CN105339382A - 脱氢表雄酮及其中间体的制备方法 - Google Patents

脱氢表雄酮及其中间体的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105339382A
CN105339382A CN201480029546.8A CN201480029546A CN105339382A CN 105339382 A CN105339382 A CN 105339382A CN 201480029546 A CN201480029546 A CN 201480029546A CN 105339382 A CN105339382 A CN 105339382A
Authority
CN
China
Prior art keywords
formula
diketone
androstene
compound
ketoreductase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201480029546.8A
Other languages
English (en)
Inventor
A·弗里斯科瓦斯卡
M·S·基伊尔姆巴赫
S·S·C·约兰特拉
S·R·阿列提
S·R·波雷迪
N·K·R·丁内
U·蒂曼纳
V·达昂乌卡
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dr Reddys Laboratories Ltd
Original Assignee
Dr Reddys Laboratories Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dr Reddys Laboratories Ltd filed Critical Dr Reddys Laboratories Ltd
Publication of CN105339382A publication Critical patent/CN105339382A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J1/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, not substituted in position 17 beta by a carbon atom, e.g. estrane, androstane
    • C07J1/0003—Androstane derivatives
    • C07J1/0011—Androstane derivatives substituted in position 17 by a keto group
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P33/00—Preparation of steroids

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本申请涉及制备脱氢表雄酮(DHEA)的区域选择性和立体选择性方法和制备其中间体的方法。

Description

脱氢表雄酮及其中间体的制备方法
技术领域
本申请涉及制备脱氢表雄酮(DHEA)的区域选择性和立体选择性方法和制备其中间体的方法。
背景技术
脱氢表雄酮(DHEA)也被称作雄烯醇酮(androstenolone)或普拉睾酮或3β-羟基雄甾-5-烯-17-酮或5-雄甾烯-3β-醇-17-酮，其为重要的内源性类固醇激素，并且具有式(I)的结构
脱氢表雄酮(DHEA)是合成甾体分子的关键中间体，所述甾体分子包括但不限于醋酸阿比特龙(其为用于去势抗性前列腺癌的治疗的药物)。
J.BryanJones等人的文章″Steroidsandsteroidases.VI.OntheC-17specificityoftheΔ5-3-ketoisomeraseofPsudomonastestosteroneandevidenceforsubstratemicelleformation，″CandianJournalofChemistry，46，1459-1465(1968)描述了制备雄甾-5-烯-3，17-二酮的方法，雄甾-5-烯-3，17-二酮是用于制备DHEA的中间体。在所述参考文献中公开的方法包括在氮气氛下，于20℃下使雄甾-4-烯-3，17-二酮与叔丁醇钾在叔丁醇中反应90分钟，随后通过快速加入10％乙酸水溶液将反应物猝灭，加入过量的碳酸氢钠，用乙醚萃取，在室温下蒸发，并由丙酮重结晶，以得到雄甾-5-烯-3，17-二酮。
然而，上述方法的缺点在于，其涉及使用较高量的碱，即10当量的叔丁醇钾，导致雄甾-5-烯-3，17-二酮的氧化杂质的形成，并具有可能不适于工业规模的后处理过程，从而导致低的和令人不满意的收率。
因此，仍然需要提供制备雄甾-5-烯-3，17-二酮的改进方法，所述方法以方便的方式消除和减少现有技术的缺陷。
第102212099号中国专利申请公布公开了从16-妊娠双烯醇酮醋酸酯开始制备脱氢表雄酮的多步骤方法，并涉及如在以下路线1中描述的反应步骤。
路线1
第102603841号中国专利申请公布公开了从4-雄甾烯-3，17-二酮制备脱氢表雄酮的多步骤方法，并涉及如在以下路线2中描述的反应步骤。
路线2
第102603839号中国专利申请公布记载了从16-妊娠双烯醇酮醋酸酯开始制备脱氢表雄酮的多步骤合成方法，其涉及(i)制备醋酸16-妊娠双烯醇酮肟，(ii)醋酸16-妊娠双烯醇酮肟通过Beckmann重排以得到脱氢表雄酮醋酸酯，(iii)水解脱氢表雄酮醋酸酯以得到脱氢表雄酮。所述方法的反应步骤描述于下面的路线3中。
路线3
第CN101362789和101717422号中国专利申请公布、第2004040555号韩国专利申请公布也公开了制备脱氢表雄酮的合成方法。
上述制备脱氢表雄酮的合成方法包括多个步骤，以及一系列保护/脱保护步骤以实现在C3位置上的立体和区域选择性还原，并且其可能不适于商业规模的合成。
Mamoli等人在US2186906中描述了将环戊并(cyclopentano)-10，13-二甲基多氢菲系列的酮化合物(Δ4，5-雄烯二酮)转化为相应的相同系列的羟基化合物(Δ4，5-雄甾烯醇(androstenole)-17-酮-3)的生物化学氢化方法，其包括使这样的酮化合物经历包含还原酵母的发酵溶液的作用。
Misaki等人在US4791057中描述了对要测定的样品中的组分(其为3β-羟基甾族化合物或3-酮甾族化合物)的高度敏感的定量测定方法，其涉及使样品中的该组分参与3β-羟基甾族化合物&3-酮甾族化合物的循环反应，并测量在包含3β-羟基甾族化合物氧化酶和/或3β-羟基甾族化合物脱氢酶的反应体系中可检测的变化。在所述循环反应中，3β-羟基甾族化合物氧化酶消耗O2并将3-羟基甾族化合物转化为3-酮甾族化合物，3β-羟基甾族化合物脱氢酶在还原型NAD(P)+存在下将3-酮甾族化合物转化为3-羟基甾族化合物并生成NAD(P)。在所述专利中描述的3β-羟基甾族化合物&3-酮甾族化合物的循环反应示意性地表示在以下路线4中：
路线4
虽然上述参考文献公开了3-羟基甾族化合物与3-酮甾族化合物相互之间的酶促转化，但是它们并没有公开制备脱氢表雄酮的方法，并且在研发在还原甾族化合物的3-氧代基而保持17-氧代基不变中表现所需的区域选择性以及在生成相应的3β-羟基化合物中表现立体选择性的改进方法中仍然存在复杂的挑战。
本申请的方法涉及制备脱氢表雄酮的酶促方法。本申请的酶促还原方法是环境友好的、成本经济的和商业上可行的。
发明概述
在一个方面中，本申请提供制备式(I)的3β-羟基雄甾-5-烯-17-酮的方法，
其包括使用酮还原酶将式(II)的Δ5-雄甾烯-3，17-二酮中的3-氧代基区域选择性地和立体选择性地还原
在另一个方面中，本申请提供制备式(I)的3β-羟基雄甾-5-烯-17-酮的方法，
其包括使用具有序列(Sequence)IDNo：1的酮还原酶还原式(II)的Δ5-雄甾烯-3，17-二酮中的3-氧代基
在一个方面中，本申请提供制备式(II)的Δ5-雄甾烯-3，17-二酮的方法，
其包括以下步骤：
a)使用叔丁醇钾和叔丁醇将式(IV)的Δ4-雄甾烯-3，17-二酮异构化
以提供式(II)的Δ5-雄甾烯-3，17-二酮；
b)由卤代烃将所述式(II)的化合物重结晶。
在另一方面中，本申请提供制备式(II)的Δ5-雄甾烯-3，17-二酮的方法，
其包括以下步骤：
a)使用叔丁醇钾和叔丁醇将式(IV)的Δ4-雄甾烯-3，17-二酮异构化
以提供式(II)的Δ5-雄甾烯-3，17-二酮；
b)在抗氧化剂的存在下分离所述式(II)的化合物。
发明详述
在一个方面中，本申请提供制备式(I)的3β-羟基雄甾-5-烯-17-酮的方法，
其包括使用酮还原酶将式(II)的Δ5-雄甾烯-3，17-二酮中的3-氧代基区域选择性地和立体选择性地还原
所述式(II)的化合物可以通过本领域已知的方法或者通过本申请中公开的方法获得。
所述式(II)的化合物的区域选择性和立体选择性还原是在酮还原酶的存在下进行，并且反应体系还包含辅因子、辅因子再生系统、底物和脱氢酶、缓冲液以及有机溶剂。
如本文中所使用的“立体选择性地或立体选择性”是指在化学或酶促反应中一种立体异构体相对于另一种的优先形成。立体选择性可以是部分的，其中一种立体异构体的形成比另一种有利，或者其也可以是完全的，其中只有一种立体异构体形成。当所述立体异构体是对映体时，所述立体选择性被称为对映选择性(一种对映体占两者总和的分数(通常以百分比的形式报告))。在本领域中，通常将其报告为对映体过量(通常为百分比的形式)，将其根据下式[主要对映体-次要对映体]/[主要对映体+次要对映体]计算。当所述立体异构体是非对映体时，所述立体选择性被称为非对映选择性(一种非对映体占其与其他异构体的总和的分数(通常以百分比的形式报告))。在本公开的上下文中，立体选择性是指式(I)的3β-羟基化合物(而不是式(I)的3α-羟基化合物)的分数(通常以百分比的形式报告)。
如本文中所使用的“区域选择性地或区域选择性”是指一个方向上的化学键的形成或断裂优先于所有其他可能的方向，或者一种产物的形成优先于另一种。在本公开的上下文中，区域选择性是指式(II)的化合物的3-氧代基的还原优先于17-氧代基或3-氧代基和17-氧代基二者的还原。在一个实施方案中，在本公开的上下文中的区域选择性是指以相当于式(II)的化合物的加入重量的大于90wt％，优选大于95wt％，更优选大于97wt％，更优选大于99wt％优先还原式(II)的化合物的3-氧代基。
所述“酮还原酶”是指催化酮或醛还原以形成相应的醇的酶。所述反应可在辅因子(NAD(P)+或NAD(P)H))的存在下，任选地在辅因子再循环系统的帮助下进行。酮还原酶包括例如分类在EC号1.1.1下的那些酶。除了酮还原酶外，给予这样的酶多种名称，其包括但不限于醇脱氢酶、羰基还原酶、乳酸脱氢酶、羟酸脱氢酶、羟基异己酸脱氢酶、β-羟基丁酸脱氢酶、类固醇脱氢酶、山梨醇脱氢酶、羟基类固醇氧化酶、酮类固醇还原酶、醛酮还原酶(AKR)和醛还原酶。NADPH-依赖性酮还原酶被分类于EC号1.1.1.2下，并且CAS号为9028-12-0。NADH依赖性酮还原酶被分类于EC号1.1.1.1下，并且CAS号为9031-72-5。
所述酮还原酶可以是野生型或重组体酶，将其以全细胞或以分离/半纯化形式使用。优选地，将所述酮还原酶分离。可将所述酮还原酶从任意宿主分离，例如哺乳动物、丝状真菌、酵母和细菌。
在另一个实施方案中，酮还原酶包括从Sphingomonaswittichii(菌株RW1/DSM6014/JCM10273)A5VBG8)获得的酶。
在另一个实施方案中，用于上述立体选择性还原的酮还原酶包括但不限于具有与序列IDNO：1相对应的氨基酸序列的酶。如本文中所使用，具有序列IDNO：1的酶与序列IDNO：1相对应或与序列IDNO：1至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
所述酮还原酶可以是具有序列IDNo.1的酶或其等同产品。如本文中所使用，术语“等同”是指具有相似至相同酶活性的酶或产品。
在一个实施方案中，酮还原酶包括辅因子依赖性酮还原酶。
根据本申请的方法，所述辅因子可以选自NADH、NADPH、NAD+、NADP+、其盐及其混合物。优选地，当所述酮还原酶是NADH依赖性时，所述辅因子选自NADH、NAD+、其盐及其混合物。更优选地，所述辅因子是NADH或其盐。优选地，当所述酮还原酶是NADPH依赖性时，所述辅因子选自NADPH、NADP+、其盐及其混合物。更优选地，所述辅因子是NADPH或其盐。所述辅因子的盐的实例包括NAD四(环己基铵)盐、NAD四钠盐、NAD+四钠水合物、NADP+磷酸盐水合物、NADP+磷酸钠盐和NADH二钾盐。
根据本申请的方法，所述辅因子再生系统包含一组参与反应的反应物，并将所述辅因子的氧化形式还原(例如NADP+转化为NADPH)。通过式(II)的化合物的酮还原酶催化的还原氧化的辅因子被通过辅因子再生系统再生为还原形式。例如，辅因子再生系统包含底物，其为还原氢等同物的来源，并能够还原辅因子和催化剂(例如酶催化剂)的氧化形式，其通过还原剂催化辅因子的氧化形式的还原。
优选地，所述辅因子再生系统包括底物/脱氢酶对，其选自D-葡萄糖/葡萄糖脱氢酶、甲酸钠/甲酸脱氢酶、乳酸/乳酸脱氢酶和亚磷酸盐/亚磷酸盐脱氢酶。
在一个实施方案中，使用D-葡萄糖/葡萄糖脱氢酶对。葡萄糖脱氢酶(GDH)包括例如被分类于EC号1.1.1.47下并市售可得的那些，例如购自Codexis，Inc.的目录号GDH-CDX-901下的。
例如，当使用葡萄糖/葡萄糖脱氢酶辅因子再生系统时，如果所得的葡糖酸水溶液不被另外中和，共同产生的葡糖酸(pKa＝3.6)会导致反应混合物的pH下降。可通过标准缓冲技术将反应混合物的pH维持在期望的水平，其中缓冲液以高至所提供的缓冲能力中和葡糖酸，或通过在转化过程中同时添加碱来中和葡糖酸。
所述还原反应可以在pH为约4至约9，更优选为约4至约8，更优选为约5至约8，最优选为约6至约8或者约5至约7的缓冲液的存在下进行。优选地，所述缓冲液是盐的溶液。优选地，所述盐选自磷酸钾或TRIS-盐、硫酸镁及其混合物。任选地，所述缓冲液包含硫醇化合物。
所述还原反应可在约10℃至约50℃的温度下进行。优选地，所述方法在环境温度下，在约20℃至约40℃或约25℃至约35℃的温度下进行。
所述还原反应可以在与水混溶或与与水不混溶的有机溶剂的存在下进行，并且所述溶剂可选自醇(如叔丁醇)、酯(如乙酸乙酯、乙酸异丙酯等)、醚(如四氢呋喃、甲基四氢呋喃、甲基叔丁基醚等)、芳族烃(如甲苯)以及极性非质子溶剂(如二甲基甲酰胺、二甲基亚砜等)。
在一个实施方案中，使用与水不混溶的有机溶剂。在一个优选的实施方案中，使用相对于水的比率为2-98％v/v，更优选为25-75％v/v的与水不混溶的有机溶剂。
在一个实施方案中，式(II)的Δ5-雄甾烯-3，17-二酮中的3-氧代基的还原在底物(式II)浓度为0.1-500g/L，优选至少50-300g/L下进行。
在另一个实施方案中，式(II)的Δ5雄甾烯-3，17-二酮中的3-氧代基的还原在具有序列IDNO：1的酮还原酶的存在下进行。
在另一个实施方案中，式(II)的Δ5-雄甾烯-3，17-二酮中的3-氧代基的还原在相对于底物(即式(II))的0.1-20重量％，但优选少于相对于底物的10重量％的酶负载下进行。
在另一个实施方案中，式(II)的Δ5-雄甾烯-3，17-二酮中的3-氧代基的还原在pH6.5并且离子强度为50mM的磷酸钾缓冲液的存在下进行。
在又一个实施方案中，式(II)的Δ5-雄甾烯-3，17-二酮中的3-氧代基的还原在辅因子NAD+、NAD(P)+，包含葡萄糖和葡萄糖脱氢酶(GDH-CDX-901)的辅因子再生系统的存在下进行。
在一个实施方案中，式(II)的Δ5-雄甾烯-3，17-二酮中的3-氧代基的还原在选自乙酸乙酯、乙酸异丙酯、四氢呋喃、甲基四氢呋喃、甲基叔丁基醚、甲苯、二甲基甲酰胺或二甲基亚砜的有机溶剂的存在下进行。
在一个实施方案中，式(II)的Δ5-雄甾烯-3，17-二酮中的3-氧代基的还原在约25℃至约35℃的温度下进行。
在一个优选的实施方案中，式(II)的Δ5-雄甾烯-3，17-二酮中的3-氧代基的还原在序列IDNo.1酮还原酶的酶、pH6.5并且离子强度为50mM的磷酸钾缓冲液、辅因子NAD+、NAD(P)+，包含葡萄糖和葡萄糖脱氢酶(GDH-CDX-901)的辅因子再生系统的存在下进行。
本申请的发明人惊奇地发现，本文中所描述的方法是高度区域特异性的(其选择性地还原式(II)的Δ5-雄甾烯-3，17-二酮中的3-氧代基而不是17-氧代基)，并且还是立体特异性的(其将式(II)的Δ5-雄甾烯-3，17-二酮中的3-氧代基选择性地还原，以生成相应的3β-羟基化合物)。
此外，本申请的方法是有益的，其是选择性的、绿色的、定量的并且避免使用保护/脱保护步骤，以及避免使用毒性氧化试剂，在温和条件(温度、pH)下、高底物浓度下进行，并且是得到DHEA及其衍生物的高效和直接的途径。
此外，本申请的方法是有益的，其提供80％至90％的收率，并且具有大于95％，优选大于99％，更优选99.5％的立体选择性程度。
在另一个方面中，本申请提供制备式(I)的3β-羟基雄甾-5-烯-17-酮的方法，
其包括使用具有序列IDNo：1的酮还原酶将式(II)的Δ5-雄甾烯-3，17-二酮中的3-氧代基还原
使用具有序列IDNO：1的酮还原酶将式(II)的Δ5-雄甾烯-3，17-二酮中的3-氧代基还原的方法可以根据如上所述操作或根据实施例中描述的方法来进行。
在一个实施方案中，本申请提供方法，其包括将由如上述方法获得的式(I)的化合物转化为式(III)的化合物的步骤。
在另一个实施方案中，本申请提供制备式(III)的化合物的方法，
其包括以下步骤：
a)使用酮还原酶将式(II)的Δ5-雄甾烯-3，17-二酮中的3-氧代基区域选择性地和立体选择性地还原
以获得式(I)的3β-羟基雄甾-5-烯-17-酮；
b)将所述式(I)的化合物转化为式(III)的化合物。
可以通过本领域已知的方法或本申请中公开的方法将所述式(I)的化合物转化为所述式(III)的化合物。
在一个方面中，本申请提供制备式(II)的Δ5-雄甾烯-3，17-二酮的方法，
其包括以下步骤：
a)使用叔丁醇钾和叔丁醇将式(IV)的Δ4-雄甾烯-3，17-二酮异构化
以提供式(II)的Δ5-雄甾烯-3，17-二酮；
b)由卤代烃将所述式(II)的化合物重结晶。
步骤a)的反应可在约10℃至约50℃的温度下进行。优选在约20℃至约40℃或约25℃至约35℃的温度下进行。
在一个实施方案中，反应完成后，将包含式(II)的Δ5-雄甾烯-3，17-二酮的反应混合物使用乙酸(优选使用10％乙酸)淬灭，并使用无机碱(优选使用碳酸氢钠)将反应混合物的pH调节至约6.0至约7.5，并通过添加水分离所述式(II)的化合物。
本申请的发明人惊奇地发现，由卤代烃溶剂将所述式(II)的化合物重结晶使式(II)的化合物的收率和纯度更高。
可在步骤b)中使用的卤代烃可选自二氯甲烷、1，2-二氯乙烯、四氯化碳、氯仿、1，1，1-三氯乙烷或其混合物。
在另一方面中，本申请提供制备式(II)的Δ5-雄甾烯-3，17-二酮的方法，
其包括以下步骤：
a)使用叔丁醇钾和叔丁醇将式(IV)的Δ4-雄甾烯-3，17-二酮异构化
以提供式(II)的Δ5-雄甾烯-3，17-二酮；
b)在抗氧化剂的存在下分离所述式(II)的化合物。
步骤a)的反应可以在约10℃至约50℃的温度下进行。优选在约20℃至约40℃或约25℃至约35℃的温度下进行。
本申请的发明人惊奇地发现，在抗氧化剂的存在下分离所述式(II)的化合物使式(II)的化合物的收率和纯度更高，并具有减少的或不可检测的量的在反应过程中形成的氧化杂质，并由此避免了额外的纯化。
在步骤b)中使用的抗氧化剂可以选自抗坏血酸、抗坏血酸钠、抗坏血酸钙、棕榈酸抗坏血酸酯、丁羟茴醚、丁羟甲苯、2，4，5-三羟基苯丁酮、4-羟甲基-2，6-二叔丁基苯酚、异抗坏血酸、没食子酸丙酯、硫代二丙酸、硫代二丙酸二月桂酯、叔丁基氢醌、生育酚或其混合物。在一个实施方案中，使用抗坏血酸钠。
使用的抗氧化剂的量可以是催化量的，例如每摩尔当量的式(IV)，约0.1至约0.5当量。
在一个实施方案中，可将步骤a)中获得的包含式(II)的化合物的反应混合物加入到含有乙酸、水和所选择的抗氧化剂的抗氧化剂混合物中。
在一个实施方案中，本申请提供制备式(III)的化合物的方法，
其包括以下步骤：
a)将式(IV)的Δ4-雄甾烯-3，17-二酮异构化
以得到式(II)的Δ5-雄甾烯-3，17-二酮；
b)使用酮还原酶将式(II)的Δ5-雄甾烯-3，17-二酮中的3-氧代基区域选择性地和立体选择性地还原，以获得式(I)的3β-羟基雄甾-5-烯-17-酮；
c)将所述式(I)的化合物转化为式(III)的化合物。
在另一个实施方案中，本申请提供制备式(III)的化合物的方法，
其包括以下步骤：
a)将式(IV)的Δ4-雄甾烯-3，17-二酮异构化
以得到式(II)的Δ5-雄甾烯-3，17-二酮；
b)使用具有序列IDNo：1的酮还原酶将式(II)的Δ5-雄甾烯-3，17-二酮中的3-氧代基区域选择性地和立体选择性地还原，以获得式(I)的3β-羟基雄甾-5-烯-17-酮；
c)将所述式(I)的化合物转化为式(III)的化合物。
乙酰化可使用本领域已知的方式进行。可以使用的乙酰化剂包括但不限于乙酰氯、乙酸酐、原甲酸甲酯或等同的乙酰化剂。可以使用的溶剂包括但不限于四氢呋喃、二氯甲烷、甲苯、氯仿、四氯化碳、乙腈、N，N-二甲基甲酰胺或其组合。可以使用的碱包括但不限于二异丙基胺、二甲胺、乙二胺、N，N-二异丙基甲基胺、4-二甲基氨基吡啶、N，N-二异丙基乙基胺、三乙胺、苯胺、吡啶、哌啶等；以及无机碱，如碱金属或碱土金属的碳酸盐、碳酸氢盐、氢氧化物和氧化物，例如碳酸钾、碳酸氢钾、氢氧化钾、乙酸钾、甲醇钾、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠、乙酸钠、甲醇钠、碳酸锂、碳酸氢锂、氢氧化锂、乙酸锂、甲醇锂、氢氧化钡、氧化钙等。
在一个实施方案中，可将上述获得的脱氢表雄酮进一步通过本领域已知的方法转化为醋酸阿比特龙和DHEA庚酸酯。
会参考以下实施例对本发明的某些具体方面和实施方案进行更详细地说明，提供所述实施例仅为了说明的目的，并且不应以任何方式解释为限制本发明的范围。
实施例
实施例1：5-雄甾烯-3，17-二酮的制备
在25-30℃下，于氮气气氛下，将叔丁醇(75mL)装入圆底烧瓶中，并在氮气鼓泡下搅拌10分钟。装入叔丁醇钾(9.79g)，并在30-35℃下，于氮气氛下搅拌10-15分钟。在30-35℃下，将4-雄甾烯-3，17-二酮(10.0g)装入圆底烧瓶中，并在相同温度下保持约90分钟。将乙酸(5.75g)、水(200mL)和抗坏血酸钠(3.5g)装入第二圆底烧瓶中，并在20-25℃下搅拌。将上述获得的反应混合物加入至第二圆底烧瓶中，并在20-25℃下搅拌约30分钟。将所获得的产物过滤，用水(100mL)洗涤并在真空下干燥。
收率：90.5％
HPLC纯度：93.6％
实施例2：5-雄甾烯-3，17-二酮的制备
在25-30℃下，于氮气气氛下，将叔丁醇(2000mL)装入圆底烧瓶中，并在氮气鼓泡下搅拌10分钟。装入叔丁醇钾(313.4g)，并在35-40℃下，于氮气鼓泡下搅拌10-15分钟。在35-40℃下将4-雄甾烯-3，17-二酮(80.0g)装入圆底烧瓶中，并在相同温度下，于氮气鼓泡下搅拌反应混合物约90分钟。在20-25℃下将反应混合物与10％乙酸水溶液(3130mL)合并，并使用碳酸氢钠(200g)将反应混合物的pH调节至6.5-7.0。向上述反应混合物中加入水(2500mL)，并搅拌约30分钟。过滤所获得的固体，用水(1000mL)洗涤并抽吸干燥。将所获得的产物在二氯甲烷(500mL)中溶解，分离水层，并将有机层在真空下完全蒸馏以得到5-雄甾烯-3，17-二酮。
收率：81.8％
HPLC纯度：92.30％
实施例3：5-雄甾烯-3，17-二酮的制备
在25-30℃下，于氮气气氛下，将叔丁醇(1500mL)装入圆底烧瓶中，并在氮气鼓泡下搅拌10分钟。装入叔丁醇钾(235g)，并在35-40℃下，于氮气鼓泡下搅拌10-15分钟。在35-40℃下，于氮气氛下将4-雄甾烯-3，17-二酮(60.0g)装入圆底烧瓶中，并在相同温度下，于氮气鼓泡搅拌反应混合物约90分钟。在20-25℃下将反应混合物加入10％乙酸水溶液(2500mL)，并搅拌10-15分钟。向上述反应混合物中加入水(1000mL)，并搅拌约30分钟。用碳酸氢钠(135g)将反应混合物的pH调节至7.0-7.5。将反应混合物搅拌30-40分钟。过滤所获得的固体，用水(500mL)洗涤并抽吸干燥。将所获得的产物在二氯甲烷(1000mL)中溶解，并用无水硫酸钠(50g)处理。过滤内容物，并在40℃以下减压下完全蒸馏，以得到5-雄甾烯-3，17-二酮。
收率：83％
实施例4：脱氢表雄酮(DHEA)的制备
在具有顶部搅拌的50mL反应器中，将甲基四氢呋喃(20mL)中的5-雄甾烯-3，17-二酮(1.80g)加入到含有NAD+(0.1mg/mL)、NADP+(0.1mg/mL)、MgCl2六水合物(2mM，0.4mg/mL)、葡萄糖(100mM，18.75mg/mL)、葡萄糖脱氢酶GDHCDX-901(0.1mg/mL)以及序列IDNO：1的酶(54mg，3％wt/wt)的磷酸钾缓冲溶液(10mL，离子强度50mM，pH6.5)的混合物中。在约30-35℃下以1000rpm搅拌反应物。将反应物的pH使用碳酸氢钠维持在约6.5，并在约30-35℃下以1000rpm持续搅拌约4小时至约24小时。分离有机层。用乙酸乙酯(50mL)萃取水层。用MgSO4干燥合并的有机层，并蒸发至干燥，以得到脱氢表雄酮粗品(1.86g)，定量NMR纯度为94.5％，并将其在未进一步纯化下于下一步中使用。1HNMR(CDCl3，400mHz)δ5.38(d，1H)，3.50-3.58(m，1H)，2.47(dd，1H)，2.22-2.39(m，2H)，2.04-2.12(m，2H)，1.92-1.98(m，1H)，1.83-1.89(m，3H)，1.44-1.71(m，6H)，1.22-1.29(m，2H)，0.97-1.14(m，2H)，1.04(s，3H)，0.89(s，3H)。
实施例5：脱氢表雄酮(DHEA)的制备
在具有顶部搅拌的100mL反应器中，将甲基四氢呋喃(36mL)中的5-雄甾烯-3，17-二酮(3.59g)加入到含有NAD+(0.044mg/mL)、NADP+(0.044mg/mL)、MgCl2六水合物(5mM，1.67mg/mL)、葡萄糖(100mM，18.44mg/mL)、葡萄糖脱氢酶GDHCDX-901(0.26mg/mL)以及序列IDNO：1(100mg，2.8％wt/wt)的磷酸钾缓冲溶液(18mL，离子强度50mM，pH6.5)的混合物中。将反应物在约20-32℃下以1000rpm搅拌。将反应物的pH使用碳酸氢钠维持在约6.5，并在约20-32℃下以1000rpm持续搅拌约4小时至约24小时。将甲基四氢呋喃层真空蒸发，并将沉淀的产物通过过滤分离，并用50mL水洗涤两次，然后在真空下干燥以得到3.47g粗品，定量NMR效能(potency)79％。将0.50g所获得的粗品由乙酸乙酯/庚烷重结晶，以得到脱氢表雄酮。
产量：0.35g
纯度：＞98％。
实施例6：醋酸脱氢表雄酮(DHEA醋酸酯)的制备
在25-30℃下，将脱氢表雄酮(10g，35mmol)和吡啶(25ml)装入圆底烧瓶中。将乙酸酐(26mL，277mmol)滴加入上述反应混合物中，并在氩气氛下，于室温下搅拌约12小时。将冰水(20mL)倒入反应混合物中。将形成的白色沉淀在二氯甲烷(200mL)中溶解，并用1M盐酸(3.20mL)、5％碳酸氢钠(1.30mL)、盐水溶液(1.30mL)和水(1.30mL)洗涤有机层，用无水硫酸钠干燥并减压蒸发，得到醋酸脱氢表雄酮粗品。由丙酮将获得的醋酸脱氢表雄酮粗品重结晶得到醋酸脱氢表雄酮。
收率：10.9g
纯度：95％
实施例7：醋酸脱氢表雄酮(DHEA醋酸酯)的制备
在25-30℃下，将脱氢表雄酮粗品(2.21g，7.68mmol)和甲苯(25ml)装入圆底烧瓶中。将4-二甲基氨基吡啶(66mg)、乙酸酐(1.45mL，1.57g，15.36mmol)和三乙胺(2.33g，3.2mL，23.0mmol)装入上述溶液中，并在室温下搅拌约3小时。将获得的反应物用1M盐酸(30mL)淬灭，并将有机层用水(30mL)、碳酸氢钠溶液(30mL)洗涤，硫酸镁干燥并在真空下浓缩，得到醋酸脱氢表雄酮。
收率：85％
HPLC纯度：84.2％。

Claims (11)

1.制备式(I)的3β-羟基雄甾-5-烯-17-酮的方法，
其包括使用酮还原酶将式(II)的Δ5-雄甾烯-3，17-二酮中的3-氧代基区域选择性地和立体选择性地还原
2.权利要求1的方法，其中将式(I)的化合物转化为醋酸阿比特龙。
3.权利要求1的方法，其中将所述式(I)的化合物转化为DHEA庚酸酯。
4.制备式(I)的3β-羟基雄甾-5-烯-17-酮的方法，
其包括使用具有序列IDNo：1的酮还原酶将式(II)的Δ5-雄甾烯-3，17-二酮中的3-氧代基还原
5.制备式(III)的化合物的方法，
其包括以下步骤：
a)使用酮还原酶将式(II)的Δ5-雄甾烯-3，17-二酮中的3-氧代基区域选择性地和立体选择性地还原
以获得式(I)的3β-羟基雄甾-5-烯-17-酮；
b)将所述式(I)的化合物转化为式(III)的化合物。
6.制备式(II)的Δ5-雄甾烯-3，17-二酮的方法，
其包括以下步骤：
a)使用叔丁醇钾和叔丁醇将式(IV)的Δ4-雄甾烯-3，17-二酮异构化
以提供式(II)的Δ5-雄甾烯-3，17-二酮；
b)由卤代烃将所述式(II)的化合物重结晶。
7.制备式(II)的Δ5-雄甾烯-3，17-二酮的方法，
其包括以下步骤：
a)使用叔丁醇钾和叔丁醇将式(IV)的Δ4-雄甾烯-3，17-二酮异构化
以提供式(II)的Δ5-雄甾烯-3，17-二酮；
b)在抗氧化剂的存在下分离所述式(II)的化合物。
8.制备式(III)的化合物的方法，
其包括以下步骤：
a)将式(IV)的Δ4-雄甾烯-3，17-二酮异构化
以得到式(II)的Δ5-雄甾烯-3，17-二酮；
b)使用酮还原酶将式(II)的Δ5-雄甾烯-3，17-二酮中的3-氧代基区域选择性地和立体选择性地还原，以获得式(I)的3β-羟基雄甾-5-烯-17-酮；
c)将所述式(I)的化合物转化为式(III)的化合物。
7.权利要求6的方法，其中所述酮还原酶具有序列IDNo：1。
8.权利要求6的方法，其中将式(I)的化合物转化为醋酸阿比特龙。
9.权利要求6的方法，其中将所述式(I)的化合物转化为DHEA庚酸酯。
CN201480029546.8A 2013-05-21 2014-05-21 脱氢表雄酮及其中间体的制备方法 Pending CN105339382A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IN2214/CHE/2013 2013-05-21
IN2214CH2013 2013-05-21
PCT/IB2014/061590 WO2014188353A2 (en) 2013-05-21 2014-05-21 Processes for the preparation of dehydroepiandrosterone and its intermediates

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105339382A true CN105339382A (zh) 2016-02-17

Family

ID=51934274

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201480029546.8A Pending CN105339382A (zh) 2013-05-21 2014-05-21 脱氢表雄酮及其中间体的制备方法

Country Status (9)

Country Link
US (1) US9879045B2 (zh)
EP (1) EP2999708B1 (zh)
JP (1) JP2016521544A (zh)
CN (1) CN105339382A (zh)
BR (1) BR112015029267A2 (zh)
CA (1) CA2913192A1 (zh)
MX (1) MX2015016031A (zh)
RU (1) RU2015154473A (zh)
WO (1) WO2014188353A2 (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105695551A (zh) * 2016-03-04 2016-06-22 苏州引航生物科技有限公司 一种制备去氢表雄酮的生物方法
CN106086148A (zh) * 2016-06-20 2016-11-09 苏州汉酶生物技术有限公司 一种化学‑酶法制备去氢表雄酮的方法
CN106928301A (zh) * 2017-03-21 2017-07-07 上海津力生物科技股份有限公司 一种19‑去甲基‑4‑雄烯二酮的制备方法
CN110590889A (zh) * 2019-10-05 2019-12-20 湖北竹溪人福药业有限责任公司 一种去氢表雄酮中间体母液回收利用方法
CN110885353A (zh) * 2019-12-04 2020-03-17 湖北竹溪人福药业有限责任公司 一种去氢表雄酮母液物制备醋酸阿比特龙中间体的方法
CN113621672A (zh) * 2021-07-30 2021-11-09 浙江神洲药业有限公司 一种新型制备去氢表雄酮的方法

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3256577B1 (en) 2015-02-10 2020-08-26 Codexis, Inc. Ketoreductase polypeptides for the synthesis of chiral compounds
US20160362442A1 (en) * 2015-06-10 2016-12-15 IronMag Labs Method For DHEA Enanthate Processing
CN105622696B (zh) * 2016-01-28 2017-03-22 浙江工业大学 一种乳化浸取法纯化去氢表雄酮的方法
CN113493814B (zh) * 2020-04-01 2023-03-31 湖南引航生物科技有限公司 一种去氢表雄酮生物合成方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5618807A (en) * 1992-03-31 1997-04-08 British Technology Group Limited Method for preparing 17-substituted steroids useful in cancer treatment
CN101421413A (zh) * 2006-04-11 2009-04-29 Iep有限责任公司 用羟基类固醇脱氢酶通过还原氧代类固醇化合物或者氧化羟基类固醇化合物制备类固醇衍生物的方法

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2186906A (en) 1937-02-27 1940-01-09 Schering Corp Biochemical hydrogenation of phenanthrenes
IE72193B1 (en) * 1983-08-02 1997-03-26 Res Corp Technologies Inc Steroids useful as anti-cancer anti-obesity anti-hyperglycemic anti-autoimmune and anti-hypercholesterolemic agents
JPS6131097A (ja) 1984-07-23 1986-02-13 Toyo Jozo Co Ltd 新規な高感度酵素的測定法
US5736537A (en) 1995-09-12 1998-04-07 Estee Lauder, Inc. Dehydroep:androsterone sailcylate useful against skin atrophy
KR20040040555A (ko) 2002-11-07 2004-05-13 경상북도(승계청 : 경북농업기술원 생물자원연구소, 관리청 : 경상북도 도지사) 야생마에서 디오스게닌 아세테이트 추출ㆍ정제 방법 및디에이치이에이 아세테이트 전환방법
CN101362789A (zh) 2008-09-19 2009-02-11 湖北丹江口丹澳医药化工有限公司 去氢表雄酮的生产方法
CN101717422A (zh) 2009-11-29 2010-06-02 湖北省丹江口开泰激素有限责任公司 一种生产去氢表雄酮的方法
CN102212099A (zh) 2011-04-02 2011-10-12 邵阳市科瑞化学品有限公司 去氢表雄酮的合成方法
CN102603839A (zh) 2012-01-13 2012-07-25 宜城市共同药业有限公司 去氢表雄酮的制备方法
CN102603841B (zh) 2012-02-20 2013-10-23 湖南诺凯生物医药有限公司 去氢表雄酮的制备方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5618807A (en) * 1992-03-31 1997-04-08 British Technology Group Limited Method for preparing 17-substituted steroids useful in cancer treatment
CN101421413A (zh) * 2006-04-11 2009-04-29 Iep有限责任公司 用羟基类固醇脱氢酶通过还原氧代类固醇化合物或者氧化羟基类固醇化合物制备类固醇衍生物的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J. BRYAN HONES ET AL.: "Steroids and steroidases. VI. On the C-17 specificity of the ∆5-3-ketoisomerase of Pseudomonas testostevoni and evidence for substrate micelle formation", 《CANADIAN JOURNAL OF CHEMISTRY》 *
R.A. BAWA ET AL.: "Enzymatic Reduction of Ketones to Optically Active Secondary Alcohols", 《JOURNAL OF PHYSICAL SCIENCE》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105695551A (zh) * 2016-03-04 2016-06-22 苏州引航生物科技有限公司 一种制备去氢表雄酮的生物方法
CN106086148A (zh) * 2016-06-20 2016-11-09 苏州汉酶生物技术有限公司 一种化学‑酶法制备去氢表雄酮的方法
CN106086148B (zh) * 2016-06-20 2020-10-02 苏州汉酶生物技术有限公司 一种化学-酶法制备去氢表雄酮的方法
CN106928301A (zh) * 2017-03-21 2017-07-07 上海津力生物科技股份有限公司 一种19‑去甲基‑4‑雄烯二酮的制备方法
CN110590889A (zh) * 2019-10-05 2019-12-20 湖北竹溪人福药业有限责任公司 一种去氢表雄酮中间体母液回收利用方法
CN110590889B (zh) * 2019-10-05 2022-02-22 湖北竹溪人福药业有限责任公司 一种去氢表雄酮中间体母液回收利用方法
CN110885353A (zh) * 2019-12-04 2020-03-17 湖北竹溪人福药业有限责任公司 一种去氢表雄酮母液物制备醋酸阿比特龙中间体的方法
CN113621672A (zh) * 2021-07-30 2021-11-09 浙江神洲药业有限公司 一种新型制备去氢表雄酮的方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP2999708A2 (en) 2016-03-30
MX2015016031A (es) 2016-08-03
US20160122382A1 (en) 2016-05-05
EP2999708B1 (en) 2018-08-22
BR112015029267A2 (pt) 2017-11-07
EP2999708A4 (en) 2017-01-18
US9879045B2 (en) 2018-01-30
WO2014188353A3 (en) 2015-04-02
RU2015154473A (ru) 2017-06-26
WO2014188353A2 (en) 2014-11-27
JP2016521544A (ja) 2016-07-25
CA2913192A1 (en) 2014-11-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105339382A (zh) 脱氢表雄酮及其中间体的制备方法
ES2389383T3 (es) Procedimiento para la preparación de derivados de esteroides mediante la reducción de compuestos oxoesteroides o mediante la oxidación de compuestos hidroxiesteroides usando una hidroxiesteroide deshidrogenasa
Mahato et al. Current trends in microbial steroid biotransformation
US7728157B2 (en) Regioselective and stereoselective oxidation of fused ring systems useful for the preparation of aminosterols
BR112014019287B1 (pt) processo para regeneração enzimática de cofatores de redox
JP2006340718A (ja) コール酸の選択的酸化のための方法
CN102272304A (zh) 切断固醇侧链的酶蛋白质及其应用
US20080050787A1 (en) Method for Manufacturing Optically Active Tetrahydrothiophene Derivative and Method for Crystallization of Optically Active Tetrahydrothiophene-3-Ol
CN109750051B (zh) 3β-羟基甾体脱氢酶制备脱氢表雄酮（DHEA）
CN106086148A (zh) 一种化学‑酶法制备去氢表雄酮的方法
Zheng et al. Chemoenzymatic synthesis of steroidal products: Recent advances
Winter et al. 16α-Dehydration of corticoids by bacteria isolated from rat fecal flora
JP3231901B2 (ja) ２０−ケト−２１α−ヒドロキシステロイド化合物の新製造法及び中間体
Holland et al. Microbial hydroxylation of acetylaminosteroids
KR20160013096A (ko) 데하이드로에피안드로스테론 및 그의 중간체의 제조 방법
Ferroud et al. Chemical and biochemical approaches to the production of 7-hydroxylated C19-steroids
CN117757882A (zh) 孕激素合成中间体的制备方法
KR102223742B1 (ko) Cyp154c8 효소를 이용한 스테로이드의 탄소-탄소 결합 절단을 위한 생물전환 방법
Su et al. A chemoenzymatic process for preparation of highly purified dehydroepiandrosterone in high space-time yield
TW200525036A (en) Microbial method for hydrolysis and oxidation of androst-5-ene and pregn-5-ene steroid esters
Zhang et al. Genome mining of multi-substituted alkylresorcinols from a hybrid highly reducing-and type III-polyketide pathway
US20020035260A1 (en) 4-aza-steroids
CN117887795A (zh) 替勃龙中间体的制备方法
Al-footy Synthesis and biotransformation of some steroidal imines by the fungus Mucor plumbeus
WO2004048586A1 (ja) 光学活性な１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オールの製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20160217