JP7109794B2 - Ｔｈ１細胞誘導性細菌に対する抗菌組成物 - Google Patents

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Description

本発明は、平成２７年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構（ＡＭＥＤ）、革新的先端研究開発支援事業、ユニットタイプ「生体恒常性維持・変容・破綻機構のネットワーク的理解に基づく最適医療実現のための技術創出」研究領域（研究開発課題名：「腸内常在細菌特性理解に基づく難治性疾患新規治療法の開発」）委託事業に基づく研究成果として得られたものである。
本発明は、腸管内でＴｈ１細胞の増殖又は活性化を誘導する細菌（以下、「Ｔｈ１細胞誘導性細菌」とも称する）に対する抗菌組成物に関する。また、本発明は、Ｔｈ１細胞に起因する疾患を治療、改善又は予防等するための、医薬組成物又は方法に関する。さらに、本発明は、Ｔｈ１細胞誘導性細菌に対して抗菌活性を有する腸内細菌に関する。また、本発明は、前記腸内細菌を特異的に検出するための物質を含む、Ｔｈ１細胞に起因する疾患を検査するための組成物に関する。さらに、本発明は、Ｔｈ１細胞に起因する疾患を治療、改善又は予防等するための医薬組成物を製造するための前記腸内細菌の使用に関する。
消化管や口腔等の粘膜には多様な常在細菌が存在し、全体としてフローラを形成している。常在菌フローラは、宿主の生理や健康維持に対して非常に大きな役割を果たしている。常在菌フローラの構成異常はＤｙｓｂｉｏｓｉｓとよばれ、様々な疾患の原因となっていることが徐々に明らかになってきている。粘膜常在菌フローラの解明が進めば、様々な疾患に対する新たな疾病対策・治療開発に結びつく可能性が高いものの、その複雑さから詳細なメカニズムは十分明らかになっていない。
ヒトは毎日１．５Ｌほどの唾液を作り出し、飲み込んでいる。通常、唾液に含まれる菌は（口腔内細菌）、腸管をただ単に通過するだけで、定着しない。しかし、ある状況では口腔内細菌が腸管に定着することがある。特にクローン病や、肝硬変、大腸がんにおいて、疾患発症の早期から、口腔内細菌の腸管定着が観察されることが報告されている。そして、定着した口腔内細菌が、疾患の病態に影響を与えることが知られている（非特許文献１～６）。
国際公開２０１８／０８４１７２
Ｙ．Ｃｈｅｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｒｅｐｏｒｔｓ ６，３４０５５（２０１６） Ｄ．Ｇｅｖｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ｈｏｓｔ＆ｍｉｃｒｏｂｅ １５，３８２－３９２（２０１４） Ｃ．Ａ．Ｌｏｚｕｐｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ｈｏｓｔ＆ｍｉｃｒｏｂｅ １４，３２９－３３９（２０１３） Ｉ．Ｖｕｊｋｏｖｉｃ－Ｃｖｉｊｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５，１９３ｒａ１９１（２０１３） Ｎ．Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５１３，５９－６４（２０１４） Ｃ．Ｌ．Ｓｅａｒｓ，Ｗ．Ｓ．Ｇａｒｒｅｔｔ，Ｃｅｌｌ ｈｏｓｔ＆ｍｉｃｒｏｂｅ １５，３１７－３２８（２０１４）
本発明において、腸管に定着することによってクローン病等を誘発する口腔内細菌を標的とする、クローン病等の疾患を治療、改善又は予防する組成物等を提供することを目的とする。
本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、先に、クローン病等の患者の口腔内細菌から、腸管に定着し、Ｔｈ１細胞を誘導することによって、当該疾患の発症に関与する菌を、単離培養し、同定することに成功している（特許文献１）。
より具体的には、本発明者らは、あるクローン病患者由来唾液を無菌マウスに経口投与した結果、大腸においてインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）産生性ＣＤ４陽性Ｔ細胞（Ｔｈ１細胞）が著増することを、見出している。
そして、このＴｈ１細胞の増加が見られたマウスの腸内から、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに属すると考えられるＫｐ２Ｈ７株を単離培養することに成功している。さらに、クローン病患者の唾液由来の当該菌が、腸管に定着し、Ｔｈ１細胞の増殖又は活性化を誘導することによって、腸炎の発症に関与していることも、明らかにしている。
また、ある潰瘍性大腸炎患者の唾液を無菌マウスに経口投与したところ、前述のクローン病患者同様に、大腸においてＴｈ１細胞が顕著に誘導されることも見出している。さらに、Ｔｈ１細胞を誘導する細菌を同定した結果、Ｋｐ２Ｈ７株とは別の株であり、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの近縁種であるＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ａｅｒｏｍｏｂｉｌｉｓに属するＫａ１１Ｅ１２株が、大腸でのＴｈ１細胞の誘導に関与していることも、明らかにしている。
今回、本発明者らは、Ｋｐ２Ｈ７株又はＫａ１１Ｅ１２株を、ＳＰＦ（ｓｐｅｃｉｆｉｃ－ｐａｔｈｏｇｅｎ－ｆｒｅｅ）マウスに経口投与した場合、前記無菌マウスの場合と異なり、これら細菌株の腸内定着が認められないということを見出した。さらに、ＳＰＦマウスに抗生物質を投与することによって、これら細菌株が、当該マウスの腸管に定着できる場合があることも明らかにした。
そして、このような結果から、腸管には、Ｔｈ１細胞誘導性細菌（Ｋｐ２Ｈ７株及びＫａ１１Ｅ１２株等）の腸内定着を阻害する腸内細菌が存在しており、前記抗生物質投与によって、前記腸内細菌が腸管内から排除されることにより、当該細菌の腸内定着が可能となるということを、本発明者らは想定した。
そこで、ヒト腸内細菌において、Ｔｈ１細胞誘導性細菌の腸内定着を抑制する細菌の同定を試みた。その結果、３人の健常人（＃Ｋ、＃Ｆ及び＃Ｉ）由来の糞便試料から、各々６８株、３７株及び４２株の腸内細菌株を単離培養し、また各菌株の１６ＳｒＤＮＡの配列を決定することに成功した。さらに、これら細菌株投与によって、Ｔｈ１細胞誘導性細菌の腸内定着が抑制されることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下を提供するものである。
［１］ 腸内細菌を有効成分として含有する、腸管内でＴｈ１細胞の増殖又は活性化を誘導する細菌に対する抗菌組成物。
［２］ 前記腸内細菌が、配列番号：１～１４７のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する、少なくとも１の細菌である、[１]に記載の抗菌組成物。
［３］ 前記腸内細菌が、配列番号：１～６８のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する、少なくとも１の細菌である、［１］に記載の抗菌組成物。
［４］ 前記腸内細菌が、配列番号：６９～１０５のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する、少なくとも１の細菌である、［１］に記載の抗菌組成物。
［５］ 前記腸内細菌が、配列番号：１０６～１４７のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する、少なくとも１の細菌である、［１］に記載の抗菌組成物。
［６］ 医薬組成物である、［１］～［５］のうちのいずれか一項に記載の抗菌組成物。
［７］ Ｔｈ１細胞に起因する疾患を治療、改善又は予防するための医薬組成物である、［１］～［５］のうちのいずれか一項に記載の抗菌組成物。
［８］ 腸管内でＴｈ１細胞の増殖又は活性化を誘導する細菌に対して、抗菌作用を有する細菌。
［９］ 配列番号：１～１４７のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する、少なくとも１の細菌。
［１０］ 配列番号：１～６８のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する、少なくとも１の細菌。
［１１］ 配列番号：６９～１０５のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する、少なくとも１の細菌。
［１２］ 配列番号：１０６～１４７のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する、少なくとも１の細菌。
［１３］ 腸管内でＴｈ１細胞の増殖又は活性化を誘導する細菌に対して抗菌作用を有する細菌である、［９］～［１２］のうちのいずれか一項に記載の細菌。
［１４］ ［８］～［１３］のうちのいずれか一項に記載の細菌を特異的に認識する抗体を含む、Ｔｈ１細胞に起因する疾患を検査するための組成物。
［１５］ ［８］～［１３］のうちのいずれか一項に記載の細菌に特異的なヌクレオチド配列を検出するためのポリヌクレオチドを含む、Ｔｈ１細胞に起因する疾患を検査するための組成物。
［１６］ ［８］～［１３］のうちのいずれか一項に記載の細菌を、対象に摂取させ、該対象におけるＴｈ１細胞に起因する疾患を治療、改善又は予防する方法。
［１７］ Ｔｈ１細胞に起因する疾患を治療、改善又は予防するための医薬組成物を製造するための、［８］～［１３］のうちのいずれか一項に記載の細菌の使用。
なお、後述の実施例に示すとおり、配列番号：１～６８に記載の塩基配列は、健常人＃Ｋ由来の糞便から単離された６８の細菌株各々の１６ｒＤＮＡの塩基配列であり、配列番号：６９～１０５のうちのいずれかに記載の塩基配列は、健常人＃Ｆ由来の糞便から単離された３７の細菌株各々の１６ｒＤＮＡの塩基配列であり、配列番号：１０６～１４７のうちのいずれかに記載の塩基配列は、健常人＃Ｉ由来の糞便から単離された４２の細菌株各々の１６ｒＤＮＡの塩基配列である。
本発明によれば、Ｔｈ１細胞誘導性細菌の腸管への定着等を抑制することによって、Ｔｈ１細胞の増殖又は活性化の抑制、腸管内免疫の抑制が可能となり、ひいては、Ｔｈ１細胞に起因する疾患を治療、改善又は予防することが可能となる。また、本発明によれば、Ｔｈ１細胞に起因する疾患を検査することも可能となる。
各種抗生物質を投与した後、Ｋｐ２Ｈ７株を摂取させたＳＰＦマウスにおける、当該菌株の腸内定着量の経時的変化についてｑＰＣＲにより解析した結果を示す、グラフである。図中、「Ａｍｐ」はアンピシリンを投与したＳＰＦマウスを示し、「Ｔｙｌ」はタイロシンを投与したＳＰＦマウスを示す。なお、グラフの横軸に完全に重なっている線は、抗生物質を投与しなかったマウス（コントロール）を示し、Ｋｐ２Ｈ７株投与７日目以降、グラフの横軸に重なっている折れ線２本は、メトロニダゾールを投与したＳＰＦマウス、スペクチノマイシンを投与したＳＰＦマウスを各々示す。 各種抗生物質を投与した後、Ｋａ１１Ｅ１２株を摂取させたＳＰＦマウスにおける、当該菌株の腸内定着量の経時的変化についてｑＰＣＲにより解析した結果を示す、グラフである。図中、「ＶＣＭ」はバンコマイシンを投与したＳＰＦマウスを示し、「Ｔｙｌ」はタイロシンを投与したＳＰＦマウスを示す。なお、グラフの横軸に重なっている線は、抗生物質を投与しなかったマウス（コントロール）を示し、Ｋａ１１Ｅ１２株投与７日目以降、グラフの横軸に重なっている折れ線は、メトロニダゾールを投与したＳＰＦマウスを示す。 Ｋｐ２Ｈ７株を接種した無菌マウスへの、健常人（♯Ｋ）由来の糞便試料投与実験の概要を示す、図である。図中、「ＡＢＰＣ」は、アンピシリン投与期間を示し、「ＭＮＺ」は、メトロニダゾール投与期間を示す。 Ｋｐ２Ｈ７株を接種した後、健常人（♯Ｋ）由来の糞便試料を摂取させた無菌マウスにおける、Ｋｐ２Ｈ７株の腸内定着量の経時的変化についてｑＰＣＲにより解析した結果を示す、グラフである。図中、「ＦＭＴ」は、糞便試料の投与日を示し、「ＡＢＰＣ」は、アンピシリン投与期間を示す。 Ｋｐ２Ｈ７株を接種した後、健常人（♯Ｆ）由来の糞便試料を摂取させた無菌マウスにおける、Ｋｐ２Ｈ７株の腸内定着量の経時的変化についてｑＰＣＲにより解析した結果を示す、グラフである。図中、「ＦＭＴ」は、糞便試料の投与日を示す。 Ｋｐ２Ｈ７株を接種した後、健常人（♯Ｉ）由来の糞便試料を摂取させた無菌マウスにおける、Ｋｐ２Ｈ７株の腸内定着量の経時的変化についてｑＰＣＲにより解析した結果を示す、グラフである。図中、「ＦＭＴ」は、糞便試料の投与日を示す。 Ｋｐ２Ｈ７株を接種した後、健常人（♯Ｋ）由来の糞便試料を摂取させた無菌マウスにおける、Ｋｐ２Ｈ７株の腸内定着量の経時的変化についてｑＰＣＲにより解析した結果を示す、グラフである。図中、「ＦＭＴ」は、糞便試料の投与日を示す。 図５～７に示したグラフを重ね合わせた図である。 Ｋｐ２Ｈ７株を接種した後、健常人糞便由来の菌カクテルを摂取させた無菌マウスにおける、Ｋｐ２Ｈ７株の腸内定着量の経時的変化を、ＣＦＵにて示したグラフである。図中、「Ｋ＿４７ｍｉｘ」は、健常人♯Ｋの糞便から単離された細菌株４７種からなるカクテルを投与した無菌マウスを示し、「Ｆ＿３７ｍｉｘ」は、健常人♯Ｆの糞便から単離された細菌株３７種からなるカクテルを投与した無菌マウスを示し、「Ｉ＿４２ｍｉｘ」は、健常人♯Ｉの糞便から単離された細菌株４２種からなるカクテルを投与した無菌マウスを示し、「ｆｅｃｅ Ｉ」は健常人♯I由来の糞便試料を投与した無菌マウスを示す。また、「ＦＭＴ」は、菌カクテル又は糞便試料の投与日を示す。図中の表記については、図１０においても同様である。 Ｋｐ２Ｈ７株を接種した後、健常人糞便由来の菌カクテルを摂取させた無菌マウスにおける、Ｋｐ２Ｈ７株の腸内定着量の経時的変化についてｑＰＣＲにより解析した結果を示す、グラフである。 Ｋｐ２Ｈ７株を接種して７日後に、健常人糞便由来の菌カクテルを摂取させた無菌マウスにおける、Ｋｐ２Ｈ７株の腸内定着量の経時的変化を、ＣＦＵにて示したグラフである。図中、「Ｋ＿６８ｍｉｘ」は、健常人♯Ｋの糞便から単離された細菌株６８種からなるカクテルを投与した無菌マウスを示す。図中の表記については、図１２においても同様である。 Ｋｐ２Ｈ７株を接種して７日後に、健常人糞便由来の菌カクテルを摂取させた無菌マウスにおける、Ｋｐ２Ｈ７株の腸内定着量の経時的変化についてｑＰＣＲにより解析した結果を示す、グラフである。
後述の実施例において示すとおり、本発明者らによって、腸管内でＴｈ１細胞の増殖又は活性化を誘導する細菌の腸管への定着等が、腸内細菌によって抑制されることが明らかになった。
したがって、本発明は、腸内細菌を有効成分として含有する、腸管内でＴｈ１細胞の増殖又は活性化を誘導する細菌（Ｔｈ１細胞誘導性細菌）に対する抗菌組成物を提供する。
先ず、当該組成物の抗菌作用の対象となる、腸管内でＴｈ１細胞の増殖又は活性化を誘導する細菌について説明する。
（腸管内でＴｈ１細胞を誘導する細菌）
本発明において、「腸管内でＴｈ１細胞の増殖又は活性化を誘導する細菌」は、通常ヒトの口腔内に存在しているが、腸管内に定着することにより、Ｔｈ１細胞の増殖又は活性化を誘導する細菌である。好ましくは、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａに属し、より好ましくは、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ又はＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ａｅｒｏｍｏｂｉｌｉｓに属し、かつ腸管内でＴｈ１細胞の増殖又は活性化を誘導する細菌である。「腸管内でＴｈ１細胞の増殖又は活性化を誘導する細菌」は、好ましくは、抗菌剤の投薬により健常状態と比較して多様性が変化した腸内環境において、定着しやすい細菌である。また、大腸炎等により健常状態と比較して多様性が変化した腸内環境において、定着しやすい細菌でもある。
「腸管内でＴｈ１細胞の増殖又は活性化を誘導する細菌」の具体例としては、特許文献１に記載のとおり、本発明者らによって、腸管内に定着するとＴｈ１細胞の顕著な誘導が生じることが明らかになっている、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａに属するＫｐ２Ｈ７株、Ｋａ１１Ｅ１２株、３４Ｅ１株、ＢＡＡ－１７０５株、７００６０３株又は４０Ｂ３株が挙げられる。
なお、Ｋｐ２Ｈ７株、Ｋａ１１Ｅ１２株、３４Ｅ１株及び４０Ｂ３株は、通常ヒトの口腔内に存在する細菌（口腔内細菌）である。また、ＢＡＡ－１７０５株及び７００６０３株も、通常ヒトの口腔内に存在する菌であるが、ヒトの尿において検出された細菌（尿中細菌）である。
また、これら菌株間において、大腸Ｔｈ１細胞の誘導レベル及びゲノム配列を比較した結果、下記表１～１０に示すとおり、本発明者らによって、Ｔｈ１細胞の増殖又は活性化の誘導の誘導に関連する、機能が既に知られている６４の遺伝子が見出されている。
したがって、本発明の「腸管内でＴｈ１細胞の増殖又は活性化を誘導する細菌」は、好ましくは、前記６４の遺伝子が各々コードする下記タンパク質群から選択される少なくとも５のタンパク質をコードする遺伝子を保有し、より好ましくは、下記タンパク質群から選択される少なくとも１０のタンパク質をコードする遺伝子を保有し、さらに好ましくは、下記タンパク質群から選択される少なくとも２０のタンパク質をコードする遺伝子を保有し、より好ましくは、下記タンパク質群から選択される少なくとも３０のタンパク質をコードする遺伝子を保有し、さらに好ましくは、下記タンパク質群から選択される少なくとも５０のタンパク質をコードする遺伝子を保有する。
タンパク質群：
マンノース－１－リン酸グアニルトランスフェラーゼ１（Ｍａｎｎｏｓｅ－１－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｇｕａｎｙｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １）、
マルチホスホリル転移タンパク質（Ｍｕｌｔｉｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）、
ＰＴＳ系フルクトース特異的ＥＩＩＡＢＣ構成タンパク質（ＰＴＳ ｓｙｓｔｅｍ ｆｒｕｃｔｏｓｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＥＩＩＡＢＣ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）、
ホスホマンノムターゼ／ホスホグルコムターゼ（Ｐｈｏｓｐｈｏｍａｎｎｏｍｕｔａｓｅ／ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｍｕｔａｓｅ）、
マンノシルフルクトース－リン酸合成酵素（Ｍａｎｎｏｓｙｌｆｒｕｃｔｏｓｅ－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）、
３－オキソアシル［アシル輸送タンパク質］レダクターゼ ＦａｂＧ（３－ｏｘｏａｃｙｌ－［ａｃｙｌ－ｃａｒｒｉｅｒ－ｐｒｏｔｅｉｎ］ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ＦａｂＧ）、
ラムノシル／マンノシルトランスフェラーゼ（ｒｈａｍｎｏｓｙｌ／ｍａｎｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、
ガラクチトール－１－リン酸５－デヒドロゲナーゼ（Ｇａｌａｃｔｉｔｏｌ－１－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ５－ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、
ガラクチトールパーミアーゼＩＩＣ構成タンパク質（Ｇａｌａｃｔｉｔｏｌ ｐｅｒｍｅａｓｅ ＩＩＣ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）、
ガラクチトール特異的ホスホトランスフェラーゼ酵素ＩＩＢ構成タンパク質（Ｇａｌａｃｔｉｔｏｌ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｅｎｚｙｍｅ ＩＩＢ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）、
Ｄ－タガトース－１，６－ビスリン酸アルドラーゼサブユニット ＧａｔＺ（Ｄ－ｔａｇａｔｏｓｅ－１，６－ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｌｄｏｌａｓｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ＧａｔＺ）、
タガトース－６－リン酸キナーゼ（Ｔａｇａｔｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｋｉｎａｓｅ）、
Ｄ－タガトース－１，６－ビスリン酸アルドラーゼサブユニット ＧａｔＹ（Ｄ－ｔａｇａｔｏｓｅ－１，６－ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｌｄｏｌａｓｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ＧａｔＹ）、
ガラクチトールパーミアーゼＩＩＣ構成タンパク質（Ｇａｌａｃｔｉｔｏｌ ｐｅｒｍｅａｓｅ ＩＩＣ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）、
ＧＤＰ－マンノース－依存性 α－（１－２）－ホスファチジルイノシトール マンノシルトランスフェラーゼ（ＧＤＰ－ｍａｎｎｏｓｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｌｐｈａ－（１－２）－ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ ｍａｎｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、
Ｌ－キシルロース／３－ケト－Ｌ－グロン酸キナーゼ（Ｌ－ｘｙｌｕｌｏｓｅ／３－ｋｅｔｏ－Ｌ－ｇｕｌｏｎａｔｅ ｋｉｎａｓｅ）、
２－デヒドロ－３－デオキシグルコノキナーゼ（２－ｄｅｈｙｄｒｏ－３－ｄｅｏｘｙｇｌｕｃｏｎｏｋｉｎａｓｅ）、
莢膜グルカン合成酵素（Ｃａｐｓｕｌａｒ ｇｌｕｃａｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ）、
３－オクタプレニル－４－ヒドロキシベンゾエートカルボキシ－リアーゼ パートナータンパク質（３－ｏｃｔａｐｒｅｎｙｌ－４－ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏａｔｅ ｃａｒｂｏｘｙ－ｌｙａｓｅ ｐａｒｔｎｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）、
２－オクタプレニルフェノールヒドロキシラーゼ（２－ｏｃｔａｐｒｅｎｙｌｐｈｅｎｏｌ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）、
フェノール酸デカルボキシラーゼ サブユニットＣ（Ｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ ｓｕｂｕｎｉｔ Ｃ）、
オキサロ酢酸デカルボキシラーゼβ鎖（Ｏｘａｌｏａｃｅｔａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ ｂｅｔａ ｃｈａｉｎ）、
アコニット酸ヒドラターゼ２（Ａｃｏｎｉｔａｔｅ ｈｙｄｒａｔａｓｅ ２）、
推定アルドラーゼ ＬｓｒＦ（Ｐｕｔａｔｉｖｅ ａｌｄｏｌａｓｅ ＬｓｒＦ）、
推定アセチルトランスフェラーゼ（Ｐｕｔａｔｉｖｅ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、
プロパンジオール利用タンパク質 ＰｄｕＡ（Ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ＰｄｕＡ）、
推定グリコシルトランスフェラーゼ ＥｐｓＦ（Ｐｕｔａｔｉｖｅ ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ＥｐｓＦ）、
へミン結合ペリプラズムタンパク質 ＨｍｕＴ前駆体（Ｈｅｍｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ＨｍｕＴ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）、
タイコ酸排出ＡＴＰ結合タンパク質 ＴａｇＨ（Ｔｅｉｃｈｏｉｃ ａｃｉｄｓ ｅｘｐｏｒｔ ＡＴＰ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ＴａｇＨ）、
タイコ酸移行透過タンパク質 ＴａｇＧ（Ｔｅｉｃｈｏｉｃ ａｃｉｄ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｐｅｒｍｅａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ＴａｇＧ）、
外膜タンパク質 ＴｏｌＣ前駆体（Ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ＴｏｌＣ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）、
多剤輸送体 ＥｍｒＥ（Ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ＥｍｒＥ）、
マグネシウム及びコバルト排出タンパク質 ＣｏｒＣ（Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ａｎｄ ｃｏｂａｌｔ ｅｆｆｌｕｘ ｐｒｏｔｅｉｎ ＣｏｒＣ）、
内膜タンパク質 ＹｉｂＨ（Ｉｎｎｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ＹｉｂＨ）、
アスパラギン酸／アラニン交換輸送体（Ａｓｐａｒｔａｔｅ／ａｌａｎｉｎｅ ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒ）、
鉄エンテロバクチン受容体前駆体（Ｆｅｒｒｉｃ ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）、
シグナル伝達ヒスチジン－プロテインキナーゼ ＢａｒＡ（Ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＢａｒＡ）、
ヘモリシン輸送タンパク質 ＳｈｌＢ前駆体（Ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ＳｈｌＢ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）、
オリゴペプチド輸送ＡＴＰ結合タンパク質 ＯｐｐＤ（Ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ＡＴＰ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ＯｐｐＤ）、
ヒ素ポンプ－駆動ＡＴＰアーゼ（Ａｒｓｅｎｉｃａｌ ｐｕｍｐ－ｄｒｉｖｉｎｇ ＡＴＰａｓｅ）、
推定抗シグマ因子アンタゴニスト（Ｐｕｔａｔｉｖｅ ａｎｔｉ－ｓｉｇｍａ ｆａｃｔｏｒ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）、
推定膜タンパク質 ＹｄｆＫ（Ｐｕｔａｔｉｖｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ＹｄｆＫ）、
推定ヘモグロビン及びヘモグロビン－へパトグロビン結合タンパク質２前駆体（Ｐｕｔａｔｉｖｅ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ａｎｄ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ－ｈａｐｔｏｇｌｏｂｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ２ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）、
（２Ｒ）－３－スルホ乳酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ（＋））（（２Ｒ）－３－ｓｕｌｆｏｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ （ＮＡＤＰ（＋）））、
ぺプチダーゼＥ（Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ Ｅ）、
オリゴペプチダーゼＡ（Ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ Ａ）、
ホスフィノトリシン Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ（Ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ Ｎ－ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、
推定２－ヒドロキシ酸デヒドロゲナーゼ ＹｏａＤ（Ｐｕｔａｔｉｖｅ ２－ｈｙｄｒｏｘｙａｃｉｄ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ＹｏａＤ）、
ｍＲＮＡインターフェラーゼ ＲｅｌＥ（ｍＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒａｓｅ ＲｅｌＥ）、
一本鎖ＤＮＡ特異的エクソヌクレアーゼ ＲｅｃＪ（Ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ－ＤＮＡ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ ＲｅｃＪ）、
チロシンリコンビナーゼ ＸｅｒＤ＿６（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ ＸｅｒＤ＿６）、
チロシンリコンビナーゼ ＸｅｒＤ（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ ＸｅｒＤ）、
グルシトールオペロンリプレッサー（Ｇｌｕｃｉｔｏｌ ｏｐｅｒｏｎ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ）、
ギ酸塩ヒドロゲンリアーゼ転写活性因子（Ｆｏｒｍａｔｅ ｈｙｄｒｏｇｅｎｌｙａｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）、
ＨＴＨ－タイプ転写制御因子 ＴｄｆＲ（ＨＴＨ－ｔｙｐｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ＴｄｆＲ）、
ＨＴＨ－タイプ転写制御因子 ＣａｔＭ（ＨＴＨ－ｔｙｐｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ＣａｔＭ）、
転写制御タンパク質 ｔｃｔＤ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｃｔＤ）、
ＨＴＨ－タイプ転写抑制因子 ＡｓｅＲ（ＨＴＨ－ｔｙｐｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ ＡｓｅＲ）、
サイクリックｄｉ－ＧＭＰホスホジエステラーゼ ＹａｈＡ（Ｃｙｃｌｉｃ ｄｉ－ＧＭＰ ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ ＹａｈＡ）、
セリン－プロテインキナーゼ ＲｓｂＷ（Ｓｅｒｉｎｅ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＲｓｂＷ）、
繊維状赤血球凝集素（Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、
ジヒドロプテロイン酸合成酵素（Ｄｉｈｙｄｒｏｐｔｅｒｏａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）、
δ－アミノレブリン酸デヒドラターゼ（Ｄｅｌｔａ－ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）、
好気呼吸制御タンパク質 ＡｒｃＡ（Ａｅｒｏｂｉｃ ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ＡｒｃＡ）。
Figure 0007109794000001
Figure 0007109794000002
Figure 0007109794000003
Figure 0007109794000004
Figure 0007109794000005
Figure 0007109794000006
Figure 0007109794000007
Figure 0007109794000008
Figure 0007109794000009
Figure 0007109794000010
なお、これら表において、２２４２、２５５２、ＫＰ－１、７００７２１、１３８８２、４０Ｂ３，３４Ｅ１，１７０５、１１Ｅ１２、７００６０３及び２Ｈ７は、後述の２２４２株、ＢＡＡ－２５５２株、ＫＰ－１株、７００７２１株、１３８８２株、４０Ｂ３株、３４Ｅ１株、ＢＡＡ－１７０５株、Ｋａ１１Ｅ１２株、７００６０３株及びＫｐ２Ｈ７株を各々示す。また、弱、中間及び強は、各菌株の腸管内でＴｈ１細胞の増殖又は活性化を誘導する作用の程度を示す。
表１は、前記大腸Ｔｈ１細胞の誘導に関連する遺伝子において、炭水化物代謝に関連する遺伝子のアノテーション及び情報（ＫＥＧＧ又はＵｎｉＰｒｏｔ）を示し、表２は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａに属する菌株における、大腸Ｔｈ１細胞の誘導レベルの程度と、前記炭水化物代謝に関連する遺伝子の保有の程度とを示す。
表３は、前記大腸Ｔｈ１細胞の誘導に関連する遺伝子において、膜輸送に関連する遺伝子のアノテーション及び情報（ＫＥＧＧ又はＵｎｉＰｒｏｔ）を示し、表４は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａに属する菌株における、大腸Ｔｈ１細胞の誘導レベルの程度と、前記膜輸送に関連する遺伝子の保有の程度とを示す。
表５は、前記大腸Ｔｈ１細胞の誘導に関連する遺伝子において、アミノ酸代謝に関連する遺伝子のアノテーション及び情報（ＫＥＧＧ又はＵｎｉＰｒｏｔ）を示し、表６は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａに属する菌株における、大腸Ｔｈ１細胞の誘導レベルの程度と、前記アミノ酸代謝に関連する遺伝子の保有の程度とを示す。
表７は、前記大腸Ｔｈ１細胞の誘導に関連する遺伝子において、遺伝子制御に関連する遺伝子のアノテーション及び情報（ＫＥＧＧ又はＵｎｉＰｒｏｔ）を示し、表８は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａに属する菌株における、大腸Ｔｈ１細胞の誘導レベルの程度と、前記遺伝子制御に関連する遺伝子の保有の程度とを示す。
表９は、前記大腸Ｔｈ１細胞の誘導に関連する遺伝子において、表１～８以外のその他の遺伝子のアノテーション及び情報（ＫＥＧＧ又はＵｎｉＰｒｏｔ）を示し、表１０は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａに属する菌株における、大腸Ｔｈ１細胞の誘導レベルの程度と、前記その他の遺伝子の保有の程度とを示す。
また、表１～１０において、これらタンパク質は、特定のアミノ酸配列（ＫＥＧＧ又はＵｎｉＰｒｏｔのＩＤによって規定されるアミノ酸配列）をもって特定しているが、本発明にかかるタンパク質は、これら典型的なアミノ酸配列をもって特定されるタンパク質のみならず、機能的に活性なその誘導体、機能的に活性なそのフラグメント、その相同体、高ストリンジェンシー条件又は低ストリンジェンシー条件下で、このタンパク質をコードする核酸にハイブリダイズする核酸にコードされる変異体も含まれる。また、このような誘導体、フラグメント、相同体又は変異体には、前記特定のアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％（好ましくは７０％、より好ましくは８０％、さらに好ましくは９０％、より好ましくは９５％、特に好ましくは９９％）の相同性を有するタンパク質が含まれる。
なお、配列（アミノ酸配列又はヌクレオチド（塩基）配列）の相同性又は同一性は、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ、基本ローカルアラインメント検索）のプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３－４１０，１９９０）を利用して決定することができる。該プログラムは、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：２２６４－２２６８，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３－５８７７，１９９３）に基づいている。ＢＬＡＳＴによって、配列間の相同性又は同一性を解析する場合には、例えば、米国国立生物学情報センター（ＮＣＢＩ）のＢＬＡＳＴ等を利用して（例えば、デフォルト、すなわち初期設定のパラメータを用いて）決定することができる。
表１及び２に示すとおり、本発明にかかるタンパク質には、マンノース、フルクトース又はガラクトースの代謝に関与するタンパク質が含まれる。したがって、「腸管内でＴｈ１細胞の増殖又は活性化を誘導する細菌」は、マンノースあるいはフルクトースあるいはガラクトース代謝に関与する遺伝子を発現していることが好ましい。
また、「腸管内でＴｈ１細胞の増殖又は活性化を誘導する細菌」は、好ましくは、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａに属し、莢膜（ｃａｐｓｕｌｅ）を形成せず、かつ腸管内でＴｈ１細胞の増殖又は活性化を誘導する細菌であり、より好ましくは、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに属し、莢膜を形成せず、外膜小胞（ＯＭＶ）又はＯＭＶ様構造体を産生し、かつ腸管内でＴｈ１細胞の増殖又は活性化を誘導する細菌である。
また、「腸管内でＴｈ１細胞の増殖又は活性化を誘導する細菌」は、好ましくは、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａに属し、鞭毛を有する細菌であり、また好ましくは、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａに属し、ＴＬＲ５への刺激性を有する細菌である。
本発明の「腸管内でＴｈ１細胞の増殖又は活性化を誘導する細菌」として、上記のとおり、典型的には、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａに属するＫｐ２Ｈ７株、Ｋａ１１Ｅ１２株、３４Ｅ１株、ＢＡＡ－１７０５株、７００６０３株、４０Ｂ３株が挙げられる。これらの中で、より好ましくは、Ｋｐ２Ｈ７株又はＫａ１１Ｅ１２株であり、特に好ましくは、Ｋｐ２Ｈ７株である。なお、これら細菌の詳細については、表１１を参照のほど。
Figure 0007109794000011
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａに属する細菌、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ａｅｒｏｍｏｂｉｌｉｓに属する細菌、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに属する細菌、Ｋｐ２Ｈ７株、Ｋａ１１Ｅ１２株、３４Ｅ１株、ＢＡＡ－１７０５株、７００６０３株、４０Ｂ３株は、例えば、１６ＳｒＲＮＡをコードするヌクレオチド配列（１６ＳｒＤＮＡの塩基配列等）を決定することによって同定することができる。また、これら細菌に特異的なヌクレオチド配列等を指標として同定することもできる。なお、Ｋｐ２Ｈ７株又はＫａ１１Ｅ１２株に特異的なヌクレオチド配列として、特に制限はないが、好ましくは、Ｋｐ２Ｈ７株又はＫａ１１Ｅ１２株は有するが、これら株と同じくＫｌｅｂｓｉｅｌｌａに属するＢＡＡ－２５５２株及び７００７２１株においては認められないヌクレオチド配列（より好ましくは、ＢＡＡ－２５５２株、ＫＣＴＣ２２４２株、ＫＰ－１株、７００７２１株及び１３８８２株においては認められないヌクレオチド配列）が、挙げられる。
なお、７００７２１株、１３８８２株、ＫＰ－１株、ＢＡＡ－２５５２株及びＫＣＴＣ２２４２株は、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株であるが、腸管内でＴｈ１細胞の増殖又は活性化を誘導する作用は弱い又は中程度である（これらの菌については、表１～１１及び特許文献１参照）。
また、本発明の「腸管内でＴｈ１細胞の増殖又は活性化を誘導する細菌」としては、Ｋｐ２Ｈ７株、Ｋａ１１Ｅ１２株、３４Ｅ１株、ＢＡＡ－１７０５株、７００６０３株又は４０Ｂ３株の１６ＳｒＲＮＡをコードするヌクレオチド配列と９０％以上（９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の同一性を有するヌクレオチド配列からなるＤＮＡを含有する細菌が挙げられ、また、Ｋｐ２Ｈ７株、Ｋａ１１Ｅ１２株、３４Ｅ１株、ＢＡＡ－１７０５株、７００６０３株又は４０Ｂ３株に特異的なヌクレオチド配列と７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上（９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上））の相同性又は同一性を有するヌクレオチド配列からなるＤＮＡを含有する細菌も挙げられる。
本発明において、「Ｔｈ１細胞」とは、ＣＤ４陽性のヘルパーＴ細胞（Ｔｈ細胞）の亜群であり、細胞性免疫を増強させる細胞を意味する。また、「Ｔｈ１細胞の活性」とは、該細胞によるＴｈ１サイトカイン（ＩＦＮ－γ等）の産生、該サイトカインによるマクロファージ、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）等の細胞の活性化、該活性化による細胞性免疫の増強を含む意味である。さらに、「Ｔｈ１細胞の増殖又は活性化の誘導」とは、Ｔｈ１細胞の増殖又は活性化に至る、ナイーブＴ細胞からＴｈ１細胞への分化誘導も含む意味である。
腸管内におけるＴｈ１細胞を増殖又は活性化を誘導する作用は、Ｔｈ１細胞特異的なマーカー（例えば、ＣＤ４及びＩＦＮ－γ）を定量的に検出することによって、評価することができる。かかる定量的な検出は、公知の手法によって行うことができ、例えば、フローサイトメトリー、イメージングサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ法、ラジオイムノアッセイ、免疫組織化学的染色法、免疫沈降法、イムノブロッティング、抗体アレイ解析法等の抗体を用いて検出する方法（免疫学的手法）によって行うことができる。
任意の菌等が、腸管内におけるＴｈ１細胞を増殖又は活性化を誘導する作用を有しているか否かは、例えば、フローサイトメトリーによって検出された腸管内におけるＣＤ４＋ＴＣＲβ＋Ｔ細胞における、ＩＦＮ－γ＋細胞の割合が、１０％以上であった場合に、前記菌等が、腸管内におけるＴｈ１細胞を増殖又は活性化を誘導する作用を有していると判定することができる（２５％以上であった場合に、前記菌等が、腸管内におけるＴｈ１細胞を増殖又は活性化を誘導する作用を有していると判定することが好ましく、３０％以上であった場合に、前記菌、物質等が、腸管内におけるＴｈ１細胞を増殖又は活性化を誘導する作用を有していると判定することがより好ましい）。
次に、本発明の抗菌組成物の有効成分として含まれる、腸内細菌について説明する。
（腸内細菌）
本発明において、抗菌組成物の有効成分として含まれる腸内細菌は、腸管内でＴｈ１細胞の増殖又は活性化を誘導する細菌に対して抗菌作用を有する。
本発明において、「抗菌活性」とは、細菌の活動を抑制する活性、より具体的には、細菌の増殖若しくは定着を抑制し、又は細菌死滅させる活性を意味する。
「腸内細菌」とは、動物の腸管内に存在する細菌を意味する。また、かかる細菌が存在する動物としては、ヒト、非ヒト動物（マウス、ラット、サル、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、カモ、ダチョウ、アヒル、イヌ、ネコ、ウサギ、ハムスター等）が挙げられるが、これら動物の中では、ヒトが好ましい。
本発明において「腸内細菌」は、１株の細菌であってもよく、複数株の細菌から構成される細菌株の混合物であってもよい。なお、複数株の細菌から構成される場合には、そのうちの少なくとも１の細菌株がＴｈ１細胞誘導性細菌に対する抗菌活性を有していることが望ましい。また、そのような場合、前記複数株の細菌には、前記抗菌活性を有していない細菌株であっても、前記抗菌活性を有している細菌株の当該活性を増強する作用を有する細菌株、前記抗菌活性を有している細菌株の増殖を維持する作用を有する細菌株、前記抗菌活性を阻害する細菌に対して当該阻害活性を抑制する作用を有する細菌株が含まれていてもよい。
本発明において「腸内細菌」としては、例えば、配列番号：１～１４７のうちのいずれかに記載の塩基配列若しくは当該塩基配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する、少なくとも１の細菌、配列番号：１～６８のうちのいずれかに記載の塩基配列若しくは当該塩基配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する、少なくとも１の細菌、配列番号：６９～１０５のうちのいずれかに記載の塩基配列若しくは当該塩基配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する、少なくとも１の細菌、又は配列番号：１０６～１４７のうちのいずれかに記載の塩基配列若しくは当該塩基配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する、少なくとも１の細菌が挙げられる。
なお、本発明の腸内細菌における「少なくとも７０％の同一性」とは、各塩基配列に対する同一性が、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上）、より好ましくは９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上）、特に好ましくは９９％以上である。
本発明において、配列番号：１～１４７のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する「腸内細菌」として、好ましくは、それら腸内細菌群の内の少なくとも１５の細菌であり、より好ましくは、前記腸内細菌群の内の少なくとも３０の細菌であり、さらに好ましくは、前記腸内細菌群の内の少なくとも７５の細菌であり、より好ましくは、前記腸内細菌群の内の少なくとも１２０の細菌であり、さらに好ましくは、前記腸内細菌群の内の少なくとも１３５の細菌であり、より好ましくは、前記腸内細菌群の内の少なくとも１４０の細菌であり、さらに好ましくは、配列番号：１～１４７のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを、各々有する１４７の腸内細菌であり、特に好ましくは、配列番号：１～１４７のうちのいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡを各々有する１４７の細菌である。
本発明において、配列番号：１～６８のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する「腸内細菌」として、好ましくは、それら腸内細菌群の内の少なくとも７の細菌であり、より好ましくは、前記腸内細菌群の内の少なくとも１５の細菌であり、さらに好ましくは、前記腸内細菌群の内の少なくとも３５の細菌であり、より好ましくは、前記腸内細菌群の内の少なくとも６０の細菌であり、さらに好ましくは、前記腸内細菌群の内の少なくとも６５の細菌でありより好ましくは、配列番号：１～６８のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを、各々有する６８の腸内細菌であり、特に好ましくは、配列番号：１～６８のうちのいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡを各々有する６８の細菌である。また、配列番号：１～６８のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する「腸内細菌」としては、アンピシリンに対して抵抗性を有していることが望ましい。また、後述の実施例に示すとおり、配列番号：１～４６のうちのいずれかに記載の塩基配列若しくは当該塩基配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを、各々有する４６の細菌も、本発明において好適に用いられる。
本発明において、配列番号：６９～１０５のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する「腸内細菌」として、好ましくは、それら腸内細菌群の内の少なくとも４の細菌であり、より好ましくは、前記腸内細菌群の内の少なくとも８の細菌であり、さらに好ましくは、前記腸内細菌群の内の少なくとも１９の細菌であり、より好ましくは、前記腸内細菌群の内の少なくとも３０の細菌であり、さらに好ましくは、前記腸内細菌群の内の少なくとも３３の細菌であり、より好ましくは、前記腸内細菌群の内の少なくとも３５の細菌であり、さらに好ましくは、配列番号：６９～１０５のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを、各々有する３７の腸内細菌であり、特に好ましくは、配列番号：６９～１０５のうちのいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡを各々有する３７の細菌である。また、配列番号：６９～１０５のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する「腸内細菌」としては、アンピシリンに対して感受性を有していることが望ましい。
本発明において、配列番号：１０６～１４７のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する「腸内細菌」として、好ましくは、それら腸内細菌群の内の少なくとも４の細菌であり、より好ましくは、前記腸内細菌群の内の少なくとも９の細菌であり、さらに好ましくは、前記腸内細菌群の内の少なくとも２２の細菌であり、より好ましくは、前記腸内細菌群の内の少なくとも３４の細菌であり、さらに好ましくは、前記腸内細菌群の内の少なくとも３９の細菌であり、より好ましくは、前記腸内細菌群の内の少なくとも４１の細菌であり、さらに好ましくは、配列番号：１０６～１４７のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを、各々有する４２の腸内細菌であり、特に好ましくは、配列番号：１０６～１４７のうちのいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡを各々有する４２の細菌である。また、配列番号：１０６～１４７のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する「腸内細菌」としては、アンピシリンに対して感受性を有していることが望ましい。
また、本発明において、「腸内細菌」の一態様としては、後述の実施例において示すとおり、スペクチノマイシンからなる群から選択される少なくとも一の化合物に対する抵抗性、及び／又は、アンピシリン、タイロシン及びクロロホルムからなる群から選択される少なくとも一の化合物に対する感受性を示す腸内細菌が挙げられる。また、別の態様として、メトロニダゾールに対する抵抗性、及び／又は、バンコマイシン及びタイロシンからなる群から選択される少なくとも一の化合物に対する感受性を示す腸内細菌が挙げられる。
＜抗菌組成物及び医薬組成物＞
本発明の組成物は、前述の腸内細菌を含むものであればよく、当該細菌は、生菌であってもよく、死菌体であってもよい。また、組成物を複合して用いることができ、結果として併用して摂取又は吸収される場合（併用組成物の場合）、前述の腸内細菌は２種以上の組成物の中に分けて存在することもできる。
本発明の組成物は、医薬組成物、飲食品（動物用飼料を含む）、あるいは研究目的（例えば、インビトロやインビボの実験）に用いられる試薬の形態であり得る。
本発明の組成物は、腸管内でＴｈ１細胞の増殖又は活性化を誘導する細菌の腸管内におけるＴｈ１細胞の誘導及び免疫を抑制するため、Ｔｈ１細胞に起因する疾患の治療、予防又は改善のための医薬組成物、飲食品として、好適に用いられる。
本発明の組成物は、公知の製剤学的方法により製剤化することができる。例えば、カプセル剤、錠剤、丸剤、液剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、フィルムコーティング剤、ペレット剤、トローチ剤、舌下剤、咀嚼剤、バッカル剤、ペースト剤、シロップ剤、懸濁剤、エリキシル剤、乳剤、塗布剤、軟膏剤、硬膏剤、パップ剤、経皮吸収型製剤、ローション剤、吸引剤、エアゾール剤、注射剤、坐剤等として、経口的、非経口的（例えば、腸管内、筋肉内、静脈内、気管内、鼻内、経皮、皮内、皮下、眼内、膣、腹腔内、直腸若しくは吸入）、又はこれらの複数の組み合わせからなる経路による投与用に使用することができる。
これら製剤化においては、薬理学上若しくは飲食品として許容される担体、具体的には、滅菌水、生理食塩水、緩衝液、培地、植物油、溶剤、基剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、芳香剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤、希釈剤、等張化剤、無痛化剤、増量剤、崩壊剤、緩衝剤、コーティング剤、滑沢剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等と適宜組み合わせることができる。
また、これら製剤化においては、腸管内におけるＴｈ１細胞の増殖又は活性化及び免疫をより効率的に抑制する等の観点から、特に経口投与を目的とする製剤においては、本発明の組成物を腸管内に効率良く送達することを可能にする組成物と組み合わせてもよい。このような腸管内への送達を可能とする組成物については特に制限されることなく、公知の組成物を適宜採用することができ、例えば、ｐＨ感受性組成物、腸管までの放出を抑制する組成物（セルロース系ポリマー、アクリル酸重合体及び共重合体、ビニル酸重合体及び共重合体等）、腸管粘膜特異的に接着する生体接着性組成物（例えば、米国特許第６．３６８．５８６号明細書に記載のポリマー）、プロテアーゼ阻害剤含有組成物、腸管内酵素によって特異的に分解される組成物）が挙げられる。
また、本発明の抗菌組成物を医薬組成物として用いる場合には、Ｔｈ１細胞に起因する疾患の治療、予防又は改善に用いられる公知の物質（例えば、抗炎症剤、免疫抑制剤）を更に含んでいてもよく、またかかる物質と併用してもよい。
本発明の組成物を飲食品として用いる場合、当該飲食品は、例えば、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品、栄養補助食品、病者用食品、あるいは動物用飼料であり得る。飲食品の具体例としては、発酵飲料、油分を含む製品、スープ類、乳飲料、清涼飲料水、茶飲料、アルコール飲料、ドリンク剤、ゼリー状飲料等の液状食品、炭水化物含有食品、畜産加工食品、水産加工食品；野菜加工食品、半固形状食品、発酵食品、菓子類、レトルト製品、電子レンジ対応食品等が挙げられる。さらには、粉末、穎粒、錠剤、カプセル剤、液状、ペースト状又はゼリー状に調製された健康飲食品も挙げられる。なお、本発明における飲食品の製造は、当該技術分野に公知の製造技術により実施することができる。当該飲食品においては、Ｔｈ１疾患に起因する疾患の改善又は予防に有効な成分（例えば、栄養素等）を添加してもよい。また、当該改善等以外の機能を発揮する他の成分あるいは他の機能性食品と組み合わせることによって、多機能性の飲食品としてもよい。
本発明の組成物の製品（医薬品、飲食品、試薬）又はその説明書は、Ｔｈ１細胞の増殖若しくは活性化を抑制する、又はＴｈ１細胞に起因する疾患を治療、改善若しくは予防するために用いられる旨の表示を付したものであり得る。また、飲食品に関しては、形態及び対象者等において一般食品との区別がつくよう、保健機能食品（特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品）として健康機能の表示を、本発明の組成物の製品等に付したものであり得る。ここで「製品又は説明書に表示を付した」とは、製品の本体、容器、包装等に表示を付したこと、あるいは製品の情報を開示する説明書、添付文書、宣伝物、その他の印刷物等に表示を付したことを意味する。また、本発明の組成物は、キットの態様であってもよい。
また、上述のとおり、本発明の腸内細菌等を用い、公知の製剤化技術により、医薬組成物を製造することができる。したがって、本発明は、Ｔｈ１細胞に起因する疾患を治療、改善又は予防するための医薬組成物を製造するための、本発明の腸内細菌等の使用をも提供する。
＜腸管内でＴｈ１細胞を誘導する細菌に対して、抗菌活性を有する細菌＞
本発明に関しては、図１に示すとおり、Ｋｐ２Ｈ７株をＳＰＦマウスに経口投与した場合、Ｋｐ２Ｈ７株の腸内定着は認められなかった。しかしながら、アンピシリン又はタイロシンをＳＰＦマウスに投与することによって、Ｋｐ２Ｈ７株はマウス腸内に定着できるようになることが明らかになった。一方、メトロニダゾール又はスペクチノマイシンをＳＰＦマウスに投与しても、Ｋｐ２Ｈ７株の腸内定着は生じないことも、本発明者らによって見出された。
また、無菌マウスにＫｐ２Ｈ７株を経口投与し、さらにヒト（健常人）の糞便試料を摂取させた結果、図２及び３に示すとおり、前記ＳＰＦマウス同様に、Ｋｐ２Ｈ７株の腸内定着は認められなかった。しかしながら、ヒトの糞便を終濃度３％のクロロホルムにて処理した試料を摂取させた場合においては、Ｋｐ２Ｈ７株はマウス腸内に定着できるようになることが明らかになった。一方、前記ＳＰＦマウス同様に、メトロニダゾールを無菌マウスに投与しても、Ｋｐ２Ｈ７株の腸内定着は生じないことも、本発明者らによって見出された。すなわち、腸内細菌において、腸管内でＴｈ１細胞を誘導する細菌の定着等を抑制する細菌が存在することも、本発明者らによって初めて明らかとなった。
したがって、本発明は、腸管内においてＴｈ１細胞の増殖又は活性化を誘導する細菌に対して抗菌活性を有する細菌を提供する。かかる細菌としては、前記抗菌作用を有していればよく、例えば、上述の腸内細菌が挙げられる。
なお、細菌が前記抗菌作用を有しているかは、例えば、後述の実施例に記載の方法又はスクリーニング方法を用い、評価することができる。
＜Ｔｈ１細胞に起因する疾患の治療方法等＞
本発明は、上述の抗菌組成物若しくは医薬組成物、又はそれらの有効成分となる上述の腸内細菌、前述の抗菌活性を有する細菌（以下、「本発明の医薬組成物等又はそれらの有効成分等」とも総称する）を、対象に摂取させることを特徴とする、対象におけるＴｈ１細胞の増殖若しくは活性化を抑制する方法、該対象における免疫を抑制する方法、又は該対象におけるＴｈ１細胞に起因する疾患を治療、改善又は予防する方法をも提供するものである。
本発明において、「Ｔｈ１細胞に起因する疾患」とは、Ｔｈ１細胞の増殖又は活性化によって誘発された疾患を意味し、炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患といった慢性炎症性腸疾患等）、１型糖尿病、関節リウマチ、実験的免疫性脳炎（ＥＡＥ）、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス等の自己免疫疾患、慢性炎症性疾患が挙げられる。また、本発明において抑制される「免疫」には、粘膜免疫（腸管免疫等）のみならず、全身免疫も含まれる。さらに、細胞性免疫のみならず、液性免疫も含まれる。
本発明の医薬組成物等又はそれらの有効成分等は、ヒトを含む動物を対象として使用することができるが、ヒト以外の動物としては特に制限はなく、種々の家畜、家禽、ペット、実験用動物等を対象とすることができる。
また、本発明の腸内細菌等の摂取対象としては、Ｔｈ１細胞に起因する疾患の発症の如何を問わず、Ｔｈ１細胞誘導性細菌を保有する動物が挙げられる。また予防の観点からは、該細菌を保有していない又はその保有の疑いのある動物に、本発明の医薬組成物等又はそれらの有効成分等を摂取させてもよい。
本発明の医薬組成物等又はそれらの有効成分等の摂取方法としては、特に制限はなく、経口投与であってもよく、また非経口投与（例えば、腸管内への投与）であってもよいが、経口投与である場合には、本発明の医薬組成物等又はそれらの有効成分等の効果をより向上させるという観点から、本発明の医薬組成物等又はそれらの有効成分等の摂取対象は、プロトンポンプ阻害剤（ＰＰＩ）等の摂取により胃酸の産生を減少させておくことが好ましい。
また、本発明の医薬組成物等又はそれらの有効成分等を摂取させる場合、その摂取量は、対象の年齢、体重、疾患の症状、健康状態、組成物の種類（医薬品、飲食品等）、摂取方法等に応じて、当業者であれば適宜選択することができる。
＜Ｔｈ１細胞に起因する疾患の検査用組成物＞
上述の通り、本発明において、Ｔｈ１細胞誘導性細菌が腸管に定着等することを抑制し得る腸内細菌の存在が明らかになった。そのため、当該腸内細菌の存在を検出することにより、Ｔｈ１細胞に起因する疾患を検査することが可能となる。
したがって、本発明は、以下のＴｈ１細胞に起因する疾患を検査するための組成物を提供する。
本発明の腸内細菌等を特異的に認識する抗体を含む、Ｔｈ１細胞に起因する疾患を検査するための組成物。
本発明の腸内細菌等に特異的なヌクレオチド配列を検出するためのポリヌクレオチドを含む、Ｔｈ１細胞に起因する疾患を検査するための組成物。
本発明において、「本発明の腸内細菌等を特異的に認識する抗体」は、該細菌を特異的に認識し得る限り、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよく、また抗体の機能的断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、可変領域断片（Ｆｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）２、ダイアボディー、多特異性抗体、又はこれらの重合体）であってもよい。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体であれば、抗原（本発明の腸内細菌等に由来するポリペプチド、ポリヌクレオチド、糖鎖、脂質等）で免疫動物を免疫し、その抗血清から、従来の手段（例えば、塩析、遠心分離、透析、カラムクロマトグラフィーなど）によって、精製して取得することができる。また、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法や組換えＤＮＡ法によって作製することができる。
また、本発明の検査に用いる抗体としては、標識物質を結合させた抗体を使用することができる。当該標識物質を検出することにより、本発明の腸内細菌等又は該細菌に由来する物質に結合した抗体量を直接測定することが可能である。標識物質としては、抗体に結合することができ、化学的又は光学的方法に検出できるものであれば特に制限されることはなく、例えば、蛍光色素（ＧＦＰ等）、酵素（ＨＲＰ等）、放射性物質が挙げられる。
本発明の検査用組成物には、抗体成分の他、組成物として許容される他の成分を含むことができる。このような他の成分としては、例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩、標識物質、二次抗体が挙げられる。また、上記検査用組成物の他、標識物質の検出に必要な基質、陽性対照や陰性対照、あるいは試料の希釈や洗浄に用いる緩衝液、試料と本発明の抗体との反応に用いるチューブ又はプレート等を組み合わせることができ、Ｔｈ１細胞に起因する疾患の検査用キットとすることもできる。また、標識されていない抗体を抗体標品とした場合には、当該抗体に結合する物質（例えば、二次抗体、プロテインＧ、プロテインＡ等）を標識化したものを組み合わせることができる。また、かかるＴｈ１細胞に起因する疾患の検査用キットには、当該キットの使用説明書を含めることができる。
さらに、本発明の検査用組成物には、本発明の抗体を検出するための装置を組み合わせることもできる。かかる装置としては、例えば、フローサイトメトリー装置、マイクロプレートリーダーが挙げられる。
本発明において、「本発明の腸内細菌等に特異的なヌクレオチド配列を検出するためのポリヌクレオチド」としては、該細菌に特異的な配列を検出する限り、特に制限はなく、例えば、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有する、下記（ａ）～（ｂ）に記載のいずれかであるポリヌクレオチドが、挙げられる。
（ａ）前記特異的なヌクレオチド配列を挟み込むように設計された一対のプライマーであるポリヌクレオチド
（ｂ）前記特異的なヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列にハイブリダイズするプライマー又はプローブであるポリヌクレオチド。
本発明のポリヌクレオチドは、本発明の腸内細菌等のヌクレオチド配列に相補的な塩基配列を有する。ここで「相補的」とは、ハイブリダイズする限り、完全に相補的でなくともよい。これらポリヌクレオチドは、前記ヌクレオチド配列に対して、通常、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは１００％の相同性を有する。
本発明のポリヌクレオチドにおける「鎖長」として、プライマーとして用いる場合に、通常１５～１００ヌクレオチドであり、好ましくは１７～３０ヌクレオチドであり、より好ましくは２０～２５ヌクレオチドである。また、プローブとして用いる場合には、通常１５～１０００ヌクレオチドであり、好ましくは２０～１００ヌクレオチドである。
本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、またその一部又は全部において、ＬＮＡ（登録商標、架橋化核酸）、ＥＮＡ（登録商標、２’－Ｏ，４’－Ｃ－Ｅｔｈｙｌｅｎｅ－ｂｒｉｄｇｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）、ＧＮＡ（グリセロール核酸）、ＴＮＡ（トレオ―ス核酸）、ＰＮＡ（ペプチド核酸）等の人工核酸によって、ヌクレオチドが置換されているものであってもよい。
なお、本発明のポリヌクレオチドは、市販のヌクレオチド自動合成機等を用いて化学的に合成することができる。また、本発明の検査に用いるポリヌクレオチドとしては、標識物質を結合させたポリヌクレオチドを使用することができる。標識物質としては、ポリヌクレオチドに結合することができ、化学的又は光学的方法に検出できるものであれば特に制限されることはなく、例えば、蛍光色素（ＤＥＡＣ、ＦＩＴＣ、Ｒ６Ｇ、ＴｅｘＲｅｄ、Ｃｙ５等）、蛍光色素以外にＤＡＢ等の色素（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ）、酵素、放射性物質が挙げられる。
本発明の検査用組成物には、前述のポリヌクレオチドの他、薬理学上許容される他の成分を含むことができる。このような他の成分としては、例えば、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、安定剤、防腐剤、生理食塩等が挙げられる。
また、上記検査用組成物の他、ポリヌクレオチドに付加した標識物質の検出に必要な基質、陽性対照や陰性対照、試料の希釈や洗浄に用いる緩衝液等の標品を組み合わせ、試料と本発明のポリヌクレオチドとの反応に用いるチューブ又はプレート等を組み合わせることができ、Ｔｈ１細胞に起因する疾患の検査用キットとすることもできる。さらに、かかるＴｈ１細胞に起因する疾患の検査用キットには、当該キットの使用説明書を含めることができる。
また、本発明の検査用組成物には、本発明の腸内細菌等に特異的なヌクレオチド配列を検出するための装置を組み合わせることもできる。かかる装置としては、例えば、サーマルサイクラ―、シークエンサー、マイクロアレイが挙げられる。
さらに、本発明においては、前述の抗体、ポリヌクレオチド、又は検査用組成物を用いた、Ｔｈ１細胞に起因する疾患の検査方法も提供する。すなわち、
前記抗体、ポリヌクレオチド、又は検査用組成物と、被検体から単離された試料とを接触させる工程、及び、該接触により、腸管内で本発明の腸内細菌等の存在又は非存在を検出する工程、を含む、Ｔｈ１細胞に起因する疾患の検査方法を、本発明は提供する。
被検体としては特に制限はなく、Ｔｈ１細胞に起因する疾患の罹患が疑われるヒト等の動物が挙げられる。また、かかる被検体から単離された試料としても特に制限はないが、被検体の糞便試料、その培養物、又はそれらから抽出されるポリペプチド、ポリヌクレオチド、糖鎖、脂質等が、本発明の方法において好適に用いられる。
本発明の抗体又はそれを含む検査用組成物と、前記試料とを接触させることにより、本発明の腸内細菌等の存在又は非存在を検出する方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ法、イムノブロッティング、抗体アレイ解析法、免疫組織化学的染色法、フローサイトメトリー、イメージングサイトメトリー、ラジオイムノアッセイ、免疫沈降法等の抗体を用いて検出する方法（免疫学的手法）が挙げられる。
また、本発明のポリヌクレオチド又はそれを含む検査用組成物と、前記試料とを接触させることにより、本発明の腸内細菌等の存在又は非存在を検出する方法としては、例えば、ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、定量ＰＣＲ）、ＤＮＡマイクロアレイ解析法、ノーザンブロッティング、１６ｓｒＲＮＡシークエンシング、次世代シークエンシング法（合成シークエンシング法（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、例えば、イルミナ社製Ｓｏｌｅｘａゲノムアナライザー又はＨｉｓｅｑ（登録商標）２０００によるシークエンシング）、パイロシークエンシング法（例えば、ロッシュ・ダイアグノステックス（４５４）社製のシークエンサーＧＳＬＸ又はＦＬＸによるシークエンシング（所謂４５４シークエンシング））、リガーゼ反応シークエンシング法（例えば、ライフテクノロジー社製のＳｏｌｉＤ（登録商標）又は５５００ｘｌによるシークエンシング）、ビーズアレイ法、ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション、ドットブロット、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ法、質量分析法、ゲノムＰＣＲ法、サザンブロッティングを用いることができる。
本発明において、Ｔｈ１細胞に起因する疾患の「検査」とは、該疾患の発症の有無のみならず、その発症のリスクを検査することも含まれ、前述の方法により、腸管内で本発明の腸内細菌等の存在が検出されれば、Ｔｈ１細胞に起因する疾患が発症していない又はその発症リスクが低いと判定することができる。
被検体におけるＴｈ１細胞に起因する疾患の診断は、通常、医師（医師の指示を受けた者も含む）によって行われるが、本発明の方法によって得られるデータは、医師による診断に役立つものである。よって、本発明の方法は、医師による診断に役立つデータを収集し、提示する方法とも表現しうる。
また、本発明においては、前述の検査方法を利用したコンパニオン診断法、及びその薬剤も提供することができる。すなわち、本発明は以下も提供する。
本発明の医薬組成物等又はそれらの有効成分等の、Ｔｈ１細胞に起因する疾患の治療、改善又は予防における有効性を判定する方法であって、前記抗体、ポリヌクレオチド、又は検査用組成物と、被検体から単離された試料とを接触させる工程、該接触により、前記腸内細菌等の存在又は非存在を検出する工程、前記工程において、該細菌の存在が検出されなかった場合において、前記被検体における本発明の医薬組成物等又はそれらの有効成分等の前記疾患の治療、改善又は予防における有効性が高いと判定される方法。
Ｔｈ１細胞に起因する疾患を治療、改善又は予防する方法であって、前記判定方法により、本発明の医薬組成物等又はそれらの有効成分等の有効性が高いと判定された患者に、該医薬組成物等又はそれらの有効成分等を摂取させる工程を含む方法。
本発明の腸内細菌等を、有効成分として含む、Ｔｈ１細胞に起因する疾患を治療、改善又は予防するための組成物であって、前記判定方法により有効性が高いと判定された被検体に摂取される組成物。
＜腸管内でＴｈ１細胞の増殖又は活性化を誘導する細菌に対して抗菌活性を有する腸内細菌をスクリーニングする方法＞
上述のとおり、腸内細菌において、腸管内でＴｈ１細胞を誘導する細菌の定着等を抑制する細菌が存在することも、本発明者らによって初めて明らかとなった。したがって、本発明は、以下の工程を含む、腸管内でＴｈ１細胞の増殖又は活性化を誘導する細菌に対して抗菌活性を有する腸内細菌をスクリーニングする方法を提供する。
腸管内でＴｈ１細胞の増殖又は活性化を誘導する細菌と、被験腸内細菌とを、非ヒト無菌動物に摂取させる工程、
該非ヒト無菌動物の腸管内において、前記Ｔｈ１細胞の増殖又は活性化を誘導する細菌を検出する工程、
前記工程にて検出された細菌の数が、前記被験腸内細菌を摂取させなかった場合と比較して減少している場合に、該被験腸内細菌を、腸管内でＴｈ１細胞の増殖又は活性化を誘導する細菌に対して抗菌活性を有する腸内細菌であると判定する工程。
「腸管内でＴｈ１細胞の増殖又は活性化を誘導する細菌」については上述のとおりである。「非ヒト無菌動物」は、無菌条件下で、出生及び生育している、ヒト以外の動物を意味する。ヒト以外の動物としては、例えば、マウス、ラット、サル、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、カモ、ダチョウ、アヒル、イヌ、ネコ、ウサギ、ハムスター等が挙げられるが、これらに制限されない。また、これら動物においては、マウスが好適に用いられる。
非ヒト無菌動物に摂取させる被験腸内細菌としては、動物の腸内に存在する細菌であればよく、かかる動物としては、ヒト、非ヒト動物（マウス、ラット、サル、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、カモ、ダチョウ、アヒル、イヌ、ネコ、ウサギ、ハムスター等）が挙げられる。また、非ヒト無菌動物に摂取させる被験腸内細菌は、単離された腸内細菌であってもよいが、腸内細菌を含む試料（例えば、前記動物の糞便試料、又はその培養物）が挙げられる。
また、被験腸内細菌及びＴｈ１細胞誘導性細菌を、非ヒト動物に「摂取」させる方法としては特に制限はなく、通常、経口投与によって行われるが、非経口投与（例えば、腸管内への投与）であってもよい。また、被験腸内細菌とＴｈ１細胞誘導性細菌との摂取は、同時であってもよく、被験腸内細菌を非ヒト動物に摂取させた後に前記Ｔｈ１細胞誘導性細菌を該動物に摂取させてもよく、前記Ｔｈ１細胞誘導性細菌を非ヒト動物に摂取させた後に被験腸内細菌を該動物に摂取させてもよい。
腸管内における前記Ｔｈ１細胞誘導性細菌の「検出」は、当該Ｔｈ１細胞誘導性細菌特異的なヌクレオチド配列を検出することによって行なうことができる。かかる検出方法として、例えば、ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、定量ＰＣＲ）、ＤＮＡマイクロアレイ解析法、ノーザンブロッティング、１６ｓｒＲＮＡシークエンシング、次世代シークエンシング法（合成シークエンシング法（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、例えば、イルミナ社製Ｓｏｌｅｘａゲノムアナライザー又はＨｉｓｅｑ（登録商標）２０００によるシークエンシング）、パイロシークエンシング法（例えば、ロッシュ・ダイアグノステックス（４５４）社製のシークエンサーＧＳＬＸ又はＦＬＸによるシークエンシング（所謂４５４シークエンシング））、リガーゼ反応シークエンシング法（例えば、ライフテクノロジー社製のＳｏｌｉＤ（登録商標）又は５５００ｘｌによるシークエンシング）、ビーズアレイ法、ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション、ドットブロット、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ法、質量分析法、ゲノムＰＣＲ法、サザンブロッティングが挙げられる。
また、腸管内におけるＴｈ１細胞誘導性細菌の「検出」は、例えば、当該Ｔｈ１細胞誘導性細菌特異的なアミノ酸配列を検出することによって行なうことができる。かかる検出方法として、ＥＬＩＳＡ法、イムノブロッティング、抗体アレイ解析法、免疫組織化学的染色法、フローサイトメトリー、イメージングサイトメトリー、ラジオイムノアッセイ、免疫沈降法等の抗体を用いて検出する方法（免疫学的手法）が挙げられる。
また、検出のタイミングとしては、特に制限はなく、当業者であれば、用いる動物の種類等に応じ、適宜調整し得る。
なお、本発明のスクリーニング方法において、１回の実施により、腸管内でＴｈ１細胞の増殖又は活性化を誘導する細菌に対して抗菌活性を有する腸内細菌を選抜することができなかった場合には、得られた該細菌を含む腸管内試料を、次なる被験腸内細菌として、新たな非ヒト無菌動物に摂取させ、前述のスクリーニングを複数回行うことにより、前記抗菌活性を有する腸内細菌を単離することができる。
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
＜抗生物質にて処理したマウスにおける、Ｔｈ１細胞誘導性細菌の定着＞
ＳＰＦマウス（野生型 Ｃ５７ＢＬ／６ ）を、Ｔｈ１細胞誘導性細菌を強制摂取させる前に、下記抗生物質を飲料水を介して４日間投与した。また、これら抗生物質を投与しないマウスも用意した。
抗生物質：アンピシリン（２００ｍｇ／Ｌ）、タイロシン（５００ｍｇ／Ｌ）、メトロニダゾール（５００ｍｇ／Ｌ）、スペクチノマイシン（２００ｍｇ／Ｌ）、バンコマイシン（２００ｍｇ／Ｌ）。
Ｔｈ１細胞誘導性細菌であるＫｐ２Ｈ７株又はＫａ１１Ｅ１２株を、ＬＢブロスにてｌｏｇフェーズに至るまで培養し、１～２ｘ１０８ＣＦＵｓをマウスへの接種のために用いた。
Ｔｈ１細胞誘導性細菌を強制接種させてから、１、３、７、１４及び２１日後に糞便を回収し、ＤＮＡを抽出した。そして、これらＤＮＡを鋳型として、各細菌株に特異的な下記プライマーを用いたｑＰＣＲにて行い、各細菌株の腸内定着量を評価した。
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ（ｏｍｐＫ３６－３＿Ｆ：５’－ＧＣＧＡＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＧＣＧＴ－３’［配列番号：１４８］，ｏｍｐＫ３６－３＿Ｒ：５’－ＡＧＴＣＧＡＡＡＧＡＧＣＣＣＧＣＧＴＣ－３’［配列番号：１４９］）、
Ｋｐ－２Ｈ７（ｓｃａ４＿２９８＿Ｆ：５’－ＡＧＣＡＣＴＡＧＣＧＧＣＴＧＴＧＧＴＡＴ－３’［配列番号：１５０］，ｓｃａ４＿２９８＿Ｒ：５’－ＡＣＴＴＡＣＴＣＧＧＧＣＣＣＴＴＧＡＴＴ－３’［配列番号：１５１］）、
Ｋａ－１１Ｅ１２（ｇｒｏｕｐ＿４０３７＿Ｆ：５’－ＣＴＴＣＧＣＣＴＴＣＡＴＣＡＧＣＴＴＣＡ－３’［配列番号：１５２］，ｇｒｏｕｐ＿４０３７＿Ｒ：５’－ＴＣＡＴＣＡＴＴＡＡＣＧＣＧＧＧＴＣＡＧ－３’［配列番号：１５３］）
得られた結果を、図１及び図２に示す。
Ｋｐ２Ｈ７株は、特許文献１に記載のとおり、無菌マウスに投与した場合には、その腸管に定着し、Ｔｈ１細胞を誘導することが、本発明者らによって明らかになっている。また、当該細菌株は、アンピシリン、タイロシン、メトロニダゾール又はスペクチノマイシンに対して抵抗性を有する細菌株であることは、本発明者らが確認している。
しかしながら、図１に示すとおり、無菌マウスに投与した場合と異なり、ＳＰＦマウスにＫｐ２Ｈ７株を投与した場合に、当該細菌株の腸管への定着が認められなかった。
また興味深いことに、メトロニダゾール又はスペクチノマイシンを投与したＳＰＦマウスにおいて、Ｋｐ２Ｈ７株はこれら抗生物質に対して抵抗性を有するにも関わらず、当該細菌株の腸内定着は認められなかった。一方、アンピシリン又はタイロシンを投与したＳＰＦマウスにおいて、Ｋｐ２Ｈ７株の腸内定着は認められた（図中の「Ａｍｐ」及び「Ｔｙｌ」参照）。
また、Ｋａ１１Ｅ１２株に関しても、特許文献１に記載のとおり、無菌マウスに投与した場合には、その腸管に定着し、Ｔｈ１細胞を誘導することが、本発明者らによって明らかになっている。さらに、当該細菌株は、バンコマイシン、タイロシン又はメトロニダゾールに対して抵抗性を有する細菌株であることは、本発明者らが確認している。
しかしながら、図２に示すとおり、無菌マウスに投与した場合と異なり、前記Ｋｐ２Ｈ７株同様、ＳＰＦマウスにＫａ１１Ｅ１２株を投与した場合、当該細菌株の腸管への定着が認められなかった。
一方、バンコマイシン又はタイロシンを投与したＳＰＦマウスにおいて、Ｋａ１１Ｅ１２株の腸管への定着は認められた（図中の「ＶＣＭ」及び「Ｔｙｌ」参照）。
以上の結果から、腸内細菌叢における特定の細菌（アンピシリン及びタイロシンに対して抵抗性を有するが、メトロニダゾール及びスペクチノマイシンに対して感受性を有する細菌、メトロニダゾールに対して抵抗性を有するが、バンコマイシン及びタイロシンに対して感受性を有する細菌等）によってもたらされる、口腔由来Ｔｈ１細胞誘導性細菌の腸内定着に対する抵抗性が、抗生物質の曝露により抑制されたことによって、前記腸内定着は増強されたことが示唆される。
（実施例２）
＜Ｔｈ１細胞誘導性細菌を接種した無菌マウスへの、ヒト糞便試料の投与１＞
図３に示すとおり、実施例１同様に、無菌マウスにＫｐ２Ｈ７株を接種した。そして、当該接種１週間後に、健常人（♯Ｋ）から採取したヒト糞便試料を経口投与した。また当該経口投与から３１～９４日間は、実施例１同様に、アンピシリンを投与し続けた（以下、このように処理したマウスを「コントロール」とも称する）。
また、前記ヒト糞便試料の代わりに、当該試料を終濃度３％のクロロホルムにて処理したものを経口投与した以外は、前記コントロール同様に、無菌マウスを処理した（以下、このように処理したマウスを「クロロホルム処理群」とも称する）。
さらに、ヒト糞便試料の経口投与１日前から、実施例１同様に、メトロニダゾールを投与し続けた以外は、前記コントロール同様に、無菌マウスを処理した（以下、このように処理したマウスを「メトロニダゾール投与群」とも称する）。
そして、以上のように処理したＳＰＦマウスの糞便を回収し、実施例１同様に、ｑＰＣＲにより、Ｋｐ２Ｈ７株の腸内定着量を評価した。得られた結果を、図４に示す。
図４に示した結果から明らかなように、無菌マウスにＫｐ２Ｈ７株を経口投与し、さらにヒト（健常人）の糞便試料を摂取させた結果、前記ＳＰＦマウス同様に、Ｋｐ２Ｈ７株の腸内定着は認められなかった。しかしながら、ヒトの糞便をクロロホルムにて処理した試料を摂取させた場合においては、Ｋｐ２Ｈ７株はマウス腸内に定着できるようになることが明らかになった。一方、前記ＳＰＦマウス同様に、メトロニダゾールを無菌マウスに投与しても、Ｋｐ２Ｈ７株の腸内定着は生じなかった。
（実施例３）
＜Ｔｈ１細胞誘導性細菌を接種した無菌マウスへの、ヒト糞便試料の投与２＞
糞便試料の調製
各健常者ボランティア（♯Ｋ、Ｆ及びＩ）から提供された糞便（♯Ｋ便サンプル、＃Ｆ便サンプル及び＃Ｉ便サンプル）を、グリセロールＰＢＳ溶液（グリセロールの終濃度：２０体積％）で５倍重量に希釈し、１００μｍ径フィルタで濾過したものを、ストック液として－８０℃で保存した。なお、当該実施例における健常者ボランティア♯Ｋと、実施例２における健常人♯Ｋとは同一人である。
Ｋｐ２Ｈ７単菌定着マウスの作製
Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ Ｊｃｌノトバイオートマウス（日本クレア株式会社製、４～８週齢）を、飼育用ビニールアイソレータ（無菌アイソレータ）（株式会社アイシーエム製；ＩＣＭ－１Ｂ）内にて自由飲水給餌条件で１週間以上飼育し、環境馴化させた。
Ｋｐ２Ｈ７株を、３７℃，１０％ＣＯ２嫌気環境下で、Ｓｃｈａｅｄｌｅｒ血液培地、ＬＢ培地、又はこれらのアガープレートにて培養した。１ｘ１０１０ＣＦＵ相当のＫｐ２Ｈ７を含む前記いずれかの培地の懸濁液２００μＬを、８～１１週齢のマウスの胃内へ経口投与した後、１週間無菌アイソレータ内で飼育することで、Ｋｐ２Ｈ７単菌定着マウスを作製した。
便移植による菌の定着
上記のとおり調製した各糞便試料のストック液を常温にて融解し、ＰＢＳで１０倍容量に希釈した。２００μＬの該希釈液をＫｐ２Ｈ７単菌定着マウスの胃内に経口投与した。さらに１ヶ月間、無菌アイソレータ内にて自由飲水給餌条件で飼育して、移植便中の菌を該マウスに定着させた。
抗生物質アンピシリン投与による定着菌の排除
前記１ヶ月の培養後、自由飲水を２００ｍｇ／Ｌアンピシリン水溶液に変更し、更に１ヶ月間飼育して、アンピシリン非耐性菌の排除を行った。
腸内Ｋｐ２Ｈ７定着量の測定
健常人の糞便試料を経口投与し、更にアンピシリンを投与したＫｐ２Ｈ７単菌定着マウスの腸内に定着しているＫｐ２Ｈ７株の存在比率を、ＣＦＵ及び腸内細菌ゲノムのｑＰＣＲ測定により求めた。
ＣＦＵは、アンピシリン及びスペクチノマイシンを各々終濃度が３０μｇ／ｍＬになるよう添加したＤＨＬ培地に、ＰＢＳに懸濁したマウス糞便を添加することにより、Ｋｐ２Ｈ７株のみを選択培養した。そして、吸光度（ＯＤ６００）を指標として算出した。
ｑＰＣＲ測定法では、マウス糞便から抽出した菌ゲノムＤＮＡを、Ｋｐ２Ｈ７ゲノム特異的プライマー及びユニバーサル菌プライマーで増幅定量して、マウス糞便試料中の菌におけるＫｐ２Ｈ７株の存在比率を算出した。
菌ゲノムの抽出は、以下の工程で行った。
マウス糞便１０ｍｇに対してＥＤＴＡ及びグリセロール含有ＰＢＳ溶液（ＥＤＴＡの終濃度：１０ｍＭ、グリセロールの終濃度：２０体積％）を５倍重量加え、激しく振盪撹拌して破砕懸濁した。
１００μｍ径フィルタで濾過したサンプル液１００μＬに、１５ｍｇリゾチーム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ ｆｒｏｍ ｃｈｉｃｋｅｎ ｅｇｇ ｗｈｉｔｅ；Ｌ４９１９）及び５μＬ ＲＮａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、ＰｕｒｅＬｉｎｋ ＲＮａｓｅ Ａ（２０ｍｇ／ｍＬ）；１２０９１－０２１）を溶解した１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／１０ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８．０，以下「ＴＥ１０」とも称する）８００μＬを加え、３７℃で１時間振盪した。続いて、アクロモペプチダーゼ（登録商標）（Ｗａｋｏ；０１５－０９９５１）２，０００Ｕを添加し、３７℃で３０分間振盪し、溶菌した。
２０％ＳＤＳ ＴＥ１０溶液 ５０μＬと、終濃度が２０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（Ｒｏｃｈｅ，Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ，ＰＣＲ Ｇｒａｄｅ；０３１１５８５２００１）を溶解したＴＥ１０溶液５０μLを加え、５５℃で６０分間振盪した。
Ｐｈｅｎｏｌ／Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ／Ｉｓｏａｍｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ（２５：２４：１）（Ｗａｋｏ；３１１－９０１５１）による液－液抽出法によりＤＮＡを抽出し、エタノール沈殿により細菌ゲノムＤＮＡを得た。
ｑＰＣＲ測定は、以下の手順で行った。
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ；０５０１５２４３００１）及びＴｈｕｎｄｅｒｂｉｒｄ（登録商標）ＳＹＢＲ（登録商標）ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ；ＱＰＳ－２０１Ｘ５）を用いて、Ｋｐ２Ｈ７ゲノム特異的プライマー及びユニバーサル細菌プライマーで増幅定量し、算出したＤＮＡ濃度比率をＫｐ２Ｈ７の存在比率とした。
各プライマーの配列は以下のとおりである。
Ｋｐ２Ｈ７プライマー：Ｆｏｒｗａｒｄ（５‘－ＡＧＣＡＣＴＡＧＣＧＧＣＴＧＴＧＧＴＡＴ－３‘［配列番号：１５０］），Ｒｅｖｅｒｓｅ（５‘－ＡＣＴＴＡＣＴＣＧＧＧＣＣＣＴＴＧＡＴＴ－３‘［配列番号：１５１］）
ユニバーサル細菌プライマー：Ｆｏｒｗａｒｄ（５‘－ＧＧＴＧＡＡＴＡＣＧＴＴＣＣＣＧＧ－３‘［配列番号：１５４］），Ｒｅｖｅｒｓｅ（５‘－ＴＡＣＧＧＣＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ－３‘［配列番号：１５５］）
得られた結果（腸内細菌ゲノムのｑＰＣＲ測定結果）を、図５～８に示す。
上述のとおり、１０×１０１０ＣＦＵのＫｐ２Ｈ７株を胃内投与後１週間飼育し、Ｋｐ２Ｈ７単一菌種のみが充分に定着したマウスに対して、健常者ボランティア＃Ｆ，Ｉ及びＫの便移植を行った。その結果、図５～８に示すとおり、処置後１ヶ月間の自由飼育の経過に伴い、いずれの便を移植されたマウスも、顕著なＫｐ２Ｈ７株の排除が認められた。このことから、＃Ｆ，Ｉ及びＫの全てにおいて、Ｋｐ２Ｈ７株を排除する活性を有する細菌株が含まれる事が示唆される。
特許文献１において本発明者らが示しているように、Ｋｐ２Ｈ７株は、少なくともアンピシリン、タイロシン、スペクチノマイシン、メトロニダゾール（ニトロイミダゾール）に耐性を有する、多剤耐性菌である。
便移植一ヶ月後から、更に１ヶ月間、抗生物質アンピシリンを投与しつつ飼育を行ったところ、図５に示すとおり、＃Ｆ便移植のマウスにおいて、急峻なＫｐ２Ｈ７株の増殖が認められた。一方で、図６及び７に示すとおり、＃Ｉ，Ｋ便移植マウスでは、有意な変化は認められなかった。このことから、＃Ｆ便に含まれ、Ｋｐ２Ｈ７株の定着の排除に関与する主要な菌は、アンピシリンに非耐性（感受性）の菌株であることが示唆される。また、＃Ｉ，Ｋ便に含まれ、Ｋｐ２Ｈ７株の定着の排除に関与する菌は、少なくとも１菌株以上のアンピシリンに耐性（抵抗性）の菌株を含むことも示唆される。
（実施例４）
健常者ボランティア便からの菌の単離 １
実施例３において調製した、＃Ｉ及び＃Ｆ由来の各凍結便サンプルを、常温にて融解した後、ＰＢＳで希釈し、Ｓｃｈａｅｄｌｅｒ血液培地（Ｗａｋｏ社製；５１７－４５８０５）、Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地（ナカライテスク社製；２００６８－７５）、ＤＨＬ培地（日本製薬社製；０５０４０）又はＭａｃＣｏｎｋｅｙ培地（Ｍｅｒｃｋ社製；１．４６４６１．００１０）のアガープレートにて、３７℃，１０％ＣＯ２嫌気環境下で培養し、形成したコロニーを単離した。
単離菌のうち、＃Ｉ由来の菌４２種、＃Ｆ由来菌３７種について、サンガー法による１６ＳｒＤＮＡ解析により、遺伝子配列の解析及び菌種の推定を行った。シーケンサーは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製３１３０ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ、及び、以下の配列のプライマーセットを用いて行なった。
２７Ｆｏｒｗａｒｄ－ｍｏｄ（５’－ＡＧＲＧＴＴＴＧＡＴＹＭＴＧＧＣＴＣＡＧ－３’ ［配列番号：１５６］）
１４９２Ｒｅｖｅｒｓｅ（５’－ＧＧＹＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ－３’ ［配列番号：１５７］）。
（実施例５）
健常者ボランティア便からの菌の単離 ２
Ｋｐ２Ｈ７株単菌を胃内投与後１週間飼育して当該菌を定着させた、Ｋｐ２Ｈ７単菌定着マウスに、健常者ボランティア＃Ｋ由来の糞便試料を、実施例３に準じる方法で胃内投与した。また、下記手順でクロロホルム処理した糞便試料も同様に胃内投与した。
クロロホルム処理：実施例３にて調製したＫ由来の糞便試料のストック液を常温にて融解した。それに、クロロホルムを終濃度が３％になるよう加え、３７℃１時間振盪攪拌した後、窒素ガスを通じてクロロホルムを除去した。
前記のとおり調製した便移植マウスに、水又は下記の抗生物質水溶液のいずれかを２ヶ月間自由飲水させた後、便を採取した。
アンピシリン、スペクチノマイシン、タイロシン、メトロニダゾール：２００ｍｇ／Ｌ
ストレプトマイシン：５０ｍｇ／Ｌ。
便採取後は、実施例４に準じる方法にて単離培養を行なった。その結果、４７の菌株が単離された。また、異なるＫｐ２Ｈ７単菌定着マウス個体に、＃Ｋ由来の糞便試料を胃内投与し、上記方法にて、便を採取し、単離培養を行なった。その結果、６８の菌株が単離された。
そして、これら単離菌の遺伝子配列解析及び菌種の推定は、実施例４に準じる方法で実施した。
実施例４及び５にて得られた結果を、下記表１２～１５に示す。
Figure 0007109794000012
Figure 0007109794000013
Figure 0007109794000014
Figure 0007109794000015
なお、＃Ｋ由来の糞便試料から単離された前記４７菌株は、１の菌株を除き、前記６８菌株と重複（表１２及び１３に記載のＫ１～Ｋ４６）していた。
（実施例６）
単離菌培養液による菌の定着
実施例４及び５で単離した各菌株を、Ｓｃｈａｅｄｌｅｒ血液培地、ＬＢ培地、ＤＨＬ培地又はＭａｃＣｏｎｋｅｙ培地で、それぞれ３７℃，１０％ＣＯ２嫌気環境下で１～３日間培養した。定常期に至った菌液を等容量ずつ混和し、２００μＬを、実施例３にて調製したＫｐ２Ｈ７単菌定着マウスの胃内に経口投与した。さらに１ヶ月間、無菌アイソレータ内にて自由飲水給餌条件で飼育して、菌を定着させた。そして、実施例３に記載の方法にて、抗生物質アンピシリン投与により定着菌の排除を行なった後、腸内Ｋｐ２Ｈ７定着量の測定を行なった。得られた結果を、図９～１２に示す。
上述のとおり、１０×１０１０ＣＦＵのＫｐ２Ｈ７株を胃内投与後１週間飼育し、Ｋｐ２Ｈ７単一菌種のみが充分に定着したマウスに対して、健常者ボランティア＃Ｆ、Ｉ及びＫから単離した菌カクテルを胃内投与した。その結果、図９及び１０に示すとおり、処置後１ヶ月間の自由飼育の経過に伴い、いずれの菌カクテルを投与したマウスも、有意なＫｐ２Ｈ７株の排除が認められた。このことは、Ｆ＿３７ｍｉｘ、Ｉ＿４２ｍｉｘ及びＫ＿４７ｍｉｘの全てにおいて、Ｋｐ２Ｈ７株を排除する活性を有する菌株が含まれている事を示唆している。
菌カクテル投与一ヶ月後から、更に１ヶ月間、抗生物質アンピシリンを投与しつつ飼育を行ったところ、図９及び１０に示すとおり、Ｆ＿３７ｍｉｘ及びＩ＿４２ｍｉｘ投与のマウスにおいて、Ｋｐ２Ｈ７の増殖が認められた。一方で、Ｋ＿４７ｍｉｘ投与マウスでは、有意な変化は認められなかった。このことから、Ｆ＿３７ｍｉｘ及びＩ＿４２ｍｉｘに含まれ、Ｋｐ２Ｈ７株の定着を排除する主要な菌は、アンピシリンに非耐性（感受性）の菌株であることが示唆される。一方、Ｋ＿４７ｍｉｘに含まれ、Ｋｐ２Ｈ７株の定着を排除する菌は、少なくとも１菌株以上のアンピシリンに耐性（抵抗性）の菌株を含むことも示唆される。
また、単離菌の投与の場合（実施例６）と、菌単離前の便移植の場合（実施例３）を比較すると、次のことが示唆される。
・＃Ｆ便より単離した３７菌及び＃Ｋ便より単離した４７菌は、単離前の便と同等以上の、Ｋｐ２Ｈ７株を排除する活性を有していた。特に、Ｆ＿３７ｍｉｘがＫｐ２Ｈ７を排除する活性は、単離前の＃Ｆ便の移植によるＫｐ２Ｈ７株の排除活性を上回っていた。つまり、Ｆ＿３７ｍｉｘには、Ｋｐ２Ｈ７株の定着を阻害する菌が濃縮されている、または、Ｋｐ２Ｈ７株の定着に関与しないか定着を支援する菌が除外されていると考えられる。したがって、Ｆ＿３７ｍｉｘは、Ｋｐ２Ｈ７株の排除に有効な菌カクテルである。
・＃Ｉ便より単離した４２菌は、充分なＫｐ２Ｈ７を排除する活性を有しているものの、単離前の＃Ｉ便の移植によるＫｐ２Ｈ７の排除活性に及ばなかった。また、単離前の＃Ｉ便の移植の場合には認められなかったアンピシリンに対する感受性が認められた。つまり、Ｉ＿４２ｍｉｘには、単離前の＃Ｉ便に含まれる、Ｋｐ２Ｈ７の定着を排除するアンピシリン抵抗性の菌が含まれないと考えられる。したがって、Ｉ＿４２ｍｉｘは、Ｋｐ２Ｈ７株の排除に有効な菌カクテルである。
また、１０×１０１０ＣＦＵのＫｐ２Ｈ７を胃内投与後１週間飼育し、Ｋｐ２Ｈ７単一菌種のみが充分に定着したマウスに対して、Ｋ＿６８ｍｉｘを胃内投与した。その結果、図１１及び１２に示すとおり、処置後１ヶ月間の自由飼育の経過に伴い、Ｋｐ２Ｈ７の排除が認められた。また、Ｋ＿６８ｍｉｘにおいて、Ｆ＿３７ｍｉｘの場合と同等レベルの顕著なＫｐ２Ｈ７の排除が認められた。
特に、Ｋ＿６８ｍｉｘがＫｐ２Ｈ７株を排除する活性は、単離前の＃Ｋ便の移植によるＫｐ２Ｈ７株の排除活性を上回っていた。つまり、Ｋ＿６８ｍｉｘには、Ｋｐ２Ｈ７株の定着を阻害する菌が濃縮されている、または、Ｋｐ２Ｈ７の定着に関与しないか定着を支援する菌が除外されていると考えられる。したがって、Ｋ＿６８ｍｉｘは、Ｋｐ２Ｈ７の排除に有効な菌カクテルである。
以上説明したように、本発明によれば、Ｔｈ１細胞誘導性細菌の腸管への定着等を抑制することによって、Ｔｈ１細胞の増殖又は活性化の抑制、腸管内免疫の抑制が可能となり、ひいては、Ｔｈ１細胞に起因する疾患を治療、改善又は予防することが可能となる。また、本発明によれば、Ｔｈ１細胞に起因する疾患を検査することも可能となる。
したがって、本発明は、Ｔｈ１細胞に起因する、炎症性腸疾患、自己免疫疾患、慢性炎症性疾患等に関する、医薬品の開発、治療、改善、予防及び診断において、極めて有用である。
配列番号：１４８～１５７
＜２２３＞ 人工的に合成されたプライマーの配列

Claims (10)

  1. 配列番号：６９～１０５のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを各々有する３７種の腸内細菌の組み合わせを、有効成分として含有する、腸管内でＴｈ１細胞の増殖又は活性化を誘導する細菌に対する抗菌組成物。
  2. 配列番号：１～６８のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを各々有する６８種の腸内細菌の組み合わせを、有効成分として含有する、腸管内でＴｈ１細胞の増殖又は活性化を誘導する細菌に対する抗菌組成物。
  3. 配列番号：１０６～１４７のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを各々有する４２種の腸内細菌の組み合わせを、有効成分として含有する、腸管内でＴｈ１細胞の増殖又は活性化を誘導する細菌に対する抗菌組成物。
  4. 医薬組成物である、請求項１～３のうちのいずれか一項に記載の抗菌組成物。
  5. Ｔｈ１細胞に起因する疾患を治療、改善又は予防するための医薬組成物である、請求項１～３のうちのいずれか一項に記載の抗菌組成物。
  6. 配列番号：６９～１０５のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを各々有する３７種の細菌の組み合わせ。
  7. 配列番号：１０６～１４７のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを各々有する４２種の細菌の組み合わせ。
  8. 請求項６又は７に記載の各細菌を特異的に認識する抗体の組み合わせを含む、Ｔｈ１細胞に起因する疾患を検査するための組成物。
  9. 請求項６又は７に記載の各細菌に特異的なヌクレオチド配列を検出するためのポリヌクレオチドの組み合わせを含む、Ｔｈ１細胞に起因する疾患を検査するための組成物。
  10. Ｔｈ１細胞に起因する疾患を治療、改善又は予防するための医薬組成物を製造するための、
    配列番号：６９～１０５のうちのいずれかに記載の塩基配列若しくは当該塩基配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを各々有する３７種の細菌の組み合わせ、
    配列番号：１～６８のうちのいずれかに記載の塩基配列若しくは当該塩基配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを各々有する６８種の細菌の組み合わせ、又は、
    配列番号：１０６～１４７のうちのいずれかに記載の塩基配列若しくは当該塩基配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを各々有する４２種の細菌の組み合わせ、の使用。
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