CN109750051A - 3β-羟基甾体脱氢酶制备脱氢表雄酮（DHEA） - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种脱氢表雄酮新的制备方法，属于甾族化合物制备方法，其特征在于5‑AD为底物，利用3β‑羟基甾体脱氢酶对3‑位羰基进行还原，得到脱氢表雄酮(DHEA)。该方法利用羰基还原酶即3β‑羟基甾体脱氢酶作为催化剂，能够实现3位羰基高度的区域选择性和立体选择性还原。

Description

3β-羟基甾体脱氢酶制备脱氢表雄酮(DHEA)

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种脱氢表雄酮(DHEA)的制备方法，利用3β-羟基甾体脱氢酶的高度区域选择性和立体选择性实现。

背景技术

作为甾体药物中的一种，DHEA经常被作为抗衰老药物来使用，因为人们认为体内DHEA含量的减少与一系列衰老相关的病症发病密切相关。有些文章显示，人在80岁的时候，其体内的DHEA含量只有25岁时候的1/10。人们通常认为，脱氢表雄酮硫酸酯(DHEAS)是DHEA的一种更稳定的存在形式。DHEA和DHEAS被认为是大脑中最重要的神经甾体(Baulieu E E,Schumacher M.Progesterone as a neuroactive neurosteroid,with specialreference to the effect of progesterone on myelination[J].Steroids,2000,65(10-11):605-612)。DHEA同时还是胆固醇代谢为性激素(如睾酮等)时关键的中间产物。近期的研究更是进一步的表明了神经甾体在加强记忆(Shi J,Schulze S,Lardy H A.Theeffect of 7-oxo-DHEA acetate on memory in young and old C57BL/6mice[J].Steroids,2000,65(3):124-129)，抵抗焦虑，抗痉挛(Kokate T G,Svensson B E,Rogawski M A.Anticonvulsant activity of neurosteroids-correlation with gamma-aminobutyric acid-evoked chloride current potentiation[J].J Pharmacol ExpTher,1994,270(3):1223-1229)，抗抑郁，以及保护神经系统尤其保护其免受氧化剂伤害(Bastianetto S,Ramassamy C,Poirier J,et al.Dehydroepiandrosterone(DHEA)protects hippocampal cells from oxidative stress-induced damage[J].Mol BrainRes,1999,66(1-2):35-41.)和由外源物诱导突变所造成的DNA损害(Shen S,Cooley D M,Glickman L T,et al.Reduction in DNA damage in brain and peripheralbloodlymphocytes of elderly dogs after treatment with dehydroepiandrosterone(DHEA)[J].Mutat Res-Fundam Mol Mech Mutagen,2001,480(1)：53-62)。除去DHEA本身的药用功能，作为甾体工业中的重要一分子，DHEA也是甾体工业中合成其他甾体药物的重要前体化合物。据文献报道，相比于DHEA，7α-OH-DHEA在防止体外神经元细胞缺氧死亡方面有着更高的活性，其抗氧化性也大大的加强。此外，羟基化之后的7α-OH-DHEA，其对肿瘤增生有着强烈的抑制作用(李合平,梁冬松,戴贵馥,et al.7α-羟基-去氢表雄酮的合成与活性测定[J].中国药学杂志,2009,43(20):1596-1598)。于此类似7α，15α-OH-DHEA，和1α-OH-DHEA等经DHEA衍生合成出来的药物均有着特殊的药理作用，应用前景十分广泛。因此，DHEA作为甾体药物中的重要基础原料，其工业合成对整个甾体工业的发展有着重大的影响。

1956年Rosenkranz等采用薯芋皂苷为初始原料成功的合成了DHEA，正式开启了DHEA合成的工业化时代。经薯芋皂苷配基合成DHEA的流程大同小异，其原理几乎一样只差别于各个步骤选择了不同的保护剂或氧化剂等。但是随着时代的发展，环境问题越来越成为制约社会和科技发展的重大问题。传统的DHEA的生产模式需要消耗大量的薯蓣皂素资源，而其基本上是由专门的耕地种植获得。此外，工业上在皂素资源的提取和裂解过程中会产生大量的废水以及其他污染物，使得该行业面临着巨大的环保压力。随着老龄化社会的到来，医用资源的消耗必将进一步扩大。这必将导致DHEA的生产面临着资源和环境的双重制约。因此开发新的工艺路线，以替代传统的生产工艺刻不容缓。

伴随着生物技术的进步，生物技术在甾体工业上的应用越来越广泛。在面对资源压力和环境压力的情况下，现在采用微生物方法降解植物甾醇生产4-AD的工艺已经取得实质性的进展。国外以及国内的领先企业已经开始了工业化规模的发酵生产。该工艺以此前大量被丢弃和闲置的甾醇资源为原料，经过工程菌大量发酵，可大规模的生产甾体工业的基础类药物4-AD。而4-AD其既解决了大面积占用耕地的资源问题，也解决了环境污染问题。可以预见，随着更多此类工程菌的开发，以及更多企业采用此工艺方法。鉴于4-AD和DHEA结构的高度相似，本方法以5-AD(II)为底物，利用3β-羟基甾体脱氢酶还原3-位羰基制备DHEA。

发明内容

本发明提供了一种由5-AD制备DHEA的新方法。该发明的是利用3β-羟基甾体脱氢酶实现3-位羰基的还原从而制备DHEA。

在合成过程中，3β-羟基甾体脱氢酶蛋白序列分别为No.6，No.7,No.8,No.9，No.10。

在羰基还原酶的作用下，将3位羰基还原为β-羟基，从而制备脱氢表雄酮(III)的反应步骤如下：

底物5-AD与溶剂、助溶剂构成反应体系，加入生物催化剂和辅酶循环体系进行反应，温度为25～40℃；时间为4～24小时，制备DHEA；直接利用发酵液转化，底物5-AD浓度为10g/L～60g/L；发酵液浓缩后，底物浓度可以达到120g/L。上述的生物催化剂包括辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、葡萄糖脱氢酶或者甲酸脱氢酶和羰基还原酶，或者是粗酶粉。

具体实施方式

结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1

全基因合成由上海旭冠公司完成。

根据来源于Williamsia sp.1138的基因WP_084836793.1优化获得基因序列SEQNo.1、来源于Novosphingobium tardaugens的基因WP_021689360.1优化后基因序列SEQNo.2、来源于Geobacter metallireducens的基因No.3、来源于Cupriavidus sp.BIS7的基因WP_026035294.1优化后基因SEQ No.4。将基因构建到相应载体中。将制备得到的重组载体用常规方法转化入大肠杆菌BL21、Rosetta或Origami中，构建分别表达了3β-羟基甾体脱氢酶SEQ No.5SEQ No.6、SEQ No.7、SEQ No.8以可溶形式存在于菌体内的基因工程菌，筛选出组建成功的基因工程菌，其中以大肠杆菌BL21为宿主菌的重组菌目的蛋白表达相对较好编号分别为Ec-1，Ec-2,Ec-3,Ec-4。以目的蛋白表达量不低于20％的工程菌，作为生产用工程菌菌种，并以甘油菌或牛奶冻干菌种形式保存。

实施例2

分别Ec-1，Ec-2,Ec-3,Ec-4配置种子液50mL，培养基为LB液体培养基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L)，用接种环挑取基因工程菌单菌落接入培养基中，37℃，200rpm培养过夜。将过夜培养的种子液以1％的接种量转接到发酵培养基(工业培养基)，32℃，200rpm培养20h。

分别取Ec-1，Ec-2,Ec-3,Ec-4的发酵液1mL超声破菌后，检测3β-羟基甾体脱氢酶的活力。3β-羟基甾体脱氢酶酶活定义：每分钟消耗1μmol NAD(P)H所需要的酶量为1个酶活单位(U)；由于在还原过程中需要辅酶的再生，引入了葡萄糖脱氢酶或甲酸脱氢酶。葡萄糖、甲酸脱氢酶的酶活定义：每分钟生成1μmol NAD(P)H所需要的酶量为1个酶活单位(U)。

经酶标仪检测，发酵液的3β-羟基甾体脱氢酶酶活达到数据如下表：

编号	Ec-1	Ec-2	Ec-3	Ec-4
					5AD酶活(U/ml)	3.5	3.5	3.9	3.3

实施例3

以5-AD为底物，分别取Ec-1，Ec-2,Ec-3,Ec-4的发酵液1mL，2-甲基四氢呋喃1mL，5-AD 30mg，葡萄糖50mg，辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0.1mg，反应24小时后，EA等体积萃取，GC检测。

实施例5

1L体系进行转化：D-葡萄糖80g，D-葡萄糖脱氢酶2g，NAD⁺0.1g，Ec-1或Ec-2或Ec-3或Ec-4的发酵液500mL，5-AD 60g溶解于500mL 2-甲基四氢呋喃中加入上述体系室温反应。GC检测反应进程至底物完全转化。约5h后，用EA萃取三遍反应液。有机相用无水硫酸钠干燥后旋干。获得DHEA粗品62g。

实施例6

1L体系进行转化：甲酸钠40g，甲酸脱氢酶2g，NAD⁺0.1g，Ec-1或Ec-2或Ec-3或Ec-4的发酵液500mL，5-AD 60g溶解于500mL 2-甲基四氢呋喃中加入上述体系室温反应。GC检测反应进程至底物完全转化。约6h后，用EA萃取三遍反应液。有机相用无水硫酸钠干燥后旋干。获得DHEA粗品62g。

实施例7

1L体系进行转化：D-葡萄糖160g，D-葡萄糖脱氢酶3g，NAD⁺0.1g，Ec-1或Ec-2或Ec-3或Ec-4的发酵液500mL，5-AD 100g溶解于500mL 2-甲基四氢呋喃中加入上述体系室温反应。GC检测反应进程至底物完全转化。约15h后，用EA萃取三遍反应液。有机相用无水硫酸钠干燥后旋干。获得DHEA粗品103g。

实施例8

1L体系进行转化：甲酸钠80g，甲酸脱氢酶4g，NAD⁺0.1g，Ec-1或Ec-2或Ec-3或Ec-4的发酵液500mL，5-AD 100g溶解于500mL 2-甲基四氢呋喃中加入上述体系室温反应。GC检测反应进程至底物完全转化。约16h后，用EA萃取三遍反应液。有机相用无水硫酸钠干燥后旋干。获得DHEA粗品105g。

序列表

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 3β-羟基甾体脱氢酶制备脱氢表雄酮（DHEA）

<130> 2017.10.30

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 774

<212> DNA

<213> Williamsia sp. 1138

<400> 1

atgggtcgtc tggaaggtaa aaccgctatc gttaccggtg gtgctcaggg tatgggttct 60

gctaccgttc gtgttatggt tgaagaaggt gctaaagttg ttatcgctga cctggctgaa 120

caggctggta aatctctggc tgctgaactg ggtgacgctg cttctttctg ccgtctggac 180

gtttcttctg aatctgactg gcagaaagtt ctggctcaca ccctggaagt tcacggtacc 240

gttaacgttc tggttaacaa cgctggtatc cagtacttcg ttggtgttga agacatcgaa 300

gctgaacgtg ttatgcgtct gttctctatc aacgttctgg gttctatgct gggtgttaaa 360

accgttgctc cgatcatgaa aaaagctggt gctggtgttg ttatcaacat ctcttctctg 420

gacggtttcc gtggtaccaa cggtatgtct ccgtacgttg cttctaaatg ggctgttcgt 480

ggtctgacca aagctcaggc tctggaactg ggtccggtta tccgtgttgt ttctgttcac 540

ccgggtggtg ttaacacccc gatgggtaac ccgaccggtg acaccggtga agctctgaac 600

gctccgtacg gtcgtgttcc gctgcgtcgt atcggtgaac cgatcgaagt tgctcgtgtt 660

accgctttca tggcttctga cgacgcttct tacgtttctg gttctgaaat cgctgttgac 720

ggtggttgga ccgctggtca ctaccacgtt ggtctgccgg gtggtccgga agct 774

<210> 2

<211> 789

<212> DNA

<213> Novosphingobium tardaugens

<400> 2

atgggtcgtc tgagcggtaa agtggccatc gtgaccggtg gtgcacgtgg tatgggtgcc 60

gcaaccgtgc gtctgtttgt ggccgaaggt gcccgtgttg ccattaccga tgtgctggat 120

gccgagggca atgcactggc agccgaactg ggtgatgccg cccgttttta ccaccaggac 180

gttaccagtg aggcaggctg ggcagaagtt gtgaagcaga ccgaagccga tctgggcccg 240

gtggatgtgc tggtgaacaa cgccggcatt ctgatgttca agagtctgct ggccaccagt 300

ctggaagagt acgaacgtgt gctgcgcgtg aacctggtgg gtgagtttct gggcattaag 360

gcagtggccc cgggtatgat tgcccgtggc aaaggcagca ttgtgaatgt gagcagcgtg 420

gatggcatga aaggtgcaaa cagcctgggt gcctatgcca gtagcaaatg gggtgtgcgc 480

ggtctgacca aagtggcagc catggaactg ggtcatcgcg gcattcgtgt gaatagcgtg 540

catccgggcg gtgttgacac cgccatgacc aatcataaca atgccagccg cgagaccgtt 600

aacgagcgct ttacaaacgt gccgctgcag cgtgttggcg gtccggaaga ggttgcagcc 660

gccagtctgt tcctggcaag cgatgatgcc agttacatga ccggcgccga aattgtggtt 720

gacggcggca tgaccatcgg cgtgtattat gaaggctttc cgggtgcccc tggtgttccg 780

gaagcctaa 789

<210> 3

<211> 783

<212> DNA

<213> Geobacter metallireducens

<400> 3

atgggtaaac tggatggcaa agtggccatc gttaccggtg gcgcacgcgg tatgggtcag 60

accaccgcag aagtgtttgt gcaggaaggc gccagcgtgg tgattgtgga cgtgctggat 120

gtggaaggcg aagccctggc aaaacgcctg ggtcgcaata ccatgtacca gcatctggat 180

gtgaccgatg agcagggttg ggaacagctg gtggaaggca ttattgaccg ctacggctgc 240

atcgatatcc tggtgaacaa cgccgccgtg tttttcagca gcccgatcga tgaaacccgc 300

agcgaagcct ttcgtcgcat tctggacatt aacctgatcg gcccgtacct gggtatgaaa 360

gccgtgatcc cgaccatgaa gaaaaatcgt cgcggcagca ttatcaatgt gagcagcgtg 420

aacggcctgc gtggtagcag cggtagtggt gcctatagcg ccagcaaatg gggcgttcgc 480

ggcctgacca agtgtgtggc catggaagtg ggtccgttcg gcattcgcgt gaatagtctg 540

catcctggct ggattgtgac cccgatgaat aacccggacg gcaaaagctt cgaagaagtg 600

aacgccgagc tgaaaattaa gttcccgggc attgccctga gccgtgttgg tcagagcgaa 660

gaaatcgccc gtgccagcct gtttctggca agcgatgaca gcagctacat cagcggcgcc 720

gaactggccg ttgatggtgc ctggagctgt ggcgtgtatc tgcaggataa accgatgcct 780

taa 783

<210> 4

<211> 777

<212> DNA

<213> Cupriavidus sp. BIS7

<400> 4

atgaatcgtc tgcataataa agtggcaatt gtgacaggtg gcgcccgtgg catgggtgca 60

cagacctgtc gtctgtttgc ccaagaaggt gcacatgtga tcattgccga tgtgctggaa 120

gccgaaggtg aagcactggc ccgcgaactg ggtggtgcag cacgcttttg caaactggac 180

gtgagtgacc agagcgcctg ggaagcactg gttagcgaaa ccgttgaagc ctttggtcgc 240

attgacgtgc tggtgaacaa tgccgcagtg ctggttttcg gcggtatcac agagctgagc 300

aaacgtgact tcgaacgcgt gatcgccatc aatctggttg gcacctttct gggcattcgt 360

accgtggcac cggtgatgaa acgccagcag gccggcagca tcgtgaacat cagcagcgtt 420

gatggcctgc gtggcgttaa tgcactggcc gcctatgtga gcagcaaatg gggcgtgcgc 480

ggtctgacca aagcagcagc actggaactg ggtctgcacg gcgtgcgcgt gaacagcatt 540

catccgggcg gcgtgaatac cgtgatgagt aatccgaccg gtgccagcgt ggaggaagtg 600

aacaagggct atcagaacgt gccgctgcag cgtgttggtc atccggatga agtggcccgt 660

gccaccctgt ttctggccag cgatgaagca agctactgcc acggtagtga actgagcgtt 720

gacggcggca tggccgcagg cagctattat ccgggtctgc cgggtgcccc gagctaa 777

<210> 5

<211> 258

<212> PRT

<213> Williamsia sp. 1138

<400> 5

Met Gly Arg Leu Glu Gly Lys Thr Ala Ile Val Thr Gly Gly Ala Gln

1 5 10 15

Gly Met Gly Ser Ala Thr Val Arg Val Met Val Glu Glu Gly Ala Lys

20 25 30

Val Val Ile Ala Asp Leu Ala Glu Gln Ala Gly Lys Ser Leu Ala Ala

35 40 45

Glu Leu Gly Asp Ala Ala Ser Phe Cys Arg Leu Asp Val Ser Ser Glu

50 55 60

Ser Asp Trp Gln Lys Val Leu Ala His Thr Leu Glu Val His Gly Thr

65 70 75 80

Val Asn Val Leu Val Asn Asn Ala Gly Ile Gln Tyr Phe Val Gly Val

85 90 95

Glu Asp Ile Glu Ala Glu Arg Val Met Arg Leu Phe Ser Ile Asn Val

100 105 110

Leu Gly Ser Met Leu Gly Val Lys Thr Val Ala Pro Ile Met Lys Lys

115 120 125

Ala Gly Ala Gly Val Val Ile Asn Ile Ser Ser Leu Asp Gly Phe Arg

130 135 140

Gly Thr Asn Gly Met Ser Pro Tyr Val Ala Ser Lys Trp Ala Val Arg

145 150 155 160

Gly Leu Thr Lys Ala Gln Ala Leu Glu Leu Gly Pro Val Ile Arg Val

165 170 175

Val Ser Val His Pro Gly Gly Val Asn Thr Pro Met Gly Asn Pro Thr

180 185 190

Gly Asp Thr Gly Glu Ala Leu Asn Ala Pro Tyr Gly Arg Val Pro Leu

195 200 205

Arg Arg Ile Gly Glu Pro Ile Glu Val Ala Arg Val Thr Ala Phe Met

210 215 220

Ala Ser Asp Asp Ala Ser Tyr Val Ser Gly Ser Glu Ile Ala Val Asp

225 230 235 240

Gly Gly Trp Thr Ala Gly His Tyr His Val Gly Leu Pro Gly Gly Pro

245 250 255

Glu Ala

<210> 6

<211> 262

<212> PRT

<213> Novosphingobium tardaugens

<400> 6

Met Gly Arg Leu Ser Gly Lys Val Ala Ile Val Thr Gly Gly Ala Arg

1 5 10 15

Gly Met Gly Ala Ala Thr Val Arg Leu Phe Val Ala Glu Gly Ala Arg

20 25 30

Val Ala Ile Thr Asp Val Leu Asp Ala Glu Gly Asn Ala Leu Ala Ala

35 40 45

Glu Leu Gly Asp Ala Ala Arg Phe Tyr His Gln Asp Val Thr Ser Glu

50 55 60

Ala Gly Trp Ala Glu Val Val Lys Gln Thr Glu Ala Asp Leu Gly Pro

65 70 75 80

Val Asp Val Leu Val Asn Asn Ala Gly Ile Leu Met Phe Lys Ser Leu

85 90 95

Leu Ala Thr Ser Leu Glu Glu Tyr Glu Arg Val Leu Arg Val Asn Leu

100 105 110

Val Gly Glu Phe Leu Gly Ile Lys Ala Val Ala Pro Gly Met Ile Ala

115 120 125

Arg Gly Lys Gly Ser Ile Val Asn Val Ser Ser Val Asp Gly Met Lys

130 135 140

Gly Ala Asn Ser Leu Gly Ala Tyr Ala Ser Ser Lys Trp Gly Val Arg

145 150 155 160

Gly Leu Thr Lys Val Ala Ala Met Glu Leu Gly His Arg Gly Ile Arg

165 170 175

Val Asn Ser Val His Pro Gly Gly Val Asp Thr Ala Met Thr Asn His

180 185 190

Asn Asn Ala Ser Arg Glu Thr Val Asn Glu Arg Phe Thr Asn Val Pro

195 200 205

Leu Gln Arg Val Gly Gly Pro Glu Glu Val Ala Ala Ala Ser Leu Phe

210 215 220

Leu Ala Ser Asp Asp Ala Ser Tyr Met Thr Gly Ala Glu Ile Val Val

225 230 235 240

Asp Gly Gly Met Thr Ile Gly Val Tyr Tyr Glu Gly Phe Pro Gly Ala

245 250 255

Pro Gly Val Pro Glu Ala

260

<210> 7

<211> 260

<212> PRT

<213> Geobacter metallireducens

<400> 7

Met Gly Lys Leu Asp Gly Lys Val Ala Ile Val Thr Gly Gly Ala Arg

1 5 10 15

Gly Met Gly Gln Thr Thr Ala Glu Val Phe Val Gln Glu Gly Ala Ser

20 25 30

Val Val Ile Val Asp Val Leu Asp Val Glu Gly Glu Ala Leu Ala Lys

35 40 45

Arg Leu Gly Arg Asn Thr Met Tyr Gln His Leu Asp Val Thr Asp Glu

50 55 60

Gln Gly Trp Glu Gln Leu Val Glu Gly Ile Ile Asp Arg Tyr Gly Cys

65 70 75 80

Ile Asp Ile Leu Val Asn Asn Ala Ala Val Phe Phe Ser Ser Pro Ile

85 90 95

Asp Glu Thr Arg Ser Glu Ala Phe Arg Arg Ile Leu Asp Ile Asn Leu

100 105 110

Ile Gly Pro Tyr Leu Gly Met Lys Ala Val Ile Pro Thr Met Lys Lys

115 120 125

Asn Arg Arg Gly Ser Ile Ile Asn Val Ser Ser Val Asn Gly Leu Arg

130 135 140

Gly Ser Ser Gly Ser Gly Ala Tyr Ser Ala Ser Lys Trp Gly Val Arg

145 150 155 160

Gly Leu Thr Lys Cys Val Ala Met Glu Val Gly Pro Phe Gly Ile Arg

165 170 175

Val Asn Ser Leu His Pro Gly Trp Ile Val Thr Pro Met Asn Asn Pro

180 185 190

Asp Gly Lys Ser Phe Glu Glu Val Asn Ala Glu Leu Lys Ile Lys Phe

195 200 205

Pro Gly Ile Ala Leu Ser Arg Val Gly Gln Ser Glu Glu Ile Ala Arg

210 215 220

Ala Ser Leu Phe Leu Ala Ser Asp Asp Ser Ser Tyr Ile Ser Gly Ala

225 230 235 240

Glu Leu Ala Val Asp Gly Ala Trp Ser Cys Gly Val Tyr Leu Gln Asp

245 250 255

Lys Pro Met Pro

260

<210> 8

<211> 258

<212> PRT

<213> Cupriavidus sp. BIS7

<400> 8

Met Asn Arg Leu His Asn Lys Val Ala Ile Val Thr Gly Gly Ala Arg

1 5 10 15

Gly Met Gly Ala Gln Thr Cys Arg Leu Phe Ala Gln Glu Gly Ala His

20 25 30

Val Ile Ile Ala Asp Val Leu Glu Ala Glu Gly Glu Ala Leu Ala Arg

35 40 45

Glu Leu Gly Gly Ala Ala Arg Phe Cys Lys Leu Asp Val Ser Asp Gln

50 55 60

Ser Ala Trp Glu Ala Leu Val Ser Glu Thr Val Glu Ala Phe Gly Arg

65 70 75 80

Ile Asp Val Leu Val Asn Asn Ala Ala Val Leu Val Phe Gly Gly Ile

85 90 95

Thr Glu Leu Ser Lys Arg Asp Phe Glu Arg Val Ile Ala Ile Asn Leu

100 105 110

Val Gly Thr Phe Leu Gly Ile Arg Thr Val Ala Pro Val Met Lys Arg

115 120 125

Gln Gln Ala Gly Ser Ile Val Asn Ile Ser Ser Val Asp Gly Leu Arg

130 135 140

Gly Val Asn Ala Leu Ala Ala Tyr Val Ser Ser Lys Trp Gly Val Arg

145 150 155 160

Gly Leu Thr Lys Ala Ala Ala Leu Glu Leu Gly Leu His Gly Val Arg

165 170 175

Val Asn Ser Ile His Pro Gly Gly Val Asn Thr Val Met Ser Asn Pro

180 185 190

Thr Gly Ala Ser Val Glu Glu Val Asn Lys Gly Tyr Gln Asn Val Pro

195 200 205

Leu Gln Arg Val Gly His Pro Asp Glu Val Ala Arg Ala Thr Leu Phe

210 215 220

Leu Ala Ser Asp Glu Ala Ser Tyr Cys His Gly Ser Glu Leu Ser Val

225 230 235 240

Asp Gly Gly Met Ala Ala Gly Ser Tyr Tyr Pro Gly Leu Pro Gly Ala

245 250 255

Pro Ser

Claims (3)

1.3β-羟基甾体脱氢酶基因，其核酸序列分别为SEQ ID No.1,No.2,No.3,No.4,No.5。

2.3β-羟基甾体脱氢酶，其蛋白质序列分别为SEQ ID No.7,No.8,No.9,No.10。

3.制备脱氢表雄酮的方法，包括：分别将3β-羟基甾体脱氢酶(SEQ ID No.7,No.8,No.9,No.10)与底物5-AD相互作用，在适当地还原反应体系中，还原5-AD制备脱氢表雄酮(DHEA)。