [in the table, 1 Represents Bacteroides drei JCM13471 T strain, 2 represents Bacteroides drei JCM13472 strain, and 3 represents Bacteroides bulgatus JCM5826 T strain. Biochemical tests were performed using API 20 A and API rapid ID 32 A strips (bioMerieux). ] (Extracted from Int J Sys Evol Microbiol. 56, 1639-1643, 2006)
  • bacterium isolated from the isolation source belongs to Bacteroides bulgatus or Bacteroides drei is determined by, for example, PCR-amplifying all or part of the 16S rRNA gene using the genomic DNA extracted from the strain as a template, and the amplification
  • the nucleotide sequence of the fragment can be determined and compared with known sequence data of Bacteroides bulgatus and Bacteroides drei, and discriminated by performing phylogenetic analysis.
  • the phylogenetic analysis and the phylogenetic tree preparation method can be performed according to the following procedure.
  • genomic DNA as a template is extracted from bacteria.
  • Methods for extracting DNA from bacteria are known and any method may be used. In general, a method of treating cells with a cell wall degrading enzyme such as lysozyme, a physical destruction method using glass beads, a treatment method of repeating freeze-thawing, and the like are used. Commercially available reagents for DNA extraction can also be used. Genomic DNA does not necessarily have to be extracted in an intact state. Therefore, it is possible to appropriately select a method that has a low possibility of sample contamination, is easy to operate, and can be performed quickly.
  • the target DNA encoding 16S rRNA is amplified by polymerase chain reaction (PCR).
  • the sequence of the primer used in PCR can be appropriately designed so that at least target DNA encoding 16S rRNA of all known bacteria belonging to Bacteroides bulgatus and / or Bacteroides drei can be amplified.
  • Primers consisting of sequences conserved across species (universal primers; for example, 27F and 357R primer sets that amplify about 350 bases in the V1 to V2 region, and about the V3 to V4 region used in the examples described later) 342F and 806R primer sets that amplify 460 bases).
  • the PCR conditions are not particularly limited, and can be appropriately selected within the range usually used.
  • the reaction can be performed using a commercially available PCR reagent according to the attached instructions.
  • the DNA fragment amplified by PCR is purified using a spin column or the like, if necessary, and its base sequence is determined.
  • the base sequence can be determined according to a standard method.
  • a known sequence showing the highest homology can be extracted by performing a homology search with a known bacterial 16S ribosomal DNA sequence using an appropriate gene sequence database and homology search program.
  • BLAST and FASTA can be used through the homepage of the Japan DNA Data Bank (DDBJ).
  • DDBJ Japan DNA Data Bank
  • the determined base sequence is used as a query
  • 16S rRNA Prokaryotes
  • Any other gene sequence database can be used (eg, RDP (http://rdp.cme.msu.edu), Silva (http: /) as long as it includes a dataset of bacterial 16S rRNA gene sequences. /www.arb-silva.de)).
  • a publicly known homology search program other than the above can also be used.
  • identification at the genus level requires 95% or more, and identification at the species level requires 98% or more 16S rRNA gene sequence identity (Science 2005, 307, 1915-1920). . Therefore, as a result of the homology search, if the sequence of the 16S rRNA gene of the isolated bacterium has 98% or more identity with the known sequence of the bacterium belonging to Bacteroides bulgatus or Bacteroides drei, It can be identified as a bacterium belonging to the species Bacteroides.
  • a known 16S rRNA gene sequence to be used for discrimination is a sequence derived from Bacteroides bulgatus ATCC 8482 T strain registered in GenBank with accession number NR_074515 (SEQ ID NO: 1), Examples include, but are not limited to, a sequence derived from Bacteroides bulgatas JCM5826 T strain (SEQ ID NO: 2) registered under accession number NR — 112946.
  • a known 16S rRNA gene sequence of Bacteroides drei for example, a sequence derived from Bacteroides drei JCM13471 T strain registered in GenBank with accession number AB242142 (sequence number 3), registered with accession number AB242143. Examples thereof include, but are not limited to, a sequence derived from the Bacteroides drei JCM13472 strain (SEQ ID NO: 4). Therefore, when the nucleotide sequence of the PCR amplified fragment has 98% or more identity with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2, the isolated bacterium should be identified as a bacterium belonging to Bacteroides bulgatus. Can do.
  • the isolated bacterium may be identified as a bacterium belonging to Bacteroides drei. it can.
  • Bacteroides bulgatus and Bacteroides drei used in the combination of the present invention may be already isolated and commercially available, or may be a strain that can be stored and distributed in a depository.
  • such strains include, for example, ATCC 8482 T strain, DSM 1447 T strain, JCM 5826 T strain, NBRC 14291 T strain, NCTC 11154 T strain, NTZ002 strain, etc. Examples thereof include, but are not limited to, DSM 17855 T strain, JCM 13471 T strain, JCM 13472 strain, NTZ001 strain, and the like.
  • NTZ002 and NTZ001 shares were numbered NITE BP-02863 and NITE BP-02862, respectively, on January 15, 2019.
  • the National Institute for Product Evaluation Technology Patent Microbiology Depositary Center ⁇ 292-0818 Japan
  • 2-10-8 Kazusa Kamashika, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan No. 122.
  • Bacteroides bulgatus and Bacteroides drei used in the combination of the present invention coexist in the intestines of humans and other animals, thereby reducing LPS levels in the intestines and strengthening the tight junction of the intestinal barrier in the blood. Any combination of strains may be used as long as the level of LPS can be reduced and the inflammatory and immune responses in the intestine, blood vessels, and organs can be suppressed (that is, LPS controllability).
  • a preferred embodiment includes, but is not limited to, a combination of Bacteroides bulgatus ATCC 8482 T or NTZ002 and Bacteroides drei DSM 17855 T or NTZ001.
  • Bacteroides bulgatus or Bacteroides drei used in the combination of the present invention is combined with bacteroides drei or bacteroides bulgatus, which are concomitant bacteria, respectively, as long as LPS controllability can be exerted, by any of the above means Not only the isolates (wild strains) from the natural source obtained, but also mutants obtained by subjecting them to mutagenesis treatment.
  • mutagenesis treatment include exposure to chemical substances such as nitroso compounds (eg, nitrosamines, nitrosoguanidines), alkylating agents (eg, ethyl methanesulfonate (EMS)), ultraviolet irradiation, and radiation irradiation. But not limited to.
  • Whether or not the obtained mutant strain exhibits LPS controllability when combined with a concomitant bacterium can be determined, for example, by using the mutant strain and the concomitant bacterium as a disease animal model (eg, ApoE deficient arteriosclerosis mouse model, obese mouse model) , NASH mouse model, etc., improve symptoms, improve various parameters (eg, blood or intestinal LPS level, blood cytokine level, intestinal barrier function, body weight, organ weight, histopathology, etc.) When recognized, it can be determined that the mutant has LPS controllability.
  • a disease animal model eg, ApoE deficient arteriosclerosis mouse model, obese mouse model
  • NASH mouse model e.g, etc., improve symptoms, improve various parameters (eg, blood or intestinal LPS level, blood cytokine level, intestinal barrier function, body weight, organ weight, histopathology, etc.)
  • the mutant has LPS controllability.
  • the mutant strain and a combined bacterium are added, and the cell growth and production of inflammatory cytokines are shown, It can be determined that the mutant has LPS controllability.
  • the Bacteroides bulgatus and Bacteroides drei thus obtained can be cultured under known culture conditions and maintained and amplified.
  • As the medium ATCC Medium 2107 (peptone 10 g, beef extract 10 g, yeast extract 3 g, dextrose 5 g, NaCl 5 g, soluble starch 1 g, L-cysteine hydrochloride 0.5 g, sodium acetate 3 g, 0.025% Resazurin 4 mL, distilled Water 1L), ATCC Medium 260 (trypton 15 g, soyton 5 g, NaCl 5 g, defibrinated sheep blood 50 mL, distilled water 950 mL), EG medium supplemented with 5% horse blood, and the like can be used.
  • These media can be used as liquid media, for example, solid media with 1.5% agar added.
  • the culture is carried out under anaerobic conditions (oxygen concentration of 1 ppm or less).
  • it can be cultured in an anaerobic gas chamber under a mixed gas atmosphere of 10% CO 2 , 10% H 2 and 80% N 2 .
  • the culture temperature is 25 to 40 ° C, preferably about 37 ° C.
  • Examples of the culture period include 12 to 72 hours, preferably 24 to 48 hours, but are not particularly limited.
  • Bacteroides bulgatus and Bacteroides drei can be mixed and cultured in the same medium as long as they do not adversely affect the growth and biological activity of each other.
  • each of Bacteroides bulgatus and Bacteroides drei contained in the combination of the present invention may be a single strain or a mixture of two or more strains.
  • Bacteroides bulgatus and Bacteroides dreyi cultures thus obtained can be stored frozen at -80 ° C. or lower as a glycerol stock by a known method until use, or lyophilized by a known method. And can be stored at 2-8 ° C.
  • Bacteroides bulgatus and Bacteroides drei of the present invention are in a living state (live bacteria), the culture (bacteria) is used as it is or a method known per se from the culture, for example, centrifugation.
  • bacteria treated products such as wet cells collected by filtration, magnetic separation, etc., or washed products thereof (can be washed with sterilized water, medium, PBS, etc.) or lyophilized powders thereof. , And can be blended in a composition containing them.
  • “bacteria” or “bacteria-treated product” means “dead” or “battered cell”, “bacterial cell extract”, “bacterial cell component”, etc. It is used in a sense that does not include those in the "" state.
  • Bacteroides bulgatus cells or treated products, and Bacteroides drei cells or treated products should be formulated alone or together with additives that are acceptable for pharmaceuticals or food or feed processing. Can do.
  • the bacterial cell or the treated bacterial cell can be blended in a pharmaceutical composition or food or feed as a pharmaceutical additive or food or feed additive.
  • Bacteroides bulgatus cells or treated cells and Bacteroides drei cells or treated cells may be formulated as separate compositions and used as kit formulations. Although preferred, they can preferably be formulated in the same composition and used as a single formulation.
  • the compositions may be simultaneously or at a time difference, It can be inoculated by the same route or by another route.
  • the pharmaceutical product or the pharmaceutical product containing the additive is, for example, a powder, granule, pill, soft capsule, hard capsule, tablet, chewable tablet, quick-disintegrating It can be formulated into tablets, syrups, solutions, suspensions, suppositories, injections and the like.
  • compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including dragees and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (including soft capsules). Syrup, emulsion, suspension and the like.
  • Such a composition is produced by a known method and may contain additives commonly used in the pharmaceutical field, such as excipients, binders, disintegrants, lubricants and the like.
  • excipients include animal and vegetable oils such as soybean oil, safflower oil, olive oil, germ oil, sunflower oil, beef tallow and sardine oil, polyhydric alcohols such as polyethylene glycol, propylene glycol, glycerin and sorbitol, sorbitan fatty acid esters, Surfactants such as sucrose fatty acid ester, glycerin fatty acid ester, polyglycerin fatty acid ester, purified water, lactose, starch, crystalline cellulose, D-mannitol, lecithin, gum arabic, sorbitol solution, sugar solution and the like can be mentioned.
  • animal and vegetable oils such as soybean oil, safflower oil, olive oil, germ oil, sunflower oil, beef tallow and sardine oil
  • polyhydric alcohols such as polyethylene glycol, propylene glycol, glycerin and sorbitol, sorbitan fatty acid esters
  • Surfactants such as sucrose fatty
  • binder examples include hydroxypropyl methylcellulose, hydroxypropylcellulose, gelatin, pregelatinized starch, polyvinylpyrrolidone, polyvinyl alcohol and the like.
  • disintegrant examples include carmellose calcium, carmellose sodium, croscarmellose sodium, crospovidone, low-substituted hydroxypropylcellulose, and corn starch.
  • lubricant examples include talc, hydrogenated vegetable oils, waxes, natural products such as light anhydrous silicic acid and derivatives thereof, stearic acid, magnesium stearate, calcium stearate, aluminum stearate and the like.
  • sweeteners, colorants, pH adjusters, fragrances, various amino acids and the like can be added to the above composition.
  • Tablets and granules may be coated by a known method. If it is a liquid preparation, it may be dissolved or suspended in water or other suitable medium at the time of taking.
  • compositions for parenteral administration for example, injections, suppositories and the like are used.
  • a method for preparing the injection for example, it is prepared by suspending or emulsifying Bacteroides bulgatus and Bacteroides drei cells or a treated product thereof in a sterile aqueous liquid or oily liquid usually used for injection. it can.
  • aqueous liquid for injection for example, isotonic solution containing physiological saline, glucose and other adjuvants, and the like are used.
  • oily liquid for example, sesame oil, soybean oil and the like are used.
  • the suppository used for rectal administration can be prepared by mixing Bacteroides bulgatas and Bacteroides drei cells or treated products with a normal suppository base.
  • the combination of the present invention may be used in combination with other drugs such as anti-inflammatory drugs, anti-arteriosclerotic drugs, anti-diabetic drugs, etc., depending on the target disease. Good.
  • the combination and the combination of the present invention may be formulated as a single composition (mixture) or may be provided as separate compositions.
  • the combination of the present invention and the concomitant drug can be administered to the subject by the same route or by different routes at the same time or at different times.
  • the combination of the present invention is provided as a food (or feed) or a food additive (or feed additive)
  • the food (or feed) or the food (or feed) containing the additive is a solution, a suspension.
  • a turbid material such as a powder, and a solid molded product.
  • supplements include supplements (powder, granules, soft capsules, hard capsules, tablets, chewable tablets, quick-disintegrating tablets, syrups, liquids, etc.), beverages (carbonated beverages, lactic acid beverages, sports beverages, fruit juice beverages, vegetable beverages, soy milk beverages) , Coffee beverages, tea beverages, powdered beverages, concentrated beverages, nutritional beverages, alcoholic beverages, etc.), dairy products (yogurt, butter, cheese, ice cream, etc.), confectionery (gummy, jelly, gum, chocolate, cookies, candy, caramel) , Japanese confectionery, snack confectionery, etc.), instant foods (instant noodles, retort foods, canned foods, microwave foods, instant soups, miso soups, freeze-dried foods, etc.), oils, oils and fats foods (mayonnaise, dressing, cream, margarine, etc.) Flour products (bread, pasta, noodles, cake mix, bread crumbs, etc.), seasonings (sauce, tomato Doo processing seasoning, flavor seasonings, cooking mix, soup, etc.), processed livestock
  • the above food includes various nutrients, various vitamins as necessary (vitamin A, vitamin B1, vitamin B2, vitamin B6, vitamin C, vitamin D, vitamin E, vitamin K, etc.), various minerals ( Magnesium, zinc, iron, sodium, potassium, selenium, etc.), dietary fiber, dispersants, stabilizers such as emulsifiers, sweeteners, taste ingredients (citric acid, malic acid, etc.), flavors, royal jelly, propolis, agaricus, etc. Can be blended.
  • the viable count of Bacteroides bulgatus and Bacteroides drei contained in the combination of the present invention is, for example, 10 4 to 10 12 colony forming units (cfu), preferably 10 6 to 10 as daily intake. 10 cfu.
  • the combination of the present invention may further contain other useful microorganism cells or treated cells.
  • other microorganisms include, for example, Lactobacillus genus, Streptococcus genus, Leuconostoc genus, Pediococcus genus, Lactococcus genus, Enterococcus (Enterococcus). ), Lactic acid bacteria belonging to the genus Bifidobacterium, yeast, Bacillus genus, Clostridium butyricum, Neisseria gonorrhoeae and the like, but are not limited thereto.
  • the compounding amount of the combined microorganism is, for example, 10 4 to 10 12 colony forming units (cfu), preferably 10 6 to 10 10 cfu, as the daily intake.
  • Diseases associated with increased LPS levels in the blood or intestine include, for example, atrial fibrillation, heart failure, ischemic heart disease, myocardial infarction, angina, hypertension, arteriosclerosis, aortic aneurysm, aortic dissection, Cardiovascular diseases such as obstructive arteriosclerosis, aortic stenosis, or hepatitis, nonalcoholic steatohepatitis, fatty liver, liver cancer due to progression of hepatitis, intestinal inflammation, irritable bowel syndrome, gastritis, collagen disease Rheumatoid arthritis, chronic nephritis, IgA nephropathy, bronchial asthma, interstitial pneumonia, drug-induced lung injury, eosinophilic pulmonary infiltration syndrome, atypical mycobacteriosis, allergic rhinitis, atopic dermatitis, sepsis Inflammatory diseases such as diabetes, metabolic diseases such as diabetes, obesity, metabolic syndrome, lifestyle-
  • the combination of the present invention is described above for humans or other mammals (eg, dogs, cats, mice, rats, hamsters, guinea pigs, rabbits, pigs, cows, goats, horses, sheep, monkeys, etc.).
  • the intake per day can be taken orally once a day or divided into several times. Alternatively, it can be administered rectally.
  • the combination of the present invention is provided as a food
  • the food is sold with an indication that it is used for the prevention and / or improvement of diseases associated with increased blood or intestinal LPS levels. can do.
  • “display” means all actions for informing consumers of the above-mentioned use, and if the display can recall and analogize the use, the purpose of the display, the content of the display, Regardless of the object / medium to be displayed, all of them correspond to “display” in the present invention. However, it is preferable to display in such an expression that the consumer can directly recognize the application.
  • the act of describing the above-mentioned use in the product relating to the food of the present invention or the packaging of the product the thing describing the above-mentioned use in the packaging of the product or the product, transferred, and exhibited for delivery, transfer or delivery , Importing, displaying advertisements related to products, price lists or transaction documents for display or distribution, or describing the above uses in information containing these contents by electromagnetic (Internet etc.) methods
  • the act to provide etc. can be illustrated.
  • the display is preferably a display approved by the government or the like (for example, a display which is approved based on various systems determined by the government and is performed in a mode based on such approval). Display on advertising materials at sales sites such as catalogs, pamphlets, and POPs, and other documents is preferable.
  • indications such as health foods, functional foods, enteral nutrition foods, special-purpose foods, nutritional functional foods, quasi-drugs, and other indications approved by the Ministry of Health, Labor and Welfare, for example, , Foods for specified health use, and labeling approved under a similar system.
  • Examples of the latter can include a display as a food for specified health use, a display as a condition specific food for specified health use, a display that affects the structure and function of the body, a display for reducing disease risk, etc.
  • Speaking of the health promotion law enforcement regulations (April 30, 2003 Ministry of Health, Labor and Welfare Ordinance No. 86) labeling as food for specified health use (especially labeling the use of health), and similar Display is a typical example.
  • Test method of the present invention and reagent therefor The present invention is also associated with increased blood or intestinal LPS levels comprising measuring the abundance of Bacteroides bulgatus and Bacteroides drei in the gut microbiota of the subject
  • LPS-related disease hereinafter also referred to as “LPS-related disease”
  • test agent of the present invention a reagent therefor
  • Bacteroides bulgatus and Bacteroides drei are significantly reduced in abundance in the gut microbiota of patients with coronary artery disease (CAD), and both bacterial species are present in arteriosclerosis mouse models.
  • Ingestion improves symptoms of arteriosclerosis, reduces intestinal LPS levels, strengthens intestinal barrier tight junctions and lowers blood LPS levels, inflammatory responses in the intestines and blood vessels Can suppress immune response (ie have LPS control).
  • the symptoms of obesity can be improved and the inflammatory and immune responses in the organ can be suppressed.
  • the subject to be inspected by the inspection method of the present invention is not particularly limited. For example, those who are suspected of having LPS-related diseases such as circulatory system diseases, inflammatory diseases, metabolic diseases and the like, and patients who are already known to have these diseases may be included. Knowing that the abundance of Bacteroides bulgatus and Bacteroides drei in the gut microbiota is reduced, the enrichment of the bacterial species in the gut microbiota can be one of the therapeutic targets for the patient. is there.
  • the sample derived from the subject for this test is preferably stool from the viewpoint of easy collection, but is not particularly limited as long as it is a sample that can reflect the intestinal bacterial flora of the subject. For example, cecal contents) may be used.
  • the detection of Bacteroides bulgatus and Bacteroides derrey is, for example, 16S rRNA gene of the bacterial species, specifically, in the case of Bacteroides bulgatus, 98% or more of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2
  • a 16S rRNA gene comprising a nucleotide sequence having sex and in the case of Bacteroides drei, a 16S rRNA gene comprising a nucleotide sequence having 98% or more identity with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4 Can be performed.
  • the DNA recovered from the sample is dissolved in an appropriate buffer such as TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) and used for detection of the 16S rRNA gene.
  • TE 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0
  • the detection of 16S rRNA gene is performed by detecting Bacteroides bulgatas 16S rRNA gene, that is, 16S rRNA gene comprising a nucleotide sequence having 98% or more identity with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2. And / or a primer capable of specifically amplifying a 16S rRNA gene of Bacteroides drei, that is, a 16S rRNA gene comprising a nucleotide sequence having 98% or more identity with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4 It is carried out by performing PCR using DNA recovered from the sample as a template.
  • the primer may be any primer as long as it is designed so as to specifically PCR amplify a part or all of the 16S rRNA gene.
  • “specifically” means that the primer PCR amplifies a part or all of the 16S rRNA gene of Bacteroides bulgatas and / or Bacteroides drei, but PCR amplifies 16S rRNA genes other than the bacterial species. It means not.
  • primers examples include a sequence of complementary sequences of a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 and a nucleotide sequence having 98% or more identity (preferably a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2).
  • nucleotide sequence having 98% or more identity with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4 (preferably the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4)
  • a polynucleotide comprising a nucleotide sequence of about 15 to about 50 bases, preferably about 18 to about 30 bases, which hybridizes to the partial sequence to be sequenced, and a continuous partial sequence of the nucleotide sequence 3 ′ to the hybridization site.
  • About 15 to about 50 bases, preferably about 18 to about 30 bases, of hybridizing A combination of a polynucleotide comprising a sequence, fragment length of about 50 to about 1,000 bases of nucleic acid amplified by them, preferably from about 100 to about 500 bases include a pair of polynucleotides.
  • the primer is preferably a nucleotide sequence having 98% or more identity with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 (preferably a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2) and / or SEQ ID NO: 3. Or 15 to 50 bases (preferably 18 to 30 bases) of a nucleotide sequence having 98% or more identity with the nucleotide sequence represented by 4 (preferably the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4) Or a partial sequence of 15 to 50 bases (preferably 18 to 30 bases) continuous with a complementary sequence thereof.
  • At least one of them is within the 16S rRNA gene in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 and / or the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4. It has a nucleotide sequence located in any of nine variable regions (V1 to V9) having different sequences among the contained bacterial species, or a complementary nucleotide sequence to its complementary strand sequence.
  • the 16S rRNA gene of Bacteroides bulgatus and the 16S rRNA gene of Bacteroides drei may be detected separately or may be detected in a lump without distinguishing both.
  • the arteriosclerosis symptom was improved, but there was a significant difference.
  • intestinal LPS levels could not be reduced. Therefore, it is desirable to detect Bacteroides bulgatus and Bacteroides drey separately, but it is difficult to realistically consider that the abundance of either one in the intestinal flora changes significantly. Even if detected, the determination result is not substantially affected.
  • Bacteroides bulgatus ATCC 8482 T strain 16S rRNA gene (SEQ ID NO: 1) and Bacteroides drei JCM 13471 T strain 16S rRNA gene (SEQ ID NO: 3) are aligned using BLAST (NCBI) under default conditions. 11 as shown in FIG. 11 (Query indicates SEQ ID NO: 1 and Sbjct indicates SEQ ID NO: 3). Both sequences overlap over 1493 nucleotides (positions 12-1497 of SEQ ID NO: 1, positions 1-1490 of SEQ ID NO: 3; gap number 10) and show high homology of about 97% (1449/1493) identity.
  • the design region of the Bacteroides bulgatus-specific primer and the Bacteroides bregatus-specific primer that can be distinguished and amplified by distinguishing the 16S rRNA gene of Bacteroides bulgatas and Bacteroides drei is limited.
  • positions 181 to 210 of SEQ ID NO: 1 have only about 73% (22/30) identity with the corresponding region of SEQ ID NO: 3, and positions 1001 to 1028 of SEQ ID NO: 1 Since there is only about 60% (18/30) identity with the three corresponding regions, the design of either or both primers within these regions allows the Bacteroides bulgatus 16S rRNA gene to It can be amplified separately from the Bacteroides drei 16S rRNA gene.
  • 16S rRNA genes of Bacteroides bulgatas and Bacteroides derrey are collectively amplified
  • Bacteroides bulgatus is described in, for example, “Molecular ecological detection and identification of intestinal flora” p109-121 (2000).
  • 16S rRNA of both bacterial species can be obtained by using a primer set (amplified at positions 136 to 608 of SEQ ID NO: 1 and positions 125 to 599 of SEQ ID NO: 3) described as specific primers (Bacteroides Drei has not been identified at that time). Genes can be amplified together and without amplifying 16S rRNA genes of other enteric bacteria.
  • the amplified fragment of SEQ ID NO: 1 has one TaqI restriction site (TCGA; positions 288 to 291 of SEQ ID NO: 1), but the amplified fragment of SEQ ID NO: 3 contains TaqI Since there is no restriction site, if the amplified fragment is digested with TaqI and electrophoresed, if only Bacteroides bulgatus is present, two bands of 153 bp and 320 bp are detected, but only Bacteroides drei exists. If not, one band of 475 bp is detected. When both bacterial species are present, the above three bands are detected. Therefore, by combining RFLP analysis with primers capable of collectively amplifying 16S rRNA genes of Bacteroides bulgatas and Bacteroides drei, it is possible to detect both bacterial species separately.
  • the temperature setting, reaction time, and cycle number in PCR can be appropriately set according to the amount of template DNA used, the type of primer, and the like.
  • the annealing temperature in PCR can be appropriately set based on the GC content of the primer.
  • the obtained PCR products are separated by electrophoresis (for example, agarose gel electrophoresis, polyacrylamide gel electrophoresis, etc.). After electrophoresis, the gel is stained with a known staining solution such as ethidium bromide solution, and a PCR product is detected using a transilluminator or the like. Then, the presence / absence and amount of Bacteroides bulgatus and / or Bacteroides drei in the sample are determined using the presence / absence and amount of the specific PCR product as an index.
  • electrophoresis for example, agarose gel electrophoresis, polyacrylamide gel electrophoresis, etc.
  • the PCR used in the inspection method of the present invention may be quantitative PCR.
  • Quantitative PCR can be performed by a known method, but two analysis methods are known. The first is to analyze the amount of reaction product during the exponential increase period using the characteristic that the reaction product increases exponentially to a certain amount in the PCR reaction and then reaches a plateau, and the initial template amount Is a method of calculating
  • the second method is a method of determining the number of PCR cycles (Ct) exceeding a certain threshold value (threshold) by monitoring the reaction products in real time.
  • it is necessary to perform PCR by changing the amount of DNA at a known concentration, analyze the reaction product in each cycle number, and determine a quantitative PCR cycle number range from the kinetics.
  • the abundance of the target gene in an unknown sample is estimated.
  • the abundance of Bacteroides bulgatus and / or Bacteroides drei in the sample can be quantified. If it is estimated that the target gene is contained even in one copy in the test sample, it is determined that the target bacterium is present. can do.
  • the detection of the 16S rRNA gene is performed using the Bacteroides bulgatas 16S rRNA gene, that is, the 16S rRNA gene comprising a nucleotide sequence having 98% or more identity with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2.
  • a probe capable of specifically hybridizing a 16S16rRNA gene of Bacteroides drei, that is, a 16S rRNA gene comprising a nucleotide sequence having 98% or more identity with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4 Can be performed by contacting the total DNA or total RNA in the sample and detecting the hybrid.
  • the contact conditions are appropriately set so that the probe hybridizes with 16S rRNA or a gene encoding it to form a nucleic acid complex.
  • the complex is detected as indicating the presence of Bacteroides bulgatus and / or Bacteroides drei.
  • the probe is a nucleotide sequence having 98% or more identity with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 (preferably a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2) and / or SEQ ID NO: 3 or 4 About 15 bases or more, preferably about 18 to about 500 bases, contained in a nucleotide sequence having 98% or more identity with the nucleotide sequence represented by (preferably the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4) More preferably, the polynucleotide hybridizes under stringent conditions to a continuous nucleotide sequence of about 18 to about 200 bases, more preferably about 18 to about 50 bases, or a complementary sequence thereof.
  • Hybridization should be carried out according to a method known per se or a method analogous thereto, for example, the method described in Molecular Cloning, 2nd edition (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). Can do.
  • stringent conditions for example, a hybridization reaction at 45 ° C. in 6 ⁇ SSC (sodium chloride / sodium citrate), followed by one or more times at 65 ° C. in 0.2 ⁇ SSC / 0.1% SDS For example, washing.
  • a person skilled in the art may appropriately change the salt concentration of the hybridization solution, the temperature of the hybridization reaction, the probe concentration, the length of the probe, the number of mismatches, the time of the hybridization reaction, the salt concentration of the washing solution, the washing temperature, etc.
  • the desired stringency can be easily adjusted.
  • the probe is a nucleotide sequence having 98% or more identity with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 (preferably a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2) and / or SEQ ID NO: 3.
  • a nucleotide sequence having 98% or more identity with the nucleotide sequence represented by 4 preferably the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4
  • a nucleic acid comprising a continuous nucleotide sequence of 500 bases, more preferably from about 18 to about 200 bases, even more preferably from about 18 to about 50 bases, or a complementary sequence thereof.
  • a suitable probe is a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2, or a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4, and a sequence between bacterial species contained in the 16S rRNA gene. And a nucleic acid that hybridizes under stringent conditions to a nucleotide sequence located in any of nine variable regions (V1 to V9) different from each other or a complementary sequence thereof.
  • V1 to V9 nine variable regions
  • nucleic acid containing a region exemplified as a primer that can specifically and collectively amplify Bacteroides bulgatas 16S rRNA gene and Bacteroides drei 16S rRNA gene as Bacteroides bulgatus and Bacteroides drei It can be mentioned as a probe that can be detected.
  • the primer or probe constituting the test agent of the present invention may contain an additional sequence (a nucleotide sequence that is not complementary to the polynucleotide to be detected) as long as specific detection is not hindered.
  • the polynucleotide used as the primer or probe may be deoxyribonucleic acid (DNA) or ribonucleic acid (RNA).
  • RNA ribonucleic acid
  • a thymidine residue (T) in the nucleotide sequence is appropriately replaced with a uridine residue (U).
  • T thymidine residue
  • U uridine residue
  • RNA containing a thymidine residue synthesized by changing U at any position to T may be used.
  • point mutations such as deletion, insertion or substitution, or modified nucleotides may exist in the polynucleotide as long as the specificity of hybridization is not lowered.
  • the primer or probe may be an appropriate labeling agent such as a radioisotope (eg, 125 I, 131 I, 3 H, 14 C, 32 P, 33 P, 35 S, etc.), an enzyme (eg, ⁇ -galactosidase). , ⁇ -glucosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase, etc.), fluorescent substances (eg, fluorescamine, fluorescein isothiocyanate, etc.), luminescent substances (eg, luminol, luminol derivatives, luciferin, lucigenin, etc.) In addition, it may be labeled with biotin or the like.
  • a radioisotope eg, 125 I, 131 I, 3 H, 14 C, 32 P, 33 P, 35 S, etc.
  • an enzyme eg, ⁇ -galactosidase.
  • ⁇ -glucosidase alkaline phosphat
  • the nucleic acid used as the primer or probe can be chemically synthesized using, for example, a general-purpose DNA synthesizer.
  • the nucleic acid may be synthesized using any other method well known in the art.
  • the test agent of the present invention may further contain, as other components, nucleic acid synthase (DNA polymerase, RNA polymerase, reverse transcriptase, etc.), other enzymes, substrates corresponding to the enzyme (dNTP, rNTP, etc.), and the like. Moreover, a label
  • the detection of Bacteroides bulgatus and / or Bacteroides drei is performed using an antibody that specifically recognizes the bacterium (hereinafter also referred to as “the antibody of the present invention”). It can also be carried out by a scientific method.
  • the antibody that specifically recognizes Bacteroides bulgatus and / or Bacteroides drei refers to an antibody that recognizes and binds to a surface antigen that specifically exists on the cell surface of the bacterium.
  • Such surface antigens include, for example, polysaccharides, peptidoglycans or proteins present in the cell wall.
  • a surface antigen may be an antibody that recognizes and binds a component specific to Bacteroides bulgatus and / or Bacteroides drei.
  • a specific antibody is prepared by producing a polyclonal antibody or a monoclonal antibody by a known production method using Bacteroides bulgatus or Bacteroides drei or a treated product thereof as an immunogen, and from among the obtained antibody clones, It can be obtained by selecting a clone that does not cross-react with related species other than Bacteroides bulgatus and / or Bacteroides drei.
  • the antibody of the present invention includes, in addition to natural antibodies, antibody fragments having specific binding activity, specifically, for example, F (ab ′) 2 , Fab ′, Fab, Fv, sFv, dsFv, sdAb and the like.
  • the class of the antibody is not particularly limited, and includes antibodies having any isotype such as IgG, IgM, IgA, IgD, or IgE. IgG or IgM is preferable, and IgG is more preferable in consideration of ease of purification.
  • detection, quantification, etc. of Bacteroides bulgatus and / or Bacteroides drei can be performed by an immunological technique.
  • immunological methods include flow cytometry analysis, radioisotope immunoassay (RIA method), ELISA method (Methods in Enzymol. 70: 419-439 (1980)), Western blotting, immunohistochemical staining, etc. However, it is not limited to these.
  • the abundance of Bacteroides bulgatas and Bacteroides drei in the intestinal flora of the subject is determined based on the normal value (eg, the amount of the bacteria in the intestinal flora of a healthy population) If the presence of the bacterium in an amount lower than the cut-off value (eg, mean value-2SD, etc.) is confirmed, the subject has developed an LPS-related disease or is at risk of developing the disease in the future It can be determined to be high. Conversely, if these two bacterial species are below the cut-off value, it can be determined that the subject has not developed LPS and has a low risk of developing in the future.
  • the cut-off value eg, mean value-2SD, etc.
  • LPS-related diseases include atrial fibrillation, heart failure, ischemic heart disease, myocardial infarction, angina pectoris, hypertension, arteriosclerosis, aortic aneurysm, aortic dissection, obstructive arteriosclerosis, aortic valve Cardiovascular diseases such as stenosis, or, for example, hepatitis, nonalcoholic steatohepatitis, fatty liver, liver cancer due to progression of hepatitis, intestinal inflammation, irritable bowel syndrome, gastritis, collagen disease, rheumatoid arthritis, chronic nephritis, IgA nephropathy, bronchial asthma, interstitial pneumonia, drug-induced lung injury, eosinophilic pulmonary infiltration syndrome, atypical mycobacterial disease, allergic rhinitis, atopic dermatitis, inflammatory diseases such as sepsis, or Examples thereof include metabolic diseases such as diabetes, obesity, metabolic syndrome, lifestyle-related
  • Diabetes was defined as diabetic when glycated hemoglobin value> 6.5%, oral antidiabetic drug use, or insulin treatment, according to the National Glycohemoglobin Standardization Program index.
  • Blood pressure 140/90 mmHg or use of antihypertensive drugs was defined as hypertension.
  • Low density lipoprotein cholesterol levels> 140 mg / dL, triglyceride levels> 150 mg / dL or anti-dyslipidemic use was defined as dyslipidemia according to guidelines issued by the Japanese Atherosclerosis Society.
  • DNA extraction from stool sample The subject was hospitalized and a stool sample derived from the subject was collected while ingesting hospital food. Fecal samples from mice were collected at 6 and 16 weeks of age. Fecal samples were stored at -80 ° C. DNA extraction from stool samples is based on previously established procedures (Appleid and Environmental Microbiology 63, 2802-2813 (1997); Appl Environ Microbiol 71, 4153-4155 (2005); FEMS Microbiology Ecology 68, 351-362 (2009) ) was conducted by the Japan Institute of Genetics. For each sample, cellular DNA was extracted from 0.2-0.3 g of fecal material using the G′NOMEs kit (BIO 101, La Jolla, Calif.) With slight modification according to the manufacturer's instructions.
  • G′NOMEs kit BIO 101, La Jolla, Calif.
  • cell lysis / denaturation solution was added and the samples were incubated at 55 ° C. for 30 minutes.
  • 750 mL silica beads 0.1 mm in diameter
  • Polyvinylpyrrolidone (15 mg) was added to ensure removal of polyphenol contamination that could inhibit subsequent quantitative PCR.
  • the sample was vortexed and centrifuged at 20,000 g for 3 minutes and the supernatant was collected.
  • the residual pellet was washed with 400 mL of TENP buffer (50 mM Tris buffer, pH 8, 20 mM EDTA, pH 8, 100 mM NaCl, 1% polyvinylpolypyrrolidone) and centrifuged at 20,000 g for 3 minutes. The washing process was repeated once more and the resulting supernatants were pooled.
  • the nucleic acid was precipitated by adding an equal volume of isopropanol, stored at ⁇ 20 ° C. for 10 minutes, and then centrifuged at 20,000 g for 5 minutes. The pellet was resuspended in 400 mL distilled water and 100 mL salting-out mixture and incubated at 4 ° C. for 10 minutes.
  • the sample was centrifuged at 20,000 g for 10 minutes and the supernatant containing the DNA was transferred to a clean 1.5 mL centrifuge tube. After adding 2 volumes of 100% ethanol and allowing to stand at room temperature for 5 minutes to precipitate DNA, it was centrifuged at 20,000 g for 5 minutes. The DNA was redissolved in 150 mL TE buffer and the DNA solution was stored at ⁇ 20 ° C. until later analysis.
  • 16S rRNA gene amplification and pyrosequencing A portion of the 16S rRNA gene (V3-V4 region, corresponding to positions 342 to 806 of the E. coli numbering system) was PCRd using the non-denaturing universal primer set of 342F and 806R (Table 2) Amplification (Refer to DNA Res. 21, 217-227 (2014) for details of primer set and PCR conditions). After adding the sequencing adapter, the amplicon was sequenced at Takara Bio Inc. according to the manufacturer's protocol using the Illumina MiSeq platform (Illumina Inc., San Diego, Calif.). A bacterial composition matrix was prepared using USEARCH version 10.0.240 (Bioinformatics.
  • each representative sequence of each OTU was used with BLASTN version 2.2.25, with an identity threshold of 97% and coverage of 80%, and the reference database silva Living Tree Project version 123 (Syst Appl Microbiol. 31, 241-250 (2008)).
  • mice All apolipoprotein E deficient (Apoe ⁇ / ⁇ ) mice were C57BL / 6 background mice. All mice were housed in SPF grade animal facilities within the Kobe University laboratory. The animals were fed a regular diet (Japan Claire) under a strict 12-hour light cycle and allowed free water intake. Six-week-old mice were divided into three treatment groups, the control group mice were orally ingested medium, and the Bacteroides live bacteria group mice were alive with Bacteroides bulgatus and Bacteroides drey, and Bacteroides spp.
  • mice were orally ingested heat-sterilized Bacteroides bulgatus and Bacteroides drei at a dose of 2.5 ⁇ 10 9 cfu / 100 ⁇ l each 5 times a week. All experiments were performed according to guidelines (guideline No. P160701) on effective animal experiments at Kobe University School of Medicine.
  • the obese mouse model and the non-alcoholic steatohepatitis (NASH) mouse model were prepared by the method described in detail later using C57BL / 6J mice (Nippon Charles River).
  • SRL automated chemical analyzer
  • the aorta was cut longitudinally, stained with oil red O, pinned on a black wax surface and captured using a digital camera.
  • the stained lesion area was shown as a percentage of the total area and was measured using ImageJ® software as described previously (Circulation. 120, 1996-2005 (2009)).
  • Macrophage detection antibody (MOMA-2, # T-2029, 1: 400; BMA Biomedicals, Augst, Switzerland) and T cell detection antibody (CD4, # 550278, 1: 100; BD Biosciences) were used to perform immunohistochemical analysis of atherosclerotic lesions on 10 ⁇ m frozen sections of the aortic root of mice fixed with acetone or formalin. Detection was performed using a biotinylated secondary antibody (# ab102250, 1: 500; abcam, Cambridge, UK) and streptavidin-labeled horseradish peroxidase (# P0397, 1: 500; Dako Co., Carpinteria, CA).
  • Flow cytometry Mesenteric lymph node (MLN) cells, splenocytes and RAW264.7 cells were incubated with anti-CD16 / CD32 antibodies (clone 2.4G2; # 553142; BD Biosciences) to block the Fc receptor.
  • mice were orally ingested with fluorescein isothiocyanate (FITC) labeled dextran (FD4, 500 mg / kg of body weight; Sigma-Aldrich). After 4 hours, plasma FD4 concentration was measured using a fluorescence spectrophotometer (EnSpire; PerkinElmer, Inc., Waltham, Mass.) With an excitation wavelength of 490 nm and a fluorescence wavelength of 520 nm.
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • LPS levels in plasma and fecal supernatant were measured according to the manufacturer's instructions. .
  • plasma was diluted 10 times and fecal supernatant was diluted 10,000 times and inactivated at 70 ° C. for 15 minutes.
  • LSP measurements were performed in pyrogen-free glass tubes, Eppendorf tubes and plates.
  • RAW 264.7 macrophages were cultured in RPMI-1640 medium containing 10% FBS.
  • RAW264.7 cells (1 ⁇ 10 5 cells) were seeded in 24-well flat bottom plates (Corning Costar, Corning, NY) and in the presence of fecal supernatant at 37 ° C., 5% CO 2 atmosphere. And incubated for 5 hours.
  • TLR4 was knocked down using RNAiMAX reagent (# 13778030, Invitrogen) using siRNA against TLR4 (# 4390771; Invitrogen, Carlsbad, CA).
  • HT29 human intestinal epithelial cells were purchased from American Type Culture Collection (ATCC) and cultured in RPMI-1640 medium containing 10% FBS. The HT29 cells were seeded on a 24-well flat bottom plate and incubated in the presence of fecal supernatant at 37 ° C., 5% CO 2 atmosphere for 24 hours.
  • RNA extraction and real-time PCR analysis Total RNA was extracted from tissue or cell samples using TRIzol TM reagent (# 15596018; Thermo Scientific, Waltham, MA) according to the manufacturer's instructions. CDNA was synthesized using PrimeScript reverse transcription reagent kit (# RR037A; Takara, Shiga). Quantitative RT-PCR was performed using SYBER Premix Ex Taq (# RR820; Takara) and LightCycler® 96 System (# 05815916001; Roche, Mannheim, Germany) according to the manufacturer's instructions. Table 2 shows primers specific to each gene. Expression data was corrected with GAPDH, a control housekeeping gene, and analyzed by the ⁇ T method.
  • Categorical variables were compared using Fisher's exact test or chi-square test. For all tests, a value of P ⁇ 0.05 was considered statistically significant. In order to evaluate the statistical correlation between the two parameters, simple regression / single correlation was calculated using the least square method, and the result was expressed by Pearson's correlation coefficient. One-way analysis of variance (ANOVA) was used to detect significant differences between the three groups. The q value was calculated using the Benjamini-Hochberg method, and the p value of multiple comparisons was adjusted. Clustering of data from 30 CAD patients and 30 controls was performed at the genus level as described in Arthritis Rheumatol. 68, 2646-2661 (2016).
  • mice orally ingesting live Bacteroides spp. did not significantly differ in body weight (FIG. 2f) or plasma cholesterol levels (FIG. 2g), but in en face analysis of aortic root and thoracic aorta The lesion size was significantly reduced (FIGS. 2a, b). No significant difference was observed in the size of arteriosclerotic lesions in mice ingested by heat-sterilized Bacteroides, compared to control mice.
  • mice that orally ingested Bacteroides have substantially reduced mRNA expression in the colon of certain antigen-presenting cell markers (CD11c, costimulatory molecule CD80) and pro-inflammatory cytokines.
  • CD11c costimulatory molecule CD80
  • pro-inflammatory cytokines progen-presenting cell markers
  • CCR7 mRNA expression which is critical for the migration of antigen-presenting cells from the intestinal lamina intestinal to the mesenteric lymph node (MLN) was significantly increased in mice orally ingesting Bacteroides. It was reduced (Fig. 3a). Therefore, we next tested the innate immune response in MLN.
  • fecal LPS levels were dramatically lower in mice orally ingesting Bacteroides than in control mice (FIG. 3e).
  • the inventors performed an in vitro stimulation assay using fecal supernatants to determine whether a decrease in colonic LPS concentration after live Bacteroides treatment was directly reflected in colonic inflammation levels.
  • mice treated with Bacteroides have significantly reduced plasma LPS concentrations (FIG. 3f), IL-2, IL-4, IL-6, IL-17A, IFN- ⁇ and Plasma concentrations of atherogenic cytokines such as TNF- ⁇ were also reduced (FIG. 3g).
  • the inventors examined the sources of these cytokines through splenocyte flow cytometry assays.
  • Live Bacteroides treatment strengthened the intestinal barrier in vitro and in vivo Because changes in gut microbiota composition promote endotoxemia and arteriosclerosis (Circulation. 133, 2434-2446 (2016) ), The inventors next investigated whether a live Bacteroides treatment was effective in intestinal tight junction permeability. As a result, mice orally ingested with Bacteroides bulgatas ATCC 8482 T strain and Bacteroides drei DSM 17855 T strain had a significant decrease in intestinal permeability of FITC-labeled dextran (FIG. 4a) and tight junction compared to control mice. A significant increase in mRNA expression of the gene zo1 (FIG.
  • HT29 cells stimulated with fecal supernatants from mice treated with live Bacteroides compared to HT29 cells stimulated with fecal supernatants from control mice (mRNA and Significantly higher expression levels of zo1 (ZO-1) were observed (at the protein level) (FIG. 4d, e).
  • ZO-1 zo1
  • the various combinations of Bacteroides bulgatus and Bacteroides drei were the combinations of the respective bacteria (live bacteria 2.5 ⁇ 10 9 CFU / 100 ⁇ l each) that improved the intestinal LPS level in the atherosclerotic mouse model.
  • Each of the mice was orally administered 5 times a week to / ⁇ mice or Apoe ⁇ / ⁇ ⁇ mice.
  • Apoe ⁇ / ⁇ mice were administered for 10 weeks from 6 to 16 weeks of age, and 16-week-old fecal LPS was measured.
  • Apoe ⁇ / ⁇ mice were administered for 7 weeks from 6 weeks to 13 weeks, and LPS in feces at 13 weeks was measured.
  • the results are shown in FIG. Not only the reference strain (v, d) but also the NT strain (Nv, Nd) decreased the amount of LPS in feces.
  • the right side and the left side show LPS levels in feces and cecal stools of Bacteroides-treated Apoe ⁇ / ⁇ ⁇ mice, respectively.
  • the stool LPS level of Apoe ⁇ / ⁇ mice treated with antibiotics is shown.
  • the amount of LPS was reduced when live bacteria were administered, but there was no change from control (NC) when dead bacteria were administered.
  • the combination of the present invention is a pharmaceutical or functional product for preventing and / or improving cardiovascular diseases such as arteriosclerosis, diseases accompanied by chronic inflammation, and metabolic diseases accompanied by metabolic abnormalities such as glycolipid metabolism. Useful as food.
  • cardiovascular diseases such as arteriosclerosis, diseases accompanied by chronic inflammation, and metabolic diseases accompanied by metabolic abnormalities such as glycolipid metabolism.
  • Useful as food Useful as food.
  • the test method and the test drug of the present invention are useful in providing a non-invasive clinical test technique because they enable diagnosis and risk prediction of the disease through microbiome analysis in feces. .

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)

Abstract

本発明は、（１）天然より分離されたバクテロイデス・ブルガタスの生菌を含む組成物と、（２）天然より分離されたバクテロイデス・ドレイの生菌を含む組成物との組み合わせ物を提供する。

Description

リポ多糖制御性腸内細菌及びその用途
　本発明は、リポ多糖（以下、「ＬＰＳ」と略記する場合がある。）制御性腸内細菌及びその用途に関する。より詳細には、本発明は、腸内細菌によるＬＰＳ産生及びその血中への移行を制御し得る２種の特定のバクテロイデス属に属する細菌（即ち、バクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイ）の組み合わせ、該組み合わせを含んでなる医薬、食品等、特にＬＰＳが関与する疾患（例、循環器系疾患、炎症性疾患、代謝性疾患）の予防及び／又は改善剤、腸内細菌叢における該細菌の存在量を指標とした上記疾患の診断方法等に関する。
　腸内細菌叢と宿主の代謝及び免疫におけるその役割の理解が進んだことで、多くの疾患に対する腸内細菌叢に関連した診断及び治療ターゲットの開発に、かつてない関心が注がれている。次世代シーケンサー技術や統合オミクス解析の普及は、微生物界に関する我々の知識を劇的に拡げた。腸内細菌叢と心血管疾患との間の強い関係を示唆する証拠が増えている。例えば、食餌性ホスファチジルコリンの腸内細菌叢による代謝物であるトリメチルアミン（ＴＭＡ）及びトリメチルアミン－Ｎ－オキシド（ＴＭＡＯ）は、心血管疾患、特に動脈硬化のプロセスと関連することが知られている。
　しかし、最近の臨床試験の結果、魚の摂取が血中ＴＭＡＯレベルを一時的ではあるが劇的に増加させるという矛盾する結果が示されており、食餌と腸内細菌叢との関係に関する現在の当該分野の理解に限界があることを浮き彫りにしている。
　バクテロイデス属（Bacteroides）は、ヒトにおいて優勢ないくつかの腸内細菌を含み、健常な腸内生態系の維持に重要な役割を果たしていることが知られている。バクテロイデス属が低レベルであることにより特徴づけられるエンテロタイプ３に分類される個体は、症候性動脈硬化の発症頻度が高い（非特許文献１）。さらに、バクテロイデス属の存在量は、動脈硬化性の虚血性脳梗塞及び一過性脳虚血発作患者において減少していることが明らかとなった（非特許文献２）。これらの観察と一致して、末端制限断片長多型（Ｔ－ＲＦＬＰ）解析を用いた本発明者らの以前の研究により、バクテロイデス門（Bacteroidetes）の存在量は、冠動脈疾患(ＣＡＤ)患者において、動脈硬化のリスクファクターを有するが動脈硬化性疾患を発症していない患者や健常ボランティアよりも、低いことが確認された（非特許文献３、４）。さらに、ショットガンシーケンス法による腸内細菌メタゲノム解析により、やはりＣＡＤ患者でのバクテロイデス菌種の減少が示され（非特許文献５）、これらの知見は、バクテロイデス属とＣＡＤとの関係を強く示唆している。
　しかし、どの特定のバクテロイデス種が関与し、ＣＡＤにおけるそれらの真の役割が何なのかについては未だ不明のままである。
　グラム陰性菌の細胞壁外膜成分であるリポ多糖（ＬＰＳ）は、マクロファージ等の免疫細胞を活性化することが知られており、代謝性エンドトキシン血症は、慢性炎症や、糖尿病、動脈硬化等の心血管－代謝性疾患に関与することが示されている（非特許文献６）。本発明者らは以前、無菌ＡｐｏＥ欠損マウスでは、コンベンショナルな条件下で飼育された同マウスに比べて、大動脈洞の動脈硬化病変の形成が抑制されること、また、それに付随して、血中ＬＰＳレベルやマクロファージ及び大動脈における炎症性サイトカインレベルが低値を示すことを見出した（非特許文献７）。
　その一方で、特許文献１には、バクテロイデス・ブルガタス（Bacteroides vulgatus）を含む３種のバクテロイデス属の細菌由来の成分（例、ＬＰＳ）を含む経口投与用のカプセル組成物が開示されており、種々の炎症性疾患や自己免疫疾患等の治療及び発症遅延に使用できることが記載されている。但し、それらの組成物が実際に当該効能を有することは実証されていない。
　また、非特許文献８には、バクテロイデス・ドレイ（Bacteroides dorei）由来のＬＰＳは大腸菌由来のＬＰＳとは構造が異なり、Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）刺激能が弱く、自然免疫を誘導しにくいことが記載されている。
　しかしながら、バクテロイデス属の細菌が、他の腸内細菌を含めた腸内でのＬＰＳ産生全般に対して影響を及ぼすとの報告は皆無である。
特表2013-527240号公報
Karlsson, F.H. et al. Nat Commun. 3, 1245 (2012). Yin, J. et al. J Am Heart Assoc. 4, E002699 (2015). Emoto, T. et al. J Atheroscler Thromb. 23, 908-921 (2016). Emoto, T. et al. Heart Vessels. 32, 39-46 (2017). Jie, Z. et al. Nat Commun. 18, 845 (2017). Patel, P.N. et al. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 35, 525-534 (2015). Kasahara, K. et al. J Lipid Res. 58, 519-528 (2017). Vatanen, T. et al. Cell. 165, 842-853 (2016).
　過去１０年間のスタチン治療の普及にもかかわらず、ＣＡＤは未だ世界中で主たる死因の１つである。本発明の目的は、新規かつ安価なＣＡＤの予防及び／又は治療戦略のターゲットとなり得る腸内細菌叢の特定の細菌種を同定することである。
　本発明者らは、上記の目的を達成すべく、まず１６Ｓ リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子ランダムシーケンシングを行ってＣＡＤ患者と非ＣＡＤ患者における腸内細菌叢を比較した。その結果、バクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイがＣＡＤ患者において減少していることを見出した。さらに、本発明者らは、動脈硬化傾向を示すＡｐｏＥ欠損マウスにおける一連の解析により、これらのバクテロイデス種と動脈硬化とを繋ぐ根底にある作用メカニズムを解明した。即ち、これらのバクテロイデス種は腸内細菌のＬＰＳ産生を顕著に抑制するとともに、腸管バリアのタイトジャンクションを強化することにより該バリアの透過性を低下させ、ＬＰＳの血中への移行（即ち、エンドトキシン血症の誘起）を抑制することで、炎症誘発性免疫応答を抑制し、動脈硬化病変の形成を阻害することを見出した。
　本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに検討を重ねた結果、バクテロイデス・ブルガタスとバクテロイデス・ドレイの摂取は、動脈硬化をはじめとする循環器系疾患や、炎症性疾患、代謝性疾患の予防及び／又は改善に有用であり、また、腸内細菌叢における該バクテロイデス種の存在量を指標として前記疾患の診断が可能であると結論して、本発明を完成するに至った。
　即ち、本発明は以下のものを提供する。
［１］
（１）天然より分離されたバクテロイデス・ブルガタスの生菌を含む組成物と、
（２）天然より分離されたバクテロイデス・ドレイの生菌を含む組成物と
の組み合わせ物。
［２］前記（１）の組成物と前記（２）の組成物とが同一物である、［１］に記載の組み合わせ物。
［３］医薬品又は医薬品添加物である、［１］又は［２］に記載の組み合わせ物。
［４］食品もしくは飼料又はそのための添加物である、［１］又は［２］に記載の組み合わせ物。
［５］血中又は腸内リポ多糖レベルの亢進と関連する疾患の予防及び／又は改善のための、［１］～［４］のいずれかに記載の組み合わせ物。
［６］前記疾患が循環器系疾患、炎症性疾患又は代謝性疾患である、［５］に記載の組み合わせ物。
［７］前記疾患が、心房細動、心不全、虚血性心疾患、心筋梗塞、狭心症、高血圧症、動脈硬化症、大動脈瘤、大動脈解離、閉塞性動脈硬化症、大動脈弁狭窄症からなる群より選択される循環器系疾患である、［５］に記載の組み合わせ物。
［８］前記疾患が、肝炎、非アルコール性脂肪肝炎、脂肪肝、肝癌、腸管炎症、過敏性腸症候群、胃炎、膠原病、慢性関節リウマチ、慢性腎炎、IgA腎症、気管支喘息、間質性肺炎、薬剤性肺障害、好酸球性肺浸潤症候群、非定型性抗酸菌症、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎及び敗血症からなる群より選択される炎症性疾患である、［５］に記載の組み合わせ物。
［９］前記疾患が、糖尿病、肥満、メタボリックシンドローム、生活習慣病、脂質異常症及び骨粗鬆症からなる群より選択される代謝性疾患である、［５］に記載の組み合わせ物。
［１０］天然より分離されたバクテロイデス・ブルガタスの生菌と、天然より分離されたバクテロイデス・ドレイの生菌とを経口摂取することを含む、血中又は腸内リポ多糖レベルの亢進と関連する疾患の予防及び／又は改善方法。
［１１］前記疾患が循環器系疾患、炎症性疾患又は代謝性疾患である、［１０］に記載の方法。
［１２］被験者の腸内細菌叢におけるバクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイの存在量を測定することを含む、血中又は腸内リポ多糖レベルの亢進と関連する疾患の検査方法。
［１３］前記疾患が循環器系疾患、炎症性疾患又は代謝性疾患である、［１２］に記載の方法。
［１４］（１）配列番号１又は２で表されるヌクレオチド配列と９８％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、及び
（２）配列番号３又は４で表されるヌクレオチド配列と９８％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子
を検出することを含む、［１２］又は［１３］に記載の方法。
［１５］バクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を検出し得るプライマーセット又はプローブを含む、血中又は腸内リポ多糖レベルの亢進と関連する疾患の発症リスクの検査用試薬。
［１６］前記疾患が循環器系疾患、炎症性疾患又は代謝性疾患である、［１５］に記載の試薬。
［１７］１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子が、
（１）配列番号１又は２で表されるヌクレオチド配列と９８％以上の同一性を有するヌクレオチド配列、及び
（２）配列番号３又は４で表されるヌクレオチド配列と９８％以上の同一性を有するヌクレオチド配列
を含む、［１５］又は［１６］に記載の試薬。
　本発明によれば、大量に発酵生産可能な微生物の経口摂取（プロバイオティクス）を通じて、動脈硬化をはじめとする循環器系疾患や、慢性炎症を伴う疾患、糖脂質代謝等の代謝異常を伴う代謝性疾患の予防及び／又は改善が可能となるため、それらの疾患の安価かつ簡便な制御戦略が提供され、高齢化社会における医療経済にも資する。また、本発明によれば、糞便中のマイクロバイオーム解析を通じて、前記疾患の診断・発症リスク予測が可能となり、非侵襲性の臨床検査手法が提供される。
ＣＡＤ患者又は非ＣＡＤ患者における腸内微生物の変化を示す図である。　３０人の対照（ＣＡＤを発症していないが、冠状動脈のリスクファクターを有している）患者及び３０人のＣＡＤ患者由来の糞便サンプルにおいて、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡのＶ３－Ｖ４領域をシーケンスした。（ａ）腸内微生物叢における属の存在量に基づいて、参加者を３つのクラスターに分類した。（ｂ）クラスター間の各主要属の分布。各属のクラスター間分布を比較するために、Ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡを使用した。（ｃ）各クラスターにおける対照及びＣＡＤ患者の分布。３つのクラスターを比較するために、カイ二乗検定を用いた。（ｄ）対照及びＣＡＤ患者におけるバクテロイデス属の相対的存在量　（全腸内微生物叢のパーセンテージ）。（ｅ）対照及びＣＡＤ患者におけるバクテロイデス種の相対的存在量（全バクテロイデス属に対するパーセンテージ）。（ｆ）バクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ブルガタスの相対的存在量（全腸内微生物叢のパーセンテージ）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。統計的有意性を決定するために、Ｍａｎｎ－ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定を用いた（ｂ，ｄ，ｆ）。データは、中央値±四分位範囲（第１～第３四分位範囲）で示す（ｂ，ｄ，ｆ）。 アテローム性動脈硬化症及びプラーク炎症の発症における、生きたバクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイを伴った胃管栄養の影響を示す図である。　生きたバクテロイデス・ブルガタスATCC 8482T株及びバクテロイデス・ドレイDSM 17855T株、又はビヒクル（対照）で処理した６週齢の雌Ａｐｏｅ－／－マウスを、１６週齢で屠殺し、アテローム性動脈硬化症による病変を評価した。（ａ）大動脈洞におけるアテローム性動脈硬化症による病変領域のオイルレッドＯ染色の代表的な顕微鏡写真及び定量分析（グループ当たり８－９サンプル）。黒棒は２００μｍを表わす。（ｂ）大動脈のアテローム硬化性プラーク領域のオイルレッドＯ染色の代表的な顕微鏡写真及び定量分析（グループ当たり７－９サンプル）。白棒は１．５ｍｍを表わす。（ｃ）大動脈洞における、マクロファージの代表的な蛍光染色及びＭＯＭＡ－２陽性染色の定量分析　（グループ当たり７サンプル）。黒棒は１００μｍを表わす。（ｄ）大動脈洞における、ＣＤ４＋　Ｔ細胞の代表的な切片及び定量分析（グループ当たり８－９サンプル）。黒棒は５０μｍを表わす。（ｅ）アテローム硬化性大動脈におけるｍＲＮＡレベル。データは、ハウスキーピングＧＡＰＤＨ遺伝子に対して標準化し、平均値で示す（グループ当たり４－５サンプル）。（ｆ）実験期間を通しての体重変化（グループ当たり８－９サンプル）。（ｇ）血漿脂質プロファイルの比較（グループ当たり８－９サンプル）。ＬＢ：生きたバクテロイデス・ブルガタスATCC 8482T株及びバクテロイデス・ドレイDSM 17855T株で処理した；Ｔ－Ｃｈｏ：総コレステロール；ＴＧ：トリグリセリド；ＬＤＬ：低密度リポタンパク質コレステロール；ＨＤＬ：高密度リポタンパク質コレステロール。＊Ｐ＜０．０５、Ｓｔｕｄｅｎｔの両側ｔ検定。データは、平均±平均の標準誤差で示す。 腸の免疫応答における変化及び腸内微生物のリポポリサッカライド（ＬＰＳ）産生を示す図である。　結腸及び腸間膜リンパ節（ＭＬＮｓ）を、バクテロイデス・ブルガタスATCC 8482T株及びバクテロイデス・ドレイDSM 17855T株、又はビヒクル（対照）で処理した１６週齢の雌Ａｐｏｅ－／－マウスから切除した。（ａ）結腸における、免疫細胞マーカー及びケモカイン／ケモカインレセプターのｍＲＮＡ発現レベル（グループ当たり７－８サンプル）。（ｂ）結腸における、炎症誘発性サイトカインのｍＲＮＡ発現レベル（グループ当たり７－８サンプル）。（ｃ）ＭＬＮにおける特異的細胞マーカーのフローサイトメトリー分析（グループ当たり４－５サンプル）。（ｄ）ＭＬＮにおけるサイトカインのｍＲＮＡ発現レベル（グループ当たり５サンプル）。（ｅ）カブトガニ変形細胞ライセートアッセイによる糞便　ＬＰＳレベルの定量（グループ当たり７－８サンプル）。（ｆ）カブトガニ変形細胞ライセートアッセイによる血漿ＬＰＳレベルの定量（グループ当たり５サンプル）。（ｇ）サイトカイン・ビーズアレイによる、血漿サイトカインレベルの定量（グループ当たり４－５サンプル）。ＬＢ：生きたバクテロイデス・ブルガタスATCC 8482T株及びバクテロイデス・ドレイDSM 17855T株で処理した；ＭＦＩ：平均蛍光強度。２グループ間の有意差を検出するために、Ｓｔｕｄｅｎｔの両側ｔ検定を用いた。データは、平均±平均の標準誤差で表す（ａ－ｇ）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。 密着結合形成における、生きたバクテロイデス処理の影響を示す図である。（ａ）マウスの経口胃管栄養後４時間における、血清のフルオレセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識デキストラン濃度の測定（グループ当たり４－５サンプル）。（ｂ）マウス結腸における、密着結合遺伝子のｍＲＮＡ発現レベル（グループ当たり７－８サンプル）。（ｃ）免疫蛍光染色によって可視化した密着結合タンパク質ＺＯ－１（グループ当たり４－５サンプル）。白棒は、２５０μｍを表わす。（ｄ）糞便上清で刺激したＨＴ２９細胞における密着結合遺伝子のｍＲＮＡレベル（グループ当たり５サンプル）。（ｅ）糞便上清で刺激したＨＴ２９細胞における、ＺＯ－１発現のウェスタン・ブロット分析（βアクチンに対して標準化）（グループ当たり８サンプル）。ＬＢ：生きたバクテロイデス・ブルガタスATCC 8482T株及びバクテロイデス・ドレイDSM 17855T株で処理した；ＬＰＳ：リポポリサッカライド；ＭＦＩ：平均蛍光強度。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、Ｓｔｕｄｅｎｔの両側ｔ検定。データは、平均±平均の標準誤差で表す。 ＣＡＤを有する又は有しない患者における腸内微生物ＬＰＳ産生を示す図である。（ａ）１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子シーケンシングに使用したものと同じサンプルにおいて、カブトガニ変形細胞ライセートアッセイによって糞便ＬＰＳレベルを定量した（グループ当たり２９－３０サンプル）。有意性を決定するために、Ｓｔｕｄｅｎｔの両側ｔ検定を用いた。＊Ｐ＜０．０５。データは、中央値±四分位範囲（第１～第３四分位範囲）で示す。（ｂ）バクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイの糞便ＬＰＳレベル及び相対的な量の間での統計的相関について、Ｐｅａｒｓｏｎの相関係数を決定することにより、単純な線形相関を計算した（５９サンプル；２９人の対照及び３０人のＣＡＤ）。ＣＡＤ：冠動脈疾患患者 ＣＡＤ患者又は非ＣＡＤ患者における、腸内微生物叢プロファイルを示す図である。腸内微生物叢の分布を比較するために、種レベルでの主成分分析を実施した。主成分においてより重い種を示す。 アテローム性動脈硬化症傾向のあるマウスの腸内微生物叢における、生きたバクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイを伴った胃管栄養の影響を示す図である。１０週間、通常の飼料、並びに生きたバクテロイデス・ブルガタスATCC 8482T株及びバクテロイデス・ドレイDSM 17855T株、又はビヒクルで処理した飼料を摂食した雌のＡｐｏｅ－／－マウスから糞便を採取した。細菌１６Ｓ　ｒＲＮＡのＶ３－Ｖ４領域をシーケンスした。（ａ）処理前後における、最も存在量が多い１５の微生物属の相対的存在量。（ｂ）属レベルでの主成分分析（ＰＣＡ）スコア・プロット。（ｃ）Ｓｈａｎｎｏｎ－Ｗｉｅｎｅｒ指標の観点から決定した腸内微生物の多様性。（ｄ）処理後のグラム陰性株に対するグラム陽性株の比。（ｅ）処理後のバクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイＤＮＡの糞便中の存在量の相対的増加（グループ当たりｎ＝３）。ＬＢ：生きたバクテロイデス・ブルガタスATCC 8482T株及びバクテロイデス・ドレイDSM 17855T株を伴った胃管栄養；ｂｅｆｏｒｅ：実験前；ａｆｔｅｒ：胃管栄養後１０週。 マウス糞便上清でのｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激による、細胞増殖及びサイトカイン産生の阻害を示す図である。ＲＡＷ２６４．７細胞を、１０週間、生きたバクテロイデス・ブルガタスATCC 8482T株及びバクテロイデス・ドレイDSM 17855T株、又はビヒクル（対照）で処理したマウス由来の糞便上清で刺激した。（ａ）代表的なフローサイトメトリーのヒストグラム（左パネル）及びＫｉ－６７発現の定量分析（右パネル）（グループ当たり５サンプル）。（ｂ）対照ｓｉＲＮＡ又はＴＬＲ４ ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＲＡＷ２６４．７細胞を、マウスの各グループ由来の糞便上清で刺激した。サイトカインレベルを、サイトカイン・ビーズアレイによって定量した（グループ当たり７サンプル）。ＬＢ：生きたバクテロイデス・ブルガタスATCC 8482T株及びバクテロイデス・ドレイDSM 17855T株で処理した；ＭＦＩ：平均蛍光強度。２グループ間の有意差を検出するために、Ｓｔｕｄｅｎｔの両側ｔ検定（ａ）又はＭａｎｎ－ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定（ｂ）を用いた。データは、平均±平均の標準誤差（ａ）、又は中央値±四分位範囲（第１～第３四分位範囲）（ｂ）で表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。 生きたバクテロイデス処理及び脾臓における免疫応答を示す図である。　バクテロイデス・ブルガタスATCC 8482T株及びバクテロイデス・ドレイDSM 17855T株、又はビヒクル（対照）で処理した１６週齢Ａｐｏｅ－／－マウスから脾細胞を採取した。（ａ）脾細胞における、表示の免疫細胞のパーセンテージ（グループ当たり４－５サンプル）。（ｂ）ＣＤ１１ｃｈｉｇｈ抗原提示細胞における免疫細胞マーカーの発現（グループ当たり４－５サンプル）。（ｃ）ＣＤ４＋Ｔ細胞数。（ｄ）ＣＤ４＋Ｔ細胞数における、免疫細胞マーカー（グループ当たり５サンプル）。（ｅ）ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋ＴｒｅｇｓにおけるＣＴＬＡ４発現（グループ当たり５サンプル）。ＬＢ：生きたバクテロイデス・ブルガタスATCC 8482T株及びバクテロイデス・ドレイDSM 17855T株で処理した；Ｔｒｅｇｓ：制御性Ｔ細胞；ＭＦＩ：平均蛍光強度。＊Ｐ＜０．０５。２グループ間の有意差を検出するために、Ｓｔｕｄｅｎｔの両側ｔ検定を用いた。データは、平均±平均の標準誤差で表す。 ＡｐｏＥ欠損マウスに及ぼす生きたバクテロイデス・ブルガタスATCC 8482T株又はバクテロイデス・ドレイDSM 17855T株の単独投与の効果を示す図である。対照群にはビヒクルのみを経口摂取させた。上段左は、大動脈洞の動脈硬化病変の大きさを、上段右は、腸管内（糞便中）ＬＰＳ濃度を示す。下段左上は、大腸におけるタイトジャンクション関連遺伝子の発現、下段右上は、大腸におけるサイトカイン遺伝子の発現、下段左下は、血中サイトカイン濃度をそれぞれ示す。 バクテロイデス・ブルガタス ATCC 8482T株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子とバクテロイデス・ドレイ JCM 13471T株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子とのアラインメントを示す図である。 バクテロイデス・ブルガタス（ATCC 8482T株（ｖ）及びNTZ002株（Ｎｖ））とバクテロイデス・ドレイ（DSM 17855T株（ｄ）及びNTZ001株（Ｎｄ））との種々の組み合わせによる動脈硬化マウスモデルにおける糞便中ＬＰＳレベルの改善効果を示す図である。 バクテロイデス・ブルガタス ATCC 8482T株及びバクテロイデス・ドレイDSM 17855T株の生菌又は死菌を投与した動脈硬化マウスにおける腸内ＬＰＳレベルを示す図である。図中左側及び右側は、それぞれバクテロイデスを投与したマウスの糞便中及び盲腸便中のＬＰＳレベルを示し、中央は、抗生物質（ＡＶＮＭ）を投与したマウスの糞便中ＬＰＳレベルを示す。 図１４－１及び図１４－２は、バクテロイデス・ブルガタス ATCC 8482T株及びバクテロイデス・ドレイDSM 17855T株（Ｂ）又はバクテロイデス・ブルガタスNTZ002株及びバクテロイデス・ドレイNTZ001株（ＮＢ）の生菌を投与した肥満マウスモデルにおける肥満の諸症状の改善を示す。Ａは、各群の投与プロトコルを模式的に示す。Ｂ及びＣは、それぞれマウスの体重の推移及び体重増加量の推移を示す。Ｄは、ＯＧＴＴ試験の結果（左から血糖値、血糖値のＡＵＣ及びインスリン抵抗性（ＨＯＭＡ－ＩＲ））を示す。 Ｅは、精巣上体脂肪標本のＨＥ、ＭＡＣ３及びシリウスレッド染色像（左）、並びに、上から脂肪細胞の大きさ、単位細胞あたりの王冠様構造の数、及び線維化領域の割合（右）を示す。Ｆは、精巣上体周囲の脂肪における炎症細胞マーカー又はマクロファージマーカーのｍＲＮＡ発現（左）及びサイトカインＩＦＮγ及びＴＮＦαのｍＲＮＡ発現を示す。 図１５－１及び図１５－２は、バクテロイデス・ブルガタス ATCC 8482T株及びバクテロイデス・ドレイDSM 17855T株の生菌を投与したＮＡＳＨマウスモデルにおけるＮＡＳＨの諸症状の改善を示す。上パネルは、１７週齢における肝臓切片のＨＥ染色像を示す。中パネルは、ＮＡＦＬＤ活動性スコア（ＮＡＳ）、下パネルは、左から血中ＡＳＴレベル及びＡＳＴ／ＡＬＴ比を示す。 切除した肝臓の全体像を示す。
１．リポ多糖（ＬＰＳ）制御性腸内細菌
　本発明は、バクテロイデス属に属する細菌であるバクテロイデス・ブルガタスとバクテロイデス・ドレイとの組み合わせ物（以下、「本発明の組み合わせ物」ともいう。）を提供する。ここで「組み合わせ物」とは、両者が混合された１つの組成物として存在してもよいし、あるいは、それぞれ別個の組成物として存在するが、ある目的（例、医薬、食品もしくは食品添加物、飼料もしくは飼料添加物）のために組み合わせて使用される、キット化された状態のものであってもよいことを意味する。本発明の組み合わせ物は、ヒトや他の動物の腸内で共存することにより、腸内のＬＰＳレベルを低減させ、腸管バリアのタイトジャンクションを強化して血中ＬＰＳレベルを低減させ、腸内、血管内、及び臓器内での炎症応答・免疫応答を抑制し得る（本明細書においては、これらの作用効果を「リポ多糖（ＬＰＳ）制御性」と包括的にいう場合がある）。
　より具体的には、「本発明の組み合わせ物」は、
（１）天然より分離されたバクテロイデス・ブルガタスの生菌を含む組成物と、
（２）天然より分離されたバクテロイデス・ドレイの生菌を含む組成物と
を組み合わせてなる。
　バクテロイデス属（Bacteroides）は、バクテロイデス門、バクテロイデス綱、バクテロイデス目、バクテロイデス科の真正細菌に分類されるグラム陰性の偏性嫌気性非芽胞形成桿菌であり、現在９２種と５亜種が知られている。バクテロイデス属は、ヒトにおいて優勢ないくつかの腸内細菌を含み、健常な腸内生態系の維持に重要な役割を果たしていると考えられている。
　バクテロイデス・ブルガタス（Bacteroides vulgatus）は、ヒト消化管から最もよく分離される細菌であり、一般的に有益な片利共生菌と考えられている。バクテロイデス・ドレイ（Bacteroides dorei）は、２００６年に、ヒト糞便から分離され１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子シーケンシングによりバクテロイデス・ブルガタスに最も近縁な（約９６％の同一性を有する）新菌種として同定された（Int J Sys Evol Microbiol. 56, 1639-1643, 2006）。
　本明細書において「天然より分離された」とは、自然界に元来存在する状態よりも菌体密度が高くなるように、人為的操作を施されたものであることを意味し、完全に純化（単離精製）されたものだけでなく、他の夾雑物を含んだ状態のものも包含される。一方、糞便や盲腸内容物等のような天然物を単に採取しただけの場合は、「天然より分離された」ものに含まれない。
　本発明の組み合わせ物の活性成分であるバクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイは、天然より分離されたものである限り、いかなる方法によって提供されてもよいが、例えば、天然の分離源（例、糞便、盲腸等の消化管内容物、土壌、水）より新たに分離したものを用いることができる。分離源としては、好ましくはヒト又は他の哺乳動物の糞便である。例えば、糞便サンプルを無菌のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等に懸濁し、得られる懸濁液を白金耳などを用いて、バクテロイデス属細菌の培養に適した平板培地にプレーティングし、出現したコロニーの菌学的特徴（形態学的特徴、生化学的特徴等）から、バクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイのコロニーを選択することができる。以下に、両菌種の代表的な菌学的特徴を示す。
（１）肉眼的特徴
（１－１）５％ウマ血液添加Eggerth Gagnon（ＥＧ）寒天培地上で、円形で白色の凸状に隆起したコロニーを形成する。
（１－２）顕微鏡学的特徴：桿菌で運動性はなく、芽胞を形成しない。
（２）生育条件
（２－１）温度：２５～４０℃で生育する。至適温度は３７℃
（２－２）偏性嫌気性
（３）生理学的・生化学的特徴
（３－１）グラム染色性：陰性
（３－２）他の生化学的特徴を表１に示す［表中、１はバクテロイデス・ドレイ JCM13471T株、２はバクテロイデス・ドレイJCM13472株、３はバクテロイデス・ブルガタス JCM5826T株をそれぞれ示す。生化学的試験は、API 20 A及びAPI rapid ID 32 Aストリップ（bioMerieux）を用いて行った。］（Int J Sys Evol Microbiol. 56, 1639-1643, 2006より抜粋）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　分離源から分離された細菌がバクテロイデス・ブルガタス又はバクテロイデス・ドレイに属する菌株か否かは、例えば、該菌株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の全部又は一部をＰＣＲ増幅し、該増幅断片のヌクレオチド配列を決定して、既知のバクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイの配列データと比較し、系統解析を行うことにより判別することができる。系統解析及び系統樹の作製方法は、例えば以下の手順に従って行うことができる。
　まず細菌から鋳型となるゲノムＤＮＡを抽出する。細菌からＤＮＡを抽出する方法は公知であり、いずれの方法を使用してもよい。一般的には、細胞をリゾチームなどの細胞壁分解酵素で処理する方法、ガラスビーズによる物理的破壊方法、凍結融解を繰り返す処理方法などが使用される。また市販のＤＮＡ抽出用の試薬も使用することができる。ゲノムＤＮＡは必ずしもインタクトな状態で抽出されなくてもよい。従って、試料のコンタミネーションの可能性が低く、操作が簡単で、迅速に行なうことのできる方法を適宜選択することができる。
　次にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする標的ＤＮＡを増幅する。ＰＣＲにおいて使用されるプライマーの配列は、少なくともバクテロイデス・ブルガタス及び／又はバクテロイデス・ドレイに属する全ての既知細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする標的ＤＮＡが増幅されるよう適宜設計することができるが、通常、生物種を超えて保存された配列からなるプライマー（ユニバーサルプライマー；例えば、Ｖ１～Ｖ２領域の約３５０塩基を増幅する２７Ｆと３５７Ｒのプライマーセットや、後述の実施例で使用されるＶ３～Ｖ４領域の約４６０塩基を増幅する３４２Ｆと８０６Ｒのプライマーセット等）が使用される。またＰＣＲの条件は特に限定されず、通常用いられる範囲内で適宜選択することができる。市販のＰＣＲ用試薬を使用して、添付の説明書に従って反応を行うことができる。
　ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片は、必要に応じてスピンカラムなどを用いて精製されたのち、その塩基配列が決定される。塩基配列の決定は定法に従って行なうことができる。
　決定された塩基配列は、適当な遺伝子配列データベース及び相同性検索プログラムを用いて、既知の細菌１６ＳリボソームＤＮＡ配列とのホモロジー検索を行うことにより、最も高いホモロジーを示す既知配列を抽出することができる。例えば、日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）のホームページを通じて、ＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡが利用できる。プログラムとしてｂｌａｓｔｎやｆａｓｔａを選択し、決定された塩基配列をクエリーとし、検索対象データベースとして１６Ｓ ｒＲＮＡ（Prokaryotes）を選択して検索を実施すれば、高いホモロジーを示す既知配列が抽出され出力される。細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列のデータセットを含む限り、いかなる他の遺伝子配列データベースも利用することができる（例えば、RDP(http://rdp.cme.msu.edu)、Silva(http://www.arb-silva.de)等）。また、上記以外の自体公知のホモロジー検索プログラムを用いることもできる。
　一般に、細菌については、属レベルでの同定には９５％以上、種レベルでの同定には９８％以上の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列の同一性が必要とされる（Science 2005, 307, 1915-1920）。従って、ホモロジー検索の結果、単離された細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の配列が、バクテロイデス・ブルガタス又はバクテロイデス・ドレイに属する細菌の既知配列と９８％以上の同一性を有する場合、当該細菌をこれらのいずれかのバクテロイデス種に属する細菌として同定することができる。
　判別の基準となる既知の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列としては、バクテロイデス・ブルガタスの場合、例えば、GenBankにアクセッション番号NR_074515にて登録されているバクテロイデス・ブルガタス ATCC 8482T株由来の配列（配列番号１）、アクセッション番号NR_112946にて登録されているバクテロイデス・ブルガタス JCM5826T株由来の配列（配列番号２）等が挙げられるが、それらに限定されない。一方、バクテロイデス・ドレイの既知１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列としては、例えば、GenBankにアクセッション番号AB242142にて登録されているバクテロイデス・ドレイ JCM13471T株由来の配列（配列番号３）、アクセッション番号AB242143にて登録されているバクテロイデス・ドレイ JCM13472株由来の配列（配列番号４）等が挙げられるが、それらに限定されない。
　従って、前記ＰＣＲ増幅断片のヌクレオチド配列が、配列番号１又は２で表されるヌクレオチド配列と９８％以上の同一性を有する場合、分離された細菌はバクテロイデス・ブルガタスに属する細菌であると同定することができる。また、前記増幅断片のヌクレオチド配列が、配列番号３又は４で表されるヌクレオチド配列と９８％以上の同一性を有する場合、分離された細菌はバクテロイデス・ドレイに属する細菌であると同定することができる。
　また、増幅したＤＮＡの塩基配列に基づき分子進化系統樹を推定し、単離された細菌の分類学的位置を特定することもできる。分子進化系統樹解析ソフトはインターネット等でも公開されており、それらを利用することができる（ＣＬＵＳＴＡＬ　Ｗ等）。系統樹解析の結果、単離された細菌がバクテロイデス・ブルガタス又はバクテロイデス・ドレイに属する細菌と同じクラスター内に位置づけられた場合、当該細菌をいずれかのバクテロイデス種に属する細菌として同定することができる。
　あるいは、本発明の組み合わせ物に用いるバクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイは、既に単離され、市販されているか、寄託機関に保存され分譲可能な菌株であってもよい。そのような菌株としては、バクテロイデス・ブルガタスの場合、例えばATCC 8482T株、DSM 1447T株、JCM 5826T株、NBRC 14291T株、NCTC 11154T株、NTZ002株等が挙げられ、バクテロイデス・ドレイの場合、例えばDSM 17855T株、JCM 13471T株、JCM 13472株、NTZ001株等が挙げられるが、それらに限定されない。NTZ002株及びNTZ001株は、2019年1月15日付で、それぞれNITE BP-02863及びNITE BP-02862の受託番号を付され、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（〒292-0818 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室）に国際寄託されている。
　本発明の組み合わせ物に用いるバクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイは、ヒトや他の動物の腸内で共存することにより、腸内のＬＰＳレベルを低減させ、腸管バリアのタイトジャンクションを強化して血中ＬＰＳレベルを低減させ、腸内、血管内及び臓器内での炎症応答・免疫応答を抑制し得る（即ち、ＬＰＳ制御性を有する）限り、いかなる菌株の組み合わせであってよい。好ましい一実施態様においては、バクテロイデス・ブルガタスATCC 8482T株又はNTZ002株とバクテロイデス・ドレイDSM 17855T株又はNTZ001株との組み合わせが挙げられるが、それに限定されない。
　本発明の組み合わせ物に用いるバクテロイデス・ブルガタス又はバクテロイデス・ドレイは、それぞれ併用菌であるバクテロイデス・ドレイ又はバクテロイデス・ブルガタスと組み合わせた場合に、ＬＰＳ制御性を発揮し得る限り、上記のいずれかの手段により得られる天然の分離源からの分離株（野生株）のみならず、それらに変異誘発処理を施して得られる変異体であってもよい。変異誘発処理としては、例えば、ニトロソ化合物（例、ニトロソアミン、ニトロソグアニジン）、アルキル化剤（例、メタンスルホン酸エチル (ＥＭＳ)）等の化学物質に曝露する方法や、紫外線照射、放射線照射等が挙げられるが、それらに限定されない。得られた変異株が、併用菌と組み合わせた場合にＬＰＳ制御性を示すか否かは、例えば、該変異株と併用菌とを疾患動物モデル（例、ＡｐｏＥ欠損動脈硬化マウスモデル、肥満マウスモデル、NASHマウスモデル等）に投与して、症状の改善、各種パラメータ（例、血中又は腸内ＬＰＳレベル、血中サイトカインレベル、腸管バリア機能、体重、臓器重量、病理組織検査等）の改善が認められた場合に、該変異株はＬＰＳ制御性を有すると判定することができる。あるいは、該動物モデルの糞便上清でマクロファージ等の免疫細胞を刺激した場合に、該変異株と併用菌とを添加し、該細胞の増殖や炎症性サイトカインの産生抑制作用を示した場合に、該変異株はＬＰＳ制御性を有すると判定することができる。
　このようにして得られたバクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイは、自体公知の培養条件にて培養し、維持増幅することができる。
　培地としては、ＡＴＣＣ Ｍｅｄｉｕｍ ２１０７（ペプトン１０ｇ、牛肉エキス１０ｇ、酵母エキス３ｇ、デキストロース５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、可溶性デンプン１ｇ、Ｌ－システイン塩酸塩０．５ｇ、酢酸ナトリウム３ｇ、０．０２５％ Ｒｅｓａｚｕｒｉｎ ４ｍＬ、蒸留水１Ｌ）、ＡＴＣＣ Ｍｅｄｉｕｍ ２６０（トリプトン１５ｇ、ソイトン５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、脱線維素ヒツジ血５０ｍＬ、蒸留水９５０ｍＬ）、５％ウマ血添加ＥＧ培地等を用いることができる。これらの培地は液体培地としても、例えば１．５％寒天を添加して固形培地としても使用できる。
　バクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイは偏性嫌気性細菌であるので、培養は、嫌気条件下（酸素濃度１ｐｐｍ以下）で行われる。例えば、嫌気ガスチャンバー内で、１０％ ＣＯ２、１０％ Ｈ２及び８０％ Ｎ２混合ガス雰囲気下で培養することができる。培養温度は２５～４０℃、好ましくは約３７℃である。培養期間としては、例えば１２～７２時間、好ましくは２４～４８時間が挙げられるが、特に制限はない。
　バクテロイデス・ブルガタスとバクテロイデス・ドレイとは、互いに生育や生物活性に悪影響を及ぼさない限り、同一培地中で混合培養することもできる。また、本発明の組み合わせ物に含まれるバクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイは、それぞれ単一の菌株であってもよいし、２以上の菌株の混合物であってもよい。
　このようにして得られたバクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイの培養物は、使用時まで、例えば、自体公知の手法でグリセロールストックとして－８０℃以下で凍結保存するか、自体公知の手法で凍結乾燥し、２～８℃で保存することができる。
２．本発明の組み合わせ物
　バクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイは、生きた状態（生菌）である限り、上記培養物（菌体）をそのまま、あるいは、該培養物から自体公知の方法、例えば、遠心分離、ろ過、磁性分離等の方法により回収した湿菌体もしくはその洗浄物（滅菌水、培地、PBS等により洗浄することができる）又はそれらの凍結乾燥粉末等の「菌体処理物」の状態で、それらを含む組成物中に配合することができる。尚、本明細書において、以下、特にことわらない限り、「菌体」もしくは「菌体処理物」は、死菌や菌体破砕物、菌体抽出物、菌体成分等の「生きていない」状態のものを包含しない意味で用いられる。
　バクテロイデス・ブルガタスの菌体もしくは菌体処理物、及びバクテロイデス・ドレイの菌体もしくは菌体処理物は、それら単独で、あるいは、医薬上又は食品もしくは飼料加工上許容される添加物とともに製剤化することができる。あるいは、該菌体もしくは菌体処理物は、医薬品添加物又は食品もしくは飼料添加物として、医薬組成物又は食品もしくは飼料中に配合することができる。本発明の組み合わせ物において、バクテロイデス・ブルガタスの菌体もしくは菌体処理物と、バクテロイデス・ドレイの菌体もしくは菌体処理物とは、別個の組成物として製剤化され、キット製剤として使用されてもよいが、好ましくは、同一組成物中に配合され、単一の製剤として使用され得る。
　バクテロイデス・ブルガタスの菌体もしくは菌体処理物と、バクテロイデス・ドレイの菌体もしくは菌体処理物とが、別個の組成物として提供される場合、それらの組成物は、同時に又は時間差をおいて、同一経路又は別経路で接種され得る。
　本発明の組み合わせ物が医薬品又は医薬品添加物として提供される場合、該医薬品又は該添加物を配合する医薬品は、例えば、散剤、顆粒剤、丸剤、ソフトカプセル、ハードカプセル、錠剤、チュアブル錠、速崩錠、シロップ、液剤、懸濁剤、坐剤、注入剤等に製剤化することができる。
　例えば、経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。このような組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる添加物、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を含有していてもよい。賦形剤としては、例えば大豆油、サフラー油、オリーブ油、胚芽油、ひまわり油、牛脂、いわし油等の動植物性油、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール等の多価アルコール、ソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル等の界面活性剤、精製水、乳糖、デンプン、結晶セルロース、D－マンニトール、レシチン、アラビアガム、ソルビトール液、糖液等が挙げられる。結合剤としては、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン、アルファー化デンプン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール等が挙げられる。崩壊剤としては、例えば、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、クロスカルメロースナトリウム、クロスポピドン、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、トウモロコシデンプン等が挙げられる。滑沢剤としては、例えば、タルク、水素添加植物油、ロウ類、軽質無水ケイ酸等の天然物由来及びその誘導体等、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸アルミニウム等が挙げられる。
　上記組成物には、さらに、甘味料、着色料、pH調整剤、香料、各種アミノ酸等を添加することもできる。また、錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティングしてもよい。液体製剤であれば、服用時に水又は他の適当な媒体に溶解又は懸濁する形であってもよい。
　非経口投与のための組成物としては、例えば、注入剤、坐剤等が用いられる。注入剤の調製方法としては、例えば、バクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイの菌体又は菌体処理物を、通常注入剤に用いられる無菌の水性液、または油性液に懸濁または乳化することによって調製できる。注入用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられる。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられる。直腸投与に用いられる坐剤は、バクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイの菌体又は菌体処理物を、通常の坐薬用基剤に混合することによって調製され得る。
　さらに、医薬品又は医薬品添加物として提供される場合、本発明の組み合わせ物は、対象疾患に応じて、他の薬剤、例えば、抗炎症薬、抗動脈硬化薬、抗糖尿病薬などと併用してもよい。本発明の組み合わせ物と併用剤とは、単一の組成物（合剤）として製剤化してもよいし、別個の組成物として提供されてもよい。別個の組成物として提供される場合、本発明の組み合わせ物と併用剤とは、同時に又は時間差をおいて、同一経路又は別経路で対象に投与することができる。
　本発明の組み合わせ物が食品（もしくは飼料）又は食品添加物（もしくは飼料添加物）として提供される場合、該食品（もしくは飼料）又は該添加物を配合する食品（もしくは飼料）は、溶液、懸濁物、粉末、固体成形物等、経口摂取可能な形態であればよく、特に限定されない。具体例としては、サプリメント（散剤、顆粒剤、ソフトカプセル、ハードカプセル、錠剤、チュアブル錠、速崩錠、シロップ、液剤等）、飲料（炭酸飲料、乳酸飲料、スポーツ飲料、果汁飲料、野菜飲料、豆乳飲料、コーヒー飲料、茶飲料、粉末飲料、濃縮飲料、栄養飲料、アルコール飲料等）、乳製品（ヨーグルト、バター、チーズ、アイスクリーム等）、菓子（グミ、ゼリー、ガム、チョコレート、クッキー、キャンデー、キャラメル、和菓子、スナック菓子等）、即席食品類（即席麺、レトルト食品、缶詰、電子レンジ食品、即席スープ・みそ汁類、フリーズドライ食品等）、油、油脂食品（マヨネーズ、ドレッシング、クリーム、マーガリン等）、小麦粉製品（パン、パスタ、麺、ケーキミックス、パン粉等）、調味料（ソース、トマト加工調味料、風味調味料、調理ミックス、つゆ類等）、畜産加工品（畜肉ハム・ソーセージ等）が挙げられる。
　上記食品（もしくは飼料）には、必要に応じて各種栄養素、各種ビタミン類（ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ等）、各種ミネラル類（マグネシウム、亜鉛、鉄、ナトリウム、カリウム、セレン等）、食物繊維、分散剤、乳化剤等の安定剤、甘味料、呈味成分（クエン酸、リンゴ酸等）、フレーバー、ローヤルゼリー、プロポリス、アガリクス等を配合することができる。
　本発明の組み合わせ物中に含まれるバクテロイデス・ブルガタスおよびバクテロイデス・ドレイの生菌数としては、１日あたりの摂取量として、例えば１０４～１０１２コロニー形成ユニット（ｃｆｕ）、好ましくは１０６～１０１０ｃｆｕである。
　本発明の組み合わせ物には、他の有用な微生物の菌体もしくは菌体処理物をさらに配合することもできる。そのような他の微生物としては、例えば、ラクトバチルス(Lactobacillus)属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、ロイコノストック（Leuconostoc）属、ペディオコッカス（Pediococcus）属、ラクトコッカス（Lactococcus）属、エンテロコッカス(Enterococcus)属、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属等に属する乳酸菌、酵母、バチルス(Bacillus）属、酪酸菌（Clostridium butyricum）、麹菌等が挙げられるが、これらに限定されない。これらの併用微生物は、有効性が認められる限り、生菌の状態のみならず、死菌又は菌体破砕物、菌体抽出物、菌体成分などの形態で、本発明の組み合わせ物中に配合することもできる。
　併用微生物の配合量としては、１日あたりの摂取量として、例えば１０４～１０１２コロニー形成ユニット（ｃｆｕ）、好ましくは１０６～１０１０ｃｆｕである。
３．本発明の組み合わせ物の用途
　上述のとおり、バクテロイデス・ブルガタスとバクテロイデス・ドレイとは、腸内で共存することにより、腸内のＬＰＳレベルを低減させ、腸管バリアのタイトジャンクションを強化して血中ＬＰＳレベルを低減させ、腸内、血管内、及び臓器内での炎症応答・免疫応答を抑制し得る（即ち、ＬＰＳ制御性を有する）ので、腸内細菌叢において両菌種を富化することにより、血中又は腸内のＬＰＳレベルの亢進と関連する疾患を予防及び／又は改善することができる。したがって、本発明の組み合わせ物は、これらの疾患を予防及び／又は改善するための、医薬品又は医薬品添加物、あるいは、機能性食品（もしくは飼料）又は食品（もしくは飼料）添加物として有用である。
　血中又は腸内のＬＰＳレベルの亢進と関連する疾患としては、例えば、心房細動、心不全、虚血性心疾患、心筋梗塞、狭心症、高血圧症、動脈硬化症、大動脈瘤、大動脈解離、閉塞性動脈硬化症、大動脈弁狭窄症等の循環器系疾患、あるいは、例えば、肝炎、非アルコール性脂肪肝炎、脂肪肝、肝炎の進行による肝癌、腸管炎症、過敏性腸症候群、胃炎、膠原病、慢性関節リウマチ、慢性腎炎、IgA腎症、気管支喘息、間質性肺炎、薬剤性肺障害、好酸球性肺浸潤症候群、非定型性抗酸菌症、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、敗血症等の炎症性疾患、あるいは、糖尿病、肥満、メタボリックシンドローム、生活習慣病、脂質異常症、骨粗鬆症などの代謝性疾患などが挙げられる。
　本発明の組み合わせ物は、ヒト、又は他の哺乳動物（例えば、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、サル等）に対して、上記の１日あたりの摂取量を、１日１回、又は数回に分けて、経口的に摂取させることができ。あるいは直腸投与することもできる。
　本発明の組み合わせ物が食品として提供される場合、該食品は、血中又は腸内のＬＰＳレベルの亢進と関連する疾患の予防及び／又は改善のために用いられる旨の表示を付して販売することができる。ここで「表示」とは、需要者に対して上記用途を知らしめるための全ての行為を意味し、上記用途を想起・類推させうるような表示であれば、表示の目的、表示の内容、表示する対象物・媒体等の如何に拘わらず、すべて本発明における「表示」に該当する。しかしながら、需要者が上記用途を直接的に認識できるような表現により表示することが好ましい。具体的には、本発明の食品に係る商品又は商品の包装に上記用途を記載する行為、商品又は商品の包装に上記用途を記載したものを譲渡し、引き渡し、譲渡若しくは引渡しのために展示し、輸入する行為、商品に関する広告、価格表若しくは取引書類に上記用途を記載して展示し、若しくは頒布し、又はこれらを内容とする情報に上記用途を記載して電磁気的（インターネット等）方法により提供する行為、等が例示できる。
　一方、表示としては、行政等によって認可された表示（例えば、行政が定める各種制度に基づいて認可を受け、そのような認可に基づいた態様で行う表示）であることが好ましく、特に包装、容器、カタログ、パンフレット、ＰＯＰ等の販売現場における宣伝材、その他の書類等への表示が好ましい。
　また、例えば、健康食品、機能性食品、経腸栄養食品、特別用途食品、栄養機能食品、医薬用部外品等としての表示を例示することができ、その他厚生労働省によって認可される表示、例えば、特定保健用食品、これに類似する制度にて認可される表示を例示できる。後者の例としては、特定保健用食品としての表示、条件付き特定保健用食品としての表示、身体の構造や機能に影響を与える旨の表示、疾病リスク低減表示等を例示することができ、詳細にいえば、健康増進法施行規則（平成１５年４月３０日日本国厚生労働省令第８６号）に定められた特定保健用食品としての表示（特に保健の用途の表示）、及びこれに類する表示が、典型的な例として挙げられる。
４．本発明の検査方法及びそのための試薬
　本発明はまた、被験者の腸内細菌叢におけるバクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイの存在量を測定することを含む、血中又は腸内ＬＰＳレベルの亢進と関連する疾患（以下、「ＬＰＳ関連疾患」ともいう。）の発症リスクの検査方法（以下、「本発明の検査方法」ともいう。）及びそのための試薬（以下、「本発明の検査薬」ともいう。）を提供する。後述の実施例でも示されるとおり、バクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイは、冠動脈疾患（ＣＡＤ）患者の腸内細菌叢において存在量が有意に減少しており、また、動脈硬化マウスモデルに両菌種を経口摂取させると、動脈硬化の症状を改善するとともに、腸内のＬＰＳレベルを低減させ、腸管バリアのタイトジャンクションを強化して血中ＬＰＳレベルを低減させ、腸内及び血管内での炎症応答・免疫応答を抑制し得る（即ち、ＬＰＳ制御性を有する）。さらに、肥満マウスモデルに両菌種を経口摂取させると、肥満の症状を改善するとともに、臓器内での炎症応答・免疫応答を抑制し得る。さらに、非アルコール性脂肪肝炎モデルマウスに両菌種を経口摂取させると、非アルコール性脂肪肝炎の症状を改善するとともに、臓器内での炎症応答・免疫応答を抑制し得る。従って、被験者の腸内細菌叢におけるバクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイの存在量を測定し、正常値と比較することにより、該被験者がＬＰＳ関連疾患を発症しているか、あるいは将来発症するリスクが高いと判定することができる。尚、本明細書において「発症リスクの検査」とは、将来の発症する蓋然性の高さを予測するだけでなく、既に発症していることを診断するための検査をも包含する意味で用いられる。また、本明細書において「検出」なる用語は、そう解釈することが明らかに誤りである場合を除き、目的の細菌の存在の有無を判定するだけでなく、その存在量を定量的に測定することも包含する意味で用いられる。
　本発明の検査方法の検査対象となる被験者は特に制限されない。例えば、臨床所見で循環器系疾患や炎症性疾患、代謝性疾患等のＬＰＳ関連疾患の疑いのある者や、既にこれらの疾患に罹患していることが判明している患者も含まれ得る。腸内細菌叢においてバクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイの存在量が減少していることが分かれば、腸内細菌叢における該菌種の富化が、該患者の治療標的の１つとなり得るからである。尚、本検査のための被験者由来の試料としては、採取の容易さから糞便が好ましいが、該被験者の腸内細菌叢を反映し得る試料であれば特に制限されず、例えば、腸内容物（例、盲腸内容物）等であってもよい。
　バクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイの検出は、例えば、当該菌種が有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、具体的には、バクテロイデス・ブルガタスの場合、配列番号１又は２で表されるヌクレオチド配列と９８％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、また、バクテロイデス・ドレイの場合、配列番号３又は４で表されるヌクレオチド配列と９８％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を検出することにより行うことができる。
　バクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の検出にあたっては、まず試料から全ＤＮＡを回収する。被験者の糞便試料からＤＮＡを単離／精製する方法は当該技術分野において公知であり、例えば、フェノール・クロロホルムによる抽出、市販のＤＮＡ抽出試薬を用いる抽出、又は市販のカラムキットによる精製などにより行うことができる。
　試料から回収されたＤＮＡは、適切な緩衝液、例えばＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）等に溶解され、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の検出に供される。
　一態様においては、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の検出は、バクテロイデス・ブルガタスの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、即ち、配列番号１又は２で表されるヌクレオチド配列と９８％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、及び／又はバクテロイデス・ドレイの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、即ち、配列番号３又は４で表されるヌクレオチド配列と９８％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を、特異的に増幅し得るプライマーを用いて、試料から回収されたＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行なうことにより実施される。
　上記プライマーは、上記１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の一部又は全部の領域を特異的にＰＣＲ増幅し得るように設計されたものであればいかなるものであってもよい。ここで「特異的に」とは、プライマーが、バクテロイデス・ブルガタス及び／又はバクテロイデス・ドレイの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の一部又は全部の領域をＰＣＲ増幅するが、当該菌種以外の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をＰＣＲ増幅しないことを意味する。
　上記プライマーとしては、例えば、配列番号１又は２で表されるヌクレオチド配列と９８％以上の同一性を有するヌクレオチド配列（好ましくは、配列番号１又は２で表されるヌクレオチド配列）の相補配列の連続する部分配列、及び／又は配列番号３又は４で表されるヌクレオチド配列と９８％以上の同一性を有するヌクレオチド配列（好ましくは、配列番号３又は４で表されるヌクレオチド配列）の相補配列の連続する部分配列にハイブリダイズする、約１５～約５０塩基、好ましくは約１８～約３０塩基のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと、このハイブリダイゼーション部位より３’側の上記ヌクレオチド配列の連続する部分配列にハイブリダイズする、約１５～約５０塩基、好ましくは約１８～約３０塩基のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドとの組み合わせであり、それらによって増幅される核酸の断片長が約５０～約１，０００塩基、好ましくは約１００～約５００塩基である、一対のポリヌクレオチドが挙げられる。
　プライマーは、好ましくは、配列番号１又は２で表されるヌクレオチド配列と９８％以上の同一性を有するヌクレオチド配列（好ましくは、配列番号１又は２で表されるヌクレオチド配列）及び／又は配列番号３又は４で表されるヌクレオチド配列と９８％以上の同一性を有するヌクレオチド配列（好ましくは、配列番号３又は４で表されるヌクレオチド配列）の連続する１５～５０塩基（好ましくは１８～３０塩基）の部分配列、あるいはそれらの相補配列の連続する１５～５０塩基（好ましくは１８～３０塩基）の部分配列を含む。
　特異性の観点から、好適なプライマーセットとしては、少なくともその一方が、配列番号１又は２で表されるヌクレオチド配列及び／又は配列番号３又は４で表されるヌクレオチド配列中、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子内に含まれる菌種間で配列が異なる９か所の可変領域（Ｖ１～Ｖ９）のいずれかに位置するヌクレオチド配列、あるいはその相補鎖配列に対して相補的なヌクレオチド配列を有するものである。
　本発明の検査方法においては、バクテロイデス・ブルガタスの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子と、バクテロイデス・ドレイの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子とを区別して検出してもよいし、両者を区別せずに一括で検出してもよい。後述の比較例に示されるように、バクテロイデス・ブルガタス又はバクテロイデス・ドレイのいずれかを単独で、動脈硬化マウスモデルに経口摂取させても、動脈硬化の症状は改善傾向ではあったものの有意差は認められず、また、腸内ＬＰＳレベルを低下させることはできなかった。従って、バクテロイデス・ブルガタスとバクテロイデス・ドレイとを区別して検出することが望ましいが、腸内細菌叢においていずれか一方の存在量のみが顕著に変動することは現実的には考えにくいので、両者を一括して検出したとしても、判定結果に実質的な影響を及ぼすことはない。
　例えば、バクテロイデス・ブルガタス ATCC 8482T株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（配列番号１）と、バクテロイデス・ドレイ JCM 13471T株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（配列番号３）とをＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩ）を用いてデフォルト条件でアラインさせると、図１１のとおりである（Ｑｕｅｒｙが配列番号１、Ｓｂｊｃｔが配列番号３を示す）。両配列は１４９３ヌクレオチド（配列番号１の１２～１４９７位、配列番号３の１～１４９０位；ギャップ数１０）にわたってオーバーラップし、約９７％（１４４９／１４９３）同一という高いホモロジーを示す。そのため、バクテロイデス・ブルガタスとバクテロイデス・ドレイの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を区別して増幅可能なバクテロイデス・ブルガタス特異的プライマー及びバクテロイデス・ドレイ特異的プライマーの設計領域は限定される。例えば、配列番号１の１８１～２１０位は、配列番号３の対応する領域と約７３％（２２/３０）の同一性しか有さず、また、配列番号１の１００１～１０２８位は、配列番号３の対応する領域と約６０％（１８／３０）の同一性しか有さないので、これらの領域内にいずれか一方又は両方のプライマーを設計することにより、バクテロイデス・ブルガタスの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子と、バクテロイデス・ドレイの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子とを区別して増幅することが可能である。
　一方、バクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を一括して増幅する場合、例えば、光岡知足編「腸内フローラの分子生態学的検出・同定」p109-121（2000年）にバクテロイデス・ブルガタス特異的プライマーとして記載される（当時バクテロイデス・ドレイは未同定）プライマーセット（配列番号１の１３６～６０８位、配列番号３の１２５～５９９位を増幅する）を用いれば、両菌種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を一括して、かつ他の腸内細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を増幅することなく、増幅することができる。
　さらに、このプライマーセットを用いた場合、配列番号１の増幅断片にはＴａｑＩ制限部位（ＴＣＧＡ；配列番号１の２８８～２９１位）が１か所存在するが、配列番号３の増幅断片にはＴａｑＩ制限部位が存在しないので、増幅断片をＴａｑＩで消化して電気泳動すれば、仮にバクテロイデス・ブルガタスしか存在しない場合には、１５３ｂｐと３２０ｂｐの２本のバンドが検出されるが、バクテロイデス・ドレイしか存在しない場合には、４７５ｂｐの１本のバンドが検出される。両菌種が存在する場合には、上記３本のバンドが検出される。従って、バクテロイデス・ブルガタスとバクテロイデス・ドレイの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を一括増幅できるプライマーに、ＲＦＬＰ分析を組み合わせることにより、両菌種を区別して検出することもできる。
　ＰＣＲにおける温度設定、反応時間及びサイクル数は、使用する鋳型ＤＮＡの量、プライマーの種類等に応じて適宜設定することができる。ＰＣＲにおけるアニーリングの温度は、プライマーのＧＣ含量に基づき適宜設定することができる。
　得られたＰＣＲ産物は、電気泳動（例えば、アガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動等）により分離される。電気泳動後、ゲルがエチジウムブロマイド溶液等の自体公知の染色液により染色され、トランスイルミネーター等を用いてＰＣＲ産物が検出される。そして、特異的ＰＣＲ産物の有無や量を指標として、試料中のバクテロイデス・ブルガタス及び／又はバクテロイデス・ドレイの存在の有無や存在量が判定される。
　本発明の検査方法において用いられるＰＣＲは、定量的ＰＣＲであってもよい。定量的ＰＣＲは、公知の方法により行なうことができるが、２つの解析方法が知られている。１つ目は、ＰＣＲ反応で反応生成物がある程度の量までは指数関数的に増加し、その後プラトーに達するという特徴を利用し、指数関数的増加期に反応生成物量を解析し、初期鋳型量を算出する方法である。２つ目は、反応生成物をリアルタイムでモニタリングすることにより、反応生成物量がある一定の値（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）を超えるＰＣＲサイクル数（Ｃｔ）を決定する方法である。いずれの解析方法も、既知濃度のＤＮＡ量を変化させＰＣＲを行ない、各サイクル数における反応生成物を解析し、そのカイネティクスから定量性のあるＰＣＲサイクル数範囲を決定することが必要である。その結果をふまえて、未知の試料中の目的遺伝子の存在量を概算する。それにより試料中のバクテロイデス・ブルガタス及び／又はバクテロイデス・ドレイの存在量を定量することができ、目的遺伝子が被検試料中に１コピーでも含まれると概算された場合、目的の細菌が存在すると判定することができる。
　別の一態様において、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の検出は、バクテロイデス・ブルガタスの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、即ち、配列番号１又は２で表されるヌクレオチド配列と９８％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、及び／又はバクテロイデス・ドレイの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、即ち、配列番号３又は４で表されるヌクレオチド配列と９８％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を特異的にハイブリダイズし得るプローブを、試料中の全ＤＮＡ又は全ＲＮＡに接触させ、該ハイブリッドを検出することにより行われ得る。接触の条件は、プローブが１６Ｓ ｒＲＮＡ又はそれをコードする遺伝子とハイブリダイズして核酸複合体を形成するよう適宜設定される。そして当該複合体は、バクテロイデス・ブルガタス及び／又はバクテロイデス・ドレイの存在を示すものとして検出される。
　上記プローブは、配列番号１又は２で表されるヌクレオチド配列と９８％以上の同一性を有するヌクレオチド配列（好ましくは、配列番号１又は２で表されるヌクレオチド配列）及び／又は配列番号３又は４で表されるヌクレオチド配列と９８％以上の同一性を有するヌクレオチド配列（好ましくは、配列番号３又は４で表されるヌクレオチド配列）に含まれる、約１５塩基以上、好ましくは約１８～約５００塩基、より好ましくは約１８～約２００塩基、いっそう好ましくは約１８～約５０塩基の連続したヌクレオチド配列又はその相補配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドである。
　ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）第２版（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。ストリンジェントな条件としては、例えば、６×ＳＳＣ（ｓｏｄｉｕｍ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ／ｓｏｄｉｕｍ　ｃｉｔｒａｔｅ）中４５℃でのハイブリダイゼーション反応の後、０．２×ＳＳＣ／０．１％　ＳＤＳ中６５℃での一回以上の洗浄などが挙げられる。当業者は、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、ハイブリダゼーション反応の温度、プローブ濃度、プローブの長さ、ミスマッチの数、ハイブリダイゼーション反応の時間、洗浄液の塩濃度、洗浄の温度等を適宜変更することにより、所望のストリンジェンシーに容易に調節することができる。
　好ましくは、プローブは、配列番号１又は２で表されるヌクレオチド配列と９８％以上の同一性を有するヌクレオチド配列（好ましくは、配列番号１又は２で表されるヌクレオチド配列）及び／又は配列番号３又は４で表されるヌクレオチド配列と９８％以上の同一性を有するヌクレオチド配列（好ましくは、配列番号３又は４で表されるヌクレオチド配列）に含まれる、約１５塩基以上、好ましくは約１８～約５００塩基、より好ましくは約１８～約２００塩基、いっそう好ましくは約１８～約５０塩基の連続したヌクレオチド配列又はその相補配列を含む核酸である。
　特異性の観点から、好適なプローブとしては、配列番号１又は２で表されるヌクレオチド配列、あるいは配列番号３又は４で表されるヌクレオチド配列中、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子内に含まれる菌種間で配列が異なる９か所の可変領域（V1～V9）のいずれかに位置するヌクレオチド配列又はその相補配列に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸が挙げられる。具体的には、図１１に示される配列番号１と配列番号３のアラインメントにおいて、比較的ホモロジーが低いと認められる、上記プライマーの設計領域について例示した領域が同様に挙げられる。あるいは、バクテロイデス・ブルガタスの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子とバクテロイデス・ドレイの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子とを、特異的かつ一括増幅可能なプライマーとして例示した領域を含む核酸を、同様にバクテロイデス・ブルガタスおよびバクテロイデス・ドレイを特異的に検出し得るプローブとして挙げることができる。
　本発明の検査薬を構成するプライマー又はプローブは、特異的検出に支障を生じない範囲で付加的配列（検出対象のポリヌクレオチドと相補的でないヌクレオチド配列）を含んでいてもよい。
　前記プライマー又はプローブとして使用されるポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）でもリボ核酸（ＲＮＡ）でもよい。リボ核酸の場合、ヌクレオチド配列におけるチミジン残基（Ｔ）は、適宜ウリジン残基（Ｕ）と読み替えられる。また任意の位置のＴをＵに変えて合成したウリジン残基を含むＤＮＡであってもよい。同様に任意の位置のＵをＴに変えて合成したチミジン残基を含むＲＮＡであってもよい。また、ハイブリダイゼーションの特異性を低下させない限り、ポリヌクレオチド中に欠失、挿入又は置換などの点突然変異や、修飾ヌクレオチドが存在してもよい。
　また、プライマー又はプローブは、適当な標識剤、例えば、放射性同位元素（例：125Ｉ、131Ｉ、3Ｈ、14Ｃ、32Ｐ、33Ｐ、35Ｓ等）、酵素（例：β－ガラクトシダーゼ、β－グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等）、蛍光物質（例：フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネート等）、発光物質（例：ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニン等）、ビオチンなどで標識されていてもよい。
　前記プライマー又はプローブとして使用される核酸は、例えば汎用のＤＮＡ合成装置を用いて化学的に合成することができる。該核酸は、当該技術分野においてよく知られる他の方法のいずれかを用いて合成してもよい。
　本発明の検査薬は、更に他の成分として核酸合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素など）、その他の酵素、酵素に応じた基質（ｄＮＴＰ、ｒＮＴＰなど）などを含んでもよい。また標識検出物質や緩衝液なども含んでもよい。
　別の一実施態様において、バクテロイデス・ブルガタス及び／又はバクテロイデス・ドレイの検出は、該細菌を特異的に認識する抗体（以下、「本発明の抗体」ともいう。）を用いて、自体公知の免疫学的手法により行うこともできる。バクテロイデス・ブルガタス及び／又はバクテロイデス・ドレイを特異的に認識する抗体とは、該細菌の細胞表層に特異的に存在する表面抗原を認識し結合する抗体をいう。そのような表面抗原としては、例えば、細胞壁に存在する多糖、ペプチドグリカン若しくはタンパク質等が挙げられる。あるいは、表面抗原に限らず、バクテロイデス・ブルガタス及び／又はバクテロイデス・ドレイに特異的な構成成分を認識し結合する抗体であってもよい。そのような特異的抗体は、バクテロイデス・ブルガタス又はバクテロイデス・ドレイ又はその菌体処理物を免疫原として、自体公知の製造方法によってポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を作製し、得られた抗体クローンの中から、バクテロイデス・ブルガタス及び／又はバクテロイデス・ドレイ以外の近縁種と交差反応しないクローンを選択することにより得ることができる。本発明の抗体は天然型抗体の他、特異的結合活性を有する抗体フラグメント、具体的には、例えばＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ、ｄｓＦｖ、ｓｄＡｂ等を包含する。抗体のクラスは、特に限定されず、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤあるいはＩｇＥ等のいずれのアイソタイプを有する抗体をも包含する。好ましくは、ＩｇＧ又はＩｇＭであり、精製の容易性等を考慮するとより好ましくはＩｇＧである。
　本発明の抗体を用いることで、免疫学的手法によりバクテロイデス・ブルガタス及び／又はバクテロイデス・ドレイの検出、定量等を行なうことができる。免疫学的手法としては、フローサイトメトリー解析、放射性同位元素免疫測定法（RIA法）、ELISA法（Methods in Enzymol. 70: 419-439 (1980)）、ウェスタンブロッティング、免疫組織染色等を挙げることができるが、これらに限定されない。
　上記のいずれかの方法により、被験者の腸内細菌叢におけるバクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイの存在量が、正常値（例、健常者集団の腸内細菌叢における該細菌の量をもとに決定されるカットオフ値（例えば、平均値－２ＳＤ等））よりも低い量の該細菌の存在が確認された場合、該被験者はＬＰＳ関連疾患を発症しているか、将来該疾患を発症するリスクが高いと判定することができる。逆にこれら２菌種がカットオフ値以下であった場合は、該被験者はＬＰＳを発症しておらず、将来発症するリスクも少ないと判定することもできる。
　ここで、ＬＰＳ関連疾患としては、例えば、心房細動、心不全、虚血性心疾患、心筋梗塞、狭心症、高血圧症、動脈硬化症、大動脈瘤、大動脈解離、閉塞性動脈硬化症、大動脈弁狭窄症等の循環器系疾患、あるいは、例えば、肝炎、非アルコール性脂肪肝炎、脂肪肝、肝炎の進行による肝癌、腸管炎症、過敏性腸症候群、胃炎、膠原病、慢性関節リウマチ、慢性腎炎、IgA腎症、気管支喘息、間質性肺炎、薬剤性肺障害、好酸球性肺浸潤症候群、非定型性抗酸菌症、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、敗血症等の炎症性疾患、あるいは、糖尿病、肥満、メタボリックシンドローム、生活習慣病、脂質異常症、骨粗鬆症などの代謝性疾患などが挙げられる。
　以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の単なる例示にすぎず、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
材料及び方法
ＣＡＤ患者及び対照の募集採用
　すべての参加者は、登録後に書面によるインフォームド・コンセントを提供した。研究はヘルシンキ宣言のガイドラインに則り実施した。本研究は神戸大学の倫理委員会の承認（承認番号１５９５）を得て、ＵＭＩＮ臨床試験レジストリに登録された（試験登録番号000015703, URL: http://www.umin.ac.jp/ctr/）。
　３０名のＣＡＤ患者と、３０名の冠状動脈のリスクファクターを有する非ＣＡＤ対照を、２０１４年１０月から２０１５年７月にかけて神戸大学附属病院にて募集採用した。ＣＡＤ群は、安定狭心症患者、及び本研究の少なくとも６か月前に経皮冠動脈インターベンション又は冠動脈バイパス移植術を受けた、保存された左室駆出率（＞４０％）を有する陳旧性心筋梗塞患者を含んだ。急性冠動脈症候群患者は除外した。一枝疾患か多枝疾患かは、診断的冠動脈造影において７５％を超える狭窄を示す主要な冠状動脈の数という観点で定義した。
　高血圧、糖尿病及び／又は脂質異常症等の冠状動脈のリスクファクターを有するが、冠動脈疾患又は他の血管の疾患を現在も既往歴も有しない３０名の患者を年齢及び性別の合致した対照として募集採用した。冠動脈疾患又は他の血管の疾患の既往歴は、確認された血管疾患、狭心症を示す症状、陳旧性心筋梗塞又は狭心症を示す心電図上の異常、あるいは胸部Ｘ線上の異常として定義した。
　肝疾患、腎疾患（血清クレアチニンレベル＞２．０ｍｇ／ｄＬ）、コラーゲン疾患又はがんを含む全身性疾患を有する患者は研究から除外した。抗生物質で治療した患者も除外した。糖尿病は、全米グリコヘモグロビン標準化プログラムの指標により、糖化ヘモグロビン値 ＞６．５％、経口抗糖尿病薬の使用、又はインスリン治療を受けている場合、糖尿病と定義した。血圧 ＞１４０／９０ｍｍＨｇ又は降圧薬の使用を高血圧症と定義した。日本動脈硬化学会が発行するガイドラインにより、低密度リポタンパク質コレステロールレベル ＞１４０ｍｇ/ｄＬ、トリグリセリドレベル ＞１５０ｍｇ／ｄＬ又は抗脂質異常症薬の使用を脂質異常症と定義した。
糞便サンプルからのＤＮＡ抽出
　被験者を入院させ、病院食を摂取させながら、被験者由来の糞便サンプルを採取した。マウス由来の糞便サンプルは、６週齢及び１６週齢時に採取した。糞便サンプルは－８０℃で保存した。糞便サンプルからのＤＮＡ抽出は、以前に確立した手順（Appleid and Environmental Microbiology 63, 2802-2813 (1997); Appl Environ Microbiol 71, 4153-4155 (2005); FEMS Microbiology Ecology 68, 351-362 (2009)）に従って、日本遺伝子研究所により実施された。各サンプルについて、０．２～０．３ｇの糞便材料から、Ｇ’ＮＯＭＥｓキット（ＢＩＯ １０１，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用い、製造者の指示に従いつつ少し改変して、細胞ＤＮＡを抽出した。簡単にいえば、提供された細胞懸濁液中で糞便サンプルをホモジナイズした後、細胞溶解／変性溶液を加えてサンプルを５５℃で３０分間インキュベートした。細胞溶解を向上させるため、７５０ｍＬのシリカビーズ（直径０．１ｍｍ）を添加し、ＢｅａｄＢｅａｔｅｒ装置（ＢｉｏＳｐｅｃ，Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ，ＯＫ）内で最大速度で１０分間振とうした。ポリビニルピロリドン（１５ｍｇ）を添加し、その後の定量的ＰＣＲを阻害し得るポリフェノールのコンタミの除去を確実にした。サンプルをボルテックスし、２０，０００ｇで３分間遠心し、上清を回収した。残渣のペレットを４００ｍＬのＴＥＮＰバッファー（５０ｍＭ トリスバッファー，ｐＨ８、２０ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ポリビニルポリピロリドン）で洗浄し、２０，０００ｇで３分間遠心した。洗浄工程をもう1回繰り返し、得られた上清をプールした。等容のイソプロパノールを加えて核酸を沈澱させ、－２０℃で１０分間保存した後、２０，０００ｇで５分間遠心した。ペレットを４００ｍＬの蒸留水と１００ｍＬの塩析剤混合液に再懸濁し、４℃で１０分間インキュベートした。サンプルを２０，０００ｇで１０分間遠心し、ＤＮＡを含む上清を清潔な１．５ｍＬ遠心管に移した。２倍容の１００％エタノールを加え、室温で５分静置してＤＮＡを沈澱させた後、２０，０００ｇで５分間遠心した。ＤＮＡを１５０ｍＬのＴＥバッファーに再溶解し、該ＤＮＡ溶液を後の分析まで－２０℃で保存した。
１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子増幅及びパイロシーケンシング
　１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の一部（Ｖ３－Ｖ４領域、大腸菌ナンバリングシステムの３４２～８０６位に相当）を、３４２Ｆと８０６Ｒの非変性ユニバーサルプライマーセット（表２）を用いてＰＣＲ増幅した（プライマーセット及びＰＣＲ条件の詳細はDNA Res. 21, 217-227 (2014)を参照）。シーケンシングアダプターを付加した後、Illumina MiSeq platform (Illumina Inc., San Diego, CA) 用い、製造者のプロトコルに従い、タカラバイオ社にてアンプリコンをシーケンシングした。
　USEARCH version 10.0.240（Bioinformatics. 26, 2460-2461 (2010)）version 0.33（パラメータ：LEADING:17 TRAILING:17 AVGQUAL:25 MINLEN:100）を用いて、細菌組成マトリクスを作成した。また、以前のプロトコルを用い、Trimmomatic（Bioinformatics. 30, 2114-2120 (2014)）を用いて生成した高品質な１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子アンプリコン配列を選択した。残りのリードは、USEARCHの-fastq_mergepairsコマンド（パラメータ：デフォルト値）を用いた。次に、Tagcleaner（BMC Bioinformatics. 11, 341 (2010)）version 0.16（パラメータ：-tag5 CTACGGGGGGCAGCAG -mm5 3 -tag3 AGATACCCCGGTAGTCC -mm3 3 -nomatch 3）を用いて、プライマー領域のない配列を除いた。その後、内部のpython scriptを用いて、Nを有する配列を除いた。USEARCHの-filter_phixコマンドを用いて、Phixリードを除いた。USEARCHのコマンド-sort_by_length（パラメータ：-minseqlength 300）を用いて、短い配列を除いた。最後に、UPARSEアルゴリズム (-fastx_uniqueコマンド及びotu_clusterコマンド（パラメータ：-minsize 1)）を用いて、OTUテーブルを生成した（Nat Meth. 10, 996-998 (2013)）。各OTUの代表的な配列を、RDP Classifier version 2.12を用い、ブートストラップ値?0.5で、細菌の属にアノテーションした（Appl Environ Microbiol. 73, 5261-5267 (2007)）。さらに、各OTUの各代表的な配列を、BLASTN version 2.2.25を用い、identity threshold ?97% 及び coverage ?80%で、参照データベースsilva Living Tree Project version 123（Syst Appl Microbiol. 31, 241-250 (2008)）にアノテーションした。
糞便サンプル中の短鎖脂肪酸の分析
　被験者が病院内で病院指定の食事を摂るようになった後に糞便サンプルを採取した。該サンプルを、内部コントロールとして２－エチル酪酸を含む滅菌水で希釈した後、YMC-Pack FA kit (#XSRFAR01, YMC, Kyoto, Japan) を用いて、２－ニトロフェニルヒドラジンで標識した。該サンプル中の短鎖脂肪酸を液体クロマトグラフィー (Prominence LC-20AD; Shimadzu, Kyoto, Japan) により定量した。
動物
　すべてのアポリポ蛋白質Ｅ欠損（Ａｐｏｅ－／－）マウスはＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドのものを用いた。すべてのマウスは、神戸大学の研究所内のＳＰＦグレードの動物施設で飼育した。動物には、厳密な１２時間明期サイクル下で、通常食（日本クレア）を与え、自由摂水させた。６週齢マウスを３つの処置群に分け、対照群のマウスには培地を経口摂取させ、バクテロイデス属生菌群のマウスには生きたバクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイを、バクテロイデス属菌加熱死菌群のマウスには熱殺菌したバクテロイデス・ブルガタスおよびバクテロイデス・ドレイを、それぞれ2.5×109 cfu/100 μlの用量で週５回経口摂取させた。すべての実験は、神戸大学医学部で有効な動物実験に関するガイドライン（ガイドラインＮｏ．Ｐ１６０７０１）に従って実施した。
　肥満マウスモデル及び非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）マウスモデルは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（日本チャールス・リバー社）を用い、後で詳述する方法にて作製した。
バクテロイデス・ブルガタスおよびバクテロイデス・ドレイの培養及び調製
　バクテロイデス・ブルガタス(#8482; American Type Culture Collection, Manassas, VA、及びNTZ002株（受託番号：NITE BP-02863）) 及びバクテロイデス・ドレイ（#17855; Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Braunschweig, Germany、及びNTZ001株（受託番号：NITE BP-02862））は、DifcoTM reinforced clostridial medium (#218081; BD Bioscience, San Jose, CA) 中で、３７℃で嫌気的に培養した。１０％ ＣＯ２、１０％ 水素及び８０％ 窒素を含む嫌気チャンバー（Coy Laboratory Products, Grass Lake, MI）を、すべての嫌気的な微生物工程に使用した。バクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイは１２１℃で１５分間処理して熱殺菌した。熱殺菌が首尾よく行われたことを、加熱処理した細菌をプレーティングし、生育しないことにより確認した。
血漿中の生化学的パラメータ及びサイトカインレベルの評価
　動物を一晩絶食させ、麻酔下の心穿刺によりヘパリン管に血液を採取した。血液サンプルを４℃で１０分間、３，０００ｒｐｍで遠心し、測定まで－８０℃で保存した。総コレステロール、高密度リポタンパク質コレステロール、低密度リポタンパク質コレステロール、及びトリグリセリドの血漿中濃度を、自動化化学分析装置（ＳＲＬ社）を用いて酵素的に測定した。血漿中サイトカインレベルは、サイトメトリックビーズアレイキット（ＢＤバイオサイエンス）を用いて、製造者の指示に従って分析した。
動脈硬化病変の評価
　マウスに麻酔し、大動脈を生理食塩水で潅流し、左室中央から腸骨動脈の分岐点までを切除した。大動脈基部の病変を分析するため、近位上行大動脈部分から大動脈洞にかけてのサンプルを得た。該サンプルを、凍結組織切片作製様包埋剤ＯＣＴコンパウンド（#4583, Tissue-Tek; Sakura Finetek, 東京）に包埋した。大動脈洞の５５０μｍにわたる５枚の連続切片（厚さ１０μｍ）を各マウスから採取し、オイルレッドＯ（#154-02072; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）又はヘマトキシリン（#3000; 武藤化学，東京）で染色した。染色切片をオールインワン蛍光顕微鏡（#BZ-8000; Keyence, 大阪）を用いてデジタル処理でキャプチャーした。動脈硬化の程度を定量的に解析するため、ImageJ（登録商標）ソフトウェアを既報のとおり用いて（Circulation. 120, 1996-2005 (2009)）、各マウスから得た５つの別個の切片について全病変面積を算出した。ｅｎ ｆａｃｅ病変解析のために、近位上行大動脈から総腸骨動脈分岐までにわたる大動脈断片を切除し、１０％ ホルマリン緩衝液中で固定した。外膜組織を注意深く除去した後、大動脈を縦方向に切開し、オイルレッドＯで染色し、黒ワックス表面上にピン留めしてデジタルカメラを用いてキャプチャーした。染色病変面積を全面積に対するパーセンテージとして示し、既報に記載のとおり（Circulation. 120, 1996-2005 (2009)）、ImageJ（登録商標）ソフトウェアを用いて測定を行った。
動脈硬化病変の免疫組織化学分析
　マクロファージ検出用抗体（MOMA-2, #T-2029, 1:400; BMA Biomedicals, Augst, Switzerland）及びＴ細胞検出用抗体（CD4, #550278, 1:100; BD Biosciences）を用いて、動脈硬化病変の免疫組織化学分析を、アセトン固定又はホルマリン固定したマウス大動脈基部の１０μｍ凍結切片上で実施した。ビオチン化二次抗体（#ab102250, 1:500; abcam, Cambridge, UK）及びストレプトアビジン標識西洋ワサビペルオキシダーゼ（#P0397, 1:500; Dako Co., Carpinteria, CA）を用いて検出を行った。染色した切片を、オールインワン蛍光顕微鏡を用いてデジタル処理でキャプチャーした。ＭＯＭＡ－２染色においては、全動脈硬化病変面積に対する染色面積のパーセンテージを算出した。ＣＤ４陽性Ｔ細胞の定量は、各切片中の染色細胞数を計数することにより実施した。
マウス結腸の組織学的解析
　各マウスにおいて、１６週齢時に上行結腸を切除し、ＯＣＴコンパウンド中に包埋した。タイトジャンクションタンパク質を検出する抗体（anti-ZO-1, #sc-33725, 1:100; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）を用いて、アセトン固定した１０μｍ凍結切片上で免疫蛍光染色を実施したＣｙ３をコンジュゲートした二次抗体（#405408, 1:200; BioLegend, San Diego, CA）を用いて検出を行った。ＤＡＰＩ（#H-1200; Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA）を用いて核染色を行った。染色した切片を、オールインワン蛍光顕微鏡を用いてデジタル処理でキャプチャーした。ＺＯ－１の発現強度はImageJ（登録商標）ソフトウェアを用いて解析した。
フローサイトメトリー
　腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）細胞、脾細胞及びＲＡＷ２６４．７細胞を抗ＣＤ１６／ＣＤ３２抗体（clone 2.4G2; #553142; BD Biosciences）とインキュベートし、Ｆｃレセプターをブロッキングした。表面抗原の検出のため、２％ 胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）５０μＬ中の１０×１０５個のＭＬＮ細胞又は脾細胞を、以下の抗体（(BD Biosciences又はeBioscience）：
・抗ＣＤ４(clone RM4-5; Cat 557871)
・抗ＣＤ１１ｂ (clone M1/70; #557396)
・抗ＣＤ１１ｃ (clone HL3; #558079)
・抗ＣＤ４４ (clone IM7; #553134)
・抗ＣＤ６２Ｌ (clone MEL-14; #553150)
・抗ＣＤ６９ (clone FN50; #555533)
・抗ＣＤ８０ (clone 16-10A1; #560016)
・抗ＣＤ８６ (clone GL1; #553692)
・抗ＣＤ２７３ (clone TY25; #560086)
・抗ＣＤ２７４ (clone MIH5; #558091)
・抗Ｆ４／８０ (clone BM8; #17-4801-82)
・抗Ｌｙ６Ｇ (clone RB6-8C5; #12-5931-82)
・抗ＴＬＲ４ (clone MTS510, #17-9924-82) 
を用いて染色した。Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set (#00-5523-00, eBioscience, San Diego, CA) 又はFixation/Permeabilization Solution Kit (#554714, BD Biosciences)、抗Ｆｏｘｐ３抗体（clone FJK-16; #17-5773-82; eBioscience）及び抗ＣＴＬＡ－４抗体（clone UC10; BD Biosciences; #553720）を用い、製造者の指示に従って細胞内染色を実施した。アイソタイプが一致する抗体を対照として使用した。ＲＡＷ２６４．７細胞の増殖を、anti-Ki67 set (clone B56; #556027) を用い、製造者の指示に従って試験した。フローサイトメトリー解析は、Attune（登録商標）acoustic focusing cytometer (Life Technologies, Grand Island, NY) とFlowJo software (Tree Star, Inc., Ashland, OR) を用いて実施した。
インビボ腸透過性アッセイ
　一晩絶食後、マウスにフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識デキストラン（FD4, 500 mg/kg of body weight; Sigma-Aldrich）を経口摂取させた。４時間後、血漿中ＦＤ４濃度を、蛍光分光光度計（EnSpire; PerkinElmer, Inc., Waltham, MA）を、励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍで用いて測定した。
糞便上清の調製
　ＬＰＳ測定と１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子シーケンシングには、同じヒト糞便サンプルを用いた。マウス糞便サンプルは、１６週齢の対照マウス及びバクテロイデス属菌処理マウス、あるいは６週齢の抗生物質（ＡＶＮＭ）投与マウスから、最後の経口摂取の２４時間後に採取した。既報のプロトコル（PLoS One. 7, e47713 (2012); Gut. 63, 1069-1080 (2014); BMC Microbiol. 16, 9 (2016)）を少し改変して、糞便上清を得た。簡単にいうと、糞便サンプルを、５０ｍｇ／５００μＬの濃度となるように無菌ＰＢＳ中に懸濁し、細菌細胞が破砕しないように穏かにボルテックスした。３，０００ｒｐｍで１５分間遠心した後、上清を回収し、０．４５μｍのフィルター、次いで０．２２μｍのフィルターで濾過して滅菌し、７０℃で１５分間インキュベートして不活性化した後－８０℃で保存した。また、マウス盲腸便サンプルは、１６週齢の対照マウス及びバクテロイデス属菌処理マウスから、常法により採取した。
血漿及び糞便上清中のＬＰＳレベルの解析
　Limulus Amebocyte Lysate アッセイキット（#K50-643J; Lonza Inc., Basel, Switzerland）を用い、製造者の指示に従って、血漿中及び糞便中のＬＰＳレベルを測定した。パイロジェンフリー水中に、血漿は１０倍、糞便上清は１０，０００倍希釈し、７０℃で１５分間不活性化した。ＬＳＰ測定は、パイロジェンフリーのガラス管、エッペンドルフチューブ及びプレート中で実施した。
インビトロでの糞便上清刺激及びｓｉＲＮＡアッセイ
　ＲＡＷ２６４．７マクロファージを１０％ ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ－１６４０培地中で培養した。増殖のために、ＲＡＷ２６４．７細胞（１×１０５個）を２４－ウェル平底プレート（Corning Costar, Corning, NY）に播種し、糞便上清の存在下、３７℃、５％ ＣＯ２雰囲気中で５時間インキュベートした。サイトカイン産生解析のため、ＴＬＲ４に対するｓｉＲＮＡ（#4390771; Invitrogen, Carlsbad, CA）を用い、RNAiMAX reagent (#13778030, Invitrogen) によりＴＬＲ４のノックダウンを行った。SilencerTM Select Negative Control No. 1 siRNA (#4390843, Invitrogen) を対照として用いた。ＨＴ２９ヒト腸管上皮細胞をAmerican Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）から購入し、１０％ ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ－１６４０培地中で培養した。このＨＴ２９細胞を２４－ウェル平底プレートに播種し、糞便上清の存在下、３７℃、５％ ＣＯ２雰囲気中で２４時間インキュベートした。
ＲＮＡ抽出及びリアルタイムＰＣＲ解析
　ＴＲＩｚｏｌTM試薬（#15596018; Thermo Scientific, Waltham, MA）を用い、製造者の指示に従って、全ＲＮＡを組織又は細胞サンプルから抽出した。PrimeScript reverse transcription reagent kit (#RR037A; Takara, 滋賀) を用いてｃＤＮＡを合成した。SYBER Premix Ex Taq (#RR820; Takara) 及びLightCycler（登録商標）96 System (#05815916001; Roche, Mannheim, Germany) を用い、製造者の指示に従って定量的ＲＴ－ＰＣＲを実施した。各遺伝子に特異的なプライマーを表２に示す。発現データは対照ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨで補正し、ΔΔＴ法により解析した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
ウェスタンブロッティング
　Sci. Rep. 7, 12989 (2017) において詳述したようにして、ウェスタンブロット分析を実施した。簡単に言うと、細胞をＰＢＳで２回リンスし、氷冷した溶解バッファー（20 mM HEPES, pH 7.4; 1% NP40; 1% SDS; 及び150 mM NaCl）中に集めた。全溶解物から抽出したタンパク質を６％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけ、iBlot（登録商標）Gel Transfer Device（Thermo Scientific）を用いて、ポリビニリデンジフルオライドメンブレン（#IB401002; Thermo Scientific）上に転写した。該メンブレンを５％ミルク（#31149-75; ナカライテスク, 京都）でブロッキングし、一次抗体と４℃で一晩インキュベートした後、西洋ワサビペルオキシダーゼをコンジュゲートした二次抗体と室温で１時間インキュベートした。Immobilon Western HRP Substrate (#WBKLS0500; Merck Millipore, Billerica, MA) とインキュベーションした後、V3 Western Workflow system (Bio-Rad, Hercules, CA) を用いてシグナルを検出した。本実験では以下の一次抗体を使用した。
・抗ＺＯ－１ (#8193, 1:1,000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA)
・抗β－アクチン (#A5441, 1:5,000; Sigma-Aldrich)
　バンド強度はImageJ（登録商標）ソフトウェアを用いて定量した。
統計解析
　R software, version 3.1.0 (http://www.r-project.org/)、JMP version 10 (SAS Institute, Cary, NC) 及びPrism version 7.0 (GraphPad Software; San Diego, CA) を用いて、統計解析を行った。Shapiro-Wilk検定を用いてデータが正規分布を示すか否かを決定した。結果は、正規分布データについては、平均値±該平均値の標準誤差、又は平均値±正規分布データの標準偏差で、非正規分布データについては、中間値±四分位範囲（第１～第３四分位範囲）で表した。正規分布データについてはStudentの両側t-検定を、非正規分布データについてはMann-Whitney U-検定を用いて、２群間の有意差を評価した。Fisherの正確確率検定又はカイ二乗検定を用いて、カテゴリー変数を比較した。すべての検定について、P<0.05の数値を統計学的に有意であるとみなした。２つのパラメータ間の統計学的相関を評価するため、最小二乗法を用いて単回帰・単相関を計算し、結果をPearsonの相関係数で表現した。一元配置分散分析（ANOVA）を用いて３群間の有意差を検出した。Benjamini-Hochberg法を用いてq値を算出し、多重比較のp値を調整した。３０名のＣＡＤ患者と３０名の対照からのデータのクラスタリングは、Arthritis Rheumatol. 68, 2646-2661 (2016) に記載されるようにして、属レベルで実施した。
結果
ＣＡＤ患者における腸内細菌叢プロファイル
　３０名のＣＡＤ患者、並びに年齢及び性別が合致する、高血圧、糖尿病もしくは脂質異常症等の冠状動脈のリスクファクターを有する３０名の非ＣＡＤ患者を、被験者として募集採用した。糞便サンプルにおける１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子シーケンシングを用い、これらの被験者の腸内細菌プロファイルを詳細に比較した。被験者の背景を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　被験者の腸内細菌プロファイルを解析すべく、既報（Nature. 473, 174-180 (2011)）の手順に従い、サンプルを属レベルで３つのクラスターに分類した（図１ａ）各クラスターは、以下に示す特定の属が豊富に存在することによって特徴づけられた（図１ｂ）。
　クラスター１：バクテロイデス属
　クラスター２：プレボテラ属
　クラスター３：フィーカリバクテリウム属、ルミノコッカス属又はビフィドバクテリウム属
　非ＣＡＤ対照は、クラスター１により多くカテゴライズされたのに対し、ＣＡＤ患者はほとんどこのクラスターにカテゴライズされなかった（図１ｃ）。α多様性、バクテロイデス門／ファーミキューテス門比、グラム陽性菌／グラム陰性菌比及び糞便中短鎖脂肪酸濃度は両群間で有意差はなかった。ＣＡＤ群と非ＣＡＤ群との間で、属及び種レベルで存在量を網羅的に比較した結果、バクテロイデス属の相対存在量が、対照に比べてＣＡＤ患者において低い傾向にあることが分かった（図１ｄ）。主成分解析の結果、両群は腸内マイクロバイオームの主要種の存在量が異なっており、ＣＡＤ患者では、バクテロイデス・ブルガタスとバクテロイデス・ドレイが相対的に減少し、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ及びプレボテラ・コプリが富化していることが明らかとなった（図６）。以前の報告で、動脈硬化症患者においてバクテロイデス属の存在量が低いことが示されているのを考慮し、本発明者らは、バクテロイデス種であるバクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイに焦点を当てた。これらの種は、抗炎症応答に関与し（Cell. 165, 842-853 (2016)）、バクテロイデス属の中で最も豊富に存在する種であり（図１ｅ）、それらの存在量はＣＡＤ患者において有意に低かった（図１ｆ）。これら２種は類似の１６Ｓ ｒＲＮＡシーケンシングパターンを有するため（Int J Syst Evol Microbiol. 56, 1639-1643 (2006)）、本発明者らが用いた方法論では両者を区別できなかった。そこで、本発明者らは、動脈硬化の傾向を示すマウスにバクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイを経口摂取させたマウスモデルを構築し、それを用いて、これらの種と動脈硬化との因果関係を確認し、その根底にあるメカニズムを解明しようとした。
バクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイの生菌の経口摂取は動脈硬化性プラークの形成を抑制する
　動脈硬化の発症に及ぼすバクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイの効果を判定すべく、６週齢の雌性アポリポタンパク質Ｅ欠損（Ａｐｏｅ－／－））マウスに、１週間あたり５回、１０週間バクテロイデス・ブルガタスATCC 8482T株及びバクテロイデス・ドレイDSM 17855T株の生菌又は加熱死菌を経口摂取させた。対照マウスには、同じプロトコルに従ってビヒクル（培地）のみを与えた。１６週齢時にマウスを安楽死させ、いくつかの分析を行って動脈硬化及び腸内細菌叢を評価した。対照マウスに比べて、バクテロイデス属の生菌を経口摂取したマウスは、体重（図２ｆ）又は血漿コレステロールレベル（図２ｇ）に有意な差はなかったが、大動脈基部及び胸部大動脈のｅｎ ｆａｃｅ解析において、病変サイズが有意に減少した（図２ａ、ｂ）。加熱殺菌したバクテロイデス属を経口摂取したマウスでは、対照マウスに比べて動脈硬化病変サイズに有意差は認められなかった。さらに、大動脈洞における動脈硬化病変の免疫組織染色とその後の形態学的解析の結果、対照と比較して、バクテロイデス属を経口摂取したマウスにおいて、マクロファージ及びＣＤ４陽性Ｔ細胞が顕著に減少することが明らかとなった（図２ｃ、ｄ）。次に、マウスの動脈硬化性大動脈における免疫細胞マーカー及びケモカイン／ケモカイン受容体のｍＲＮＡ発現を評価すべく、定量的ＲＴ－ＰＣＲ解析を実施した。その結果、いくつかのアテローム形成性の免疫細胞マーカー及びケモカイン／ケモカイン受容体が、バクテロイデス属を経口摂取したマウスで減少していた（図２ｅ）。これらの結果は、経口摂取による生きたバクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイの補充がプラークの炎症を低減し、それによって動脈硬化病変の形成を抑制することを示唆するものである。
　マウス糞便サンプルの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子シーケンシングの結果、バクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイの経口摂取に応答して、腸内細菌叢の組成が大きく変化することが明らかとなった（図７ａ、ｂ）。さらに、腸内細菌の多様性は、対照マウスで低下していたが、生きたバクテロイデス属を経口摂取したマウスでは維持されていた（図７ｃ）。驚くべきことに、グラム陽性菌／グラム陰性菌比は、対照マウスよりも生きたバクテロイデス属を経口摂取したマウスにおいて高い傾向があった（図７ｄ）。バクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイの存在量は、生きたバクテロイデス属を経口摂取したマウスにおいて大幅に高かった（図７ｅ）。
生きたバクテロイデス処理により結腸リポ多糖（ＬＰＳ）レベルは低下した結果、腸管及び全身の免疫応答が低下した
　本発明者らは以前、腸管免疫応答の調節により動脈硬化を予防し得ることを報告していたので（Circulation. 120, 1996-2005 (2009);.Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30, 2495-2503 (2010)）、バクテロイデス処理がプラーク形成を減少させるメカニズムを調べるために、本発明者らはまず、バクテロイデス・ブルガタスATCC 8482T株及びバクテロイデス・ドレイDSM 17855T株の経口摂取の腸管免疫に及ぼす影響を試験した。その結果、対照マウスと比べて、バクテロイデス属を経口摂取したマウスでは、ある特定の抗原提示細胞マーカー（ＣＤ１１ｃ、共刺激分子ＣＤ８０）及び炎症誘発性サイトカインの結腸におけるｍＲＮＡ発現が実質的に低下していた（図３ａ、ｂ）さらに、腸管固有層から腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）への抗原提示細胞の移動に決定的に重要なＣＣＲ７のｍＲＮＡ発現が、バクテロイデス属を経口摂取したマウスにおいて有意に低下していた（図３ａ）。そこで、本発明者らは次に、ＭＬＮにおける自然免疫応答を試験した。ＭＬＮのフローサイトメトリー解析により、バクテロイデス属を経口摂取したマウスでは、ＣＤ１１ｃ高発現細胞の存在量が有意に低いだけでなく、ＣＤ１１ｃ高発現細胞におけるＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）、ＭＨＣクラスＩＩ及びＣＤ８０の発現も有意に低下していた（図３ｃ）。ＭＬＮにおけるサイトカインｍＲＮＡの発現もまた、対照マウスよりもバクテロイデス属を経口摂取したマウスにおいて低い傾向にあった（図３ｄ）。これらの結果は、生きたバクテロイデス処理がＴＬＲ４発現の下方制御と関連した抗原提示細胞の活性化阻害を通じて、腸管免疫応答を抑制することを示唆している。
　ＬＰＳは、ＴＬＲ４を通じて細胞を刺激し、抗原提示細胞上の共刺激分子を上方制御するので、本発明者らは、腸内細菌叢による結腸ＬＰＳ産生の指標として、糞便中ＬＰＳレベルを測定した。驚くべきことに、糞便中ＬＰＳレベルは、対照マウスよりも、バクテロイデス属を経口摂取したマウスにおいて劇的に低かった（図３ｅ）。さらに、本発明者らは、糞便上清を用いてインビトロ刺激アッセイを行い、生きたバクテロイデス属処理後の結腸ＬＰＳ濃度の低下が結腸の炎症レベルに直接反映されているか否かを調べた。ＲＡＷ２６４．７マクロファージを糞便上清で刺激したところ、バクテロイデス属を経口摂取したマウス由来の糞便上清で処理した細胞の増殖が有意に阻害された（図８ａ）。さらに、ＬＰＳ／ＴＬＲ４シグナルが結腸の炎症を制御する主要経路であるか否かを検証すべく、ｓｉＲＮＡを導入してＴＬＲ４をノックダウンしたＲＡＷ２６４．７マクロファージを作製し、該細胞を糞便上清で刺激した。その結果、非特異的ｓｉＲＮＡの導入により、炎症誘発性サイトカインＩＬ－１ｂ、ＩＬ－６及びＴＮＦ－αの分泌は、対照マウス由来の糞便上清で処理したＲＡＷ２６４．７マクロファージよりも、生きたバクテロイデス属で処理したマウス由来の糞便上清で処理したマクロファージにおいて顕著に低下した。ＴＬＲ ｓｉＲＮＡを導入したＲＡＷ２６４．７マクロファージは、非常に少量の炎症誘発性サイトカインしか分泌せず、非特異的ｓｉＲＮＡを導入したＲＡＷ２６４．７マクロファージと比べて有意に低かった（図８ｂ）。これらの知見は、結腸ＬＰＳ濃度が、ＬＰＳ／ＴＬＲ４依存性シグナリングを介して結腸の炎症を制御していることを示唆している。
　エンドトキシン血症は全身性の炎症を惹起し、自然免疫及び適応免疫の破綻と動脈硬化の発症を引き起こすことが知られている（Nat Commun.7, 13436 (2016); Circulation. 133, 2434-2446 (2016); Nat Immunol. 12, 204-212 (2011)）。実際に、対照マウスと比べて、バクテロイデス属で処理したマウスでは、血漿ＬＰＳ濃度が有意に低下し（図３ｆ）、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１７Ａ、ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－α等のアテローム形成性サイトカインの血漿中濃度も低下していた（図３ｇ）。さらに、本発明者らは、脾細胞のフローサイトメトリーアッセイを通じて、これらのサイトカインのソースを調べた。その結果、ＣＤ１１ｂ高発現・Ｆ４／８０高発現マクロファージ、ＣＤ１１ｂ高発現・Ｌｙ６Ｇ高発現好中球及びＣＤ１１ｃ高発現樹状細胞の割合は２群間で有意差はなかったが（図９ａ）、バクテロイデス属を経口摂取したマウスは、ＭＨＣクラスＩＩと共刺激分子ＣＤ８６の発現低下、並びに脾ＣＤ１１ｃ高発現樹状細胞上での共阻害分子ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ ｌｉｇａｎｄ １（ＰＤ－Ｌ１）及びＰＤ－Ｌ２の発現上昇を認めた（図９ｂ）。脾ＣＤ１１ｃ高発現樹状細胞上でのＴＬＲ４発現は２群間で有意差はなかった。樹状細胞の高度な寛容原性と一致して、生きたバクテロイデス属で処理したマウスでは、ＣＤ４陽性Ｔ細胞数もまた低下していた（図９ｃ）。生きたバクテロイデス属を経口摂取したマウスでは、エフェクターＣＤ４４高発現・ＣＤ６２Ｌ低発現・ＣＤ４陽性Ｔ細胞の数が低下していたが、高レベルの細胞内ＣＴＬＡ４を有するＣＤ４陽性・ＣＤ２５陽性・Ｆｏｘｐ３陽性制御性Ｔ細胞の割合は有意に高かった（図９ｄ、ｅ）。このことは、免疫バランスが抑制方向にシフトしていることを示す。これらのデータは、全身性の自然免疫細胞の活性化と、動脈硬化の発症機序に関与するＴｈ１駆動性炎症の抑制が、生きたバクテロイデス属処理により誘起される血漿ＬＰＳ濃度の低下により引き起こされることを示唆している。
生きたバクテロイデス処理はインビトロ及びインビボで腸バリアを強化した
　腸の漏出性に続いて腸内細菌叢組成が変化するとエンドトキシン血症や動脈硬化を促進するので（Circulation. 133, 2434-2446 (2016)）、本発明者らは次に、生きたバクテロイデス属処理が腸のタイトジャンクション透過性に効果があるか否かを調査した。その結果、バクテロイデス・ブルガタスATCC 8482T株及びバクテロイデス・ドレイDSM 17855T株を経口摂取したマウスは、対照マウスに比べて、ＦＩＴＣ標識デキストランの腸透過性の有意な低下（図４ａ）と、タイトジャンクション遺伝子ｚｏ１のｍＲＮＡ発現の有意な上昇（図４ｂ）を示し、それは結腸におけるＺＯ－１の平均蛍光強度の上昇（図４ｃ）に反映されていた。これらのデータは、生きたバクテロイデス属処理が、対照マウスにおける状態と比べて、タイトジャンクションのバリアを強化することを示している。結腸ＬＰＳ濃度の変化がタイトジャンクション形成に影響があるか否かを明らかにするため、本発明者らは、糞便上清を用いて、上皮細胞の形態を有するＨＴ２９ヒト結腸直腸腺がん細胞を刺激した。その結果、インビボでの結果と一致して、対照マウス由来の糞便上清で刺激したＨＴ２９細胞よりも、生きたバクテロイデス属で処理したマウス由来の糞便上清で刺激したＨＴ２９細胞において、（ｍＲＮＡ及びタンパク質レベルで）有意に高いｚｏ１（ＺＯ－１）の発現レベルが観察された（図４ｄ、ｅ）。これらの結果は、腸内細菌叢により誘起される結腸ＬＰＳ濃度の変化が、タイトジャンクションを介した傍細胞透過性に直接影響する可能性を示唆している。
糞便中ＬＰＳレベルはＣＡＤ患者において上昇していた
　ＣＡＤ発生率とヒトにおける腸内細菌によるＬＰＳ産生との関係をさらに調査すべく、本発明者らは、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子シーケンシングに用いたのと同じ糞便サンプルにおけるＬＰＳレベルを測定した。その結果、ＣＡＤ患者における糞便中ＬＰＳレベルは、非ＣＡＤ対照におけるレベルより有意に高かった（図５ａ）。興味深いことに、バクテロイデス種の存在量は、糞便中ＬＰＳレベルと有意に負相関していた（Ｒ＝－０．３０，Ｐ＝０．０２３）。さらに、糞便中ＬＰＳレベルとバクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイの％存在量との間に有意な負相関が認められた（Ｒ＝－０．２９，Ｐ＝０．０２７）（図５ｂ）。これらの結果は、バクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイが腸内細菌によるＬＰＳ産生を制御しており、それらの活性がヒトにおける動脈硬化の進展に影響を及ぼし得ることを強く示唆している。
比較例　バクテロイデス・ブルガタス又はバクテロイデス・ドレイの単独投与は動脈硬化マウスモデルの症状及び腸内ＬＰＳレベルを有意に改善しなかった
　上記２菌種併用投与の場合と同様の方法により、Ａｐｏ－／－マウスにバクテロイデス・ブルガタスATCC 8482T株又はバクテロイデス・ドレイDSM 17855T株をそれぞれ単独で経口摂取させた。
　結果を図１０に示す。いずれの単独投与群でも、対照（ビヒクル投与）群と比較して、大動脈洞における動脈硬化病変は改善傾向にあったが、有意差はみとめられなかった。さらに、糞便中（腸内）ＬＰＳレベルはいずれの菌種の単独投与によっても低下しなかった。バクテロイデス・ドレイ単独投与群では、大腸のタイトジャンクション関連遺伝子の発現が対照群に比べて増大傾向にあり、バクテロイデス・ブルガタス単独投与群では、大腸でのサイトカイン遺伝子の発現が対照群に比べて低下していたが、血中サイトカイン濃度については、いずれの投与群でも有意な差は認められなかった。
　以上の結果は、バクテロイデス・ブルガタスとバクテロイデス・ドレイとは、それぞれが異なる作用機序により、腸内に共存した場合にそれらの効果が相乗的に作用して、顕著なＬＰＳ制御性を発揮することを示唆している。
バクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイの種々の組み合わせは、いずれも動脈硬化マウスモデルにおける腸内ＬＰＳレベルを改善した
　それぞれの菌の組み合わせ（生菌２．５×１０９　ＣＦＵ／１００μｌずつ）を、Ａｐｏｅ－／－♀マウスあるいＡｐｏｅ－／－♂マウスに、それぞれ週５回経口投与した。Ａｐｏｅ－／－♀マウスには、６週齢～１６週齢まで１０週間投与して、１６週齢の糞便中ＬＰＳを測定した。Ａｐｏｅ－／－♂マウスには６週齢～１３週齢まで７週間投与して、１３週齢の糞便中ＬＰＳを測定した。
　結果を図１２に示す。基準株（ｖ，ｄ）だけでなく、ＮＴ株（Ｎｖ，Ｎｄ）も糞便中ＬＰＳ量を低下させた。
動脈硬化マウスモデルにおいて、生きたバクテロイデス処理は腸内ＬＰＳレベルを改善した
　バクテロイデス・ブルガタスATCC8482T及びバクテロイデス・ドレイDSM 17855Tの菌の組み合わせ（生菌あるいは死菌。生菌として２．５×１０９　ＣＦＵ／１００μｌずつ）を、Ａｐｏｅ－／－♀マウスにそれぞれ週５回経口投与した。６週齢～１６週齢まで１０週間投与して、１６週齢の糞便中及び盲腸便中のＬＰＳを測定した。また、５週齢～６週齢までＡＶＮＭ（アンピシリン，バンコマイシン，ネオマイシン，メトロニダゾール）投与して、６週齢の糞便中ＬＰＳを測定した。
　結果を図１３に示す。図中右側及び左側が、バクテロイデス処理したＡｐｏｅ－／－♀マウスの、それぞれ糞便中及び盲腸便中ＬＰＳレベルを示す。また、図中中央は、抗生物質を投与したＡｐｏｅ－／－♀マウスの糞便中ＬＰＳレベルを示す。糞便中及び盲腸便中にて、生菌投与の場合ＬＰＳ量が低下したが、死菌投与の場合はコントロール（ＮＣ）と変化は無かった。
肥満マウスモデルにおいて、バクテロイデス処理は肥満の諸症状を改善した
　Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ♂マウスに６週齢～１８週齢の１２週間、週５回投与した。ＮＣ群は通常食を投与し、Ｃｔｒｌ群は高脂肪食ＨＦＤ（オリエンタル酵母工業製；６０％脂肪を含む）及びバクテロイデス・ブルガタスあるいはバクテロイデス・ドレイを培養する際に用いる液体培地を２００μｌ／回経口投与し、Ｂ群は高脂肪食及び生菌バクテロイデス・ブルガタスATCC8482T及び生菌バクテロイデス・ドレイDSM 17855Tを投与し、ＮＢ群は高脂肪食及び生菌バクテロイデス・ブルガタスNTZ002株及び生菌バクテロイデス・ドレイNTZ001株を投与した（図１４－１Ａ）。
　その結果、高脂肪食に加えて基準株の２菌（Ｂ）あるいはＮＴ株の２菌（ＮＢ）を投与した方が、Ｃｔｒｌ群と比較して体重増加が抑制された（図１４－１Ｂ，Ｃ）。
　１ｇ ＯＧＴＴ試験を実施したところ、基準株の２菌（Ｂ）あるいはＮＴ株の２菌（ＮＢ）を投与した方が、負荷後の血糖値の急激な上昇が抑えられ（図１４－１Ｄ左）、ＡＵＣ値が低く（図１４－１Ｄ中央）、インスリン抵抗性（ＨＯＭＡ－ＩＲ）が低く（図１４－１Ｄ右）、耐糖能の改善が確認できた。
　精巣上体脂肪をＨＥ染色、ＭＡＣ３染色、あるいはシリウスレッド染色したところ（図１４－２Ｅ左）、基準株の２菌（Ｂ）あるいはＮＴ株の２菌（ＮＢ）を投与した方が、脂肪細胞の大きさが小さく、王冠様構造の数が少なく、繊維形成率が少なかった（図１４－２Ｅ右）。
　内臓脂肪（精巣上体周囲脂肪）のｍＲＮＡ量を測定したところ、基準株の２菌（Ｂ）あるいはＮＴ株の２菌（ＮＢ）を投与した方が、炎症細胞マーカーであるＭＣＰ１、Ｆ４／８０、ｉＮＯＳ、ＣＣＲ５、ＴＬＲ４のｍＲＮＡ発現はＣｔｒｌ群と比べて低下し（図１４－２Ｆ左）、Ｆｉｚｚｉ１（Ｍ２マクロファージマーカーで高い方が抗炎症とされている）のｍＲＮＡ発現量は増加傾向であった（図１４－２Ｆ左）。さらに、サイトカインＩＦＮγ及びＴＮＦαのｍＲＮＡ発現は低下した（図１４－２Ｆ右）。
ＮＡＳＨマウスモデルにおいて、バクテロイデス処理はＮＡＳＨの諸症状を改善した
　Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ♂マウスに８週齢～１７週齢の間、週５回投与した。Ｃｔｒｌ群は餌として超高脂肪コリン欠乏メチオニン減量食（ＥＰＳ益新株式会社製ＮＡＳＨモデル作製用飼料）を投与、Bacteroides群はさらに生菌バクテロイデス・ブルガタスATCC8482T及び生菌バクテロイデス・ドレイDSM 17855Tを投与した。
　１７週齢で解剖し、肝臓をＨＥ染色した結果、Ｃｔｒｌ群では脂肪肝と炎症細胞浸潤と肝細胞の風船様腫大を認めたが、基準株の２菌投与群では炎症細胞浸潤が著明に抑制され、風船様腫大は認めなかった（図１５－１上）。基準株の２菌投与群ではさらにＮＡＦＬＤ活動性スコア（ＮＡＳ）の改善、血中ＡＳＴ、ＡＳＴ／ＡＬＴ比の有意な低下を認め、肝障害が著明に抑制された（図１５－１中央、下、及び図１５－２）。
　本発明を好ましい態様を強調して説明してきたが、好ましい態様が変更され得ることは当業者にとって自明である。
　ここで述べられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
　本出願は、2018年2月9日付で日本国に出願された特願2018-022578を基礎としており、ここで言及することにより、その内容はすべて本明細書に包含されるものである。
　本発明の組み合わせ物は、動脈硬化をはじめとする循環器系疾患や、慢性炎症を伴う疾患、糖脂質代謝等の代謝異常を伴う代謝性疾患の予防及び／又は改善のための医薬もしくは機能性食品として有用である。また、本発明の検査方法及び検査薬は、糞便中のマイクロバイオーム解析を通じて、前記疾患の診断・発症リスク予測を可能とすることから、非侵襲性の臨床検査手法を提供する点で有用である。

Claims (17)

  1. 　（１）天然より分離されたバクテロイデス・ブルガタスの生菌を含む組成物と、
    （２）天然より分離されたバクテロイデス・ドレイの生菌を含む組成物と
    の組み合わせ物。
  2. 　前記（１）の組成物と前記（２）の組成物とが同一物である、請求項１に記載の組み合わせ物。
  3. 　医薬品又は医薬品添加物である、請求項１又は２に記載の組み合わせ物。
  4. 　食品もしくは飼料又はそのための添加物である、請求項１又は２に記載の組み合わせ物。
  5. 　血中又は腸内リポ多糖レベルの亢進と関連する疾患の予防及び／又は改善のための、請求項１～４のいずれか一項に記載の組み合わせ物。
  6. 　前記疾患が循環器系疾患、炎症性疾患又は代謝性疾患である、請求項５に記載の組み合わせ物。
  7. 　前記疾患が、心房細動、心不全、虚血性心疾患、心筋梗塞、狭心症、高血圧症、動脈硬化症、大動脈瘤、大動脈解離、閉塞性動脈硬化症、大動脈弁狭窄症からなる群より選択される循環器系疾患である、請求項５に記載の組み合わせ物。
  8. 　前記疾患が、肝炎、非アルコール性脂肪肝炎、脂肪肝、肝癌、腸管炎症、過敏性腸症候群、胃炎、膠原病、慢性関節リウマチ、慢性腎炎、IgA腎症、気管支喘息、間質性肺炎、薬剤性肺障害、好酸球性肺浸潤症候群、非定型性抗酸菌症、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎及び敗血症からなる群より選択される炎症性疾患である、請求項５に記載の組み合わせ物。
  9. 　前記疾患が、糖尿病、肥満、メタボリックシンドローム、生活習慣病、脂質異常症及び骨粗鬆症からなる群より選択される代謝性疾患である、請求項５に記載の組み合わせ物。
  10. 　天然より分離されたバクテロイデス・ブルガタスの生菌と、天然より分離されたバクテロイデス・ドレイの生菌とを経口摂取することを含む、血中又は腸内リポ多糖レベルの亢進と関連する疾患の予防及び／又は改善方法。
  11. 　前記疾患が循環器系疾患、炎症性疾患又は代謝性疾患である、請求項１０に記載の方法。
  12. 　被験者の腸内細菌叢におけるバクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイの存在量を測定することを含む、血中又は腸内リポ多糖レベルの亢進と関連する疾患の検査方法。
  13. 　前記疾患が循環器系疾患、炎症性疾患又は代謝性疾患である、請求項１２に記載の方法。
  14. 　（１）配列番号１又は２で表されるヌクレオチド配列と９８％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、及び
    （２）配列番号３又は４で表されるヌクレオチド配列と９８％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子
    を検出することを含む、請求項１２又は１３に記載の方法。
  15. 　バクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を検出し得るプライマーセット又はプローブを含む、血中又は腸内リポ多糖レベルの亢進と関連する疾患の発症リスクの検査用試薬。
  16. 　前記疾患が循環器系疾患、炎症性疾患又は代謝性疾患である、請求項１５に記載の試薬。
  17. 　１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子が、
    （１）配列番号１又は２で表されるヌクレオチド配列と９８％以上の同一性を有するヌクレオチド配列、及び
    （２）配列番号３又は４で表されるヌクレオチド配列と９８％以上の同一性を有するヌクレオチド配列
    を含む、請求項１５又は１６に記載の試薬。
PCT/JP2019/004763 2018-02-09 2019-02-08 リポ多糖制御性腸内細菌及びその用途 WO2019156251A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2019571188A JP7325106B2 (ja) 2018-02-09 2019-02-08 リポ多糖制御性腸内細菌及びその用途
US16/968,376 US11730772B2 (en) 2018-02-09 2019-02-08 Lipopolysaccharide-regulated enteric bacteria and use thereof
EP19750410.3A EP3750548A4 (en) 2018-02-09 2019-02-08 LIPOPOLYSACCHARIDE-REGULATED ENTERIC BACTERIA AND THEIR USES
CN201980012489.5A CN112105371A (zh) 2018-02-09 2019-02-08 脂多糖控制性肠道细菌及其用途

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2018022578 2018-02-09
JP2018-022578 2018-02-09

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2019156251A1 true WO2019156251A1 (ja) 2019-08-15

Family

ID=67549689

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2019/004763 WO2019156251A1 (ja) 2018-02-09 2019-02-08 リポ多糖制御性腸内細菌及びその用途

Country Status (5)

Country Link
US (1) US11730772B2 (ja)
EP (1) EP3750548A4 (ja)
JP (1) JP7325106B2 (ja)
CN (1) CN112105371A (ja)
WO (1) WO2019156251A1 (ja)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022025222A1 (ja) 2020-07-30 2022-02-03 Ｎｏｓｔｅｒ株式会社 細菌提供システム
CN114807118A (zh) * 2022-02-16 2022-07-29 上海长岛抗体诊断试剂有限公司 从粪便提取肠上皮细胞dna的方法
WO2022191182A1 (ja) * 2021-03-08 2022-09-15 学校法人順天堂 炎症抑制作用を有する組成物及び改善剤
WO2023100745A1 (ja) * 2021-12-02 2023-06-08 礼子 新藏 免疫賦活化組成物

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110699468B (zh) * 2019-10-29 2023-05-02 圣湘生物科技股份有限公司 检测人肠道细菌的组合物、试剂盒及方法
CN113186124B (zh) * 2021-04-08 2022-07-01 江南大学 一株能够缓解由脂多糖引起的急性肠道损伤的普通拟杆菌
CN114053310B (zh) * 2022-01-17 2022-08-26 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 普通拟杆菌益生菌cgmcc no.17140在制备降脂药物中的应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH04330016A (ja) * 1991-05-01 1992-11-18 Rikagaku Kenkyusho 過酸化脂質低下剤
WO2012142605A1 (en) * 2011-04-15 2012-10-18 Samaritan Health Services Rapid recolonization deployment agent
CN104546942A (zh) * 2014-09-30 2015-04-29 深圳华大基因科技有限公司 多氏拟杆菌在治疗或预防类风湿性关节炎或其相关疾病中的应用
WO2017160711A1 (en) * 2016-03-14 2017-09-21 Holobiome, Inc. Modulation of the gut microbiome to treat mental disorders or diseases of the central nervous system
JP2018022578A (ja) 2016-08-02 2018-02-08 パナソニックＩｐマネジメント株式会社 基板挿入装置

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130195802A1 (en) 2010-06-01 2013-08-01 Moore Research Enterprises Llc Cellular Constituents From Bacteroides, Compositions Thereof, and Therapeutic Methods Employing Bacteroides or Cellular Constituents Thereof
AU2014232370B2 (en) * 2013-03-15 2018-11-01 Seres Therapeutics, Inc. Network-based microbial compositions and methods
MA41020A (fr) * 2014-11-25 2017-10-03 Evelo Biosciences Inc Compositions probiotiques et prébiotiques, et leurs procédés d'utilisation pour la modulation du microbiome
WO2018152306A1 (en) * 2017-02-15 2018-08-23 President And Fellows Of Harvard College Modulation of host immune cell populations using gut microbiota

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH04330016A (ja) * 1991-05-01 1992-11-18 Rikagaku Kenkyusho 過酸化脂質低下剤
WO2012142605A1 (en) * 2011-04-15 2012-10-18 Samaritan Health Services Rapid recolonization deployment agent
CN104546942A (zh) * 2014-09-30 2015-04-29 深圳华大基因科技有限公司 多氏拟杆菌在治疗或预防类风湿性关节炎或其相关疾病中的应用
WO2017160711A1 (en) * 2016-03-14 2017-09-21 Holobiome, Inc. Modulation of the gut microbiome to treat mental disorders or diseases of the central nervous system
JP2018022578A (ja) 2016-08-02 2018-02-08 パナソニックＩｐマネジメント株式会社 基板挿入装置

Non-Patent Citations (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"GenBank", Database accession no. NR_074515
"Molecular ecological detection and identification of intestinal microflora", 2000, pages: 109 - 121
"Ordinance for Enforcement of Health Promotion Act", 30 April 2003, ORDINANCE OF THE MINISTRY OF HEALTH, LABOUR AND WELFARE OF JAPAN
APPL ENVIRON MICROBIOL, vol. 71, 2005, pages 4153 - 4155
APPL ENVIRON MICROBIOL., vol. 73, 2007, pages 5261 - 5267
APPLEID AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, vol. 63, 1997, pages 2802 - 2813
ARTERIOSCLER THROMB VASC BIOL., vol. 30, 2010, pages 2495 - 2503
ARTHRITIS RHEUMATOL., vol. 68, 2016, pages 2646 - 2661
AUSTIN G.DAVIS-RICHARDSON, ALEXANDRIA N .ARDISSONE, RAQUEL DIAS, VILLE SIMELL, MICHAEL T. LEONARD, KAISA M.KEMPPAINEN, JENNIFER C.: "Bacteroides dorei dominates gut microbiome prior to autoimmunity in Finnish children at high risk for type 1 diabetes", FRONTIERS IN MICROBIOLOGY, vol. 5, 678, 10 December 2014 (2014-12-10), pages 1 - 11, XP055629405, DOI: 0.3389/fmicb.2014.00678 *
BIOINFORMATICS, vol. 26, 2010, pages 2460 - 2461
BIOINFORMATICS, vol. 30, 2014, pages 2114 - 2120
BMC MICROBIOL., vol. 16, 2016, pages 9
CIRCULATION, vol. 120, 2009, pages 1996 - 2005
CIRCULATION, vol. 133, 2016, pages 2434 - 2446
CIRCULATION., vol. 133, 2016, pages 2434 - 2446
DNA RES., vol. 21, 2014, pages 217 - 227
EMOTO, T. ET AL., HEART VESSELS, vol. 32, 2017, pages 39 - 46
EMOTO, T. ET AL., J ATHEROSCLER THROMB., vol. 23, 2016, pages 908 - 921
FEMS MICROBIOLOGY ECOLOGY, vol. 68, 2009, pages 351 - 362
GUT., vol. 63, 2014, pages 1069 - 1080
INT J SYS EVOL MICROBIOL., vol. 56, 2006, pages 1639 - 1643
INT J SYST EVOL MICROBIOL., vol. 56, 2006, pages 1639 - 1643
J. SAMBROOK ET AL.: "Molecular Cloning", 1989, COLD SPRING HARBOR LAB. PRESS
JIE, Z. ET AL., NAT COMMUN., vol. 18, 2017, pages 845
KASAHARA, K. ET AL., J LIPID RES., vol. 58, 2017, pages 519 - 528
KEN-ICHI HIRATA, TOMOYA YAMASHITA: "3) Gut Microbiota and Cardiovascular Disease", THE JOURNAL OF THE JAPANESES SOCIETY OF INTERNAL MEDICINE, vol. 105, no. 9, 1 January 2016 (2016-01-01), pages 1706 - 1711, XP055732663, ISSN: 0021-5384, DOI: 10.2169/naika.105.1706 *
METHODS IN ENZYMOL., vol. 70, 1980, pages 419 - 439
NAOFUMI YOSHIDA, TAKUO EMOTO, TOMOYA YAMASHITA, HIKARU WATANABE, TOMOHIRO HAYASHI, TOKIKO TABATA, NAMIKO HOSHI, NAOYA HATANO, G: "Bacteroides vulgatus and Bacteroides dorei Reduce Gut Microbial Lipopolysaccharide Production and Inhibit Atherosclerosis", CIRCULATION, vol. 138, no. 22, 27 November 2018 (2018-11-27), pages 2486 - 2498, XP055629408, ISSN: 0009-7322, DOI: 10.1161/CIRCULATIONAHA.118.033714 *
NAT COMMUN., vol. 7, 2016, pages 13436
NAT IMMUNOL., vol. 12, 2011, pages 204 - 212
NAT METH., vol. 10, 2013, pages 996 - 998
NATURE, vol. 473, 2011, pages 174 - 180
PATEL, P.N. ET AL., ARTERIOSCLER. THROMB. VASE. BIOL., vol. 35, 2015, pages 525 - 534
PLOS ONE, vol. 7, 2012, pages e47713
RUNE M PEDERSEN; EA S MARMOLIN; ULRIK S JUSTESEN: "Species differentiation of Bacteroides dorei from Bacteroides vulgatus and Bacteroides ovatus from Bacteroides xylanisolvens - Back to basics", ANAEROBE, vol. 24, 28 August 2013 (2013-08-28), pages 1 - 3, XP055093129, ISSN: 1075-9964, DOI: 10.1016/j.anaerobe.2013.08.004 *
SCIENCE, vol. 307, 2005, pages 1915 - 1920
See also references of EP3750548A4
SYST APPL MICROBIOL., vol. 31, 2008, pages 241 - 250
TAKUO EMOTO , TOMOYA YAMASHITA , MAOTO SASAKI , YUSHI HIROTA , TOMOHIRO HAYASHI ,ANNA SO , KAZUYKI KASAHARA , KEIKO YODOI , TAKUYA: "Analysis of Gut Microbiota in Coronary Artery Disease Patients: a Possible Link between Gut Microbiota and Coronary Artery Disease", JOURNAL OF ATHEROSCLEROSIS AND THROMBOSIS , vol. 23, no. 8, 1 January 2016 (2016-01-01), pages 908 - 921, XP055629403, ISSN: 1340-3478, DOI: 10.5551/jat.32672 *
VATANEN, T. ET AL., CELL, vol. 165, 2016, pages 842 - 853

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022025222A1 (ja) 2020-07-30 2022-02-03 Ｎｏｓｔｅｒ株式会社 細菌提供システム
WO2022191182A1 (ja) * 2021-03-08 2022-09-15 学校法人順天堂 炎症抑制作用を有する組成物及び改善剤
WO2023100745A1 (ja) * 2021-12-02 2023-06-08 礼子 新藏 免疫賦活化組成物
CN114807118A (zh) * 2022-02-16 2022-07-29 上海长岛抗体诊断试剂有限公司 从粪便提取肠上皮细胞dna的方法

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2019156251A1 (ja) 2021-02-18
JP7325106B2 (ja) 2023-08-14
CN112105371A (zh) 2020-12-18
US11730772B2 (en) 2023-08-22
US20200390828A1 (en) 2020-12-17
EP3750548A1 (en) 2020-12-16
EP3750548A4 (en) 2021-10-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7325106B2 (ja) リポ多糖制御性腸内細菌及びその用途
Zhang et al. Akkermansia muciniphila is a promising probiotic
Crost et al. Ruminococcus gnavus: friend or foe for human health
US11903980B2 (en) Composition for diagnosis and treatment of alcoholic liver disease, using change in short-chain fatty acid producing gut bacterial community
JP2022000040A (ja) 代謝障害を処置するための低温殺菌アッカーマンシアの使用
Martín et al. Faecalibacterium: a bacterial genus with promising human health applications
US20150104423A1 (en) Use of blood group status iii
TWI572354B (zh) 抑制發炎之組成物
JP5401733B2 (ja) プロバイオティクス及びシンバイオティックとしてのラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ）の使用
US20120020941A1 (en) Use of blood group status iii
WO2012013861A2 (en) Use of blood group status iii
KR20210091119A (ko) 장내세균 불균형을 감소시키는 방법 및 마이크로바이옴을 회복시키는 방법
Liu et al. Limosilactobacillus reuteri and Lacticaseibacillus rhamnosus GG differentially affect gut microbes and metabolites in mice with Treg deficiency
Berthelot et al. Contribution of mycobiota to the pathogenesis of spondyloarthritis
Gresse et al. Pathogen challenge and dietary shift alter microbiota composition and activity in a mucin-associated in vitro model of the piglet colon (MPigut-IVM) simulating weaning transition
Zhou et al. High-fructose corn syrup aggravates colitis via microbiota dysbiosis-mediated Th17/Treg imbalance
Toward et al. Immunosenescence and the gut microbiota: the role of probiotics and prebiotics
WO2023068279A1 (ja) ブラウチア（Ｂｌａｕｔｉａ）属細菌のスクリーニング方法
WO2021221110A1 (ja) Ｔｈ１細胞及び／又はＴｈ１７細胞の増殖又は活性化を誘導する小腸内細菌
EP2580343B1 (en) Use of abo type in a method for tailoring a bacterial composition
Coleman et al. Dysbiosis of the intestinal microbiota and colorectal cancer
Zhu et al. Nanoparticles alleviate non-alcoholic steatohepatitis via ER stress sensor-mediated intestinal barrier damage and gut dysbiosis
Ikeda-Ohtsubo et al. Raphaële Gresse1, 2, Frédérique Chaucheyras-Durand1, 2, Juan J. Garrido3, Sylvain Denis1, Angeles Jiménez-Marín3, Martin Beaumont4, Tom Van de Wiele5, Evelyne Forano1 and Stéphanie Blanquet-Diot1
US20130230859A1 (en) Use of blood group status
Odenwald et al. Prebiotic activity of lactulose optimizes gut metabolites and prevents systemic infection in liver disease patients

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 19750410

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019571188

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019750410

Country of ref document: EP

Effective date: 20200909