RU2426791C2 - Способ получения стероидных производных восстановлением оксостероидных соединений или окислением гидроксистероидных соединений с использованием гидроксистероидной дегидрогеназы - Google Patents

Способ получения стероидных производных восстановлением оксостероидных соединений или окислением гидроксистероидных соединений с использованием гидроксистероидной дегидрогеназы Download PDF

Info

Publication number
RU2426791C2
RU2426791C2 RU2008144419/10A RU2008144419A RU2426791C2 RU 2426791 C2 RU2426791 C2 RU 2426791C2 RU 2008144419/10 A RU2008144419/10 A RU 2008144419/10A RU 2008144419 A RU2008144419 A RU 2008144419A RU 2426791 C2 RU2426791 C2 RU 2426791C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
group
hydroxysteroid
hydrogen
compound
methyl
Prior art date
Application number
RU2008144419/10A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2008144419A (ru
Inventor
Антье ГУПТА (DE)
Антье ГУПТА
Анке ЧЕНЧЕР (DE)
Анке ЧЕНЧЕР
Мария БОБКОВА (DE)
Мария БОБКОВА
Original Assignee
Иеп Гмбх
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Иеп Гмбх filed Critical Иеп Гмбх
Publication of RU2008144419A publication Critical patent/RU2008144419A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2426791C2 publication Critical patent/RU2426791C2/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P33/00—Preparation of steroids
    • C12P33/02—Dehydrogenating; Dehydroxylating
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P33/00—Preparation of steroids
    • C12P33/12—Acting on D ring
    • C12P33/16—Acting at 17 position
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C12P41/002—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by oxidation/reduction reactions

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ энантиоселективного ферментативного восстановления оксостероидных соединений общей формулы I и формулы II, представленных в описании изобретения. Оксостероидное соединение в реакционной смеси в концентрации ≥50 г/л восстанавливают гидроксистероидной дегидрогеназой в присутствии кофактора NADH или NADPH. Окисленный кофактор NAD или NADP, образуемый гидроксистероидной дегидрогеназой, непрерывно восстанавливается через окисление вторичного спирта или через окисление С4-С6-циклоалканола. Для окисления вторичного спирта или циклоалканола используется дополнительная оксидоредуктаза/спиртовая дегидрогеназа. Также предложен способ энантиоселективного ферментативного окисления гидроксистероидных соединений общей формулы I или гидроксистероидных соединений, являющихся производными желчной кислоты. Гидроксистероидное соединение в реакционной смеси в концентрации ≥50 г/л окисляют гидроксистероидной дегидрогеназой в присутствии кофактора NAD или NADP. Восстановленный кофактор NADH или NADPH, образуемый гидроксистероидной дегидрогеназой, непрерывно регенерируется через восстановление кетосоединения или через восстановление С4-С6-циклоалканона. Для восстановления кетосоединения или циклоалканона используется дополнительная оксидоредуктаза/спиртовая дегидрогеназа. Изобретения позволяют окислять/восстанавливать исходные гидроксистероидные/оксостероидные соединения с выходом более 90% и с высоким TTN кофакторов ≥103. 2 н. и 16 з.п. ф-лы.

Description

Настоящее изобретение относится к способу энантиоселективного ферментативного восстановления соединений, которые имеют стероидную структуру (ABCD), включая один или несколько гетероатомов, одну или несколько двойных связей и/или ароматическое звено в циклической структуре, и содержат по меньшей мере одну оксо-группу в положении 3, 7, 11, 12 или 17 стероидной циклической системы или в α-положении какого-либо углеродного остатка на стероидном скелете (= оксостероидное соединение), причем оксостероидное соединение восстанавливается гидроксистероидной дегидрогеназой в присутствии кофактора NADH или NADPH.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу окисления соединений, которые имеют стероидную структуру (ABCD), включая один или несколько гетероатомов, одну или несколько двойных связей и/или одно ароматическое звено в циклической структуре, и содержат по меньшей мере одну гидрокси-группу в положении 3, 7, 11, 12 или 17 стероидной циклической системы или в α-положении какого-либо углеродного остатка на стероидном скелете (= гидроксистероидное соединение), причем гидроксистероидное соединение окисляется гидроксистероидной дегидрогеназой в присутствии кофактора NAD или NADP.
Стероиды представляют собой соединения, имеющие циклическую систему холестерина и различающиеся числом двойных связей, видом, числом и положением функциональных групп, числом метильных групп, алкильной боковой цепью и конфигурацией связей. Стероидные соединения встречаются как в животных организмах, так и в грибах и растениях и имеют разнообразную биологическую активность, например, как мужские и женские половые гормоны, как гормоны надпочечников, как витамины, как желчные кислоты, как стероидные сапогенины, как действующие на сердце вещества и как жабьи яды.
Далее под оксостероидными соединениями понимаются стероиды определенного в начале вида, то есть такие, которые содержат по меньшей мере одну кетогруппу, причем она может находиться на циклической системе или же на имеющейся на стероидном скелете боковой цепи.
Под гидроксистероидными соединениями далее понимаются стероиды определенного в начале вида, то есть такие, которые содержат по меньшей мере одну гидрокси-группу, причем она может находиться на циклической системе или же на имеющейся на стероидном скелете боковой цепи.
Благодаря многостороннему физиологическому действию стероидов понятно, что стероидные соединения и производные применяются также в большом числе как терапевтические средства и лекарственные средства в медицине.
Так, например, производные гестагена и эстрогена широко применяются во всем мире как контрацептивы; андрогены (тестостерон) применяются в лечении, например, рака предстательной железы как анаболики и антиандрогены. Глюкокортикоиды (кортизон, кортизол, преднизолон и преднизон) и их производные благодаря их противовоспалительному, противоаллергическому и иммунодепрессивному действию широко используются в терапевтическом лечении кожных заболеваний, ревматических заболеваний, аллергических реакций, заболеваний почек, желудочно-кишечных заболеваний и многих других нарушений.
Мировой рынок биологически активных стероидных соединений огромен. В производстве различных производных стероидов разного действия большую роль играют биотрансформации. При этом, в частности, важны реакции, которые катализируются гидроксилазами и дегидрогеназами. При этом особую роль играют дельта-1-дегидрирование, 11-бета-восстановление, 20-бета-восстановление, 17-бета-восстановление, стереоселективное восстановление в положении 3 и 7, а также окисление гидрокси-групп, в частности, в положениях 3, 7, 12 и 17.
В промышленности биовосстановление на стероидах до сих пор проводилось исключительно с целыми, невредимыми клетками и при концентрациях субстрата намного ниже 10 г/л. Это объясняется, во-первых, тем, что ответственные за биотрансформации ферменты до сих пор не были охарактеризованы или не могли быть экспрессированы, а, во-вторых, также тем, что не предлагалось никакого удовлетворительного технологического решения, которое, с одной стороны, решало бы проблему низкой растворимости стероидов в водной среде, а с другой стороны - проблему регенерации кофакторов NADH и NADPH в достаточной степени.
Окисление на стероидах до настоящего времени в промышленности осуществлялось химически.
Опыты по энантиоселективному восстановлению стероидов изолированными ферментами были описаны с 1975 по 1988 в основном G.Carrea (Eur. J. Biochemistry 44, 1974, p.401-405; Biotechnology and Bioengineering, Vol. 17, 1975, p.1101-1108; Enzyme Microb. Technol. Vol. 6, July, 1984, p.307-311; Biotechnology and Bioengineering, Vol. 26, 1984, p.560-563; J. Org. Chem. 51, 1986, p.2902-2906; J. Org. Chem. 58, 1993, p.499-501; J. Org. Chem., 53, 1988, p.88-92; Enzyme Microb. Technol., Vol. 10, June, p.333-339; Archives of Biochemistry and Biophysics, 159, 1973, p.7-10).
При этом использовались различные гидроксистероидные дегидрогеназы (HSHD), причем регенерация кофактора NADH достигалась в основном путем сочетания с ферментами лактатдегидрогеназа, формиатдегидрогеназа или же спиртовая дегидрогеназа из дрожжей. Регенерация NADP проводилась с помощью глюкозадегидрогеназы. Для решения проблемы растворимости проводились также опыты в двухфазной системе с этилацетатом и бутилацетатом в качестве органической фазы. При этом с изолированными ферментами в двухфазной системе также работали в диапазоне концентраций в основном намного ниже 10 г/л, причем достигаемые "total turn over numbers" (TTN = моли восстановленного оксостероидного соединения на моль использованного кофактора) также лежали намного ниже 1000, из-за чего эти способы не давали существенного экономического преимущества по сравнению со способами с цельными клетками.
Кроме того, имеются работы, в которых превращение гидрокси-групп из 7-альфа в 7-бета проводилось путем сочетания окисления и восстановления. Это достигалось сочетанием 7α HSDH и 7β HSDH (Pedrini et al., Steroid 71 (2006), p. 189-198). И в этом способе работали в диапазоне концентраций намного ниже 10 г/л, и получаемые "total turn over numbers" (TTN = моли восстановленного оксостероидного соединения на моль используемого кофактора) были ниже 100, из-за чего эти способы также не имеют экономического значения.
Изобретение имеет целью устранение этих недостатков и трудностей и ставит задачу разработать способ, который позволяет энантиоселективное восстановление или окисление оксостероидных соединений или гидроксистероидных соединений с высокими выходами, в диапазоне высоких концентраций и с высокими TTN кофакторов и тем самым экономически выгодным образом.
Эта задача решена способом указанного в начале вида тем, что:
a) оксостероидное соединение находится в реакционной смеси в концентрации ≥50 г/л,
b) окисленный кофактор NAD или NADP, образуемый гидроксистероидной гидрогеназой, непрерывно регенерируется через окисление вторичного спирта общей формулы RXRYCHOH, причем RX, RY независимо друг от друга означают водород, разветвленный или неразветвленный C1-C8-алкил и Собщ≥3, или через окисление C4-C6-циклоалканола, и
c) для окисления вторичного спирта общей формулы RXRYCHOH или циклоалканола используется дополнительная оксидоредуктаза/спиртовая дегидрогеназа.
Кроме того, вышеуказанная задача в соответствии со способом указанного в начале вида решается тем, что:
a) гидроксистероидное соединение находится в реакционной смеси в концентрации ≥50 г/л,
b) восстановленный кофактор NADH или NADPH, образуемый гидроксистероидной гидрогеназой, непрерывно регенерируется через восстановление кетосоединения общей формулы RXRYCO, причем RX, RY независимо друг от друга означают водород, разветвленный или неразветвленный C1-C8-алкил и Собщ≥3, или через восстановление C4-C6-циклоалканона, и
c) для восстановления кетосоединения общей формулы RXRYCO или циклоалканона используется дополнительная оксидоредуктаза/спиртовая дегидрогеназа.
Настоящее изобретение представляет собой существенное улучшение реакции энантиоселективного ферментативного восстановления и окисления на стероидном скелете по сравнению с уровнем техники. Настоящее изобретение делает возможным восстановление или окисление оксостероидных соединений до соответствующих гидрокси- или оксостероидов свободными ферментами в диапазонах концентраций, которые намного превышают описанные в уровне техники.
В способе согласно изобретению в качестве кофактора применяется NADH или NADPH. Под термином "NADP" понимается никотинамид-аденин-динуклеотид-фосфат, под "NADPH" восстановленный никотинамид-аденин-динуклеотид-фосфат. Термин "NAD" означает никотинамид-аденин-динуклеотид, термин "NADH" - восстановленный никотинамид-аденин-динуклеотид.
Согласно одной предпочтительной форме реализации способ по изобретению отличается тем, что в качестве оксостероидного соединения используется соединение общей формулы I
Figure 00000001
в которой означают:
R1 - водород, метильная группа, гидрокси-группа или оксо-группа,
R2 - водород, метильная группа, гидрокси-группа или оксо-группа,
R3 - водород, гидрокси-группа, оксо-группа или метильная группа,
R4 - водород или гидрокси-группа,
R5 - водород, остаток -COR10, причем R10 представляет собой незамещенную или замещенную гидрокси-группой C1-C4-алкильную группу или замещенную или незамещенную C1-C4-карбоксиалкильную группу,
или R4 и R5 вместе означают оксо-группу,
R6 - водород, метильная группа, гидрокси-группа или оксо-группа,
R7 - водород, метильная группа, гидрокси-группа или оксо-группа,
R8 - водород, метильная группа или галогенид, и
R9 - водород, метильная группа, гидрокси-группа, оксо-группа или галогенид,
причем по меньшей мере одно из R1, R2, R4+R5, R6, R8 или R9 означает оксо-группу или R5 является остатком -COR10, а структурный элемент
Figure 00000002
означает бензольное кольцо или C6-кольцо с 0, 1 или 2 двойными связями C-C.
Согласно одной предпочтительной форме реализации способ по изобретению отличается тем, что в качестве гидроксистероидного соединения используется соединение общей формулы I
Figure 00000001
в которой означают:
R1 - водород, метильная группа, гидрокси-группа или оксо-группа,
R2 - водород, метильная группа, оксо-группа или гидрокси-группа,
R3 - водород, гидрокси-группа, оксо-группа или метильная группа,
R4 - водород или гидрокси-группа,
R5 - водород, остаток -COR10, причем R10 представляет собой незамещенную или замещенную гидрокси-группой C1-C4-алкильную группу или замещенную или незамещенную C1-C4-карбоксиалкильную группу,
или R4 и R5 вместе означают оксо-группу,
R6 - водород, метильная группа, оксо-группа или гидрокси-группа,
R7 - водород, метильная группа, оксо-группа или гидрокси-группа,
R8 - водород, метильная группа или галогенид, и
R9 - водород, метильная группа, гидрокси-группа, оксо-группа или галогенид,
причем по меньшей мере одно из R1, R2, R4, R6, R7, R8 или R9 означает гидрокси-группу, а структурный элемент
Figure 00000002
означает бензольное кольцо или C6-кольцо с 0, 1 или 2 двойными связями C-C.
Предпочтительно, в качестве вторичного спирта общей формулы RXRYCHOH используется 2-пропанол, 2-бутанол, 2-пентанол, 4-метил-2-пентанол, 2-гексанол, 2-гептанол, 5-метил-2-гексанол или 2-октанол, а в качестве циклического спирта - циклогексанол.
Предпочтительно, в качестве кетона общей формулы RXRYCO используется ацетон, 2-бутанон, 2-пентанон, 4-метил-2-пентанон, 2-гексанон, 2-гептанон, 5-метил-2-гексанон или 2-октанон, а в качестве циклоалканона - циклогексанон.
В дальнейшем для кетона общей формулы RXRYCO, соответственно C4-C6-циклоалканона и вторичного спирта общей формулы RXRYCHOH или C4-C6-циклоалканола используется обобщенное обозначение косубстрат.
Предпочтительно, способ по изобретению осуществляется в водно-органической двухфазной системе. При этом целесообразно, чтобы используемый для образования коферментов косубстрат не смешивался с водой и тем самым образовывал органическую фазу водно-органической двухфазной системы.
Согласно следующей форме реализации в способе дополнительно используется органический растворитель, который не участвует в регенерации кофактора, такой как, например, диэтиловый эфир, трет-бутилметиловый эфир, диизопропиловый эфир, дибутиловый эфир, этилацетат, бутилацетат, гептан, гексан или циклогексан.
Далее, предпочтительно, чтобы TTN в способе по изобретению составляло ≥103.
Кроме того, предпочтительно, чтобы по меньшей мере 50% используемого оксостероидного соединения или гидроксистероидного соединения окислялось в течение 2-96 часов до соответствующего гидроксистероидного соединения или восстанавливалось до оксостероидного соединения.
Предпочтительные формы реализации способа по изобретению отличаются тем, что в качестве оксостероидного соединения используются, например, кетолитохолевая кислота (формула II), дексаметазон (формула III), 4-андростен-3,17-дион (формула IV), 1,4-андростадиен-3,17-дион (формула V), эстрон (формула VI), прегненолон (формула VII) и кортизон (формула VIII).
Предпочтительные формы реализации способа по изобретению отличаются, кроме того, тем, что в качестве гидроксистероидного соединения используются, например, различные производные желчной кислоты, такие как холевая кислота, хенодеоксохолевая кислота, 12-оксохолевая кислота, 3-гидрокси-12-оксохолевая кислота, кетолитохолевая кислота, литохолевая кислота или же гидрокортизон.
Под гидроксистероидными дегидрогеназами понимаются обычно такие ферменты, которые способны катализировать восстановление кетогрупп до гидрокси-групп или окисление гидрокси-групп в соответствующие кетогруппы на стероидном скелете. При этом окисление или восстановление может происходить на циклической системе самого стероида (например, 7-α гидроксистероидные дегидрогеназы) или же на углеродных остатках стероидного скелета (например, 20-β гидроксистероидные дегидрогеназы).
Гидроксистероидными дегидрогеназами, подходящими для восстановления оксостероидных соединений, являются, например, 3-α гидроксистероидная дегидрогеназа (HSDH), 3β HSDH, 12α HSDH, 20β HSDH, 7α HSDH, 7β HSDH, 17β HSDH и 11β HSDH.
Подходящая 3-α гидроксистероидная дегидрогеназа может быть получена, например, из Pseudomonas testosteroni (J. Biol. Chem. 276 (13), 9961-9970 (2001)) и может применяться для окисления 3-α-гидроксистероидов или для восстановления 3-кетостероидов, например 3-кетожелчных кислот, прогестерона, 4-андростен-3,17-диона, 5-α-андростан-3,17-диона и т.д.
Подходящие ферменты с активностью к 3-β гидроксистероидной дегидрогеназе могут быть получены, например, из Clostridium innocuum (Applied and Environmental Microbiology, June 1989, p.1656-1659) или из Pseudomonas testosteroni, и их можно использовать для окисления 3-β-гидроксистероидов или для восстановления 3-кетостероидов, например 3-кетожелчных кислот, прогестерона, 4-андростен-3,17-диона, 5-α-андростан-3,17-диона и т.д.
Например, 12α HSDH может быть получена из клостридий (Eur. J. Biochem. 196 (1991) 439-450), ее можно использовать для окисления 12α-гидроксистероидов (например, холевой кислоты) или для восстановления 12-кетостероидов, например 12-кетожелчных кислот (12-кетохенодеоксихолевая кислота, дегидрохолевая кислота). Описаны также ферменты из клостридий с активностью к 12-β гидроксистероидной дегидрогеназе (Biochim. Biophys. Acta 1988 Oct. 14; 962(3): 362-370).
Ферменты с активностью к 20-β гидроксистероидной дегидрогеназе могут быть получены, например, из организмов группы Streptomyces (The Journal of Biological Chemistry, 1977, Vol. 252 № 1, Jan 10, 205-211) и могут применяться для восстановления кортизона и производных кортизола (кортизон, кортизол, кортексолон, прогестерон) до соответствующих 20-β-гидроксистероидов (например, 20-β-гидроксипрогестерон).
Соответствующие ферменты с активностью к 20-α гидроксистероидной дегидрогеназе могут быть получены, например, из клостридий, в частности из Clostridium scindens (Journal of Bacteriology, June 1989, p.2925-2932), и из Tetrahymena pyriformis (Biochem J. (1994) 297, 195-200).
Подходящие 7-α гидроксистероидные дегидрогеназы могут быть получены, кроме того, из организмов кишечной флоры, например из клостридий (Clostridium absonum, Clostridium sordellii) (Journal of Bacteriology, Aug. 1994, p.4865-4874), из Escherichia coli (Journal of Bacteriology Apr., 1991, p.2173-2179), из Bacteroides fragilis (Current Microbiology, Vol. 47 (2003), 475-484), Brucella, Eubacterium, они могут применяться для окисления 7-α-гидроксистероидов (хенолитохолевая кислота) или для восстановления 7-кетостероидов, например 7-кетожелчных кислот (кетолитохолевая кислота).
Описаны также соответствующие ферменты с активностью к 7-β гидроксистероидной дегидрогеназе из клостридий, из микроорганизмов семейства Ruminococcen (J. Biochemistry 102, 1987, p.613-619) или пептострептококков (Biochimica and Biophysica Acta 1004, 1989, p.230-238), из Eubacterium aerofaciens (Applied and Environmental Microbiology, May 1982, p.1057-1063) и из Xanthomonas maltophila (Pedrini et al., Steroids 71 (2006), p. 189-198). С помощью 7-β HSDH можно получить, например, урсодезоксихолевую кислоту из кетолитохолевой кислоты.
Известны 17-β гидроксистероидные дегидрогеназы из грибов, как Cylindrocarpon radicola (J. Biochemistry 103, 1988, 1039-1044) и Cochliobolus lunatus (J. Steroid Biochem. Molec. Biol. Vol. 59, 1996, № 2, p.205-214), из бактерий семейства Streptomyces (Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem, Bd. 356, 1975, 1843-1852), Pseudomonas (The Journal of Biological Chemistry, Vol.252, № 11, June 10, 1977, p.3775-3783) и Alcaligenes (The Journal of Biological Chemistry, Vol.260, № 25, Nov 5, 1985, p.13648-13655).
17-β-гидроксистероидные дегидрогеназы могут применяться, например, для окисления 17-β-гидроксистероидов или для восстановления 17-кетостероидов, например 4-андростен-3,17-диона, андростерона, эстрона.
Описан соответствующий фермент с активностью к 17-α гидроксистероидной дегидрогеназе из Eubacterium sp. (Journal of Lipid Research, Vol.35, 1994, p.922-929).
Известны 11-β гидроксистероидные дегидрогеназы из высших млекопитающих, которые могут применяться, например, для окисления кортизола в кортизон.
Однако в качестве гидроксистероидной дегидрогеназы могут применяться также любые другие оксидоредуктазы, которые катализируют окисление или восстановление на стероидном скелете.
Дегидрогеназами вторичных спиртов, подходящими для регенерации NADH или NAD, например, при использовании 17-β гидроксистероидных дегидрогеназ из Pseudomonas testosteroni, 3-β гидроксистероидных дегидрогеназ из Clostridium innocuum или 7-α гидроксистероидной дегидрогеназы из Bacteroides fragilis, являются, например, вышеописанные дегидрогеназы, которые выделяют из дрожжей рода Candida и Pichia, такие как, например, карбонилредуктаза из Candida parapsilosis (CPCR) (US 5523223 и US 5763236; Enzyme Microb. Technol. 1993 Nov; 15(11):950-8), Pichia capsulata (DE 10327454.4), Pichia farinosa (A 1261/2005, кл. C12N), Pichia finlandica (EP 1179595 Al), Candida nemodendra (A 1261/2005, кл. C12N), Pichia trehalophila (A 1261/2005, кл. C12N), Rhodotorula mucilaginosa (A 1261/2005, кл. C12N), Lodderomyces elongisporus (A 1261/2005, кл. C12N) и Pichia stipidis (A 1261/2005, кл. C12N).
Кроме того, регенерация NADH может осуществляться также вторичными спиртовыми дегидрогеназами/оксидоредуктазами, какие описаны и выделены из бактерий класса Actinobacteria, например, из Rhodococcus erythropolis (US 5523223), Norcardia fusca (Biosci. Biotechnol. Biochem., 63 (10) (1999), p. 1721-1729; Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003 Sep; 62(4):380-6, Epub 2003 Apr 26), Rhodococcus ruber (J. Org. Chem. 2003 Jan 24; 8(2):402-6) или Microbacterium spec. (A 1261/2005, кл. C12N).
Вторичными спиртовыми дегидрогеназами/оксидоредуктазами, подходящими для регенерации NADPH или NADP, например, при использовании 12-α гидроксистероидных дегидрогеназ из Clostridium paraputrificum, 17-α гидроксистероидных дегидрогеназ из Eubacterium sp. или 7-α гидроксистероидных дегидрогеназ из Clostridium sordelli, являются, например, такие, какие описаны и выделены из организмов отряда лактобацилл (Lactobacillus kefir (US 5200335), Lactobacillus brevis (DE 19610984 Al; Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 2000 Dec; 56 Pt 12:1696-8), Lactobacillus minor (DE 10119274), Leuconostoc carnosum (A 1261/2005, кл. C12N)), или такие, какие описаны из Thermoanerobium brockii, Thermoanerobium ethanolicus или Clostridium beijerinckii.
Оба фермента: гидроксистероидная дегидрогеназа и оксидоредуктаза/спиртовая дегидрогеназа - предпочтительно используются рекомбинатно сверхэкспрессированными в Escherichia coli. В способе по изобретению оба фермента: гидроксистероидная дегидрогеназа и спиртовая дегидрогеназа/оксидоредуктаза - могут применяться полностью очищенными, частично очищенными или находящимися в клетках. При этом используемые клетки могут присутствовать как естественные, как клетки с нарушенной проницаемостью мембраны или растворенными.
На 1 кг реагирующего оксостероидного соединения или гидроксистероидного соединения используется от 50000 до 10 млн ед. гидроксистероидной дегидрогеназы и от 50000 до 10 млн ед. спиртовой дегидрогеназы (с открытой верхней границей).
При этом единице ферментов 1 ед. соответствует такое количество ферментов в гидроксистероидной дегидрогеназе, которое необходимо, чтобы реагировал 1 мкмоль оксостероидного соединения в минуту (мин), или такое количество ферментов в спиртовой дегидрогеназе, которое необходимо для окисления 1 мкмоль вторичного спирта в минуту (мин).
Аналогично, на каждый кг реагирующего оксостероидного соединения или гидроксистероидного соединения может использоваться примерно от 10 г до 500 г влажной биомассы E.coli, содержащей гидроксистероидную дегидрогеназу, и от 10 г до 500 г влажной биомассы E.coli, содержащей спиртовую дегидрогеназу/оксидоредуктазу (верхняя граница открыта).
Регенерация NAD(P)H осуществляется в описанном способе в сочетании с ферментами.
В способе по изобретению реакция превращения оксостероидного соединения или гидроксистероидного соединения протекает предпочтительно в двухфазной системе, содержащей вторичный спирт или кетосоединение для регенерации кофактора, гидроксистероидную дегидрогеназу, спиртовую дегидрогеназу, воду, кофактор и оксостероидное соединение или гидроксистероидное соединение. Кроме того, могут содержаться также дополнительные органические растворители, которые не участвуют в регенерации кофактора, то есть ни один из которых не содержит окисляемых спиртовой дегидрогеназой гидрокси-групп или восстанавливаемых кетогрупп.
При этом доля не смешиваемых с водой органических компонентов двухфазной системы может составлять от 10 до 90%, предпочтительно от 20 до 80%, в расчете на полный объем реакционной смеси. Содержание воды может составлять от 90 до 10%, предпочтительно от 80 до 20%, от полного объема реакционной смеси.
К воде можно добавлять буфер, например калийфосфатный, Tris/HCl, глициновый или триэтаноламиновый буфер со значением pH от 5 до 10, предпочтительно от 6 до 9. Дополнительно буфер может содержать ионы для стабилизации или активирования обоих ферментов, например ионы магния или ионы цинка.
Кроме того, в способе по изобретению могут использоваться дополнительные добавки для стабилизации ферментов гидроксистероидная дегидрогеназа и спиртовая дегидрогеназа, такие как, например, глицерин, сорбитол, 1,4-DL-дитиотреит (DTT) или диметилсульфоксид (ДМСО).
Концентрация кофактора NAD(P)H в расчете на водную фазу составляет от 0,001 мМ до 10 мМ, в частности от 0,01 мМ до 1,0 мМ. Температура в зависимости от конкретных свойств использующихся ферментов может составлять от 10°C до 70°C, предпочтительно от 20°C до 35°C.
При этом достигаемое в способе по изобретению TTN (total turn over number = моли восстановленного оксостероидного соединения на моль используемого кофактора) может находиться в интервале от 102 до 105, как правило, предпочтительно TTN ≥103.
Восстанавливаемые оксостероидные соединения или гидроксистероидные соединения, как правило, плохо растворяются в воде. Субстрат во время реакции может находиться полностью, а также частично растворенным. Если субстрат в реакционной смеси растворим не полностью, то часть субстрата находится в твердой форме и, таким образом, может образовывать третью твердую фазу. Реакционная смесь может также во время превращения периодически образовывать эмульсию.
Восстанавливаемое оксостероидное соединение или окисляемое гидроксистероидное соединение в способе по изобретению используется в количествах ≥50 г/л в расчете на полный объем реакционной смеси. Предпочтительно используется от 50 г/л до 400 г/л оксостероидного соединения/гидроксистероидного соединения, особенно предпочтительно от 50 г/л до 200 г/л.
Предпочтительными дополнительными органическими растворителями, которые не участвуют в регенерации кофактора, являются, например, этилацетат, бутилацетат, трет-бутилметиловый эфир, диизопропиловый эфир, гептан, гексан, толуол, дихлорметан или циклогексан или их смеси разного состава.
Регенерация NAD(P)H достигается окислением вторичных спиртов общей формулы RXRYCHOH или C4-C6-циклоалканолов. При этом в качестве продуктов реакции образуются кетоны общей формулы RXRYC=O или C4-C6-циклоалканоны. Предпочтительными вторичными спиртами являются при этом алифатические вторичные спирты, такие как, например, изопропанол, 2-бутанол, 2-пентанол, 2-гексанол, 2-гептанол, 2-октанол, 4-метил-2-пентанол, 5 метил-2-гексанол, и циклические вторичные спирты, такие как циклогексанол, циклопентанол. В принципе допустимо также применение диолов, таких как, например, 1,4-циклогександиол.
Регенерация NAD(P) достигается восстановлением кетосоединений общей формулы RXRYC=O или C4-C6-циклоалканонов. При этом как продукты реакции образуются вторичные спирты общей формулы RXRYCHOH или C4-C6-циклоалканолы. Предпочтительными кетосоединениями при этом являются кетоны, такие как, например, ацетон, 2-бутанон, 2-пентанон, 2-гексанон, 2-гептанон, 2-октанон, 4-метил-2-пентанон, 5-метил-2-гексанон и циклические кетоны, такие как циклогексанон, циклопентанон. В принципе допустимо также применение дионов, например 1,4-циклогександиона.
Способ по изобретению проводится, например, в реакционном сосуде из стекла или металла. Для этого компоненты помещают в реакционный сосуд по отдельности и перемешивают в атмосфере, например, азота или воздуха. В зависимости от используемого оксостероидного соединения продолжительность реакции составляет от 1 часа до 96 часов, в частности от 2 часов до 48 часов. За это время по меньшей мере 50% оксостероидного соединения восстановится до соответствующего гидроксистероида или гидроксистероид окислится до оксостероидного соединения.
Далее настоящее изобретение подробнее поясняется на примерах.
Примеры
1. Восстановление андростен-3,17-диона до 17-β-гидрокси-4-андростен-3-она (тестостерон)
A) Двухфазная система с 4-метил-2-пентанолом для регенерации кофермента
Для синтеза 17β-гидрокси-4-андростен-3-она (тестостерона) к 0,5 мл буфера (100 мМ триэтаноламина, pH 7, 1 мМ MgCl2, 10% глицерина), содержащего 0,1 мг NAD, 30 единиц рекомбинантной 17-β-гидроксистероидной дегидрогеназы из Pseudomonas testosteroni (J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 44 (2), 133-139 (1993), Pubmed P19871) и 50 единиц рекомбинантной спиртовой дегидрогеназы из Pichia capsulata (DE-A 10327454), добавляют 100 мг андростен-3,17-диона, растворенного в 0,4 мл 4-метил-2-пентанола. Смесь выдерживают 24 ч при комнатной температуре и постоянном перемешивании. Концентрация андростен-3,17-диона во всем реакционном объеме составляет около 100 г/л.
По окончании реакции реакционную смесь можно переработать, например, экстрагируя реакционную смесь органическим растворителем и затем удаляя растворитель перегонкой.
Через 24 часа около 94% использованного андростен-3,17-диона превращается в 17-β-гидрокси-4-андростен-3-он (тестостерон).
За превращением андростен-3,17-диона в 17-β-гидрокси-4-андростен-3-он (тестостерон) наблюдали с помощью газовой хроматографии. Для этого применялся газовый хроматограф GC-17A фирмы Shimadzu с хиральной разделительной колонкой Lipodex E, 12m (Machery-Nagel, Düren, Германия), пламенно-ионизационный газоанализатор и гелий в качестве газа-носителя.
B) Двухфазная система с бутилацетатом и 2-пропанолом для регенерации кофермента
Для синтеза 17-β-гидрокси-4-андростен-3-она (тестостерона) к 0,5 мл буфера (100 мМ триэтаноламина, pH 7, 1 мМ MgCl2, 10% глицерина), содержащего 0,1 мг NAD, 30 единиц рекомбинантной 17-β-гидроксистероидной дегидрогеназы из Pseudomonas testosteroni (J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 44 (2), 133-139 (1993), Pubmed P19871) и 50 единиц рекомбинантной спиртовой дегидрогеназы из Pichia capsulata (DE-A 10327454), добавляют 100 мг андростен-3,17-диона, растворенного в 0,3 мл бутилацетата и 0,1 мл 2-пропанола. Смесь выдерживают 24 часа при комнатной температуре и при постоянном перемешивании. Концентрация андростен-3,17-диона во всем реакционном объеме составляет около 100 г/л.
По окончании реакции реакционную смесь можно переработать, например, экстрагируя реакционную смесь органическим растворителем и затем удаляя растворитель перегонкой.
Через 24 часа около 90-95% использованного андростен-3,17-диона превращается в 17-β-гидрокси-4-андростен-3-он (тестостерон).
2. Восстановление кетолитохолевой кислоты до хенолитохолевой кислоты
A) Регенерация коферментов посредством ADH из Thermoanerobium brockii/двухфазная система
Для синтеза 3α-7α-дигидрокси-5-β-холановой кислоты (хенодеоксихолевой кислоты) к 0,2 мл буфера (100 мМ калийфосфатного буфера, pH 8,5, 1 мМ MgCl2, 10% глицерина), содержащего 0,1 мг NADP, 10 единиц рекомбинантной 7-α-гидроксистероидной дегидрогеназы из Clostridiem scindens (Pubmed AAB61151) и 10 единиц рекомбинантной спиртовой дегидрогеназы из Thermoanerobium brockii, добавляют 100 мг 3α-гидрокси-7-оксо-5-β-холановой кислоты (кетолитохолевой кислоты) в 0,5 мл метилпентанола. Смесь выдерживают 24 часа при комнатной температуре и при постоянном перемешивании. Концентрация кетолитохолевой кислоты во всем реакционном объеме составляет около 100 г/л.
Через 24 часа примерно 90-98% использованной кетолитохолевой кислоты превращается в хенодеоксихолевую кислоту.
За превращением кетолитохолевой кислоты в хенодеоксихолевую кислоту наблюдают с помощью ВЭЖХ. Для этого применяется разделительная колонка EC125/4 Nucleodur 100-5 C18ec (Machery-Nagel, Düren, Германия) изократического разделения со смесью MeOH/вода (80:20).
B) Регенерация кофермента посредством ADH из лактобацилл (DE 10119274)/двухфазная система
Для синтеза 3α-7α-дигидрокси-5-β-холановой кислоты (хенодеоксихолевой кислоты) к, например, 0,3 мл буфера (100 мМ триэтаноламинового буфера, pH 7, 1 мМ MgCl2, 10% глицерина), содержащего 0,1 мг NADP, 10 единиц рекомбинантной 7-α-гидроксистероидной дегидрогеназы из Clostridium scindens (Pubmed AAB61151) и 10 единиц рекомбинантной спиртовой дегидрогеназы из лактобацилл (DE 10119274), добавляют 100 мг 3α-гидрокси-7-оксо-5-β-холановой кислоты (кетолитохолевой кислоты) в 0,5 мл октанола. Смесь выдерживают 24 часа при комнатной температуре и при постоянном перемешивании. Концентрация кетолитохолевой кислоты во всем реакционном объеме составляет около 100 г/л.
Через 24 часа примерно 70-80% использованной кетолитохолевой кислоты превращается в хенодеоксихолевую кислоту.
3. Восстановление 1,4-андростадиен-3,17-диона в 17-β-гидрокси-1,4-андростадиен-3-он
Для синтеза 17-β-гидрокси-1,4-андростадиен-3-она к 0,5 мл буфера (100 мМ триэтаноламина, pH 7, 1 мМ MgCl2, 10% глицерина), содержащего 0,1 мг NAD, 30 единиц рекомбинантной 17-β-гидроксистероидной дегидрогеназы из Pseudomonas testosteroni (J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 44 (2), 133-139 (1993), Pubmed P19871) и 5 единиц рекомбинантной спиртовой дегидрогеназы из Pichia capsulata (DE-A 10327454), добавляют 100 мг 1,4-андростадиен-3,17-диона, растворенного в 0,4 мл 4-метил-2-пентанола. Смесь выдерживают 24 часа при комнатной температуре и при постоянном перемешивании. Концентрация 1,4-андростадиен-3,17-диона во всем реакционном объеме составляет около 100 г/л.
По окончании реакции реакционную смесь можно переработать, например, экстрагируя реакционную смесь органическим растворителем и затем удаляя растворитель перегонкой.
Через 24 часа примерно 90-98% использованного андростен-3,17-диона превращается в 17-β-гидрокси-1,4-андростадиен-3-он.
За превращением 1,4-андростадиен-3,17-диона в 17-β-гидрокси-1,4-андростадиен-3-он наблюдают с помощью газовой хроматографии. Для этого применяется газовый хроматограф Autosystem XL от Perkin Elmer, оборудованный масс-спектрометром с FS-капиллярной колонкой Optima-5-MS (Machery-Nagel, Düren, Германия), и гелий в качестве газа-носителя.
4. Окисление хенолитохолевой кислоты до кетолитохолевой кислоты
A) Регенерация кофермента посредством ADH из Thermoanerobium brockii/двухфазная система
Для синтеза 3α-гидрокси-7-оксо-5-β-холановой кислоты (кетолитохолевой кислоты) к 0,4 мл буфера (100 мМ калийфосфатного буфера, pH 8,5, 1 мМ MgCl2, 10% глицерина), содержащего 0,1 мг NADP, 10 мг влажной биомассы E.coli, содержащей сверхэкспрессированную 7-α-гидроксистероидную дегидрогеназу из Clostridiem scindens (Pubmed AAB61151), и 5 мг влажной биомассы E.coli, содержащей сверхэкспрессированную спиртовую дегидрогеназу из Thermoanerobium brockii, добавляют 100 мг 3α-7α-дигидрокси-5-β-холановой кислоты (хенодеоксихолевой кислоты) в 0,5 мл метилизобутилкетона. Смесь выдерживают 24 часа при комнатной температуре и при постоянном перемешивании. Концентрация кетолитохолевой кислоты во всем реакционном объеме составляет около 100 г/л.
Через 24 часа более 80% использованной хенодеоксихолевой кислоты превратилось в кетолитохолевую кислоту.
За реакцией кетолитохолевой кислоты в хенодеоксихолевую кислоту наблюдают с помощью тонкослойной хроматографии.
B) Регенерация кофермента посредством ADH из лактобацилл (DE 10119274)/двухфазная система
Для синтеза 3α-гидрокси-7-оксо-5-β-холановой кислоты (кетолитохолевой кислоты) к 0,15 мл буфера (100 мМ калийфосфатный буфер, pH 7,5, 1 мМ MgCl2, 10% глицерина), содержащему 0,1 мг NADP, 10 мг влажной биомассы E.coli, содержащей сверхэкспессированную 7-α-гидроксистероидную дегидрогеназу из Clostridiem scindens (Pubmed AAB61151), и 5 мг влажной биомассы E.coli, содержащей сверхэкспрессированную спиртовую дегидрогеназу из лактобацилл (DE 10119274), добавляют 100 мг 3α-7α-дигидрокси-5-β-холановой кислоты (хенодеоксихолевой кислоты) в 0,7 мл метилизобутилкетона. Смесь выдерживают 24 часа при комнатной температуре и при постоянном перемешивании. Концентрация кетолитохолевой кислоты во всем реакционном объеме составляет около 100 г/л.
Через 24 часа более 90% использованной хенодеоксихолевой кислоты превращается в кетолитохолевую кислоту.

Claims (18)

1. Способ энантиоселективного ферментативного восстановления оксостероидных соединений общей формулы I
Figure 00000003

где
R1 водород, метильная группа, гидроксигруппа или оксогруппа,
R2 водород, метильная группа, гидроксигруппа или оксогруппа,
R3 водород, гидроксигруппа, оксогруппа или метильная группа,
R4 водород или гидроксигруппа,
R5 водород, остаток -COR10, где R10 представляет собой незамещенную или замещенную гидроксигруппой С1-С4-алкильную группу, или замещенную или незамещенную С1-С4-карбоксиалкильную группу,
или R4 и R5 вместе означают оксогруппу,
R6 водород, метильная группа, гидроксигруппа или оксогруппа,
R7 водород, метильная группа, гидроксигруппа или оксогруппа,
R8 водород, метильная группа или галогенид, и
R9 водород, метильная группа, гидроксигруппа, оксогруппа или галогенид,
причем по меньшей мере один из R1, R2, R4+R5, R6, R8 или R9 означает оксогруппу, или R5 является остатком -COR10, а структурный элемент
Figure 00000004

означает бензольное кольцо или С6-кольцо с 0, 1 или 2 двойными связями С-С, или формулы II (кетолитохолевая кислота)
Figure 00000005

причем оксостероидное соединение восстанавливают гидроксистероидной дегидрогеназой в присутствии кофактора NADH или NADPH, отличающийся тем, что
a) оксостероидное соединение присутствует в реакционной смеси в концентрации ≥50 г/л,
b) окисленный кофактор NAD или NADP, образуемый гидроксистероидной дегидрогеназой, непрерывно регенерируется через окисление вторичного спирта общей формулы RXRYCHOH, где RX, RY независимо друг от друга означают разветвленный или неразветвленный C1-C8-алкил и Собщ≥3, или через окисление С4-С6-циклоалканола, и
c) для окисления вторичного спирта общей формулы RXRYCHOH или циклоалканола используется дополнительная оксидоредуктаза/спиртовая дегидрогеназа.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве вторичного спирта общей формулы RXRYCHOH используют 2-пропанол, 2-бутанол, 2-пентанол, 4-метил-2-пентанол, 2-гексанол, 2-гептанол, 5-метил-2-гексанол или 2-октанол, а в качестве циклического спирта - циклогексанол.
3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что его осуществляют в водно-органической двухфазной системе.
4. Способ по п.3, отличающийся тем, что дополнительно применяется органический растворитель, как, например, диэтиловый эфир, третбутилметиловый эфир, диизопропиловый эфир, дибутиловый эфир, этилацетат, бутилацетат, гептан, гексан или циклогексан.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что TTN (total turn over number = моли восстановленного оксостероидного соединения на моль используемого кофактора) составляет ≥103.
6. Способ по п.1, отличающийся тем, что в пределах 2-96 ч по меньшей мере 50% используемого оксостероидного соединения восстанавливается до гидроксистероидного соединения.
7. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве оксостероидного соединения используют дексаметазон (формула III)
Figure 00000006
8. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве оксостероидного соединения используют 4-андростен-3,17-дион (формула IV)
Figure 00000007
9. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве оксостероидного соединения используют 1,4-андростадиен-3,17-дион (формула V)
Figure 00000008
10. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве оксостероидного соединения используют эстрон (формула VI)
Figure 00000009
11. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве оксостероидного соединения используют прегненолон (формула VII)
Figure 00000010
12. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве оксостероидного соединения используют кортизон (формула VIII)
Figure 00000011
13. Способ энантиоселективного ферментативного окисления гидроксистероидных соединений общей формулы I
Figure 00000012

где
R1 водород, метильная группа, гидроксигруппа или оксогруппа,
R2 водород, метильная группа, оксогруппа или гидроксигруппа,
R3 водород, гидроксигруппа, оксогруппа или метильная группа,
R4 водород или гидроксигруппа,
R5 водород, остаток -COR10, причем R10 означает незамещенную или
замещенную гидроксигруппой С1-С4-алкильную группу или замещенную или незамещенную С1-С4-карбоксиалкильную группу,
или R4 и R5 вместе означают оксогруппу,
R6 водород, метильная группа, оксогруппа или гидроксигруппа,
R7 водород, метильная группа, оксогруппа или гидроксигруппа,
R8 водород, метильная группа или галогенид, и
R9 водород, метильная группа, гидроксигруппа, оксогруппа или галогенид,
причем по меньшей мере одно из R1, R2, R4, R6, R7, R8 или R9 означает гидроксигруппу, а структурный элемент
Figure 00000013

означает бензольное кольцо или С6-кольцо с 0, 1 или 2 двойными связями С-С,
или гидроксистероидных соединений, являющихся производными желчной кислоты, как холевая кислота, хенодезоксихолевая кислота, 12-оксохолевая кислота, 3-гидрокси-12-оксохолевая кислота, кетолитохолевая кислота,
причем гидроксистероидное соединение окисляют гидроксистероидной дегидрогеназой в присутствии кофактора NAD или NADP, отличающийся тем, что
a) гидроксистероидное соединение присутствует в реакционной смеси в концентрации ≥50 г/л,
b) восстановленный кофактор NADH или NADPH, образуемый гидроксистероидной дегидрогеназой, непрерывно регенерируется через восстановление кетосоединения общей формулы RXRYCO, где RX, RY независимо друг от друга означают разветвленный или неразветвленный С1-С8-алкил, и Собщ≥3, или через восстановление С4-С6-циклоалканона, и
с) для восстановления кетосоединения общей формулы RXRYCO или циклоалканона используется дополнительная оксидоредуктаза/спиртовая дегидрогеназа.
14. Способ по п.13, отличающийся тем, что в качестве кетона общей формулы RXRYCO применяется ацетон, 2-бутанон, 2-пентанон, 4-метил-2-пентанон, 2-гексанон, 2-гептанон, 5-метил-2-гексанон или 2-октанон, а в качестве циклоалканона используется циклогексанон.
15. Способ по пп.13 или 14, отличающийся тем, что его осуществляют в водно-органической двухфазной системе.
16. Способ по п.15, отличающийся тем, что дополнительно применяется органический растворитель, как, например, диэтиловый эфир, третбутилметиловый эфир, диизопропиловый эфир, дибутиловый эфир, этилацетат, бутилацетат, гептан, гексан или циклогексан.
17. Способ по п.13, отличающийся тем, что TTN (total turn over number = моли окисленного гидроксистероидного соединения на моль используемого кофактора) составляет ≥103.
18. Способ по п.13, отличающийся тем, что в пределах 2-96 ч по меньшей мере 50% используемого гидроксистероидного соединения окисляется в оксостероидное соединение.
RU2008144419/10A 2006-04-11 2007-04-11 Способ получения стероидных производных восстановлением оксостероидных соединений или окислением гидроксистероидных соединений с использованием гидроксистероидной дегидрогеназы RU2426791C2 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ATA627/2006 2006-04-11
AT0062706A AT503486B1 (de) 2006-04-11 2006-04-11 Verfahren zur enantioselektiven reduktion von steroiden

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2008144419A RU2008144419A (ru) 2010-05-20
RU2426791C2 true RU2426791C2 (ru) 2011-08-20

Family

ID=38234310

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2008144419/10A RU2426791C2 (ru) 2006-04-11 2007-04-11 Способ получения стероидных производных восстановлением оксостероидных соединений или окислением гидроксистероидных соединений с использованием гидроксистероидной дегидрогеназы

Country Status (15)

Country Link
US (1) US8227208B2 (ru)
EP (1) EP2004838B1 (ru)
JP (1) JP5113832B2 (ru)
KR (1) KR101344581B1 (ru)
CN (1) CN101421413A (ru)
AT (1) AT503486B1 (ru)
AU (1) AU2007237475B2 (ru)
CA (1) CA2633736C (ru)
ES (1) ES2389383T3 (ru)
PL (1) PL2004838T3 (ru)
PT (1) PT2004838E (ru)
RU (1) RU2426791C2 (ru)
TW (1) TWI374936B (ru)
WO (1) WO2007118644A1 (ru)
ZA (1) ZA200806774B (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2635087C2 (ru) * 2012-02-07 2017-11-09 Анникки Гмбх Способ ферментной регенерации окислительно-восстановительных кофакторов

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AT502395B1 (de) 2005-07-27 2007-03-15 Iep Gmbh Oxidoreduktasen zur stereoselektiven reduktion von ketoverbindungen
AT503486B1 (de) 2006-04-11 2008-05-15 Iep Gmbh Verfahren zur enantioselektiven reduktion von steroiden
IT1398729B1 (it) * 2009-07-01 2013-03-18 F S I Fabbrica Italiana Sint Processo per la preparazione di testosterone
AT513721B1 (de) * 2012-12-10 2014-09-15 Annikki Gmbh Verfahren zur enzymatischen Regenerierung von Redoxkofaktoren
WO2013117251A1 (de) 2012-02-07 2013-08-15 Annikki Gmbh Verfahren zur enzymatischen regenerierung von redoxkofaktoren
RS59314B1 (sr) 2012-02-07 2019-10-31 Annikki Gmbh Postupak za proizvodnju derivata furana od glukoze
CN103030677A (zh) * 2012-09-26 2013-04-10 宜城市共同药业有限公司 一种高收率的宝丹酮的合成方法
EP2999708B1 (en) * 2013-05-21 2018-08-22 Dr. Reddy's Laboratories Ltd. Processes for the preparation of dehydroepiandrosterone and its intermediates
EP3171855B1 (en) 2014-07-23 2020-08-26 Sphaera Pharma Pvt. Ltd. 11.beta.-hydroxysteroid-4-aza-compounds, compositions and uses thereof
CN105483198A (zh) * 2014-09-16 2016-04-13 中国科学院天津工业生物技术研究所 雄烯二酮（4-ad）制备脱氢表雄酮（dhea）的新方法
WO2017093980A1 (en) 2015-12-05 2017-06-08 Lupin Limited Process for preparation of testosterone
CA3049101A1 (en) * 2017-01-19 2018-07-26 Novartis Ag Enzymatic reaction medium containing surfactant
CN109706108B (zh) * 2019-01-29 2021-04-09 天津科技大学 一种通过强化nadh脱氢增强甾药前体生产的方法
CN110387360B (zh) * 2019-06-18 2021-12-28 华东理工大学 羟基类固醇脱氢酶及其在合成熊去氧胆酸前体中的应用
WO2021145458A1 (ja) * 2020-01-16 2021-07-22 学校法人慶應義塾 胆汁酸を生成するための組成物
CN117778342B (zh) * 2024-02-27 2024-05-28 中国科学院天津工业生物技术研究所 羰基还原酶突变体及其在合成11β-羟基甾体化合物中的应用

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE23191T1 (de) * 1983-02-03 1986-11-15 Duphar Int Res Verfahren zur enzymatischen umwandlung eines wasserunloeslichen oder wesentlich wasserunloeslichen organischen substrats.
US5869283A (en) * 1988-05-06 1999-02-09 Roussel Uclaf Expression cassette operable in a recombinant host
JPH03127998A (ja) * 1989-10-13 1991-05-31 Taunzu:Kk 尿素の定量法
DE4014573C1 (ru) * 1990-05-07 1991-10-10 Forschungszentrum Juelich Gmbh, 5170 Juelich, De
US5385833A (en) * 1992-02-26 1995-01-31 The Scripps Research Institute Pseudomonas sp. ATCC No. 49794 alcohol dehydrogenase
JP3672307B2 (ja) * 1992-03-13 2005-07-20 フォルシュングスツェントルム・ユーリッヒ・ゲゼルシャフト・ミト・ベシュレンクテル・ハフツング 新規ケトエステル‐還元酵素，その製造方法及びこれを酵素酸化還元反応に使用する方法
JP3574682B2 (ja) 1993-09-24 2004-10-06 ダイセル化学工業株式会社 新規な酵素、該酵素を製造する方法、該酵素をコードするｄｎａ、該ｄｎａを含む形質転換体、該酵素による光学活性アルコール等の製造方法
US5523233A (en) * 1995-05-03 1996-06-04 Merck & Co., Inc. Enzymatic hydrolysis of 3,3-diethyl-4-[(4-carboxy)phenoxy]-2-azetidinone esters
DE19610984A1 (de) * 1996-03-21 1997-09-25 Boehringer Mannheim Gmbh Alkohol-Dehydrogenase und deren Verwendung zur enzymatischen Herstellung chiraler Hydroxyverbindungen
CN1224716C (zh) * 1999-10-22 2005-10-26 阿克佐诺贝尔公司 类固醇的微生物9α－羟基化
TWI275645B (en) 2000-02-16 2007-03-11 Daicel Chemical Industries Ltd. (R)-2-octanol dehydrogenases, methods for producing the enzymes, DNA encoding the enzymes, and methods for producing alcohols using the enzymes
DE10119274A1 (de) 2001-04-20 2002-10-31 Juelich Enzyme Products Gmbh Enzymatisches Verfahren zur enantioselektiven Reduktion von Ketoverbindungen
DE10218689A1 (de) 2002-04-26 2003-11-20 Degussa ADH aus Rhodococcus erythropolis
DE10300335B4 (de) * 2003-01-09 2008-06-26 Iep Gmbh Oxidoreduktase
US20050037946A1 (en) * 2003-01-13 2005-02-17 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treating cardiovascular disease using 1722, 10280, 59917, 85553, 10653, 9235, 21668, 17794, 2210, 6169, 10102, 21061, 17662, 1468, 12282, 6350, 9035, 1820, 23652, 7301, 8925, 8701, 3533, 9462, 9123, 12788, 17729, 65552, 1261, 21476, 33770, 9380, 2569654, 33556, 53656, 44143, 32612, 10671, 261, 44570, 41922, 2552, 2417, 19319, 43969, 8921, 8993, 955, 32345, 966, 1920, 17318, 1510, 14180, 26005, 554, 16408, 42028, 112091, 13886, 13942, 1673, 54946 or 2419
DE10327454A1 (de) 2003-06-18 2005-01-20 Juelich Enzyme Products Gmbh Oxidoreduktase aus Pichia capsulata
KR20060071397A (ko) * 2003-08-11 2006-06-26 코덱시스, 인코포레이티드 4-치환된 3-히드록시부티르산 유도체 및 이웃자리 시아노,히드록시 치환된 카르복실산 에스테르의 효소적 제조 방법
US7629157B2 (en) * 2003-08-11 2009-12-08 Codexis, Inc. Ketoreductase polypeptides and related polynucleotides
DE10354779A1 (de) * 2003-11-21 2005-06-23 Juelich Enzyme Products Gmbh Oxidoreduktase aus Metschnikowia zobellii
WO2005067673A2 (en) * 2004-01-06 2005-07-28 The University Of Tennessee Research Foundation Enzymatic method to produce 7-dehydropregnenolone, vitamin d3-like compounds and derivatives thereof
EP1731618A1 (en) 2005-06-07 2006-12-13 Prodotti Chimici E Alimentari Spa Process for the selective oxydation of colic acid
AT503486B1 (de) 2006-04-11 2008-05-15 Iep Gmbh Verfahren zur enantioselektiven reduktion von steroiden

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
RIVA S. et al. Enzimatic ά/β inversion of C-3 hydroxyl of bile acids and stady of the effects of organic solvents on reaction rates. J. Org. Chem. 1988, v.53, p.88-92. RIVA S. et al. Oxidoreduction of steroids with immobilized hydroxysteroid dehydrogenases and cofactor regeneration DOI, 1988, p.413. *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2635087C2 (ru) * 2012-02-07 2017-11-09 Анникки Гмбх Способ ферментной регенерации окислительно-восстановительных кофакторов

Also Published As

Publication number Publication date
CA2633736C (en) 2015-06-16
US8227208B2 (en) 2012-07-24
ZA200806774B (en) 2009-11-25
EP2004838B1 (de) 2012-06-13
KR20090004862A (ko) 2009-01-12
CA2633736A1 (en) 2007-10-25
JP5113832B2 (ja) 2013-01-09
PL2004838T3 (pl) 2012-11-30
AU2007237475B2 (en) 2012-04-05
AU2007237475A1 (en) 2007-10-25
RU2008144419A (ru) 2010-05-20
TWI374936B (en) 2012-10-21
AT503486A1 (de) 2007-10-15
EP2004838A1 (de) 2008-12-24
CN101421413A (zh) 2009-04-29
TW200806798A (en) 2008-02-01
ES2389383T3 (es) 2012-10-25
JP2009535017A (ja) 2009-10-01
AT503486B1 (de) 2008-05-15
KR101344581B1 (ko) 2013-12-26
WO2007118644A1 (de) 2007-10-25
PT2004838E (pt) 2012-08-21
US20090280525A1 (en) 2009-11-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2426791C2 (ru) Способ получения стероидных производных восстановлением оксостероидных соединений или окислением гидроксистероидных соединений с использованием гидроксистероидной дегидрогеназы
Eggert et al. Enzymatic routes for the synthesis of ursodeoxycholic acid
Hummel et al. Strategies for regeneration of nicotinamide coenzymes emphasizing self-sufficient closed-loop recycling systems
US10370691B2 (en) Process for the enzymatic regeneration of redox cofactors
Donova et al. Microbial steroid transformations: current state and prospects
Donova et al. Steroid 17β-reduction by microorganisms—a review
Mahato et al. Steroid transformations by microorganisms—II
Giorgi et al. Microbial transformation of cholesterol: Reactions and practical aspects—An update
Rohman et al. Application of microbial 3-ketosteroid Δ1-dehydrogenases in biotechnology
WO2010079594A1 (ja) ステロール側鎖切断酵素蛋白質およびその利用
Riva Enzymatic modification of steroids
Egorova et al. Transformation of C19-steroids and testosterone production by sterol-transforming strains of Mycobacterium spp.
Wu et al. Improvement of NADPH-dependent P450-mediated biotransformation of 7α, 15α-diOH-DHEA from DHEA by a dual cosubstrate-coupled system
Tekucheva et al. Cascade biotransformation of phytosterol to testosterone by Mycolicibacterium neoaurum VKM Ас-1815D and Nocardioides simplex VKM Ас-2033D Strains
JPH0614874B2 (ja) ステロイド転化プロセス
JPH06104072B2 (ja) 毒性酸素スカベンジャーを使用する微生物による△▲１▼―脱水素化方法
Luthra et al. Biotransformation of 4-androstene-3, 17-dione to androst-1, 4-diene-3, 17-dione by Nocardioides Simplex
Wang et al. Recent developments in the enzymatic modifications of steroid scaffolds
Shkumatov et al. Range of substrates and steroid bioconversion reactions performed by recombinant microorganisms Saccharomyces cerevisiae and Yarrowia lipolytica expressing cytochrome P450c17
Katagiri et al. A steroid ketone monooxygenase from Cylindrocarpon radicicola
Madyastha Novel microbial transformations of steroids
El Refai et al. Enhancement of-sitosterol bioconversion by Fusarium solani using aqueous-organic solvent system
Kiss Steroid conversions with the CYP106A subfamily from Bacillus megaterium
Erkılıç Biotechnological modification of steroidal structures
DE102015120587A1 (de) Verfahren zur selektiven Oxygenierung von Testosteron und Testosteron-ähnlichen Steroiden