JP7399400B2 - Paraprevotella属に属する細菌を有効成分として含有する、トリプシン活性を抑制するための組成物 - Google Patents
Paraprevotella属に属する細菌を有効成分として含有する、トリプシン活性を抑制するための組成物 Download PDFInfo
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Description
<1> Paraprevotella属に属する細菌を有効成分として含有する、トリプシン活性を抑制するための組成物。
<2> 前記Paraprevotella属に属する細菌が、Paraprevotella clara及びParaprevotella xylaniphilaからなる群から選択される少なくとも1の細菌である、<1>に記載の組成物。
<3> 前記Paraprevotella属に属する細菌が、配列番号:1~3のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも90%の同一性を有する塩基配列からなるDNAを有する、少なくとも1の細菌である、<1>に記載の組成物。
<4> 前記Paraprevotella属に属する細菌が、
受託番号NITE BP-02775にて特定されるParaprevotella claraに属する細菌株(Paraprevotella clara 1C4株)、
Paraprevotella clara JCM14859T株及び
Paraprevotella xylaniphila JCM14860T株
からなる群から選択される少なくとも1の細菌株である、<1>に記載の組成物。
<5> Parabacteroides merdae及びBacteroides uniformisからなる群から選択される少なくとも1の細菌を更に含有する、<1>~<4>のうちのいずれか一項に記載の組成物。
<6> 前記Parabacteroides merdaeが、配列番号:4に記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも90%の同一性を有する塩基配列からなるDNAを有する、少なくとも1の細菌であり、前記Bacteroides uniformisが、配列番号:5に記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも90%の同一性を有する塩基配列からなるDNAを有する、少なくとも1の細菌である、<5>に記載の組成物。
<7> 前記Parabacteroides merdaeが、受託番号NITE BP-02776にて特定されるParabacteroides merdaeに属する細菌株(Parabacteroides merdae 1D4株)であり、前記Bacteroides uniformisが、受託番号NITE BP-02777にて特定されるBacteroides uniformisに属する細菌株(Bacteroides uniformis 3H3株)である、<5>に記載の組成物。
<8> 受託番号NITE BP-02775にて特定されるParaprevotella claraに属する細菌株(Paraprevotella clara 1C4株)。
<9> 受託番号NITE BP-02776にて特定されるParabacteroides merdaeに属する細菌株(Parabacteroides merdae 1D4株)。
<10> 受託番号NITE BP-02777にて特定されるBacteroides uniformisに属する細菌株(Bacteroides uniformis 3H3株)。
<11> Paraprevotella属に属する細菌、Parabacteroides merdae及びBacteroides uniformisからなる群から選択される少なくとも1の細菌を有効成分として含有する、トリプシン活性に起因する疾患を治療、改善又は予防するための医薬組成物。
<12> Paraprevotella属に属する細菌が、Paraprevotella clara及びParaprevotella xylaniphilaからなる群から選択される少なくとも1の細菌である、<11>に記載の医薬組成物。
<13> Paraprevotella属に属する細菌が、配列番号:1~3のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも90%の同一性を有する塩基配列からなるDNAを有する、少なくとも1の細菌である、<11>に記載の医薬組成物。
<14> Paraprevotella属に属する細菌が、
受託番号NITE BP-02775にて特定されるParaprevotella claraに属する細菌株(Paraprevotella clara 1C4株)、
Paraprevotella clara JCM14859T株及び
Paraprevotella xylaniphila JCM14860T株
からなる群から選択される少なくとも1の細菌株である、<11>に記載の医薬組成物。
<15> 前記Parabacteroides merdaeが、配列番号:4に記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも90%の同一性を有する塩基配列からなるDNAを有する、少なくとも1の細菌である、<11>~<14>のいずれか一項に記載の医薬組成物。
<16> 前記Parabacteroides merdaeが、受託番号NITE BP-02776にて特定されるParabacteroides merdaeに属する細菌株(Parabacteroides merdae 1D4株)である、<11>~<14>のいずれか一項に記載の医薬組成物。
<17> 前記Bacteroides uniformisが、配列番号:5に記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも90%の同一性を有する塩基配列からなるDNAを有する、少なくとも1の細菌である、<11>~<16>のいずれか一項に記載の医薬組成物。
<18> 前記Bacteroides uniformisが、受託番号NITE BP-02777にて特定されるBacteroides uniformisに属する細菌株(Bacteroides uniformis 3H3株)である、<11>~<16>のいずれか一項に記載の医薬組成物。
<19> 前記トリプシン活性に起因する疾患が炎症性腸疾患である、<11>~<18>のいずれか一項に記載の医薬組成物。
<20> 前記炎症性腸疾患が、潰瘍性大腸炎(UC:Ulcerative colitis)及びクローン病(CD:Crohn’s disease)のいずれか1の疾患である、<19>に記載の医薬組成物。
<21> Paraprevotella属に属する細菌、Parabacteroides merdae及びBacteroides uniformisからなる群から選択される少なくとも1の細菌を、対象に摂取させ、該対象におけるトリプシン活性に起因する疾患を治療、改善又は予防する方法。
<22> Paraprevotella属に属する細菌が、Paraprevotella clara及びParaprevotella xylaniphilaからなる群から選択される少なくとも1の細菌である、<21>に記載の方法。
<23> Paraprevotella属に属する細菌が、配列番号:1~3のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも90%の同一性を有する塩基配列からなるDNAを有する、少なくとも1の細菌である、<21>に記載の方法。
<24> Paraprevotella属に属する細菌が、
受託番号NITE BP-02775にて特定されるParaprevotella claraに属する細菌株(Paraprevotella clara 1C4株)、
Paraprevotella clara JCM14859T株及び
Paraprevotella xylaniphila JCM14860T株
からなる群から選択される少なくとも1の細菌株である、<21>に記載の方法。
<25> 前記Parabacteroides merdaeが、配列番号:4に記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも90%の同一性を有する塩基配列からなるDNAを有する、少なくとも1の細菌である、<21>~<24>のいずれか一項に記載の方法。
<26> 前記Parabacteroides merdaeが、受託番号NITE BP-02776にて特定されるParabacteroides merdaeに属する細菌株(Parabacteroides merdae 1D4株)である、<21>~<24>のいずれか一項に記載の方法。
<27> 前記Bacteroides uniformisが、配列番号:5に記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも90%の同一性を有する塩基配列からなるDNAを有する、少なくとも1の細菌である、<21>~<26>のいずれか一項に記載の方法。
<28> 前記Bacteroides uniformisが、受託番号NITE BP-02777にて特定されるBacteroides uniformisに属する細菌株(Bacteroides uniformis 3H3株)である、<21>~<26>のいずれか一項に記載の方法。
<29> 前記トリプシン活性に起因する疾患が炎症性腸疾患である、<21>~<28>のいずれか一項に記載の方法。
<30> 前記炎症性腸疾患が、潰瘍性大腸炎及びクローン病のいずれか1の疾患である、<29>に記載の方法。
本発明は、上述の組成物、又はそれらの有効成分となる上述の細菌(「本発明の医薬組成物等又はそれらの有効成分等」とも称する)を、対象に摂取させることを特徴とする、対象におけるトリプシン活性を抑制する方法、該対象における免疫を抑制する方法、又は該対象におけるトリプシン活性に起因する疾患を治療、改善又は予防する方法をも提供するものである。
後述の実施例において示すとおり、下記3菌株は、本発明者らによって初めて単離培養された黄色ブドウ球菌株である。また、これらの有用性も上述のとおりである。したがって、本発明は、以下の菌株も提供するものである。
受託番号NITE BP-02776にて特定されるParabacteroides merdaeに属する細菌株(Parabacteroides merdae 1D4株)。
受託番号NITE BP-02777にて特定されるBacteroides uniformisに属する細菌株(Bacteroides uniformis 3H3株)。
C57BL/6N Jclノトバイオートマウス(日本クレア株式会社、4~8週齢)を、飼育用ビニールアイソレータ(無菌アイソレータ、株式会社アイシーエム;ICM-1B)内にて自由飲水給餌条件で1週間以上飼育し、環境馴化させた。
C57BL/6N SPFマウス(4~8週齢)を、理化学研究所バイオリソース研究センター、日本SLC株式会社、日本クレア株式会社、あるいは日本チャールズ・リバー株式会社より取得し、SPF環境下で、自由飲水給餌条件で1週間以上飼育し、環境馴化させた。
マウスをイソフルラン麻酔下でサクリファイスして、盲腸内容物を採取し、-80℃で保存した。凍結保存したサンプルを氷上で融解し、RIPA Lysis Buffer with protease inhibitor cocktail(コスモ・バイオ株式会社;AKR-190)を5倍重量加えて充分攪拌した。4℃,15,000×gで20分間遠心し、タンパク質が溶存した上清を取得した。
健常者ボランティア#A~G便、あるいはマウス便サンプルを、20体積%グリセロール溶解PBSで5倍重量に希釈し、100μm径フィルタで濾過したものを、ストック液として-80℃で保存した。
凍結便サンプルを常温に融解後、0.9%NaCl水溶液に分散し、その上清のトリプシン活性をProtease Activity Assay Kit(Abcam ab111750)のプロトコールに従って測定した。
上記(マウス便あるいはヒト健常者ボランティア便取得)にて作成したストック液を常温にて融解し、PBSで10倍容量に希釈した。200μLの該希釈液を無菌マウスの胃内に経口投与した。さらに1ヶ月間、無菌アイソレータ内にて自由飲水給餌条件で飼育して、移植便中の菌を該マウスに定着させた。また、これらマウスについても、上記(便中トリプシン活性の測定)に記載の方法にてトリプシン活性を測定した。
前記(ヒト健常者ボランティア便由来菌の定着マウスの作成)おいて、自由飲水をアンピシリン、メトロニダゾールあるいはタイロシンの200mg/L水溶液に変更し、さらに1ヶ月間飼育して、各抗生物質に非耐性の菌の排除を行った。上記(マウス便あるいはヒト健常者ボランティア便取得)に記載の方法にて、投与過程のマウスの便サンプルを取得した、また、上記(便中トリプシン活性の測定)に記載の方法にてトリプシン活性を測定した。
100μm径フィルタで濾過した便サンプル液100μlに、15mgリゾチーム(Sigma-Aldrich、Lysozyme from chicken egg white; L4919)と5μl RNase(Thermo Fisher Scientific、PureLink RNase A(20mg/mL);12091-021)を溶解した10mM Tris/10mM EDTA緩衝液(pH8.0,以下TE10と称する)800μlを加え、37℃で1時間振盪した。続いて、アクロモペプチダーゼ(登録商標)(Wako;015-09951)2,000Uを添加し、37℃で30分間振盪し、溶菌した。
細菌ゲノムDNAについて、TaKaRa ExTaq(タカラバイオ;RR001A)を用いてPCR反応を行い、16S rDNAのIllumina社Miseqシーケンス用アンプリコンを作成した。プライマー配列は以下の通りである(Nishijima S et al DNA Res 23 125-133 2016)。
27Forward-mod:(5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC**index**ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAGRGTTTGATYMTGGCTCAG-3’)
インデックス配列に隣接する両配列を、配列番号:10及び11に示す。
338Reverse:(5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT**index**GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3’)
インデックス配列に隣接する両配列を、配列番号:12及び13に示す。
便サンプル投与12日後の便をPBSで希釈し、以下の培地を用いて10% CO2嫌気環境下で培養し、形成したコロニーを単離した。
EG ext.培地、mGAM培地、Schaedler培地(Wako;517-45805)、BL培地(Nissui;5430)CM0619培地(Wilkins T.D.and Chalgren S.(1976)Antimicrob.Agents Chemother.10.926-928.)を基本培地として、終濃度5%の馬血液または馬脱繊維血液を添加した培地のアガープレートを用いた。特に、CM0619培地については、所定のサプリメントを添加したSR0107選択培地あるいはSR0108選択培地(http://www.oxoid.com/UK/blue/prod_detail/prod_detail.asp?pr=CM0619)も同様に用いた。
統計分析ソフトR(https://www.r-project.org/)のパッケージapeを用いて、菌叢解析時の帰属に用いたOTUの代表配列に基づいて、単離した35菌の16SrDNA配列の類似度に基づく系統樹を作成した。
上記(菌の単離)にて単離した各菌を、EG ext.培地、mGAM培地、Schaedler培地、BL培地あるいはCM0619培地で、それぞれ37℃,10%CO2嫌気環境下で1~3日間培養した。定常期に至った菌液を等容量ずつ混和し、200μLを実施例1の無菌マウスの胃内に経口投与した。無菌アイソレータ内にて自由飲水給餌条件で飼育して、菌を定着させた。また、上記(便中トリプシン活性の測定)にしたがってトリプシン活性を測定した。
便投与12日後の、16SrDNAに基づく腸内菌叢解析から得られた、各構成菌の相対占有率と、その便のトリプシン活性値について、Spearmanの順位相関分析行った。菌の相対占有率とトリプシン活性値の相関係数ρが、ρ≦-0.5であり、かつ、該無相関検定のP値が、P<0.05である菌群を、トリプシン活性抑制菌の候補として推定した。
前記(Spearmanの順位相関分析)にて、トリプシン活性抑制菌の候補として推定した9菌株について、上記(単離35菌定着による腸内トリプシン活性の抑制)に記載の方法に準じて、菌定着マウスの作成及びその腸内トリプシン活性の測定を行った。また、前記9菌株について、バクテロイデス属3菌株と、非バクテロイデス属6菌株に区分して、菌定着マウスの作成及びその腸内トリプシン活性の測定を行った。
IL10-/-マウス(4~8週齢、ジャクソン・ラボラトリー)を、上記(無菌マウス)に記載の方法に準じて無菌飼育した。また上記(選択菌カクテルによる腸内トリプシン活性の抑制)に記載の方法に準じて、単離したバクテロイデス属3菌株あるいは非バクテロイデス属6菌株を経口投与して定着させた。該経口投与から1週間後に、以下の手順で、UC様の炎症の誘導処置を行った。UC患者より単離されたK.aeromobilis 11E12株(Atarashi K.et al Science 358,359 2017)を、Schaedler培地で37℃,10%CO2嫌気環境下で1~3日間培養し、定常期に至った菌液1-2×108CFU/200μlを、マウスの胃内に経口投与した。継続して、無菌アイソレータ内にて自由飲水給餌条件で更に3週間飼育し、菌を定着させた。11E12株投与3週間後の、腸内トリプシン活性の測定を、上記(便中トリプシン活性の測定)に記載の方法に準じて行った。また、炎症の指標として、便中のLipocalin-2レベルをELISA法により測定した(abcam;Mouse Lipocalin-2 ELISA Kit;ab199083)。
37℃,10%CO2嫌気環境下で1~3日間培養して定常期に至った、上記(Spearmanの順位相関分析)にて選抜された各9菌の培養液に、無菌マウスの盲腸内容物を無菌水で50倍に希釈したトリプシン含有液を、同体積量混合し、更に同条件で12時間培養した。
JCM14859(P.clara株)及びJCM14860(P.xylaniphila株)を、理化学研究所 バイオリソース研究センター(RIKEN BRC) 微生物材料開発室(JCM)より取得し、EG ext.培地で、それぞれ37℃,10%CO2嫌気環境下で1~3日間培養した。定常期に至った菌液を、上記(培養菌によるトリプシン活性の抑制)に記載の方法に準じて処理し、ウェスタンブロッティングの結果から、トリプシンの分解活性を評価した。
150μg/ml mPRSS2/PBS溶液25μlと、嫌気条件でEGEF培地中で培養し定常期に達したP.clara 1C4株(OD600>1.0)150μlと、新鮮なEGEF培地75μlを混合し、37℃で35分間インキュベートした。室温、4,000×gで5分間遠心分離し、上清を回収した(図14中の「supernatant」サンプルに該当)。800μlのPBSに菌を再分散した後、室温、4,000×gで遠心分離し、上清を除くことで、未吸着のmPRSS2タンパク質を除去した。10mM DSSO/PBS水溶液250μlに菌を再分散し、室温で15分間静置することで、菌構成物及び吸着物にランダムな共有結合の架橋を形成させた。さらに、200mM Tris-HCl水溶液(pH8.0)30μlを加え、室温で5分間静置することで、未反応のDSSOをクエンチした。室温、4,000×g条件で5分間遠心分離し、上清を除去した。800ulのPBSに菌を再分散したのち、同条件で遠心分離し、上清を除いて洗浄した。1% SDS/10mM Tris-HCl(pH8.0)/5mM EDTA組成の細胞溶解液を添加して菌を破砕したのち、4℃、20,000×g条件で5分間遠心分離し、上清として細胞破砕液を得た(図14中の「Pellet」サンプルに該当)。supernatantサンプル及びPelletサンプルをWestern Blottingに供し、mPRSS2特異的抗体を化学発光で検出することで、mPRSS2と結合したタンパク質を検出した。なお、本法に用いた試薬等は以下のとおりである。
mPRSS2:マウスリコンビナントPRSS2タンパク質(His Tag)(Sino biological社50383-M08H)
DSSO:ジスクシンイミジルスルホキシド(Thermo Fisher Scientific社A33545)
SDS:10%-SDS溶液より調製(ナカライテスク社30562-04)
Tris-HCl:1mol/l-トリス-塩酸緩衝液(pH8.0)より調製(ナカライテスク社06938-44)
EDTA:0.5mol/l-EDTA溶液(ph8.0)より調製(ナカライテスク社06894-14)
PBS:ダルベッコりん酸緩衝生理食塩水(Ca,Mg不含) (ナカライテスク社14249-95)
WB検出用一次抗体:Anti-6-His, Rabbit-Poly(フナコシ社A190-114A、400倍希釈して使用)
WB検出用二次抗体:Anti-IgG (Rabbit) pAb-HRP(MBL Code No.458、400倍希釈して使用)
WB検出用試薬:ケミルミワンL (ナカライテスク社07880-54)。
1mg/ml hPRSS2/PBS水溶液に、5倍mol量TLCKのDMSO溶液を添加し、室温で3時間静置して、TLCK修飾を施したトリプシン活性を有しないTLCK-hPRSS2とした。Sephadex-G25カラムクロマトグラフィにて、未反応のTLCKを除去し、限外ろ過膜による濃縮を経て、TCLK-hPRSS2を精製した。嫌気条件でEGEF培地中で培養し定常期に達したP.clara菌を、室温、4,000×g条件で5分間遠心分離してPBSに菌を再分散したのち、同条件での遠心分離と上清除去を更に1回行い、EGEF培地成分を除去した菌を得た。PBSに分散した菌と、TCLK-hPRSS2/PBS溶液を混合し、20ng/μl TLCK-hPRSS2、菌濃度OD=0.9の条件で、嫌気条件の37℃環境にて3時間静置した。菌液を室温、4,000×g条件で5分間遠心分離し、その上清中のhPRSS2を、Western Blottingにより検出した。なお、本法に用いた試薬等は以下のとおりである。
hPRSS2:ヒトPRSS2/トリプシン2タンパク質(リコンビナント)(LSBio社LS-G20167-5)
TLCK:トリプシンインヒビター トシル-L-リシル-クロロメタン塩酸塩(ABCAM社ab144542)
Sephadex-G25:プレパック ディスポーザブル PD-10 カラム(GEヘルスケア社17085101)
WB検出用一次抗体:Anti-PRSS2/Trypsin 2 antibody IHC-plus(LSBio社LS-B15185-50、400倍希釈して使用)
WB検出用二次抗体:Anti-IgG (Rabbit) pAb-HRP(MBL Code No.458、400倍希釈して使用)
WB検出用試薬:ケミルミワンL (ナカライテスク社07880-54)。
[無菌マウスの便中には活性型トリプシンが多い]
理化学研究所で維持されたSPFマウス(理研・SPFマウス)とGFマウスの盲腸内容物の網羅的タンパク質解析(shotgun proteomics、プロテオーム解析)を行った。
日本の潰瘍性大腸炎(UC)及びクローン病(CD)に罹患するIBD患者の便サンプルについて、トリプシンの活性測定及びそのタンパク質量の評価を行った。比較対象として、日本の健常者ボランティアの便サンプルを評価した。その結果、図には示さないが、健常者の便と比較して、UCやCDの患者の便には、有意に多くの活性型トリプシンが認められた。
消化管内の部位別のトリプシン活性を、理研・SPFマウスとGFマウスについて比較した。その結果、図には示さないが、小腸では、両者に有意差は認められなかったが、盲腸以遠では、GFマウスの方が有意に高かった。また、トリプシンの分泌を主に担う膵臓組織におけるトリプシン前駆体・トリプシノーゲン(PRSS2)の発現量及び分泌量をRT-qPCR及びWBで確認したところ、両者に有意差は認められなかった。
SPFマウスの腸内細菌叢は、飼育施設毎に特有に維持されている事が知られている。そこで、盲腸以遠の定着した腸内細菌とそのトリプシン活性の関連性を評価するため、異なる飼育施設に由来するSPFマウスについて、盲腸内容物中のトリプシン活性とその菌叢を評価した。理研・SPFマウスと、日本エスエルシー株式会社、日本チャールズ・リバー株式会社、及び日本クレア株式会社で維持されたSPFマウス(以下、SLC・SPFマウス、Charles・SPFマウス及び Clea・SPFマウス)を比較した。
上述の検討から、マウスにおいて、大腸の炎症への関与が疑われる盲腸以遠のトリプシン活性を、特定の腸内細菌種が低下させる可能性が示唆された。この仮説に基づけば、特定の腸内細菌種を盲腸以遠に定着させる事で、トリプシン活性を抑制し、ひいては大腸の炎症の緩和が期待できる。そこで将来的な臨床応用を想定し、ヒト由来の腸内細菌を用いたトリプシン活性の制御について検討した。
[健常者の便由来の35菌株は、マウス便中トリプシン活性を低下させる]
前述の検討において特に低いトリプシン活性を示した健常者ボランティアCの便について、盲腸以遠のトリプシン活性を低下させる細菌種の探索を行った。健常者ボランティアCの便をGFマウスに経口的に胃内投与し、その24時間後から、抗生物質のアンピシリン(Amp)、タイロシン(Tylosin)、あるいはメトロニダゾール(MNZ)を自由飲水により投与した。
前述のトリプシン活性を低下させる機能を有する35菌株のうち、その機能を司る責任菌の同定を行った。具体的には、各種抗生物質を投与しながら健常者ボランティア ドナーCの便由来の菌をGFマウスに定着させる検討において、抗生物質投与12日後の、16SrRNA解析に基づく腸内細菌の相対占有率と便中トリプシン活性値のSpearman順位相関解析を行った。
前述の9菌株は、図9に示すとおり、Bacteroides属の3菌株を含む群と非Bacteroides属の6菌株に分類できる。トリプシンの活性を低下させる機能が系統的に保存されていると仮定する場合、責任菌はいずれか一方の群にのみ含まれると考えられる。そこで、上記検討と同様に、前者のBacteroides属を投与した群(以下、3-mix投与群)及び後者の非Bacteroidesを投与した群(以下、6-mix投与群)について評価した。
責任菌の更なる絞り込みを目的として、in vitroにてトリプシンと単培養した菌を共存させ、トリプシンのタンパク質量の変化を評価した。
前述のとおり、健常者の便から単離したP.clara 1C4株がマウスの活性型トリプシンの量を減少させる事を、in vitroで実証した。次に、前述のin vitro実験系をヒトのトリプシンに適用し、その機能の有効性を検証した。すなわち、嫌気チャンバー内において、単培養したP.clara 1C4株とリコンビナントのヒトトリプシンを共培養し、12時間後のトリプシン量をWBにより評価した。その結果、図には示さないが、P.clara 1C4株と共培養した場合にのみ、ヒトトリプシンのタンパク質量の減少が認められた。以上の結果から、健常者の便から単離したP.clara 1C4株は、ヒトのトリプシンのタンパク質量を減少させることが判明した。
[トリプシン活性を低下させる細菌カクテル投与により大腸組織の炎症が抑制される]
大腸炎モデルマウスを用いて、同定した前記3菌株(3-mix)の炎症の緩和の可能性を検討した。大腸炎モデルマウスには、IL10-/-腸炎発症モデル及びDSS誘導モデルを選択した。前者については、IL10-/-マウス個体を無菌化したのち、UC患者の便中から単離された腸炎誘導菌であるEnterobacter aerogenes 11E12株を感染させたモデルを適用した。
[Paraprevotella属はトリプシン活性を低下させる]
P.clara 1C4株に認められたトリプシン活性を低下させる機能の、類縁菌株における保存性を評価した。
[クロスリンク試験]
図14に示すとおり、mPRSS2とP.clara菌を混合し、DSSOで架橋を形成させた場合にのみ、250kDa付近にバンドが検出された。これは、mPRSS2を含まず架橋を形成させた場合には認められないことから、mPRSS2とP.clara菌の構成タンパク質から成る複合タンパク質と推定された。mPRSS2が約32kDaのタンパク質である事を鑑みれば、P.clara菌を構成する220kDa程度のあるタンパク質に対して、トリプシンは優先的に吸着もしくは結合していると考えられる。
図15に示すとおり、TLCK阻害剤を修飾していないhPRSS2とParaprevotella属菌を混合した場合、hPRSS2由来のバンドが薄化しており、hPRSS2の分解が誘導された。一方で、TLCKを修飾してトリプシン活性を失ったTLCK-hPRSS2の場合は、hPRSS2の分解が誘導されなかった。TLCKが不可逆結合に基づくトリプシン活性阻害剤である事を鑑みれば、Paraprevotella属菌によるトリプシンの分解は、トリプシンの自己分解の促進によるものと考えられる。
(2)受託番号:NITE BP-02775
(3)受託日:2018年8月30日
(4)寄託機関:独立行政法人製品評価技術基盤機構
(1)識別の表示:1D4
(2)受託番号:NITE BP-02776
(3)受託日:2018年8月30日
(4)寄託機関:独立行政法人製品評価技術基盤機構
(1)識別の表示:3H3
(2)受託番号:NITE BP-02777
(3)受託日:2018年8月30日
(4)寄託機関:独立行政法人製品評価技術基盤機構
Claims (10)
- Paraprevotella属に属する細菌を有効成分として含有し、前記細菌が受託番号NITE BP-02775にて特定されるParaprevotella claraに属する細菌株である、トリプシン活性を抑制するための組成物。
- Parabacteroides merdae及びBacteroides uniformisからなる群から選択される少なくとも1の細菌を更に含有する、請求項1に記載の組成物。
- 前記Parabacteroides merdaeが、配列番号:4に記載の塩基配列からなるDNAを有する細菌であり、前記Bacteroides uniformisが、配列番号:5に記載の塩基配列からなるDNAを有する細菌である、請求項2に記載の組成物。
- 前記Parabacteroides merdaeが、受託番号NITE BP-02776にて特定されるParabacteroides merdaeに属する細菌株であり、前記Bacteroides uniformisが、受託番号NITE BP-02777にて特定されるBacteroides uniformisに属する細菌株である、請求項2に記載の組成物。
- Paraprevotella属に属する細菌と、
受託番号NITE BP-02776にて特定されるParabacteroides merdaeに属する細菌株、及び、受託番号NITE BP-02777にて特定されるBacteroides uniformisに属する細菌株からなる群から選択される少なくとも1の細菌とを、含有する、トリプシン活性を抑制するための組成物。 - 前記Paraprevotella属に属する細菌が、Paraprevotella clara及びParaprevotella xylaniphilaからなる群から選択される少なくとも1の細菌である、請求項5に記載の組成物。
- 前記Paraprevotella属に属する細菌が、配列番号:1~3のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも90%の同一性を有し、16SrRNAの配列である塩基配列からなるDNAを有する、少なくとも1の細菌である、請求項5に記載の組成物。
- 前記Paraprevotella属に属する細菌が、
Paraprevotella clara JCM14859T株及び
Paraprevotella xylaniphila JCM14860T株
からなる群から選択される少なくとも1の細菌株である、請求項5に記載の組成物。 - 受託番号NITE BP-02775にて特定されるParaprevotella claraに属する細菌株。
- 受託番号NITE BP-02775にて特定されるParaprevotella claraに属する細菌株と、
受託番号NITE BP-02776にて特定されるParabacteroides merdaeに属する細菌株、及び、受託番号NITE BP-02777にて特定されるBacteroides uniformisに属する細菌株からなる群から選択される少なくとも1の細菌との、混合物。
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