CN114053310A

CN114053310A - 普通拟杆菌益生菌cgmcc no.17140在制备降脂药物中的应用

Info

Publication number: CN114053310A
Application number: CN202210049195.3A
Authority: CN
Inventors: 徐建国; 刘丽云; 杨晶
Original assignee: National Institute for Communicable Disease Control and Prevention of Chinese Center For Disease Control and Prevention
Current assignee: National Institute for Communicable Disease Control and Prevention of Chinese Center For Disease Control and Prevention
Priority date: 2022-01-17
Filing date: 2022-01-17
Publication date: 2022-02-18
Anticipated expiration: 2042-01-17
Also published as: CN114053310B

Abstract

本发明公开了一种拟杆菌益生菌菌株在制备降脂药物中的应用，所述菌株的保藏编号为CGMCC NO.17140，保藏日期为2019年01月07日，保藏分类命名为普通拟杆菌（Bacteroides vulgatus），保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。所述菌株对动物无害，且具有显著降低低密度脂蛋白，总胆固醇，甘油三酯，升高高密度脂蛋白的调节血脂功效。

Description

普通拟杆菌益生菌CGMCC NO.17140在制备降脂药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种益生菌及其应用，属于微生物领域。

背景技术

高脂血症是由于脂肪代谢或运转异常使总胆固醇、甘油三酯和(或)低密度脂蛋白过高，和(或)高密度脂蛋白过低而引发的一种脂质代谢紊乱疾病，是动脉粥样硬化的主要发病因素之一。近年来，随着人们生活水平的提高和饮食结构的改变，高脂血症的发生率在逐年上升。目前治疗高脂血症的主要措施是使用他汀类药物，但长期服用会有副作用。

国内外越来越多的证据表明肠道微生物群及其代谢物在调节胆固醇代谢紊乱方面发挥重要的作用。拟杆菌属，是革兰氏阴性染色、无芽孢、专性厌氧的小杆菌。正常寄居于人和动物的肠道、口腔、上呼吸道和生殖道。拟杆菌可代谢利用多糖、参与胆汁及胆固醇代谢、参与治疗炎症性肠病，甚至可以预防癌症，具有广阔的医疗应用前景，是下一代益生菌的研究对象之一。

本发明旨在从健康人类的粪便中分离筛选具有良好降胆固醇功能的普通拟杆菌菌株，并进一步开发其在制备降脂药物中的应用。

发明内容

基于上述发明目的，本发明首先提供了一种普通拟杆菌菌株在制备降脂药物中的应用，所述菌株的保藏编号为CGMCC NO.17140，保藏日期为2019年 01月 07日，保藏分类命名为普通拟杆菌（Bacteroides vulgatus），保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

在一个优选的技术方案中，所述普通拟杆菌菌株的16S rDNA的序列如SEQ IDNO.1所示。

在一个更为优选的技术方案中，所述降脂药物是指降低人体或动物体血清中血清总胆固醇、血清甘油三酯、血清低密度脂蛋白或肝脏总胆固醇的药物。

在另一个更为优选的技术方案中，所述降脂药物是指升高人体或动物体血清高密度脂蛋白的药物。

在又一个更为优选的技术方案中，所述降脂药物是指降低高脂血症中血清炎性因子的药物。

更为优选地，所述炎性因子包括白介素1-β、单核细胞趋化蛋白-1、肿瘤坏死因子-α、白介素6或内毒素。

在又一个更为优选的技术方案中，所述降脂药物是指治疗高脂血症中胆固醇代谢障碍的药物。

更为优选地，所述胆固醇代谢障碍是指总胆汁酸和游离胆汁酸升高。

本发明是从健康人粪便中分离纯化得到具有益生菌特性的拟杆菌，实验证明分离得到的普通拟杆菌对动物无害，且经动物实验确证具有调节血脂的功能。CGMCC NO.17140菌株能显著降低低密度脂蛋白，总胆固醇，甘油三酯，升高高密度脂蛋白的调节血脂功效。摄入CGMCC NO.17140菌株的大鼠体征正常，摄入四周结束实验后取胃肠肝脾做病理未见异常。无菌组织做细菌检测未见普通拟杆菌异位定植。

附图说明

图1. 菌株CGMCC NO.17140对高脂模型大鼠的体重增长量的影响；

图2. 菌株CGMCC NO.17140对高脂模型大鼠的肝脏重量的影响；

图3. 菌株CGMCC NO.17140对高脂模型大鼠的饲料消耗影响；

图4. 菌株CGMCC NO.17140对高脂模型大鼠的饲料利用率的影响；

图5. 菌株CGMCC NO.17140对高脂模型大鼠的血清总胆固醇（TC）的影响；

图6. 菌株CGMCC NO.17140对高脂模型大鼠的血清甘油三酯（TG）的影响；

图7. 菌株CGMCC NO.17140对高脂模型大鼠的血清低密度脂蛋白（LDL）的影响；

图8. 菌株CGMCC NO.17140对高脂模型大鼠的血清高密度度脂蛋白（HDL）的影响；

图9. 菌株CGMCC NO.17140对高脂模型大鼠的肝脏总胆固醇的影响；

图10. 菌株CGMCC NO.17140对高脂模型大鼠的血清白介素1-β(IL-1β)的影响；

图11. 菌株CGMCC NO.17140对高脂模型大鼠的血清单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1)的影响；

图12. 菌株CGMCC NO.17140对高脂模型大鼠的血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的影响；

图13. 菌株CGMCC NO.17140对高脂模型大鼠的血清白介素6 (IL-6)的影响；

图14. 菌株CGMCC NO.17140对高脂模型大鼠的血清内毒素（ET)的影响；

图15. 菌株CGMCC NO.17140对高脂模型大鼠的粪便总胆汁酸的影响；

图16. 菌株CGMCC NO.17140对高脂模型大鼠的粪便游离胆汁酸的影响；

图17. 菌株CGMCC NO.17140对高脂模型大鼠的粪便结合胆汁酸的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施案例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。

实施例1 .普通拟杆菌的分离、筛选和鉴定。

1. 普通拟杆菌的分离

1）配置脑心浸液琼脂培养基经121℃，15min高压灭菌处理后冷却至50℃，加入5%脱纤维养血，混匀后倒入培养皿；

2）取经梯度稀释的10^-4的粪便标本56ul涂布于1）的培养基上；

3）在37℃，厌氧环境中培养48h；

4）挑取湿润、呈圆形凸起的单菌落进行转接。

2. 菌种保藏

本实验室用含25%甘油的培养基作为保菌液进行菌种的冷冻保藏，方法如下：

1）将容量为2mL的保菌管经121℃，15min高压灭菌处理后以备使用；

2）细菌在固体培养基上连续转接3次后，向培养皿上加入1. 5ml 的无菌保菌液；

3）用L棒对培养皿进行刮涂，使菌落充分融入保菌液中。

4）将菌液转移到保菌管中，混匀后于-80℃保藏。

3. 菌落外观和菌体形态观察

普通拟杆菌属于严格厌氧菌，在厌氧条件下生长良好，菌落呈灰白色、表面光滑、呈圆形凸起。

4. 菌株的生化鉴定方法

本研究采用法国梅里埃公司生产的“BioMerieux”细菌系统生化鉴定卡API 50CH和 API ZYM 对菌株 B.v-46进行碳水化合物酵解和酶促反应生化鉴定。

根据生化鉴定结果，获得了一株生化特征为普通拟杆菌的菌株，菌株保藏编号为CGMCC NO.17140，保藏日期为2019年 01月 07日，保藏分类命名为普通拟杆菌（Bacteroides vulgatus），保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101。

5. 细菌总DNA的提取和16S rRNA 鉴定

将单个菌落接种于BHI（含5%脱纤维羊血）培养基上，37℃厌氧过夜培养，按照细菌基因组DNA提取试剂盒(Promega）说明书操作，提取DNA。然后用拟杆菌通用引物，扩增拟杆菌16S rDNA并测序，测序序列在NCBI上进行BLAST比对，进行初步鉴定。

本实验所用的细菌16S rDNA PCR 扩增的引物以及PCR 反应的条件如下所述，实验全部用50μL的PCR体系。通过对待测拟杆菌通用引物16S rDNA PCR产物测序结果在NCBI上进行BLAST比对，鉴定。结果提示CGMCC NO.17140菌株的16S rDNA序列与普通拟杆菌(Bacteroides vulgatus) JCM 5826和ATCC 8482的序列一致性分别为99.51%和99.44%。CGMCC NO.17140菌株属于普通拟杆菌。

通用引物16S rDNA PCR 扩增条件

引物序列：

27F， 5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’；

1492R 5’-GGYTACCTTG TTACGACTT-3’；

反应体系（50μl），如表1所示：

表1. 16S rDNA PCR 扩增反应体系

。

扩增条件如表2所示：

表2. 16S rDNA PCR 扩增反应条件

。

实施例2. 普通拟杆菌CGMCC NO .17140对大鼠降脂功能体内评价。

将24只约200克体重的雌性SD大鼠分别随机分三组，一组给与正常维持饲料，两组给予高脂饲料（胆固醇1%，猪油10%，0.2胆酸盐，10%蛋黄粉）。两组高脂饲料组，在喂食一周后，一组隔天经口给予10¹⁰CFU CGMCC NO .17140普通拟杆菌菌液，一组隔天给予生理盐水，共五周终止实验，检测血清的血脂水平，来评价普通拟杆菌CGMCC NO .17140脂代谢紊乱模型的预防干预效果。

图1显示普通拟杆菌CGMCC NO .17140对高脂模型大鼠的体重增长的影响。CGMCCNO .17140干预组的大鼠体重增长量平均为65.00±12.04g，显著低于高脂模型组83.75±8.71g（p<0.01）；高脂模型组的大鼠体重增长量平均为83.75±8.71g，显著高于正常对照组56.38±4.66g（p<0.001）。

图2显示普通拟杆菌CGMCC NO .17140对高脂模型大鼠的肝脏重量的影响。CGMCCNO .17140干预组的大鼠肝脏重量平均为8.78±0.65g，显著低于高脂模型组9.81±0.87g（p<0.05）；高脂模型组的大鼠肝脏重量平均为9.81±0.87g，显著高于正常对照组7.61±0.74g（p<0.001）。

图3显示普通拟杆菌CGMCC NO .17140对高脂模型大鼠的饲料消耗的影响。CGMCCNO .17140干预组的大鼠饲料消耗量平均为619.13±40.32g，接近于高脂模型组648.50±18.41g（p＞0.05）；高脂模型组的大鼠饲料消耗量平均为648.50±18.41g，显著高于正常对照组588.56±26.12g（p<0.01）。

图4显示普通拟杆菌CGMCC NO .17140对高脂模型大鼠的饲料利用率（大鼠平均体重增长量/饲料平均消耗量）的影响。CGMCC NO .17140干预组的大鼠饲料利用率平均为10.48±1.80%，显著低于高脂模型组12.92±1.34g（p<0.01）；高脂模型组的大鼠饲料利用率平均为12.92±1.34g，显著高于正常对照组9.58±0.76g（p<0.001）。

图5显示普通拟杆菌CGMCC NO .17140对高脂模型大鼠的血清总胆固醇（TC）的影响。CGMCC NO .17140干预组的血清TC平均含量为1.94±0.18mmol/L，显著低于高脂模型组2.48±0.16mmol/L（p<0.001）；高脂模型组的血清TC平均含量为2.48±0.16mmol/L，显著高于正常对照组1.40±0.14mmol/L（p<0.001）。

图6显示普通拟杆菌CGMCC NO .17140对高脂模型大鼠的血清甘油三酯（TG）的影响。CGMCC NO .17140干预组的血清TG平均含量为2.30±0.15mmol/L，显著低于高脂模型组2.96±0.08mmol/L（p<0.001）；高脂模型组的血清TG平均含量为2.96±0.08mmol/L，显著高于正常对照组1.81±0.15mmol/L（p<0.001）。

图7显示普通拟杆菌CGMCC NO .17140对高脂模型大鼠的血清低密度脂蛋白（LDL）的影响。CGMCC NO .17140干预组的血清LDL平均含量为2.68±0.18mmol/L，显著低于高脂模型组2.99±0.20mmol/L（p<0.05）；高脂模型组的血清LDL平均含量为2.99±0.20mmol/L，显著高于正常对照组1.77±0.20mmol/L（p<0.001）。

图8显示普通拟杆菌CGMCC NO .17140对高脂模型大鼠的血清高密度度脂蛋白（HDL）的影响。CGMCC NO .17140干预组的血清HDL平均含量为2.29±0.32mmol/L，显著高于高脂模型组1.59±0.34mmol/L（p<0.01）；高脂模型组的血清HDL平均含量为1.59±0.34mmol/L，显著低于正常对照组3.18±0.26mmol/L（p<0.001）。

图9显示普通拟杆菌CGMCC NO .17140对高脂模型大鼠的肝脏总胆固醇（TC）的影响。CGMCC NO .17140干预组的肝脏TC平均含量为3.01±0.40mmol/L，显著低于高脂模型组3.94±0.48mmol/L（p<0.01）；高脂模型组的血清TC平均含量为3.94±0.48mmol/L，显著高于正常对照组2.47±0.44mmol/L（p<0.001）。

图10显示普通拟杆菌CGMCC NO .17140对高脂模型大鼠的血清白介素1-β(IL-1β)的影响。CGMCC NO .17140干预组的血清IL-1β平均含量为16.31±2.22pg/mL，显著低于高脂模型组26.73±3.89pg/mL（p<0.001）；高脂模型组的血清IL-1β平均含量为26.73±3.89pg/mL，显著高于正常对照组15.97±3.17pg/mL（p<0.001）。

图11显示普通拟杆菌CGMCC NO .17140对高脂模型大鼠的血清单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1)的影响。CGMCC NO .17140干预组的血清MCP-1平均含量为498.04±75.07pg/mL，显著低于高脂模型组703.96±83.34pg/mL（p<0.001）；高脂模型组的血清MCP-1平均含量为703.96±83.34pg/mL，显著高于正常对照组438.25±92.66pg/mL（p<0.001）。

图12显示普通拟杆菌CGMCC NO .17140对高脂模型大鼠的血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的影响。CGMCC NO .17140干预组的血清TNF-α平均含量为108.67±20.39pg/mL，显著低于高脂脂模型组220.09±22.28pg/mL（p<0.001）；高脂模型组的血清TNF-α平均含量为220.09±22.28pg/mL，显著高于正常对照组126.90±31.59pg/mL（p<0.001）。

图13显示普通拟杆菌CGMCC NO .17140对高脂模型大鼠的血清白介素6 (IL-6)的影响。CGMCC NO .17140干预组的血清IL-6平均含量为95.89±17.02pg/mL，显著低于高脂模型组155.94±14.19pg/mL（p<0.001和p<0.01）；高脂模型组的血清IL-6平均含量为155.94±14.19pg/mL，显著高于正常对照组99.69±21.68pg/mL（p<0.001）。

图14显示普通拟杆菌CGMCC NO .17140对高脂模型大鼠的血清内毒素（ET)的影响。CGMCC NO .17140干预组的血清ET平均含量为28.61±8.62pg/mL，显著低于高脂模型组53.38±14.74pg/mL（p<0.001）；高脂模型组的血清ET平均含量为53.38±14.74pg/mL，显著高于正常对照组31.87±12.61pg/mL（p<0.001）。

图15显示普通拟杆菌CGMCC NO .17140对高脂模型大鼠的粪便总胆汁酸的影响。CGMCC NO .17140干预组的大鼠粪便总胆汁酸平均含量为6140.24±1753.89ng/mg，显著高于高脂模型组4224.78±762.70ng/mg（p<0.05）；高脂模型组的大鼠粪便总胆汁酸平均含量为4224.78±762.70ng/mg，显著高于正常对照组1216.38±394.03ng/mg（p<0.01）。

图16显示普通拟杆菌CGMCC NO .17140对高脂模型大鼠的粪便游离胆汁酸的影响。CGMCC NO .17140干预组的大鼠粪便游离胆汁酸平均含量为6132.67±1753.34ng/mg，显著高于高脂模型组4208.41±767.08ng/mg（p<0.05）；高脂模型组的大鼠粪便游离胆汁酸平均含量为4208.41±767.08ng/mg，显著高于正常对照组1213.30±393.81ng/mg（p<0.01）。

图17显示普通拟杆菌CGMCC NO .17140对高脂模型大鼠的粪便结合胆汁酸的影响。CGMCC NO .17140干预组的大鼠粪便结合胆汁酸平均含量为7.57±5.04ng/mg，与高脂模型组16.37±14.78ng/mg没有统计学差异（p＞0.05）；高脂模型组的大鼠粪便结合胆汁酸平均含量为16.37±14.78ng/mg，与正常对照组3.07±0.64ng/mg没有统计学差异（p＞0.05）。

上述结果表明，普通拟杆菌CGMCC NO .17140具有减少体重和肝脏重量的作用，而且可以降低食物利用率。同时普通拟杆菌CGMCC NO .17140可以显著降低血清和肝脏总胆固醇、血清甘油三酯、血清低密度脂蛋白和升高血清高密度脂蛋白的作用。

普通拟杆菌CGMCC NO .17140还具有显著降低血清TNF-α、IL-6、IL-1β和MCP-1炎性因子和血清内毒素（ET)的作用。肝脏纤维化是各种原因导致的肝损伤持续发展的最终结局，MCP-l是组织损伤修复中重要的巨噬细胞趋化因子，其在肝脏损伤及修复中起着重要作用。IL-1β是另一个致纤维化的重要炎症细胞因子，是前炎症反应的主要诱导剂，它可以通过协同其他炎性因子如TNF-α和IL-6，并促进其他炎性因子的表达加强炎性反应程度。总之，普通拟杆菌CGMCC NO .17140显著降低血清TNF-α、IL-6、IL-1β和MCP-1炎性因子和血清内毒素（ET)的含量，从而减少肝脏炎症和肝脏纤维化的发生。

此外，普通拟杆菌CGMCC NO .17140干预组比高脂模型组的大鼠粪便总胆汁酸和游离胆汁酸升高明显，对结合胆汁酸无显著影响。可能为普通拟杆菌CGMCC NO .17140通过增加粪便中胆汁酸的排泄量进而促进肝脏合成胆汁酸的途径，降低血液中胆固醇的水平。

摄入普通拟杆菌CGMCC NO .17140的大鼠表现正常，摄入五周结束实验后取胃肠肝脾做病理未见异常。无菌组织做细菌检测未见普通拟杆菌异位定植。

序列表

<110> 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所

<120> 普通拟杆菌益生菌CGMCC NO.17140在制备降脂药物中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1414

<212> DNA

<213> Bacteroides vulgatus

<400> 1

gcttaccatg caagtcgagg ggcagcatgg tcttagcttg ctaaggccga tggcgaccgg 60

cgcacgggtg agtaacacgt atccaacctg ccgtctactc ttggacagcc ttctgaaagg 120

aagattaata caagatggca tcatgagtcc gcatgttcac atgattaaag gtattccggt 180

agacgatggg gatgcgttcc attagatagt aggcggggta acggcccacc tagtcttcga 240

tggatagggg ttctgagagg aaggtccccc acattggaac tgagacacgg tccaaactcn 300

tacgggaggc agcagtgagg aatattggtc aatgggcgag agcctgaacc agccaagtag 360

cgtgaaggat gactgcccta tgggttgtaa acttctttta taaaggaata aagtcgggta 420

tggatacccg tttgcatgta ctttatgaat aaggatcggc taactccgtg ccagcagccg 480

cggtaatacg gaggatccga gcgttatccg gatttattgg gtttaaaggg agcgtagatg 540

gatgtttaag tcagttgtga aagtttgcgg ctcaaccgta aaattgcagt tgatactgga 600

tatcttgagt gcagttgagg caggcggaat tcgtggtgta gcggtgaaat gcttagatat 660

cacgaagaac tccgattgcg aaggcagcct gctaagctgc aactgacatt gaggctcgaa 720

agtgtgggta tcaaacagga ttagataccc tggtagtcca cacggtaaac gatgaatact 780

cgctgtttgc gatatacagc aagcggccaa gcgaaagcgt taagtattcc acctggggag 840

tacgccggca acggtgaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggaggaacat 900

gtggtttaat tcgatgatac gcgaggaacc ttacccgggc ttaaattgca gatgaattac 960

ggtgaaagcc gtaagccgca aggcatctgt gaaggtgctg catggttgtc gtcagctcgt 1020

gccgtgaggt gtcggcttaa gtgccataac gagcgcaacc cttgttgtca gttactaaca 1080

ggnnntgctg aggactctga caagactgcc atcgtaagat gtgaggaagg tggggatgac 1140

gtcaaatcag cacggccctt acgtccgggg ctacacacgt gttacaatgg ggggtacaga 1200

gggccgctac cacgcgagtg gatgccaatc cccaaaacct ctctcagttc ggactggagt 1260

ctgcaacccg actccacgaa gctggattcg ctagtaatcg cgcatcagcc acggcgcggt 1320

gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcaagcc atgggagccg ggggtacctg 1380

aagtgcgtaa ccgcgaggag cgccctaggg taaa 1414

Claims

1.一种普通拟杆菌菌株在制备降脂药物中的应用，其特征在于，所述菌株的保藏编号为CGMCC NO.17140，保藏日期为2019年 01月 07日，保藏分类命名为普通拟杆菌（Bacteroides vulgatus），保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述普通拟杆菌菌株的16S rDNA的序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述降脂药物是指降低人体或动物体血清中血清总胆固醇、血清甘油三酯、血清低密度脂蛋白或肝脏总胆固醇的药物。

4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述降脂药物是指升高人体或动物体血清高密度脂蛋白的药物。

5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述降脂药物是指降低高脂血症中血清炎性因子的药物。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述炎性因子包括白介素1-β、单核细胞趋化蛋白-1、肿瘤坏死因子-α、白介素6或内毒素。

7.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述降脂药物是指治疗高脂血症中胆固醇代谢障碍的药物。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述胆固醇代谢障碍是指总胆汁酸和游离胆汁酸升高。