CN111269852B - 普通拟杆菌菌株及在制备炎症性肠病治疗药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种拟杆菌益生菌菌株,所述菌株的保藏号为CGMCC NO.17140,保藏日期为2019年01月07日,保藏分类命名为普通拟杆菌,保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。所述菌株对动物无害,且具有改善调节肠道炎症的显著功效,本发明还公开了所述菌株在制备预防和治疗炎症性肠病的药物和保健品中的应用。

Description

普通拟杆菌菌株及在制备炎症性肠病治疗药物中的应用
技术领域
本发明涉及一种潜在益生菌及其应用,属于微生物领域。
背景技术
炎症性肠病(Inflammatory Bowel Disease,IBD)是一种病因学不明的肠道非特异性炎症性疾病,包括克罗恩病(Crohn’s Disease,CD)和溃疡性结肠炎(UlcerativeColitis,UC),目前尚无理想的治疗方法,需要长期治疗、经常住院。常用的药物氨基水杨酸和皮质类固醇用于轻中度验证,无效者应用TNF抑制剂等抗炎类药物和免疫抑制剂药物,但长期服用可能产生过敏反应或肝脏损害副作用,寻求副作用小又能够保护肠炎的新药物成为本领域的技术需求。
IBD的发病机制复杂,多认为与肠道免疫异常和菌群变化等多因素相关。近年来研究发现肠道微生物菌群与IBD和肠易激综合征(IBS)有关。肠道微生物大多数是非致病性的共生菌,参与营养代谢,药物代谢,减少致病微生物定居,调节肠黏膜免疫系统的发育,参与肠道免疫调节,具有维持肠道屏障和肠道结构完整性的作用。多项研究显示IBD患者中微生物菌群的多样性下降,真杆菌属(Eubacterium)、粪杆菌属(Faecalibacterium)和乳杆菌属(Lactobacillus)以及拟杆菌属(Bacteroides)的数量减少,而放线杆菌属(Actinobaculum)、梭形杆菌属(Fusobacterium)和变形杆菌门的埃希氏菌属(Escherichia)的数量明显增加。IBD患者厚壁菌门的多样性下降,特别是在梭菌簇IV,如粪杆菌属、双歧杆菌属和乳杆菌属等与粘膜保护有关的菌群;肠杆菌科的兼性有氧细菌和许多革兰氏阴性病原体的物种的多样性相对升高。粪便移植应用于IBD的治疗有报道,但效果不一。研究可治疗和/或预防IBD的益生菌或共生菌是很多公司的研发热点。有研究表明多型拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)、卵型拟杆菌(Bacteroides ovatus)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragile)可有效减轻葡聚糖硫酸钠盐(DSS)诱导的IBD和细菌诱导肠炎症状,逆转炎症反应,脆弱拟杆菌的作用被证实与该菌胞外多糖的抗炎作用有关,是否还有其他细菌具有保护IBD作用以及作用机制都有待发现。本发明的目的就是提供一种具有优异的益生菌性能,能够有效预防和治疗保护炎症性肠病的益生菌菌株。
发明内容
基于上述发明目的,本发明首先提供了一种普通拟杆菌益生菌株,所述益生菌的保藏号为CGMCC NO.17140,保藏日期为2019年01月07日。
其次,本发明还提供了一种乳酸杆菌益生菌株,所述菌株的16S rRNA的序列如SEQID NO:1所示。
第三,本发明还提供了上述菌株在制备炎症性肠病治疗和/或预防药物中的应用。
第四,本发明还提供了上述菌株在制备保健品中的应用。
最后,本发明提供了含有上述菌株的组合物。
在一个优选的技术方案中,所述组合物被制备为胶囊、冻干粉或者菌液制剂。
本发明是从健康人粪便中分离纯化得到具有益生菌特性的拟杆菌,实验证明分离得到的普通拟杆菌对动物无害,且经动物实验确证具有保护炎症性肠病的功能。所述普通拟杆菌能够有效保护结肠长度因炎症缩短,降低肠炎疾病活动指数,显著降低炎症损伤程度。本发明提供的普通拟杆菌菌株显示出在制备炎症性肠病治疗和/或预防药物,以及制备保健品中的优异应用前景。
附图说明
图1.菌株CGMCC NO.17140糖发酵反应(50CH)鉴定图谱;
图2.菌株CGMCC NO.17140酶活性反应(ZYM)鉴定图谱;
图3.普通拟杆菌对DSS诱导的小鼠结肠炎模型的影响分析图;
图4.普通拟杆菌干预对结肠长度影响的对比图;
图5.PBS组和普通拟杆菌干预组小鼠的结肠组织切片图;
图6.PBS组和普通拟杆菌干预组小鼠的结肠组织切片病理评分比较图。
具体实施方式
下面结合具体实施案例来进一步描述本发明,本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的,并不对本发明权利要求限定的保护范围构成任何限制。
实施例1.普通拟杆菌的分离、筛选和鉴定
1.普通拟杆菌的分离
1)配置脑心浸液琼脂培养基经121℃,15min高压灭菌处理后冷却至50℃,先加入5ug/ml的万古霉素,轻轻摇匀,再加入5%脱纤维羊血,混匀后倒入培养皿;
2)取经梯度稀释的10-4的粪便标本56ul涂布于步骤1)制备的培养基上;
3)在37℃,0.5%CO2环境中培养48h;
4)挑取湿润、呈圆形凸起的单菌落进行转接。
2.菌种保藏
本实验室用含25%甘油的培养基作为保菌液进行菌种的冷冻保藏,方法如下:
1)将容量为2mL的保菌管经121℃,15min高压灭菌处理后以备使用;
2)细菌在固体培养基上连续转接3次后,向培养皿上加入1.5ml的无菌保菌液;
3)用L棒对培养皿进行刮涂,使菌落充分融入保菌液中;
4)将菌液转移到保菌管中,混匀后于-80℃保藏。
3.菌落外观和菌体形态观察
拟杆菌属严格厌氧菌,在厌氧条件下生长良好,菌落呈浅灰色、表面光滑、呈圆形凸起。镜下观察普通拟杆菌细胞形态为杆状。
4.细菌总DNA的提取
将单个菌落接种于BHI(含5%脱纤维羊血)培养基上,37℃厌氧过夜培养,按照细菌基因组DNA提取试剂盒(Promega)说明书操作,提取DNA。
5.菌株的生化鉴定方法
将菌株Bv-46对数期培养物混悬于50CHB培养基,按说明书调至一定的麦氏浊度培养36小时后的糖发酵结果见图1和表1,可知该菌能较快发酵D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、鼠李糖、N-乙酰-葡糖胺、麦芽糖、乳糖、蔗糖、蜜二糖、棉子糖、淀粉、L-岩糖。将Bv-46对数期培养物混悬于灭菌的超纯水,按说明书调至一定的麦氏浊度培养4.5小时后的酶活性结果见图2和表2,可知该菌反应为阳性的酶有:碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、萘酚-AS-BI-磷酸水解酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、N-乙酰-葡萄糖胺酶。
表1.图1中50CH生化条成分反应说明:
Figure BDA0002383748560000041
Figure BDA0002383748560000051
表2.图2中ZYM酶活性测试反应说明:
管号 底物成分 管号 底物成分
1 空白对照 11 酸性磷酸酶
2 碱性磷酸酶 12 奈酚-AS-BI-磷酸水解酶
3 酯酶C4 13 α-半乳糖苷酶
4 类脂酯酶C8 14 β-半乳糖苷酶
5 类脂酶C14 15 β-糖醛酸苷酶
6 白氨酸芳胺酶 16 α-葡萄糖苷酶
7 缬氨酸芳胺酶 17 β-葡萄糖苷酶
8 胱氨酸芳胺酶 18 N-乙酰-葡萄糖胺酶
9 胰蛋白酶 19 α-甘露糖苷酶
10 胰凝乳蛋白酶 20 β-岩藻糖苷酶
结果:根据生化鉴定,获得了一株生化特征为普通拟杆菌的菌株,菌株保藏号为CGMCC NO.17140(生化鉴定结果见图1),保藏日期为2019年01月07日,保藏分类命名为普通拟杆菌(Bacteroides vulgatus),保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所,邮政编码:100101。
6.细菌通用引物16S rRNA PCR扩增
细菌16S rRNA鉴定:提取细菌基因组DNA,扩增拟杆菌通用引物16S rDNA PCR产物并测序,序列在NCBI上进行BLAST比对,进行初步鉴定。
以下列出了本实验所用的细菌16S rRNA PCR扩增的引物以及PCR反应的条件。
通用引物16S rRNA PCR扩增条件:
95℃ 5分钟;95℃ 45秒,54℃ 45秒,72℃ 1.5分钟(32个循环);72℃10分钟。
引物序列:27F-1492R(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’;5’-GGYTACCTTGTTACGACTT-3’)。
实验全部用50μL的PCR体系。通过对待测拟杆菌通用引物16S rRNA PCR产物测序结果在NCBI上进行BLAST比对,鉴定。挑选具有代表性的样本PCR产物测序。
经测序,CGMCC NO.17140菌株的16S rRNA如SEQ ID NO.1,选择NCBI-16Sribosome RNA sequences(Bacteria and Archaea)数据库,利用BLASTn在线比对,完成对拟杆菌的初步鉴定。比对结果显示,CGMCC NO.17140菌株的16S rRNA序列与普通拟杆菌(Bacteroides vulgatus)JCM 5826和ATCC 8482的序列一致性分别为99.51%和99.44%(见表3)。
表3.CGMCC NO.17140与JCM 5826和ATCC 8482的16S rRNA序列比对
Figure BDA0002383748560000061
实施例2、普通拟杆菌能有效改善DSS诱导的小鼠结肠炎
1.研究方法:
38只6-8周雌性SPF级C57BL/6J小鼠适应5天后,随机分为两组,PBS组(n=20)和Bacteroids组(n=18)。全部小鼠从第0天开始每天给予含有3%DSS的溶液的饮用水,连续6天,3天换一次DSS溶液,PBS组小鼠同时每天给予200μL/只PBS灌胃处理;Bacteroids组小鼠每只每天给予200μL含有108CFU的热灭活菌液。
取小鼠结肠组织,放入10%的福尔马林溶液固定。送北京博奥赛恩科技有限公司进行病理切片制作。过程如下:结肠组织经过脱水、透明、浸蜡后,制作成蜡块。用切片机切成4μm的切片。然后进行苏木素—伊红染色。由两名经验丰富的病理科专家对HE切片进行盲评评分(镜检倍数为100×和200×)。
2.评价指标
普通拟杆菌干预对DSS诱导的小鼠体重、结肠长度和肠炎疾病活动指数的影响,以及小鼠结肠病理切片的观察,并对病理切片的病理状况进行评分。
肠炎疾病活动指数(disease activity index,DAI)评价:根据实验动物的体重下降百分率、大便黏稠度(正常、稀便、水样便)及粪便潜血情况(正常、潜血阳性、潜血强阳性)三种情况进行综合评分,将3项结果的总分除以3即得到结肠炎DAI值,即结肠炎DAI=(体重下降百分率得分+粪便形态得分+粪便潜血情况得分)/3。
病理状况分为三个方面进行评价,病理状况越严重。得分越高,满分为10分,具体病理评分标准:
炎症严重程度(0:没有炎症,1:轻度,2:中度,3:重度);
炎症范围(0:没有,1:粘膜层,2:粘膜和粘膜下层,3:全层);
隐窝破坏程度(0:没有,1:基底1/3受损,2,基底2/3受损,3:仅存表面上皮完整,4:隐窝和上皮完全消失)。
3.研究结果:
图3为普通拟杆菌对DSS诱导的小鼠结肠炎模型的影响结果图,其中PBS组,DSS处理小鼠时用PBS干预(n=20);Bacteroids组,DSS处理小鼠时用普通拟杆菌干预(n=18)。DSS作用小鼠第7天,A为PBS组和Bacteroids组的两个组别小鼠的体重对照图,可见两个组别的体重没有显著差别,即普通拟杆菌干预DSS诱导对体重没有显著影响;B为PBS组和Bacteroids组的两个组别小鼠的结肠长度的对照图,可见普通拟杆菌干预7天后,Bacteroids组小鼠的结肠长度显著长于PBS干预(5.43±0.39cm:4.89±0.38cm);C为PBS和普通拟杆菌干预DSS诱导的两个组别小鼠的小鼠疾病活动指数(Disease Activity Index,DAI)对照,可见Bacteroids组小鼠的DAI指数显著小于PBS干预(5.28±1.52:6.85±1.63)。
图4给出了普通拟杆菌干预对结肠长度的影响的两个大体标本的对照。A图代表PBS干预的DSS诱导的小鼠结肠炎模型;B图代表普通拟杆菌干预的DSS诱导的小鼠结肠炎模型。可见经过普通拟杆菌干预,小鼠模型的结肠长度明显长于PBS组(5.9cm:4.9cm)。
图5给出了普通拟杆菌干预对结肠病理影响的病理切片图。其中,A是PBS干预小鼠的病理图片(100×);图片显示结肠粘膜上皮细胞脱落,固有层腺体消失,炎细胞浸润,粘膜下层水肿,炎细胞浸润。B是普通拟杆菌干预小鼠的病理图片(100×);图片显示结肠粘膜固有层少量炎细胞浸润;粘膜下层水肿,少量炎细胞浸润。C是PBS干预小鼠的病理图片(200×);图片显示结肠粘膜上皮细胞脱落,固有层腺体消失,炎细胞浸润;粘膜下层水肿,炎细胞浸润。D是普通拟杆菌干预小鼠的病理图片(200×);图片显示拟结肠粘膜固有层少量炎细胞浸润;粘膜下层水肿,少量炎细胞浸润。
图6给出了PBS和普通拟杆菌干预后的小鼠结肠病理图片得分比较。评价结果为:PBS组的平均得分为8.75±1.05,Bacteroids组平均得分为4.50±1.00。结肠组织HE切片病理评分是反映结肠炎症程度的客观指标。分值越低,炎症水平越低;分值越高,炎症程度越高。正常小鼠分值为零,普通拟杆菌干预以后显著的降低了结肠组织HE切片的分值,说明普通拟杆菌干预显著降低了结肠炎症水平。
序列表
<110> 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所
<120> 普通拟杆菌菌株及在制备炎症性肠病治疗药物中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1414
<212> DNA
<213> Bacteroides vulgatus
<220>
<221> misc_feature
<222> (300)..(300)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (1083)..(1085)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 1
gcttaccatg caagtcgagg ggcagcatgg tcttagcttg ctaaggccga tggcgaccgg 60
cgcacgggtg agtaacacgt atccaacctg ccgtctactc ttggacagcc ttctgaaagg 120
aagattaata caagatggca tcatgagtcc gcatgttcac atgattaaag gtattccggt 180
agacgatggg gatgcgttcc attagatagt aggcggggta acggcccacc tagtcttcga 240
tggatagggg ttctgagagg aaggtccccc acattggaac tgagacacgg tccaaactcn 300
tacgggaggc agcagtgagg aatattggtc aatgggcgag agcctgaacc agccaagtag 360
cgtgaaggat gactgcccta tgggttgtaa acttctttta taaaggaata aagtcgggta 420
tggatacccg tttgcatgta ctttatgaat aaggatcggc taactccgtg ccagcagccg 480
cggtaatacg gaggatccga gcgttatccg gatttattgg gtttaaaggg agcgtagatg 540
gatgtttaag tcagttgtga aagtttgcgg ctcaaccgta aaattgcagt tgatactgga 600
tatcttgagt gcagttgagg caggcggaat tcgtggtgta gcggtgaaat gcttagatat 660
cacgaagaac tccgattgcg aaggcagcct gctaagctgc aactgacatt gaggctcgaa 720
agtgtgggta tcaaacagga ttagataccc tggtagtcca cacggtaaac gatgaatact 780
cgctgtttgc gatatacagc aagcggccaa gcgaaagcgt taagtattcc acctggggag 840
tacgccggca acggtgaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggaggaacat 900
gtggtttaat tcgatgatac gcgaggaacc ttacccgggc ttaaattgca gatgaattac 960
ggtgaaagcc gtaagccgca aggcatctgt gaaggtgctg catggttgtc gtcagctcgt 1020
gccgtgaggt gtcggcttaa gtgccataac gagcgcaacc cttgttgtca gttactaaca 1080
ggnnntgctg aggactctga caagactgcc atcgtaagat gtgaggaagg tggggatgac 1140
gtcaaatcag cacggccctt acgtccgggg ctacacacgt gttacaatgg ggggtacaga 1200
gggccgctac cacgcgagtg gatgccaatc cccaaaacct ctctcagttc ggactggagt 1260
ctgcaacccg actccacgaa gctggattcg ctagtaatcg cgcatcagcc acggcgcggt 1320
gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcaagcc atgggagccg ggggtacctg 1380
aagtgcgtaa ccgcgaggag cgccctaggg taaa 1414

Claims (5)

1.一种普通拟杆菌菌株,所述菌株的保藏号为CGMCC NO.17140,保藏日期为2019年 01月 07日,保藏分类命名为普通拟杆菌,保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.根据权利要求1所述的菌株在制备炎症性肠病治疗和/或预防药物中的应用。
3.根据权利要求1所述的菌株在制备保健品中的应用。
4.一种含有权利要求1所述的菌株的组合物。
5.根据权利要求4所述的组合物,所述组合物被制备为胶囊、冻干粉或者菌液制剂。
CN202010091080.1A 2020-02-13 2020-02-13 普通拟杆菌菌株及在制备炎症性肠病治疗药物中的应用 Active CN111269852B (zh)

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