CN110268066B - 含有表面活性剂的酶促反应介质 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于酶促合成反应的水性反应混合物，所述水性反应混合物包含表面活性剂。所述反应混合物中的表面活性剂增加了所述酶促反应的稳定性和产率。此外，本发明提供了用于使用所述水性反应混合物进行酶促反应的方法。

Description

含有表面活性剂的酶促反应介质
技术领域
本发明涉及用于酶促合成反应的改善的反应介质。反应介质包含特定的表面活性剂，与常规表面活性剂相比，所述特定的表面活性剂增强了化学反应的反应物和产物的溶剂化并提高了酶的活性。特定的表面活性剂的使用导致产率提高和酶促反应更稳健。因此，本发明提供了包含酶和表面活性剂的反应混合物以及使用所述反应混合物进行酶促反应的方法。
背景技术
制药和化学工业迫切需要新的有机化学催化合成方法，以满足日益严格的环境限制。此外，新的催化程序对于生产正在成为分子和生物医学研究目标的新兴有机化合物类别是必要的。酶催化的化学转化现在被广泛认为是传统(非生物)有机合成的实际替代方案，并且对某些棘手的合成问题而言是方便的解决方案。
酶促反应通常在水性介质中进行。然而，合成化学工业中许多感兴趣的底物和产物是疏水的并且是仅部分水溶性的。为了提高溶解度，通常将有机溶剂添加到反应混合物中。另一方面，这些有机溶剂对许多酶的稳定性和性能是有害的。此外，若干种有机溶剂对环境有害。
因此，本领域需要提供用于酶促合成反应的反应介质，所述反应介质能够将疏水底物和产物溶剂化，且不会干扰酶促反应的稳定性和产率。
发明内容
本发明基于以下发现：通过向反应混合物中添加特定的表面活性剂，可以提高使用酶作为催化剂的化学合成反应的性能。表面活性剂可用于酶促合成反应，以增加反应的反应物和产物的溶剂化。然而，这些表面活性剂负面地影响酶的活性和稳定性。诸位发明人现在发现，与常规表面活性剂或共溶剂相比，使用维生素E衍生的表面活性剂(如TPGS-750-M)大大提高了酶促反应的性能。在更低温度下反应的产率也增加，并且即使在不利条件(如低pH值)下反应仍然进行。
在第一方面，本发明提供了水性反应混合物，所述水性反应混合物包含酶，所述酶的底物和表面活性剂，其中所述表面活性剂选自由以下组成的组：
(i)具有下式I的表面活性剂：
Figure GDA0004235641720000021
(ii)具有下式II的表面活性剂：
Figure GDA0004235641720000022
和
(iii)具有下式III的表面活性剂：
Figure GDA0004235641720000023
其中
R1包含聚(C1-4-亚烷基二醇)基团；
R2、R3、R4和R5独立地是氢或C1-4-烷基；并且
R6是C5-80-烷基或C5-80-烯基。
在第二方面，本发明提供了进行酶促反应的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供根据本发明的第一方面所述的反应混合物，和
(b)允许所述酶促反应继续进行。
在第三方面，本发明提供了表面活性剂用于提高酶促反应的产率和/或稳定性的用途，所述用途包括将所述表面活性剂添加到包含酶和所述酶的底物的水性混合物中，其中所述表面活性剂选自由以下组成的组：
(i)具有下式I的表面活性剂：
Figure GDA0004235641720000031
(ii)具有下式II的表面活性剂：
Figure GDA0004235641720000032
和
(iii)具有下式III的表面活性剂：
Figure GDA0004235641720000033
其中
R1包含聚(C1-4-亚烷基二醇)基团；
R2、R3、R4和R5独立地是氢或C1-4-烷基；并且
R6是C5-80-烷基或C5-80-烯基。
可以将以上方面组合。从以下描述和所附权利要求书，本发明的其他目的、特征、优点和方面对于本领域的技术人员而言将变得显而易见。然而，应理解，以下描述、所附权利要求书和指示本申请的优选实施例的具体实例仅以说明的方式给出。从阅读以下内容，在所披露发明的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域的技术人员而言将变得显而易见。
具体实施方式
在第一方面，本发明提供了反应混合物，所述反应混合物包含酶、所述酶的底物和表面活性剂，其中所述表面活性剂选自由以下组成的组：
(i)具有下式I的表面活性剂：
Figure GDA0004235641720000041
(ii)具有下式II的表面活性剂：
Figure GDA0004235641720000042
和
(iii)具有下式III的表面活性剂：
Figure GDA0004235641720000043
其中
R1包含聚(C1-4-亚烷基二醇)基团；
R2、R3、R4和R5独立地是氢或C1-4-烷基；并且
R6是C5-80-烷基或C5-80-烯基。
本发明的技术适合于使用酶来催化反应的所有化学反应。它特别可用于使用酶促反应来合成有机化合物。适合于在本发明反应混合物中使用的酶包括，例如，氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶(合酶)、异构酶和连接酶(合成酶)。氧化还原酶可以催化C＝O和C＝C键的还原，C＝O基团的还原胺化，以及C-H、C＝C、C-N和C-O键的氧化。转移酶能够将官能团(如氨基、酰基、磷酰基、甲基、糖基、硝基和含硫基团)从一种化合物转移至另一种化合物。水解酶可以催化酯、酰胺、内酯、内酰胺、环氧化物、腈和其他基团的水解，以及对应的逆反应，以形成此类官能度。裂合酶(也称为合酶)可以催化小分子加成双键(如C＝C、C＝N和C＝O)。异构酶可以催化异构体的转化(异构化)，包括外消旋化、差向异构化和重排反应。连接酶(也称为合成酶)可以使用ATP作为能源形成复合化合物(类似于裂合酶)。在具体的实施例中，酶选自由以下组成的组：酮还原酶、烯还原酶、转氨酶、脱氢酶如醇脱氢酶和氨基酸脱氢酶、脂肪酶、酯酶和苯丙氨酸氨裂合酶。酶的具体实例包括酮还原酶、烯还原酶和丙氨酸转氨酶。
酶以适合于进行反应的浓度(例如以相对于底物的量为约0.01％至约100％)存在于反应混合物中。特别地，酶能以相对于底物的量为约0.1％至约75％、约0.5％至约50％、约1％至约40％、约2％至约30％、约4％至约25％、或约5％至约20％的量存在。在这方面，“量”是指化合物的重量或化合物的摩尔量。
在具体的实施例中，水性反应混合物进一步包含辅因子和/或辅酶。辅因子/辅酶的存在和类型取决于要进行的酶促反应。示例性辅因子包括烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和吡哆醛单磷酸酯。这些辅因子可用于为酶促反应提供质子、电子和/或胺基团。NAD、NADP和FAD可以作为离子(例如NAD+、NADP+)或质子化(例如NADH、NADPH)存在于水性反应混合物中。
辅因子能以化学计量的量存在于水性反应混合物中。特别地，辅因子的摩尔量可以至少与底物的摩尔量一样高。在其他实施例中，辅因子的量低于底物的量，特别是相对于底物的量在从约0.01％至约20％、约0.05％至约15％、约0.1％至约10％、约0.25％至约7.5％，或约0.5％至约5％的范围内。在这方面，“量”是指化合物的重量或化合物的摩尔量。在这些实施例中，如果需要，优选在反应期间再生辅因子。例如，反应混合物可以包含另外的酶，所述酶任选地与其对应的底物再生辅因子。例如，如果使用NAD、NADP或FAD作为辅因子，则水性反应混合物可以进一步包含脱氢酶如醇脱氢酶或葡萄糖脱氢酶，以及相应的底物如醇或葡萄糖。
在其他实施例中，辅因子可以通过酶再生，所述酶还催化感兴趣的反应。在这些实施例中，这种酶的第二底物可以存在于水性反应混合物中，特别是以比感兴趣的底物显著更高的量存在，如以相对于感兴趣的底物至少2倍，优选至少4倍、至少10倍或至少50倍摩尔过量。例如，对于转氨酶反应，水性反应混合物可以包含胺化合物(如异丙胺)，用于再生辅助因子(如吡哆醛单磷酸酯)。
在具体实施例中，酶是酮还原酶，底物是酮，并且辅因子是NADP。在另一个实施例中，酶是烯还原酶，底物是包含碳-碳双键的化合物，并且辅因子是NAD。在另一个实施例中，酶是转氨酶，底物是酮，并且辅因子是吡哆醛单磷酸酯。
水性反应混合物中的表面活性剂选自由以下组成的组：
(i)具有下式I的表面活性剂：
Figure GDA0004235641720000071
(ii)具有下式II的表面活性剂：
Figure GDA0004235641720000072
和
(iii)具有下式III的表面活性剂：
Figure GDA0004235641720000073
其中
R1包含聚(C1-4-亚烷基二醇)基团；
R2、R3、R4和R5独立地是氢或C1-4-烷基；并且
R6是C5-80-烷基或C5-80-烯基。
水性反应混合物中的表面活性剂可以是根据式(I)、式(II)或式(III)的任何表面活性剂。在某些实施例中，表面活性剂具有10,000g/mol或更低，特别是7,500g/mol或更低、5,000g/mol或更低、3,000g/mol或更低、2,500g/mol或更低或甚至2,000g/mol或更低的分子量。
特别地，表面活性剂不应干扰化学反应。在某些实施例中，表面活性剂是非离子表面活性剂。表面活性剂通常是两亲性的并且包含亲水部分和疏水部分。亲水部分主要由残基R1形成，并且疏水部分主要由残基R6形成。在具体的实施例中，表面活性剂能够在表面活性剂-水混合物中形成胶束。
表面活性剂包括残基R1中的聚(C1-4-亚烷基二醇)基团。这一聚(C1-4-亚烷基二醇)基团尤其是聚(乙二醇)基团或聚(丙二醇)基团，特别是聚(乙二醇)基团。聚(C1-4-亚烷基二醇)基团也可以由不同的聚(C1-4-亚烷基二醇)基团的混合物(如聚(乙二醇)和聚(丙二醇)的混合物)组成。R1特别包含聚(C2-3-亚烷基二醇)基团。聚(C1-4-亚烷基二醇)基团(尤其是聚(乙二醇)基团)可以具有在约100至约10,000g/mol的范围内，尤其在约200至约5,000g/mol的范围内，特别在约250至2500g/mol、约400至约2,000g/mol或约500至1500g/mol的范围内(如约550、约750或约1000g/mol)的平均分子量。
残基R1的聚(C1-4-亚烷基二醇)基团可以经由共价键或连接基团附接至核心结构的氧原子上。连接基团可以是适合于将聚(C1-4-亚烷基二醇)基团附接至氧原子上的任何化学接头。特别地，连接基团可以是二羧酸，所述二羧酸形成核心结构和聚(C1-4-亚烷基二醇)基团的酯键。示例性连接基团包括具有2至20个碳原子的二羧酸，如琥珀酸、癸二酸、丙二酸、戊二酸、己二酸、马来酸和富马酸。
在某些实施例中，R1进一步包含附接至聚(C1-4-亚烷基二醇)基团的一端上的末端基团。特别地，这一末端基团经由醚、酯或酰胺键附接至聚(C1-4-亚烷基二醇)基团上。末端基团尤其是C1-16烷基或烯基基团，特别是C1-8烷基基团，如C1-4-烷基基团。在某些实施例中，末端基团是经由醚键附接至聚(C1-4-亚烷基二醇)基团上的甲基基团。
在具体的实施例中，R1由如本文所述的聚(C1-4-亚烷基二醇)基团、连接基团和末端基团组成。
R2、R3、R4和R5独立地是氢或C1-4-烷基，特别是氢、甲基或乙基，尤其是氢或甲基。在某些实施例中，R5是甲基。在某些实施例中，R4是甲基。在某些实施例中，R4和R5是甲基。在另外的实施例中，R2和R3独立地是氢或甲基。在具体的实施例中，R4和R5是甲基，并且R2和R3独立地是氢或甲基。在其中表面活性剂具有式(I)的某些实施例中，R2、R3、R4和R5均是甲基。在其中表面活性剂具有式(II)的某些实施例中，R4和R5均是甲基。在其中表面活性剂具有式(III)的某些实施例中，R2是氢，并且R3、R4和R5是甲基。
R6是C5-80-烷基或C5-80-烯基。R6可以是直链或支链的，并且可以含有环状基团(包括芳族基团)。在某些实施例中，R6不含有环状基团或芳族基团。特别地，R6是支链的。
在其中表面活性剂具有式(I)的实施例中，R6可以是C5-30-烷基或C5-30-烯基，尤其是C8-25-烷基或C8-25-烯基，特别是C10-20-烷基或C10-20-烯基，优选C14-18-烷基或C14-18-烯基。烯基基团可以包含一个或多个碳-碳双键，特别是一个、两个、三个、四个或五个双键，如两个或三个，尤其是三个。在具体的实施例中，R6是C16-烷基或C16-烯基，特别是4,8,12-三甲基十三烷基或4,8,12-三甲基-3,7,11-十三碳三烯基。在某些实施例中，携带R5和R6的碳原子是R构象。
在其中表面活性剂具有式(II)的实施例中，R6可以是C5-20-烷基或C5-20-烯基，尤其是C6-18-烷基或C6-18-烯基，特别是C7-15-烷基或C7-15-烯基，优选C8-12-烷基或C8-12-烯基。在具体的实施例中，R6是C10-烷基，特别是5-乙基-6-甲基庚-2-基。
在其中表面活性剂具有式(III)的实施例中，R6可以是C30-80-烷基或C30-80-烯基，尤其是C35-70-烷基或C35-70-烯基，特别是C40-60-烷基或C40-60-烯基，优选C45-55-烷基或C45-55-烯基。烯基基团可以包含一个或多个碳-碳双键，特别是五个、八个或十个双键，尤其是十个。在具体的实施例中，R6是C50-烯基，特别是3,7,11,15,19,23,27,31,35,39-十甲基四十碳-2,6,10,14,18,22,26,30,34,38-十烯基。
在其中表面活性剂具有式(I)的实施例中，所述表面活性剂尤其衍生自维生素E，特别衍生自生育酚(尤其衍生自α-生育酚)。表面活性剂的某些实例包括生育酚聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)，特别是DL-α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯，如TPGS-750-M、TPGS-1000、TPGS-1500、TPGS-400、TPGS-1100-M、TPGS-2000、TPGS-860-油酸酯、TPGS-PEG-PPG-PEG-1100和TPGS-PPG-PEG-70-丁基、和DL-α-生育酚聚丙二醇琥珀酸酯，如TPPG-1000和TPPG-1000-丁基；和癸二酸的聚乙二醇α-生育酚二酯(PTS)，如PTS-600。在具体的实施例中，表面活性剂选自由以下组成的组：TPGS-750-M、TPGS-1000和PTS，特别是TPGS-750-M。
在其中表面活性剂具有式(II)的实施例中，所述表面活性剂尤其衍生自泛醇。表面活性剂的某些实例包括聚乙二醇泛醇琥珀酸酯(PQS)，特别是包含mPEG(如mPEG2000)的PQS。
在其中表面活性剂具有式(III)的实施例中，所述表面活性剂尤其衍生自谷甾醇，特别是β-谷甾醇。表面活性剂的某些实例包括β-谷甾醇甲氧基乙二醇琥珀酸酯(Nok)，特别是包含mPEG(如mPEG550)的Nok。
水性反应混合物中表面活性剂的浓度特别是至少0.01％(w/w)、特别是至少0.02％(w/w)、尤其是至少0.5％(w/w)或至少1％(w/w)。在具体的实施例中，水性反应混合物中表面活性剂的浓度在0.01％至20％(w/w)的范围内，特别是在0.02％至15％(w/w)的范围内，在0.1％至10％(w/w)、0.2％至7.5％(w/w)或0.5％至5％(w/w)的范围内，尤其是在0.75％至3％(w/w)的范围内(如约1％(w/w)、约1.5％(w/w)或约2％(w/w))。在具体的实施例中，表面活性剂-水混合物中表面活性剂的浓度高于其临界胶束浓度。
在某些实施例中，水性反应混合物进一步包含缓冲液。特别地，缓冲液应该适合于将反应混合物的pH保持在中性pH处或其附近。特别地，缓冲液选自由以下组成的组：TRIS、磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐和氨。水性反应混合物优选具有其中酶有活性且是稳定的pH和/或适合酶促反应的pH。在某些实施例中，pH值在从4.0至10.0、特别是从6.0至8.0、尤其是从6.5至7.5的范围内，如约7.0。
反应混合物中的底物可以是适合于进行酶促反应的任何底物。底物特别取决于在反应混合物中进行的酶促反应的类型。反应混合物还可以包含一种以上的底物，如两种底物或三种底物。在具体的实施例中，酶促反应的底物和/或产物不与水混溶或仅部分与水混溶。特别地，仅部分可与水混溶的化合物在室温仅以20g/l或更低，尤其是10g/l或更低或5g/l或更低的浓度与水混溶。能以任何可用于进行化学反应的浓度使用底物。特别是，以高浓度使用底物。例如，反应混合物中底物的浓度为至少0.1M，特别是至少0.5M，至少1.0M，至少1.1M，至少1.2M，至少1.3M，至少1.5M，至少1.7M或至少2.0M。本领域的技术人员能够选择适合的底物及其浓度。
在某些实施例中，水性反应混合物可另外包含共溶剂。共溶剂可以特别是有机溶剂或另外的表面活性剂或这些的混合物。
有机溶剂可以是任何有机溶剂。优选地，它不应干扰或抑制酶促反应。在某些实施例中，有机溶剂可与水混溶或部分可与水混溶。有机溶剂尤其是非质子有机溶剂。适合的有机溶剂的实例包括丙酮、四氢呋喃(THF)及其衍生物，如甲基四氢呋喃，吡啶，聚乙二醇(PEG)，聚丙二醇(PPG)，特别是具有约100g/mol至约2000g/mol的平均分子量的PEG(如PEG200、PEG600、PEG1000和PEG2000)，其衍生物(如单烷基-或二烷基PEG，特别是单甲基或二甲基PEG、单乙基或二乙基PEG和单丙基或二丙基PEG)。另外的实例包括乙腈、二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)、甲苯和醇，如C1-10脂族醇，特别是2-丁醇。在某些实施例中，反应混合物中有机溶剂的量在从0.1％至50％(v/v)，特别是从1％至40％(v/v)、从2％至30％(v/v)、从4％至25％(v/v)或从5％至20％(v/v)的范围内。
另外的表面活性剂可以是任何表面活性剂。优选地，它不应干扰或抑制酶促反应。在某些实施例中，表面活性剂的亲水部分包含聚亚烷基二醇部分，尤其是聚乙二醇部分或聚丙二醇部分。聚亚烷基部分(尤其是聚乙二醇部分)可以具有在约100至约10,000g/mol的范围内、尤其是在约300至约3,000g/mol的范围内、特别是在约400至约2,000g/mol的范围内的平均分子量。包含聚亚烷基二醇部分的另外的表面活性剂的某些实例包括Triton X-100；聚乙二醇烷基醚如Brij类表面活性剂，特别是Brij 30、Brij 35、Brij 52、Brij 56、Brij 58、Brij 72、Brij 76、Brij 78、Brij 92、Brij 96、Brij 98、克列莫佛(Cremophor)A6、克列莫佛A25和Thesit；聚乙二醇酯，如聚乙二醇(15)-羟基硬脂酸酯(Solutol HS 15)；聚乙二醇脱水山梨糖醇脂肪酸酯(也称为聚山梨醇酯或吐温)，如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯21、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯61、聚山梨醇酯65、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯81、聚山梨醇酯85和聚山梨醇酯120；胆固醇基PEG琥珀酸酯，如胆固醇基PEG1000琥珀酸酯；(脱氧)胆酸PEG，如胆酸PEG1000和脱氧-胆酸PEG1000；色原醇乙二醇琥珀酸酯，如Chrom-400和Chrom-1000；和其他PEG衍生物，如C4-偶氮-PEG；十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)；相转移表面活性剂，如脱氧胆酸钠；和辛酸和其他长链烷基酸，特别是C6-20烷基链酸。特别地，水性反应混合物中的另外的表面活性剂的浓度可以在0.1％至10％(w/w)的范围内。在某些实施例中，另外的表面活性剂的浓度在0.5％至5％(w/w)的范围内，尤其是在0.8％至4％(w/w)、1％至3％(w/w)或1.5％至2.5％(w/w)的范围内，如约2％(w/w)。
本技术尤其适用于其中需要反应混合物中高底物浓度的应用，如非常大的规模或非常小的规模。在一个实施例中，反应混合物是工业规模的。它可以例如具有至少1l、特别是至少10l、至少100l或至少1000l的体积。在另一个实施例中，反应混合物是微尺度的。它可以例如具有10ml或更少，特别是1ml或更少，100μl或更少，10μl或更少，或1μl或更少的体积。
反应混合物是用于进行化学反应的进料混合物或批料混合物。在某些实施例中，反应混合物不包含酶促反应的任何产物或仅包含残留量的任何酶促反应产物。在其他实施例中，它还可以含有显著量的酶促反应的产物。
在第二方面，本发明提供了进行酶促反应的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供如本文所述的水性反应混合物，和
(b)允许所述酶促反应继续进行。
反应混合物尤其包含酶、所述酶的底物和表面活性剂，其中所述表面活性剂选自由以下组成的组：
(i)具有下式I的表面活性剂：
Figure GDA0004235641720000131
(ii)具有下式II的表面活性剂：
Figure GDA0004235641720000132
和
(iii)具有下式III的表面活性剂：
Figure GDA0004235641720000133
其中
R1包含聚(C1-4-亚烷基二醇)基团；
R2、R3、R4和R5独立地是氢或C1-4-烷基；并且
R6是C5-80-烷基或C5-80-烯基。
特别地，水性反应混合物可以表现出本文所述的任何特征、实施例和实例，包括其组合。
酶促反应可以是可以使用酶进行催化反应的任何化学反应。特别地，可以进行有机化学合成反应，例如用至少部分疏水的化合物。示例性化学反应包括还原反应、氧化反应、胺化反应、腈化反应、水解反应、酯化反应和酰胺化反应(如酰化)。水性反应混合物中的酶和底物适合于特定的化学反应。特别地，特别选择酶和底物，以便按需继续进行酶促反应。本文描述了适合的酶和底物。
在某些实施例中，允许酶促反应在步骤(b)中在适合于进行酶促反应的反应条件下继续进行。特别地，反应条件包括80℃或更低，尤其是60℃或更低，45℃或更低，或40℃或更低的温度。特别地，酶促反应在10℃至50℃，特别是20℃至45℃或25℃至40℃的范围内的温度进行。例如，可以允许酶促反应在约37℃、约30℃或约室温继续进行。在具体的实施例中，在酶促反应的过程期间搅动(特别是搅拌)反应混合物。
此外，反应条件特别包括在4.0至10.0，特别是在5.0至9.5、5.5至9.0、6.0至8.5或6.5至8.0的范围内的pH值。在某些实施例中，pH在酶促反应期间保持恒定，特别是在+/-1.0pH单位的范围内，尤其是在pH期望值附近的+/-0.5pH单位内。然而，在其他实施例中，允许pH值变化超过1.0个pH单位，特别是超过1.5个pH单位或甚至超过2.0个pH单位。如本文所述的水性反应混合物能够稳定酶，使得pH的变化不会显著影响酶促反应。
进行酶促反应的方法可以包括分离酶促反应的产物的另外的步骤。特别地，这一步骤在酶促反应完成后进行。特别地，将产物从一种或多种(特别是基本上所有)水性反应混合物的其他组分分离。例如，将产物从剩余的底物、副产物、酶、表面活性剂、辅酶、辅因子和/或有机溶剂分离。产物的分离可以通过本领域已知的方式和技术实现，包括例如溶剂的蒸发、聚集或结晶和过滤、相分离、色谱分离等。
本发明改善了底物和产物在水性反应混合物中的溶解度并增强了酶的稳定性。因此，酶促反应的产率增加，并且通过酶促反应获得的不需要的副产物的量减少。鉴于此，在另外的方面，本发明提供了表面活性剂用于提高酶促反应的产率的用途，所述用途包括将所述表面活性剂添加到包含酶和所述酶的底物的水性混合物中，其中所述表面活性剂选自由以下组成的组：
(i)具有下式I的表面活性剂：
Figure GDA0004235641720000151
(ii)具有下式II的表面活性剂：
Figure GDA0004235641720000152
和
(iii)具有下式III的表面活性剂：
Figure GDA0004235641720000153
其中
R1包含聚(C1-4-亚烷基二醇)基团；
R2、R3、R4和R5独立地是氢或C1-4-烷基；并且
R6是C5-80-烷基或C5-80-烯基。
在另外的方面，本发明提供了表面活性剂用于提高酶促反应的稳定性的用途，所述用途包括将所述表面活性剂添加到包含酶和所述酶的底物的水性混合物中，其中所述表面活性剂选自由以下组成的组：
(i)具有下式I的表面活性剂：
Figure GDA0004235641720000161
(ii)具有下式II的表面活性剂：
Figure GDA0004235641720000162
和
(iii)具有下式III的表面活性剂：
Figure GDA0004235641720000163
其中
R1包含聚(C1-4-亚烷基二醇)基团；
R2、R3、R4和R5独立地是氢或C1-4-烷基；并且
R6是C5-80-烷基或C5-80-烯基。
特别地，酶促反应的稳定性增加包括酶在反应混合物中的稳定性增加。
本文所述的关于进行酶促反应的方法和水性反应混合物的实施例、特征和实例(包括其组合)同样适用于表面活性剂用于提高酶促反应的产率和/或稳定性的用途。
除了其字面含义之外，如本文所用的表述“包含(comprise)”还包括并且具体是指表述“基本上由……组成”和“由……组成”。因此，表述“包含”是指其中“包含”具体列出的元素的主题可能和/或确实涵盖另外元素的实施例，以及其中“包含”具体列出的元素的主题不包含另外元素的实施例。同样，表述“具有”应理解为表述“包含”，还包括并且具体是指表述“基本上由……组成”和“由……组成”。
本文所述的数字范围包括定义所述范围的数字。本文提供的标题不是对本发明的各个方面或实施例的限制，这些方面或实施例可以通过参考整个说明书来阅读。根据一个实施例，本文在方法的情况下描述为包括某些步骤的主题或在组合物的情况下描述为包含某些成分的主题是指由相应步骤或成分组成的主题。优选选择并组合本文所述的具体方面和实施例，并且由具体实施例的相应组合产生的具体主题也属于本披露内容。
实例
实例1：使用酮还原酶合成苄基(R)-4-羟基-2-(4-(甲氧基羰基)苯基)哌啶-1-甲酸酯
表面活性剂已经在生物催化中应用于调节酶活性，具有有益作用，如增加反应物的溶解度和提高反应选择性。尽管许多表面活性剂(包括离子液体、SDS和Triton X)已被广泛用于生物转化，但作为利普舒茨实验室(Lipshutz lab)开发的替代性表面活性剂的TPGS-750-M尚未在生物催化中进行研究。在如方案1中所示的酮还原酶(KRED)介导的反应的研究期间，起始酮1和产物醇2两者的低溶解度需要大量努力来寻找用于这种非均相反应的适合的反应介质。
Figure GDA0004235641720000171
首先，在用于上述反应的平行筛选条件下，在水溶液中使用许多共溶剂系统，包括TPGS、PEG400和DMSO。进行了不同反应介质中反应动力学的比较。反应条件：在每个小瓶中，在共溶剂系统中，添加20mg的酮1、5mg的KRED-EW124、5mg的GDH、2mg的NADP、25mg的葡萄糖、2mM的MgCl2。pH＝7，温度＝30℃。在指定时间进行反应混合物的HPLC分析。结果显示，在2.5h内的反应的第一阶段，TPGS的表现优于PEG400和DMSO，其中转化差异为10％。随着反应进一步进行，TPGS中的反应明显更快，并且与PEG400和DMSO在6h内的反应相比，观察到约40％的转化差异。22h后，在TPGS中的反应基本完全转化(100％)，而PEG400和DMSO中的反应分别在82％和86％转化时停止。这一现象反映了PEG400和DMSO系统两者的有机溶剂添加剂中酮还原酶的稳定性更低。
通过筛选结果，我们进一步优化了克规模的反应。我们尤其比较了TPGS和DMSO系统的性能。因此，反应分别在2％ TPGS和15％ DMSO水溶液中，在40℃使用5w％酶加载进行。在TPGS系统中18h后反应达到93％转化，而在DMSO系统中20h后达到80％的较低转化。更重要的是，反应继续并在另外25h后在TPGS中达到98.8％的转化。但是必须添加另外的2wt％酶以将反应推至DMSO中98.6％转化(表1，条目1)。这一观察结果清楚地证明了与DMSO相比，TPGS中酶的活性和稳定性更强。另一个有趣的观察结果是，在TPGS的反应系统中，将酶在pH4.7下意外暴露24h并将pH重新调节至7后，所述酶仍具有足够的活性来进一步以相同的活性催化反应(表1，条目2)。TPGS和蛋白质之间的分子相互作用可以提供优异的稳定性，并且保护酶的催化活性位点免受水性反应介质的影响。
表1：TPGS和DMSO中酮还原酶的比较
Figure GDA0004235641720000181
Figure GDA0004235641720000191
最后，TPGS中的反应更易于按比例放大，并且化合物1能以固体形式添加而无需预先形成溶液或研磨以减小粒度。典型的实验程序如下：在室温下，在配备有pH/ORP控制器的机械搅拌反应器中，向缓冲水中的经脱气的2％重量的TPGS-750-M溶液(34mL，10v；从74mL的2wt％TPGS-750-M水溶液、1.6g的Na2HPO4.12H2O和0.5g的NaH2PO4.2H2O制备的储备溶液)中添加葡萄糖(3.2g，18mmol，2.0当量)。将悬浮液在室温搅拌20分钟，并向所得混合物中依次添加NADP(59mg，68％纯度)、GDH(33mg)和酮还原酶(0.16g，5wt％的底物1)。然后在室温下，添加底物1(3.3g，9mmol，1.0当量)并通过添加1M NaOH水溶液将反应混合物的pH调节至6.8-7.2。将所得反应混合物加热至40℃，并在40℃搅拌43hr，直至如通过HPLC确定反应完成。随着反应进行，产物2从反应混合物中沉淀出来并形成悬浮液。将所得悬浮液在40℃过滤，并将所得湿滤饼用水洗涤并干燥，以得到呈灰白色固体的产物2(2.8g，纯度97％，产率85％)。
Figure GDA0004235641720000192
方案2
总之，显示了TPGS作为酮还原酶介导的生物转化中的添加剂的有益作用，包括优异的反应动力学和过程稳健性。当应用于广泛的生物催化转化时，TPGS中潜在的酶稳定性将发现类似的益处。
实例2：使用酮还原酶合成(R)-5-氟-3-(3-氟苯基)-2-(1-羟乙基)-4H-色原烯-4-酮
Figure GDA0004235641720000201
方案3
反应混合物：
20mg底物3
酶酮还原酶KRED-EW-109(量：见表2)
20mg D-葡萄糖
0.4mg(2％(m/m))葡萄糖脱氢酶(GDH)
0.2mg(1％(m/m))NADP
0.1M PBS(量：见表2)
在0.1M PBS中2％TPGS-750-M(m/m)(量：见表2)
DMSO(量：见表2)
反应条件：pH 7.0，30℃
表2
Figure GDA0004235641720000202
Figure GDA0004235641720000211
实例3：使用酮还原酶合成1-苯基乙醇
Figure GDA0004235641720000212
方案4
反应混合物：
20μl苯乙酮
酶酮还原酶KRED-EW-124(量：见表3)
20mg D-葡萄糖
0.4mg(2％(m/m))葡萄糖脱氢酶(GDH)
0.2mg(1％(m/m))NADP
0.1M PBS(量：见表3)
在0.1M PBS中2％ TPGS-750-M(m/m)(量：见表3)
DMSO(量：见表3)
反应条件：pH 7.0，30℃
表3
Figure GDA0004235641720000221
实例4：使用烯还原酶合成(S)-3-(3-溴吡啶-4-基)-5-甲基环己-1-酮
Figure GDA0004235641720000222
方案5
反应混合物：
20μl底物5
烯还原酶ENE012(量：见表4)
20mg D-葡萄糖
0.4mg(2％(m/m))葡萄糖脱氢酶(GDH)
0.2mg(1％(m/m))NAD
0.1M PBS(量：见表4)
在0.1M PBS中2％ TPGS-750-M(m/m)(量：见表4)甲苯(量：见表4)
反应条件：pH 7.0，30℃
表4
Figure GDA0004235641720000231
/>

Claims (63)

1.一种水性反应混合物，所述水性反应混合物包含酶、所述酶的底物和表面活性剂，其中所述表面活性剂具有下式I：
Figure QLYQS_1
其中
R1包含聚(C1-4-亚烷基二醇)基团；
R2、R3、R4和R5独立地是氢或C1-4-烷基；并且
R6是C5-80-烷基或C5-80-烯基；且
其中所述酶反应的底物不与水混溶或在室温仅以20g/l或更低的浓度与水混溶。
2.根据权利要求1所述的反应混合物，其中R1是聚(C1-4-亚烷基二醇)基团，所述基团经由共价键或连接基团附接至核心结构的氧原子上，并且任选地包含末端C1-4-烷基基团。
3.根据权利要求2所述的反应混合物，其中所述连接基团是二羧酸，所述二羧酸形成核心结构和聚(C1-4-亚烷基二醇)基团的酯键。
4.根据权利要求3所述的反应混合物，其中所述连接基团是具有2至20个碳原子的二羧酸。
5.根据权利要求4所述的反应混合物，其中所述连接基团是琥珀酸或癸二酸。
6.根据权利要求2至5中任一项所述的反应混合物，其中所述末端C1-4-烷基基团是甲基。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的反应混合物，其中所述聚(C1-4-亚烷基二醇)基团是聚(乙二醇)基团。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的反应混合物，其中所述聚(C1-4-亚烷基二醇)基团具有250至2500g/mol的平均分子量。
9.根据权利要求8所述的反应混合物，其中所述聚(C1-4-亚烷基二醇)基团具有500至1500g/mol的平均分子量。
10.根据权利要求8所述的反应混合物，其中所述聚(C1-4-亚烷基二醇)基团具有550、750或1000g/mol的平均分子量。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的反应混合物，其中R5是甲基。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的反应混合物，其中R4是甲基。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的反应混合物，其中R2和R3独立地是氢或甲基。
14.根据权利要求1至12中任一项所述的反应混合物，其中
R2、R3、R4和R5均是甲基。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的反应混合物，其中R6是支链或直链的。
16.根据权利要求15所述的反应混合物，其中R6是支链的。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的反应混合物，其中
R6是C8-25-烷基或C8-25-烯基。
18.根据权利要求17所述的反应混合物，其中
R6是C14-18-烷基或C14-18-烯基。
19.根据权利要求17所述的反应混合物，其中
R6是C16-烷基或C16-烯基。
20.根据权利要求17所述的反应混合物，其中
R6是4,8,12-三甲基十三烷基或4,8,12-三甲基-3,7,11-十三碳三烯基。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的反应混合物，其中所述表面活性剂具有式(I)，并且是维生素E衍生的化合物。
22.根据权利要求21所述的反应混合物，其中所述表面活性剂是D-α-生育酚聚(乙二醇)琥珀酸酯。
23.根据权利要求22所述的反应混合物，其中所述表面活性剂是TPGS-750-M、TPGS-1000、癸二酸的聚乙二醇α-生育酚二酯。
24.根据权利要求22所述的反应混合物，其中所述表面活性剂是基于PEG-600/α-生育酚的癸二酸二酯。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的反应混合物，其中所述酶选自由以下组成的组：还原酶、转移酶、脱氢酶、脂肪酶和酯酶。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的反应混合物，其中所述酶选自由以下组成的组：酮还原酶、烯还原酶、转氨酶、醇脱氢酶、氨基酸脱氢酶和苯丙氨酸氨裂合酶。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的反应混合物，所述反应混合物进一步包含进行酶促反应所必需的辅酶或辅因子。
28.根据权利要求27所述的反应混合物，其中所述辅酶或辅因子选自由以下组成的组：醇脱氢酶、NAD、NADP、FAD和吡哆醛单磷酸酯。
29.根据权利要求27所述的反应混合物，其中所述酶是酮还原酶，所述底物是酮，并且所述辅因子是NADP。
30.根据权利要求27所述的反应混合物，其中所述酶是烯还原酶，所述底物是包含碳-碳双键的化合物，并且所述辅因子是NAD。
31.根据权利要求27所述的反应混合物，其中所述酶是转氨酶，所述底物是酮，并且所述辅因子是吡哆醛单磷酸酯。
32.根据权利要求1至31中任一项所述的反应混合物，其中所述反应混合物中所述表面活性剂的浓度高于其临界胶束浓度。
33.根据权利要求1至32中任一项所述的反应混合物，其中所述反应混合物中所述表面活性剂的浓度是至少0.01％(w/w)。
34.根据权利要求33所述的反应混合物，其中所述反应混合物中所述表面活性剂的浓度是至少0.02％(w/w)。
35.根据权利要求33所述的反应混合物，其中所述反应混合物中所述表面活性剂的浓度是至少0.5％(w/w)。
36.根据权利要求33所述的反应混合物，其中所述反应混合物中所述表面活性剂的浓度是至少1％(w/w)。
37.根据权利要求1至36中任一项所述的反应混合物，其中所述反应混合物中所述表面活性剂的浓度在0.1％至10％(w/w)的范围内。
38.根据权利要求37所述的反应混合物，其中所述反应混合物中所述表面活性剂的浓度在0.5％至5％(w/w)的范围内。
39.根据权利要求37所述的反应混合物，其中所述反应混合物中所述表面活性剂的浓度在0.75％至3％(w/w)的范围内。
40.根据权利要求37所述的反应混合物，其中所述反应混合物中所述表面活性剂的浓度是2％(w/w)。
41.根据权利要求1至40中任一项所述的反应混合物，其中所述酶以在底物量的0.1％至50％的范围内的量存在。
42.根据权利要求41所述的反应混合物，其中所述酶以在底物量的0.5％至35％的范围内的量存在。
43.根据权利要求41所述的反应混合物，其中所述酶以在底物量的1％至20％的范围内的量存在。
44.根据权利要求1至43中任一项所述的反应混合物，所述反应混合物进一步包含缓冲液。
45.根据权利要求44所述的反应混合物，其中所述缓冲液选自由以下组成的组：TRIS、磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐和氨。
46.根据权利要求1至45中任一项所述的反应混合物，其中所述反应混合物具有适合酶促反应的pH值。
47.根据权利要求46所述的反应混合物，其中所述pH值在从4.0至10.0的范围内。
48.根据权利要求47所述的反应混合物，其中所述pH值在从6.0至8.0的范围内。
49.根据权利要求47所述的反应混合物，其中所述pH值在从6.5至7.5的范围内。
50.根据权利要求47所述的反应混合物，其中所述pH值是7.0。
51.根据权利要求1至50中任一项所述的反应混合物，其中所述反应混合物是工业规模的。
52.根据权利要求51所述的反应混合物，其中所述反应混合物的体积为至少10l。
53.根据权利要求52所述的反应混合物，其中所述反应混合物的体积为至少100l。
54.根据权利要求52所述的反应混合物，其中所述反应混合物的体积为至少1000l。
55.一种进行酶促反应的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供根据权利要求1至54中任一项所述的反应混合物，和
(b)允许所述酶促反应继续进行。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述反应在80℃或更低的温度进行。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述反应在10℃至50℃的范围内的温度进行。
58.根据权利要求56所述的方法，其中所述反应在20℃至45℃的范围内的温度进行。
59.根据权利要求55至58中任一项所述的方法，其中，在所述反应期间，所述反应混合物的pH变化至少1.0。
60.根据权利要求59所述的方法，其中，在所述反应期间，所述反应混合物的pH变化是至少2.0。
61.表面活性剂用于提高酶促反应的产率的用途，所述用途包括将所述表面活性剂添加到包含酶和所述酶的底物的水性混合物中，其中所述表面活性剂具有下式I：
Figure QLYQS_2
其中
R1包含聚(C1-4-亚烷基二醇)基团；
R2、R3、R4和R5独立地是氢或C1-4-烷基；并且
R6是C5-80-烷基或C5-80-烯基，且
其中所述酶反应的底物不与水混溶或在室温仅以20g/l或更低的浓度与水混溶。
62.表面活性剂用于提高酶促反应的稳定性的用途，所述用途包括将所述表面活性剂添加到包含酶和所述酶的底物的水性混合物中，其中所述表面活性剂具有下式I：
Figure QLYQS_3
其中
R1包含聚(C1-4-亚烷基二醇)基团；
R2、R3、R4和R5独立地是氢或C1-4-烷基；并且
R6是C5-80-烷基或C5-80-烯基；且
其中所述酶反应的底物不与水混溶或在室温仅以20g/l或更低的浓度与水混溶。
63.根据权利要求61或62所述的用途，其中所述反应混合物是根据权利要求1至54中任一项所定义的反应混合物。
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