CN113621672A - 一种新型制备去氢表雄酮的方法 - Google Patents

Abstract

一种新型制备去氢表雄酮的方法。本发明公开了一种去氢表雄酮的制备方法，属于化合物的制备加工技术领域。该方法以4‑雄烯二酮(Ⅰ)为起始原料，经过乙酰化反应得到3‑乙酰氧基‑Δ3,5‑雄甾二烯‑17‑酮(Ⅱ)，再将得到的中间化合物(Ⅱ)经生物酶法反应得到产物去氢表雄酮。本发明中的化合物Ⅱ作为关键中间体，其性质较5‑AD更加稳定，且纯度高，从而有效的确保进入下一步生物酶法的稳定性；本发明反应路线的生物酶法采用了特定配比的复合生物酶，该特定配比的复合生物酶作用于化合物Ⅱ具备更好更稳定的转化效果；本发明路线的单批次收率＞90％，且产品化合物Ⅲ纯度高，纯度＞99％，工业化应用价值更高。

Description

一种新型制备去氢表雄酮的方法

技术领域

本发明涉及化合物的制备加工技术领域，具体涉及一种去氢表雄酮的制备方法。

背景技术

去氢表雄酮(DehydroepⅠandrosterone，简称为DHEA)，化学名为(3β)-3-羟基-5-烯-17-甾酮，分子式C19H22O2，分子量288.42，结构式如下：

去氢表雄酮是人体肾上腺皮质网状层分泌一种肾上腺激素前体物质，具有调节肥胖、防糖尿病、抗致癌和病毒感染、提高记忆、免疫反应和应激反应、减轻紧张等生理活性，是制造甾体激素中间体，并参与合成肾上腺分泌多种激素。

CN102603839A公布公开了一种以双烯醇酮醋酸酯为起始原料，经酮肟、贝克曼重排、水解反应，制备得到去氢表雄酮的方法，该方法需要使用环境不友好的五氧化二磷及高致癌溶剂苯，并不适用于工业化生产，其工艺路线如下：

CN102603841B公布了一种以4-AD为起始原料，经乙酰化、缩酮保护、还原、水解，制备得到去氢表雄酮的方法，该方法反应步骤较多，还原过程中会产生较大的难以精制除去的异构体杂质，并不适用于工业化生产，其合成路线如下：

CN106086148A、CN109312382A、CN105483198A和CN105339382A都公布了一种化学-酶法制备去氢表雄酮的方法(后简称5-AD路线)，该方法以4-AD为起始原料，经化学法合成中间体5-雄烯二酮(简称5-AD)，再经生物酶法制备得到去氢表雄酮。

该方法中化学合成的中间体5-AD稳定性很差，根据文献Org.ProcessRes.Dev.2016,20,1520-1528报道，4-AD经叔丁醇和叔丁醇钾处理后得到的醇钾中间态易与氧气发生反应，故在冰醋酸水析时必须加入抗氧化剂，另根据专利CN105483198A记载从4-AD得到5-AD收率只有32％，收率非常低，而在CN105339382A、CN106086148A记载方法中合成5-AD时使用了叔丁醇钾，还需要使用抗坏血酸钠来抑制5-AD的氧化，操作复杂不易控制，而5-AD的纯度是影响下一步反应的主要问题，其中带来的杂质，严重影响去氢表雄酮的质量和收率，这给工业化生产带来了很大的困难。

根据文献Org.Process Res.Dev.2016,20,1520-1528、CN105483198A报道5-AD方法的收率和质量均较差，根据CN105339382A、CN106086148A报道5-AD方法，即使添加了抗坏血酸钠来抑制5-AD的氧化，我们通过稳定性实验研究发现，5-AD在密闭的条件下仍易转变成其他杂质，对于5-AD纯度的影响较大，从而影响下一步的反应获得去氢表雄酮的质量和收率。

【发明内容】

为解决上述现有技术的问题，本发明提供了一种操作简单，反应路线短，中间体稳定，收率高，成本低，污染小的去氢表雄酮的制备方法。

本发明的目的是通过如下方式实现的：

一种新型制备去氢表雄酮的方法，其特征在于，该方法的合成路线如下：

具体包括如下步骤：

1)氮气保护下，将4-雄烯二酮(Ⅰ)、二氯甲烷、醋酐和酸性催化剂混合或者将4-雄烯二酮(Ⅰ)、醋酐和酸性催化剂混合后加入到反应器中，控制0～40℃搅拌反应至薄层层析色谱检测原料反应完全，浓缩掉二氯甲烷，水析，过滤，干燥，得到3-乙酰氧基-Δ3,5-雄甾二烯-17-酮(Ⅱ)；

2)以步骤1)中得到的化合物(Ⅱ)为中间体，将其与助溶剂、酶缓冲溶液构成酶反应体系，加入生物酶、辅酶、辅酶再生系统，在26-32℃的温度条件下进行生物酶促反应，整个反应过程控制pH在6.8-8.0，通过HPLC检测生物酶法反应进程，当转化率达到98％时，反应结束，经后续处理，得到所述的去氢表雄酮(Ⅲ)。

进一步，步骤1)中所述二氯甲烷体积用量为化合物(Ⅰ)的0～5倍；所述醋酐体积用量为化合物(Ⅰ)的2-5倍；所述酸性催化剂为对甲苯磺酸、甲磺酸或三氟醋酸中的一种，其质量用量为化合物(Ⅰ)的0.1-0.5倍。

进一步，步骤2)中其中所述助溶剂为叔丁醇，所述生物酶为酮还原酶和酯水解酶按一定比例混合后的复合酶，所述辅酶为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，所述辅酶再生系统为葡萄糖和葡萄糖脱氢酶按一定比例的混合物，所述的化合物(Ⅱ)：叔丁醇的投料重量体积比为1：3；所述的化合物(Ⅱ):酮还原酶：酯水解酶的投料重量比为1:0.01-0.02：0.005-0.01；所述的化合物(Ⅱ):烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的投料重量比为1:0.002-0.005；所述的化合物(Ⅱ):葡萄糖:葡萄糖脱氢酶的投料重量比为＝1:0.4-0.8:0.002-0.005；

进一步，所述酶缓冲溶液为pH6.5的磷酸盐缓冲溶液；

进一步，所述酮还原酶是由生物酶氨基酸序列1在非致病性微生物中表达的产物；

进一步，所述酯水解酶是由生物酶氨基酸序列2在非致病性微生物中表达的产物；

更进一步，所述的非致病性微生物为大肠杆菌；

进一步，所述葡萄糖脱氢酶通过市购获得；

优选地，步骤2)中所述的后续处理具体为反应结束后降温至8-10℃，过滤收集固体，固体干燥后，加入甲醇萃取三遍，每遍萃取50-60分钟，萃取液合并减压浓缩至有大量晶体析出，水析，8-10℃2小时，过滤，干燥，得到化合物(Ⅲ)。

本发明与现有技术相比的有益效果是：

1、本发明中的化合物Ⅱ作为关键中间体，其性质较5-AD更加稳定，且纯度高，从而有效的确保进入下一步生物酶法的稳定性。

2、相对于现有5-AD路线中使用叔丁醇钾的严苛无水反应条件，还需使用抗坏血酸钠控制体系中氧气含量，避免产物5-AD与氧气发生反应，本发明申请采用了乙酰化制备化合物Ⅱ，才达到了反应条件要求低，产品质量稳定，易于生产操作，适于工业化生产的效果，有较好的市场前景。

3、本发明路线的生物酶法采用了特定配比的复合生物酶，这样的特定配比的复合生物酶作用于化合物Ⅱ具备更好更稳定的转化效果。

4、本发明路线的后续处理工艺操作简易，有机溶剂单一且用量少，能耗小，污染低，更加符合工业化生产，绿色化工的需求。

5、本发明的工艺方法能够使得产品化合物Ⅲ的收率更高，相比于5AD路线多次回收套用收率85％，本发明路线的单批次收率＞90％，且产品化合物Ⅲ纯度高，纯度＞99％，工业化应用价值更高。

【附图说明】

图1为本发明实施例1中化合物Ⅱ含量谱图。

图2为本发明实施例1中化合物Ⅱ稳定性含量谱图。

图3为本发明实施例2中化合物Ⅲ含量谱图。

图4为本发明对比实施例3中5-AD含量谱图。

图5为本发明对比实施例3中5-AD稳定性实验含量谱图。

图6为本发明对比实施例4中去氢表雄酮含量谱图。

【具体实施方式】

下面结合实施例对本发明进行进一步阐述，其并不用于限制本发明。

实施例中未说明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的公开文本所描述的常规实验方法的操作即可进行，所用试剂或设备未注明厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1化合物II的制备及稳定性试验，具体如下：

1)氮气保护下，将50g化合物Ⅰ、250毫升醋酐和10g对甲苯磺酸混合加入到反应器中，控制20℃搅拌反应至薄层层析色谱检测原料反应完全，水析，过滤，干燥，得到化合物Ⅱ55.6g，HPLC含量97.3％，如图1所示。

将上述化合物Ⅱ放置在20-30℃密封遮光放置6小时后，HPLC含量稳定在97.3％，如图2所示。

实施例2一种去氢表雄酮的制备方法，包括如下步骤：

1)氮气保护下，将50g化合物Ⅰ、250毫升醋酐和10g对甲苯磺酸混合加入到反应器中，控制20℃搅拌反应至薄层层析色谱检测原料反应完全，水析，过滤，干燥，得到化合物Ⅱ55.5g，HPLC含量97.5％。

2)将上述化合物Ⅱ55.5g溶于167ml叔丁醇中，加入390ml 100mM pH6.5的磷酸盐酶缓冲溶液，开始搅拌，依次加入555mg酮还原酶，277.5mg酯水解酶，220mg烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，30g葡萄糖，220mg葡萄糖脱氢酶，26-28℃温度条件下进行生物酶法反应，并用10％碳酸钠水溶液控制pH值6.8-7.2。5小时后取样检测，转化率为99.3％，降温至8-10℃，过滤收集固体，固体干燥后，加入180ml甲醇萃取三遍，每遍萃取50-60分钟，萃取液合并减压浓缩至有大量晶体析出，水析，8-10℃2小时，过滤，干燥，得到化合物Ⅲ45.3g，含量99.8％，收率90.6％，如图3所示。

实施例3一种去氢表雄酮的制备方法，包括如下步骤：

1)氮气保护下，将50g化合物Ⅰ、100毫升二氯甲烷、150毫升醋酐和25g甲磺酸混合加入到反应器中，控制0℃搅拌反应至薄层层析色谱检测原料反应完全，浓缩掉二氯甲烷，水析，过滤，干燥，得到化合物Ⅱ55.6g，HPLC含量97.6％。

2)将上述化合物Ⅱ55.6g溶于167ml叔丁醇中，加入390ml 100mM pH6.5的磷酸盐缓冲溶液，开始搅拌，依次加入834mg酮还原酶，417mg酯水解酶，220mg烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，30g葡萄糖，220mg葡萄糖脱氢酶，28-30℃温度条件下进行生物酶法反应，并用10％碳酸钠水溶液控制pH值7.2-7.6。5小时后取样检测，转化率为99.2％，降温至8-10℃，过滤收集固体，固体干燥后，加入180ml甲醇萃取三遍，每遍萃取50-60分钟，萃取液合并减压浓缩至有大量晶体析出，水析，8-10℃2小时，过滤，干燥，得到化合物Ⅲ45.2g，含量99.7％，收率90.4％。

实施例4一种去氢表雄酮的制备方法，包括如下步骤：

1)氮气保护下，将50g化合物Ⅰ、250毫升二氯甲烷、100毫升醋酐和5g三氟醋酸混合加入到反应器中，控制40℃搅拌反应至薄层层析色谱检测原料反应完全，浓缩掉二氯乙烷，水析，过滤，干燥，得到化合物Ⅱ55.6g，HPLC含量97.3％。

2)将上述化合物Ⅱ55.6g溶于167ml叔丁醇中，加入390ml 100mM pH6.5的磷酸盐缓冲溶液，开始搅拌，依次加入1112mg酮还原酶，556mg酯水解酶，220mg烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，30g葡萄糖，220mg葡萄糖脱氢酶，30-32℃温度条件下进行生物酶促反应，并用10％碳酸钠水溶液控制pH值7.6-8.0。5小时后取样检测，转化率为99.3％，降温至8-10℃，过滤收集固体，固体干燥后，加入180ml甲醇萃取三遍，每遍萃取50-60分钟，萃取液合并减压浓缩至有大量晶体析出，水析，8-10℃2小时，过滤，干燥，得到化合物Ⅲ45.3g，含量99.7％，收率90.6％。

对比实施例1 5-AD制备

30-35℃下，向330毫升叔丁醇中通入氮气90分钟，在通气条件下加入39.2g叔丁醇钾，继续通入氮气90分钟，加入50g 4-AD，30-35℃通入氮气下反应1小时。取经过通入氮气24小时处理的1000毫升水，加入25ml冰醋酸，氮气保护下降温至20℃，搅拌15分钟，氮气保护下将上述反应液慢慢加入，约15分钟加完，加完后降温至12℃，搅拌1小时，过滤，滤饼用水洗涤，滤饼在40℃下真空干燥得白色固体5-AD 47.8g，HPLC含量75.9％。

对比实施例2 5-AD制备

50g 4-AD和195g叔丁醇钾放入至干燥的三口瓶中，通氮气25分钟，氮气保护下，加入1500ml叔丁醇，30-35℃下，搅拌3小时，将反应液迅速倒入至520ml10％的醋酸水溶液中，搅拌10分钟，使用碳酸氢钠溶液中和，并使用乙酸乙酯900ml分三次萃取，无水硫酸钠干燥，减压浓缩去溶剂，干燥得到黄色固体5-AD 45.6g，HPLC含量64.3％。

对比实施例3 5-AD制备及稳定性试验，具体如下：

20℃下，向800ml叔丁醇中通入氮气15分钟，氮气保护下加入60g叔丁醇钾，氮气保护，搅拌半小时，加入50g 4-AD，氮气保护下35℃下搅拌5小时。取35g抗坏血酸钠、57g醋酸2000ml水，搅拌15分钟，将上述溶液倒入，氮气保护下搅拌半小时，过滤，水洗，干燥后得到白色固体5-AD 47.3g，HPLC含量82.8％,收率94.6％，如图4所示。

将上述产品5-AD放置在20-30℃密封遮光保存，放置6小时后，HPLC含量从82.3％下降至68.4％，如图5所示。

对比实施例4 5-AD路线

20℃下，向800ml叔丁醇中通入氮气15分钟，氮气保护下加入60g叔丁醇钾，氮气保护，搅拌半小时，加入50g 4-AD，氮气保护下35℃下搅拌5小时。取35g抗坏血酸钠、57g醋酸2000ml水，搅拌15分钟，将上述溶液倒入，氮气保护下搅拌半小时，过滤，水洗，干燥后得到白色固体5-AD 47.2g，HPLC含量82.5％,收率94.4％。

取上述产品5-AD 47.2g溶于246ml 2-甲基四氢呋喃中，加入246ml 100mM pH6.5的磷酸盐缓冲溶液开始搅拌，依次加入49.2g葡萄糖，787mg六水氯化镁，590mg酮还原酶(使用本发明申请中所述的酮还原酶)，295mg葡萄糖脱氢酶，197mgNAD，25℃下开始反应，并用40％氢氧化钠控制pH6.5，6小时候取样检测，转化率89.3％，用盐酸调节pH<2，加入295ml乙酸乙酯和19.7g活性炭搅拌1小时，过滤，滤饼用148ml乙酸乙酯洗涤三次，合并滤液和洗涤液，旋蒸除去有机溶剂，水相加入394ml乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯，浓缩至197ml体积，至室温下缓慢加入394ml正庚烷，过夜析晶，过滤，干燥，得32.3g去氢表雄酮产品，含量93.7％，收率68.4％，如图6所示。

对比结论：通过上述实施例1-4以及对比实施例1-4，可以得出以本发明方法的化合物I为起始原料，只有采用本申请的中间体化合物Ⅱ以及生物酶(酮还原酶和酯水解酶的复合酶)，才能实现产品化合物Ⅲ收率＞90％，纯度＞99％的效果。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。

序列表

<110> 浙江神洲药业有限公司

<120> 一种新型制备去氢表雄酮的方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 264

<212> PRT

<213> 酮还原酶氨基酸(人工序列)

<400> 1

Met Ala Arg Leu Glu Gly Lys Val Ala Ile Val Thr Gly Ala Ala Gln

1 5 10 15

Gly Met Gly Ala Ala Thr Ala His Leu Phe Val His Glu Gly Ala Arg

20 25 30

Val Val Leu Gly Asp Val Leu Glu Glu Lys Gly Arg Ala Leu Ala Ala

35 40 45

Glu Leu Gly Asp Ala Ala Ile Phe Thr Pro Leu Asp Val Ser Asp Glu

50 55 60

Ser Ser Trp Glu Ser Ala Val Ala Val Ala Val Asp Arg Phe Gly Gly

65 70 75 80

Leu Asp Ile Leu Val Asn Asn Ala Gly Val Met His Trp Ala Pro Ile

85 90 95

Glu Asp Leu Asp Val Ala Arg Thr Glu Arg Leu Leu Asp Ile Asn Val

100 105 110

Leu Gly Asn Leu Leu Gly Ala Lys Ala Val Val Pro Thr Met Lys Lys

115 120 125

Ala Gly Arg Gly Val Ile Val Asn Ile Ser Ser Val Asp Gly Leu Arg

130 135 140

Gly Val Asn Gly Leu Ala Ala Tyr Thr Ala Ser Lys Trp Ala Val Arg

145 150 155 160

Gly Leu Thr Lys Ala Leu Ala Tyr Glu Leu Gly Pro Ala Gly Ile Arg

165 170 175

Val Cys Ser Val His Pro Gly Gly Val Asp Thr Thr Leu Gly Asn Pro

180 185 190

Gly Gly Leu Val Gly Asp Asp Leu Gln Ser Lys Tyr Val Gly Val Pro

195 200 205

Leu Gln Arg Ile Gly Glu Ser Glu Asp Ile Ala Arg Ala Thr Leu Phe

210 215 220

Val Ala Ser Asp Glu Ala Ser Tyr Ile Ser Gly Ala Glu Leu Ala Val

225 230 235 240

Asp Gly Gly Trp Ser Ala Gly Thr Tyr Tyr Pro Gly Leu Pro Gly Thr

245 250 255

Pro Pro Ala Leu Met Pro Asn Gly

260

<210> 2

<211> 261

<212> PRT

<213> 酯水解酶氨基酸(人工序列)

<400> 2

Met Ala Met Asn Ser Pro Thr Phe Ser Ala Pro Val Val Ala Phe Ala

1 5 10 15

Ala Ala Ser Leu Leu Ala Thr Arg Gly Met Ala Ala Ser Ser Ala Gly

20 25 30

Leu Lys Ala Arg Asn Val Ser Leu Ala His Gly Leu Lys Ala Asp Gly

35 40 45

Ser Cys Trp Thr Glu Val Ile Ala Arg Leu Gln Ala Ala Gly Leu Asn

50 55 60

Ala Thr Ala Val Gln Asn Pro Leu Thr Thr Leu Pro Glu Ala Val Ala

65 70 75 80

Ala Val Lys Arg Leu Leu Glu Pro Leu Asp Gly Arg Thr Asp Leu Val

85 90 95

Gly His Ser Phe Ser Gly Met Met Val Thr Glu Ala Gly Val Asp Pro

100 105 110

Asp Asp Ser Ala Leu Val Tyr Val Ala Pro Arg Ala Pro Asp Ala Gly

115 120 125

Glu Asp Tyr Thr Ala Leu Ala Leu Thr Phe Pro Thr Pro Pro Ala Ser

130 135 140

Ala Gly Ile Val Phe Asp Ala Asp Asp Gly Arg Leu Ser Glu Glu Ala

145 150 155 160

Phe Leu Arg Asp Phe Gln Gly Asp Leu Pro Glu Ala Lys Ala Lys Val

165 170 175

Leu Tyr Ala Val Gln Gln Pro Phe His Gly Ala Leu Leu Thr Gly Lys

180 185 190

Thr Thr Gln Ala Ala Trp Arg Ser Lys Pro Ser Trp Tyr Gly Val Ser

195 200 205

Thr Glu Asp Arg Thr Ile Asn Pro Asp Leu Glu Arg Phe Met Ala Lys

210 215 220

Arg Met Pro Ala Leu Thr Ile Glu Ile Gln Ala Ser His Leu Ser Leu

225 230 235 240

Ile Ser His Pro Asp Glu Ile Thr Lys Leu Ile Leu Thr Ala Ala Ala

245 250 255

Glu Asn Arg His Thr

260

Claims (5)

1.一种新型制备去氢表雄酮的方法，其特征在于，该方法的合成路线如下：

具体包括如下步骤：

1)氮气保护下，将4-雄烯二酮(Ⅰ)、二氯甲烷、醋酐和酸性催化剂混合或者将4-雄烯二酮(Ⅰ)、醋酐和酸性催化剂混合后加入到反应器中，控制0～40℃搅拌反应至薄层层析色谱检测原料反应完全，浓缩掉二氯甲烷，水析，过滤，干燥，得到3-乙酰氧基-Δ3,5-雄甾二烯-17-酮(Ⅱ)；

2)以步骤1)中得到的化合物(Ⅱ)为中间体，将其与助溶剂、酶缓冲溶液构成酶反应体系，加入生物酶、辅酶、辅酶再生系统，在26-32℃的温度条件下进行生物酶促反应，整个反应过程控制pH在6.8-8.0，通过HPLC检测生物酶法反应进程，当转化率达到98％时，反应结束，经后续处理，得到所述的去氢表雄酮(Ⅲ)。

2.根据权利要求1所述去氢表雄酮的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述二氯甲烷体积用量为化合物(Ⅰ)的0～5倍；所述醋酐体积用量为化合物(Ⅰ)的2-5倍；所述酸性催化剂为对甲苯磺酸、甲磺酸或三氟醋酸中的一种，其质量用量为化合物(Ⅰ)的0.1-0.5倍。

3.根据权利要求1所述去氢表雄酮的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述助溶剂为叔丁醇，所述生物酶为酮还原酶和酯水解酶按一定比例混合后的复合酶，所述辅酶为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，所述辅酶再生系统为葡萄糖和葡萄糖脱氢酶按一定比例的混合物，所述的化合物(Ⅱ)：叔丁醇的投料重量体积比为1：3；所述的化合物(Ⅱ):酮还原酶：酯水解酶的投料重量比为1:0.01-0.02：0.005-0.01；所述的化合物(Ⅱ):辅酶的投料重量比为1:0.002-0.005；所述的化合物(Ⅱ):葡萄糖:葡萄糖脱氢酶的投料重量比为＝1:0.4-0.8:0.002-0.005；

所述酶缓冲溶液为pH6.5的磷酸盐缓冲溶液；

所述酮还原酶是由生物酶氨基酸序列1在非致病性微生物中表达的产物；

所述酯水解酶是由生物酶氨基酸序列2在非致病性微生物中表达的产物。

4.根据权利要求3所述去氢表雄酮的制备方法，其特征在于，所述的非致病性微生物为大肠杆菌。

5.根据权利要求1所述去氢表雄酮的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述的后续处理具体为：反应结束后降温至8-10℃，过滤收集固体，固体干燥后，加入甲醇萃取三遍，每遍萃取50-60分钟，萃取液合并减压浓缩至有大量晶体析出，水析，8-10℃2小时，过滤，干燥，得到化合物(Ⅲ)。

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