KR102470125B1 - 계면활성제를 함유하는 효소 반응 매질 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 계면활성제를 포함하는, 효소적 합성 반응을 위한 수성 반응 혼합물에 관한 것이다. 반응 혼합물 중 계면활성제는 효소 반응의 안정성 및 수율을 증가시킨다. 더욱이, 상기 수성 반응 혼합물을 사용하여 효소 반응을 수행하는 방법이 제공된다.

Description

계면활성제를 함유하는 효소 반응 매질
본 발명은 효소적 합성 반응을 위한 개선된 반응 매질에 관한 것이다. 반응 매질은 종래의 계면활성제와 비교하여 화학 반응의 반응물 및 생성물의 용매화를 향상시키고 효소의 활성을 증가시키는 특정 계면활성제를 포함한다. 이 특정 계면활성제의 사용은 향상된 수율 및 더 강력한 효소 반응을 초래한다. 따라서 본 발명은 효소 및 계면활성제를 포함하는 반응 혼합물 및 상기 반응 혼합물을 사용한 효소 반응의 수행 방법을 제공한다.
점점 더 엄격해지고 있는 환경 제약을 충족시키는 유기 화학에서의 새로운 촉매적 합성법은 제약 산업 및 화학 산업에 의한 수요가 많아지고 있다. 게다가, 신규한 촉매적 절차가 의생명 분자 연구의 표적이 되고 있는 신흥 유기 화합물류의 제조에 필요하다. 지금에 와서야, 효소-촉매된 화학적 변환이 전통적(비-생물학적) 유기 합성법에 대한 실용적인 대안으로, 그리고 다루기 힘든 특정 합성 문제에 대한 편리한 해결책으로 널리 인식되고 있다.
일반적으로 효소 반응은 수성 매질에서 수행된다. 그러나, 합성 화학 산업에서 대상으로 하는 많은 기질 및 생성물은 소수성이며 단지 부분적으로 수용성이다. 용해도를 향상시키기 위하여, 종종 유기 용매가 반응 혼합물에 첨가된다. 다른 한편으로는, 이러한 유기 용매는 많은 효소의 안정성 및 성능에 유해하다. 더욱이, 몇몇 유기 용매는 환경에 해롭다.
따라서, 본 기술 분야에서 소수성 기질 및 생성물의 용매화를 가능하게 하지만 효소 반응의 안정성 및 수율은 방해하지 않는 효소적 합성 반응용 반응 매질을 제공할 필요성이 있다.
본 발명은 촉매로서 효소를 사용한 화학적 합성 반응의 성능이 반응 혼합물에의 특정 계면활성제의 첨가에 의해 증가될 수 있다는 발견을 기반으로 한다. 계면활성제가 반응의 생성물 및 반응물의 용매화를 증가시키기 위하여 효소적 합성 반응에 사용될 수 있다. 그러나, 이러한 계면활성제는 효소의 활성 및 안정성에 부정적인 영향을 준다. 본 발명자는 지금에 와서야, TPGS-750-M과 같은 비타민 E 유도된 계면활성제의 사용이 종래의 계면활성제 또는 공용매와 비교하여 효소 반응의 성능을 크게 향상시킴을 알아냈다. 반응 수율은 더 낮은 온도에서도 증가되며, 반응은 심지어 불리한 조건, 예컨대 낮은 pH 값에서도 여전히 일어난다.
제1 양태에서, 본 발명은 효소, 효소 기질 및 계면활성제를 포함하는 수성 반응 혼합물을 제공하며, 여기서 계면활성제는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다:
(i) 하기 화학식 I을 갖는 계면활성제:
[화학식 I]
Figure 112019071434070-pct00001
(ii) 하기 화학식 II를 갖는 계면활성제:
[화학식 II]
Figure 112019071434070-pct00002
및
(iii) 하기 화학식 III을 갖는 계면활성제:
[화학식 III]
Figure 112019071434070-pct00003
여기서,
R1은 폴리(C1-4-알킬렌 글리콜) 기를 포함하며;
R2, R3, R4 및 R5는 독립적으로 수소 또는 C1-4-알킬이며;
R6은 C5-80-알킬 또는 C5-80-알케닐이다.
제2 양태에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는, 효소 반응을 수행하는 방법을 제공한다:
(a) 본 발명의 제1 양태에 따른 반응 혼합물을 제공하는 단계, 및
(b) 효소 반응이 진행되게 하는 단계.
제3 양태에서, 본 발명은 효소 및 효소 기질을 포함하는 수성 혼합물에 계면활성제를 첨가하는 것을 포함하는, 효소 반응의 수율 및/또는 안정성을 증가시키는 데 있어서의 계면활성제의 용도를 제공하며, 여기서 계면활성제는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다:
(i) 하기 화학식 I을 갖는 계면활성제:
[화학식 I]
Figure 112019071434070-pct00004
(ii) 하기 화학식 II를 갖는 계면활성제:
[화학식 II]
Figure 112019071434070-pct00005
및
(iii) 하기 화학식 III을 갖는 계면활성제:
[화학식 III]
Figure 112019071434070-pct00006
여기서,
R1은 폴리(C1-4-알킬렌 글리콜) 기를 포함하며;
R2, R3, R4 및 R5는 독립적으로 수소 또는 C1-4-알킬이며;
R6은 C5-80-알킬 또는 C5-80-알케닐이다.
상기 양태들은 조합될 수 있다. 본 발명의 다른 목적, 특징, 장점 및 양태가 하기 [발명을 실시하기 위한 구체적인 내용] 및 첨부된 청구범위로부터 당업자에게 자명해질 것이다. 그러나, 하기 [발명을 실시하기 위한 구체적인 내용], 첨부된 청구범위, 및 특정 실시예(이는 본 발명의 바람직한 실시 형태를 나타냄)는 단지 예시로 주어지는 것임이 이해되어야 한다. 개시된 본 발명의 사상 및 범주 내에서의 다양한 변화 및 변경은 다음을 읽음으로써 당업자에게 쉽게 자명해질 것이다.
제1 양태에서, 본 발명은 효소, 효소 기질 및 계면활성제를 포함하는 반응 혼합물을 제공하며, 여기서 계면활성제는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다:
(i) 하기 화학식 I을 갖는 계면활성제:
[화학식 I]
Figure 112019071434070-pct00007
(ii) 하기 화학식 II를 갖는 계면활성제:
[화학식 II]
Figure 112019071434070-pct00008
및
(iii) 하기 화학식 III을 갖는 계면활성제:
[화학식 III]
Figure 112019071434070-pct00009
여기서,
R1은 폴리(C1-4-알킬렌 글리콜) 기를 포함하며;
R2, R3, R4 및 R5는 독립적으로 수소 또는 C1-4-알킬이며;
R6은 C5-80-알킬 또는 C5-80-알케닐이다.
본 발명의 기술은 반응을 촉매하기 위해 효소를 사용하는 모든 화학 반응에 적합하다. 이것은 구체적으로, 효소 반응을 이용하여 유기 화합물을 합성하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 반응 혼합물에 사용하기에 적합한 효소는 예를 들어 옥시도리덕타아제, 트랜스퍼라아제, 하이드롤라아제, 라이아제(신타아제), 아이소머라아제 및 라이가아제(신테타아제)를 포함한다. 옥시도리덕타아제는 C=O 및 C=C 결합의 환원, C=O 기의 환원적 아미노화, 및 C-H, C=C, C-N, 및 C-O 결합의 산화를 촉매할 수 있다. 트랜스퍼라아제는 작용기, 예컨대 아미노, 아실, 포스포릴, 메틸, 글리코실, 니트로, 및 황-함유 기를 하나의 화합물로부터 또 다른 것으로 이전시킬 수 있다. 하이드롤라아제는 에스테르, 아미드, 락톤, 락탐, 에폭시드, 니트릴, 및 기타 기의 가수분해와, 이러한 작용체를 형성하기 위한 각각의 역반응을 촉매할 수 있다. 신타아제로도 칭해지는 라이아제는 이중 결합, 예컨대 C=C, C=N, 및 C=O에의 소분자의 부가를 촉매할 수 있다. 아이소머라아제는 라세미화, 에피머화, 및 재배열 반응을 비롯하여 이성질체의 변환(이성질체화)을 촉매할 수 있다. 신테타아제로도 칭해지는 라이가아제는 에너지원으로서 ATP를 사용하여 (라이아제와 유사하게) 복합 화합물을 형성할 수 있다. 특정한 실시 형태에서, 상기 효소는 케토리덕타아제, 엔 리덕타아제, 트랜스아미나아제, 데하이드로게나아제, 예컨대 알코올 데하이드로게나아제 및 아미노산 데하이드로게나아제, 리파아제, 에스테라아제 및 페닐알라닌 암모니아 라이아제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 상기 효소의 구체적인 예는 케토리덕타아제, 엔 리덕타아제 및 알라닌 트랜스아미나아제를 포함한다.
상기 효소는 반응 혼합물 내에 반응 수행에 적합한 농도로, 예를 들어 기질의 양에 대하여 약 0.01% 내지 약 100%의 양으로 존재한다. 구체적으로, 상기 효소는 기질의 양에 대하여 약 0.1% 내지 약 75%, 약 0.5% 내지 약 50%, 약 1% 내지 약 40%, 약 2% 내지 약 30%, 약 4% 내지 약 25% 또는 약 5% 내지 약 20%의 양으로 존재할 수 있다. 이와 관련하여 "양"은 화합물의 중량 또는 화합물의 몰량 중 어느 하나를 지칭한다.
특정한 실시 형태에서, 수성 반응 혼합물은 보조 인자 및/또는 조효소를 추가로 포함한다. 보조 인자/조효소의 존재 및 유형은 수행될 효소 반응에 따라 달라진다. 예시적인 보조 인자는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD), 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트(NADP), 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드(FAD), 및 피리독살 모노포스페이트를 포함한다. 이러한 보조 인자는 양성자, 전자 및/또는 아민 기를 효소 반응에 제공하는 데 사용될 수 있다. NAD, NADP 및 FAD은 이온(예를 들어 NAD+, NADP+) 또는 양성자화된 것(예를 들어 NADH, NADPH)으로서 수성 반응 혼합물에 존재할 수 있다.
보조 인자는 화학량론적 양으로 수성 반응 혼합물에 존재할 수 있다. 구체적으로, 보조 인자의 몰량은 적어도 기질의 몰량만큼 많을 수 있다. 다른 실시 형태에서, 보조 인자의 양은 기질의 양보다 더 적으며, 구체적으로, 기질의 양에 대하여 약 0.01% 내지 약 20%, 약 0.05% 내지 약 15%, 약 0.1% 내지 약 10%, 약 0.25% 내지 약 7.5%, 또는 약 0.5% 내지 약 5%의 범위이다. 이와 관련하여 "양"은 화합물의 중량 또는 화합물의 몰량 중 어느 하나를 지칭한다. 이러한 실시 형태에서, 바람직하게는 보조 인자는 필요할 경우 반응 중에 재생된다. 예를 들어, 반응 혼합물은 추가 효소를, 선택적으로 이의 각각의 기질과 함께 포함할 수 있는데, 상기 기질은 보조 인자를 재생시킨다. 예를 들어, NAD, NADP 또는 FAD가 보조 인자로서 사용되는 경우, 수성 반응 혼합물은 데하이드로게나아제, 예컨대 알코올 데하이드로게나아제 또는 글루코스 데하이드로게나아제, 및 각각의 기질, 예컨대 알코올 또는 글루코스를 추가로 포함할 수 있다.
다른 실시 형태에서, 보조 인자는 대상으로 하는 반응을 또한 촉매하는 효소에 의해 재생될 수 있다. 이러한 실시 형태에서, 이 효소의 제2 기질이 수성 반응 혼합물에, 구체적으로, 대상으로 하는 기질보다 유의하게 더 많은 양으로, 예컨대 대상으로 하는 기질에 대하여 적어도 2배, 바람직하게는 적어도 4배, 적어도 10배, 또는 적어도 50배의 몰 과량으로 존재할 수 있다. 예를 들어, 트랜스아미나아제 반응에 있어서, 수성 반응 혼합물은 피리독살 모노포스페이트와 같은 보조 인자의 재생을 위한 이소프로필아민과 같은 아민 화합물을 포함할 수 있다.
특정한 실시 형태에서, 효소는 케토리덕타아제이며, 기질은 케톤이고, 보조 인자는 NADP이다. 또 다른 실시 형태에서, 효소는 엔 리덕타아제이며, 기질은 탄소-탄소 이중 결합을 포함하는 화합물이고, 보조 인자는 NAD이다. 또 다른 실시 형태에서, 효소는 트랜스아미나아제이며, 기질은 케톤이고, 보조 인자는 피리독살 모노포스페이트이다.
수성 반응 혼합물 중 계면활성제는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다:
(i) 하기 화학식 I을 갖는 계면활성제:
[화학식 I]
Figure 112019071434070-pct00010
(ii) 하기 화학식 II를 갖는 계면활성제:
[화학식 II]
Figure 112019071434070-pct00011
및
(iii) 하기 화학식 III을 갖는 계면활성제:
[화학식 III]
Figure 112019071434070-pct00012
여기서,
R1은 폴리(C1-4-알킬렌 글리콜) 기를 포함하며;
R2, R3, R4 및 R5는 독립적으로 수소 또는 C1-4-알킬이며;
R6은 C5-80-알킬 또는 C5-80-알케닐이다.
수성 반응 혼합물 중 계면활성제는 화학식 I, 화학식 II 또는 화학식 III에 따른 임의의 계면활성제일 수 있다. 특정 실시 형태에서, 계면활성제의 분자량은 10,000 g/mol 이하, 구체적으로 7,500 g/mol 이하, 5,000 g/mol 이하, 3,000 g/mol 이하, 2,500 g/mol 이하 또는 심지어 2,000 g/mol 이하이다.
구체적으로, 계면활성제는 화학 반응을 방해하지 않아야 한다. 특정 실시 형태에서, 계면활성제는 비이온성 계면활성제이다. 일반적으로 계면활성제는 친양쪽성이며, 친수성 부분과 소수성 부분을 포함한다. 친수성 부분은 주로 잔기 R1에 의해 형성되며, 소수성 부분은 주로 잔기 R6에 의해 형성된다. 특정한 실시 형태에서, 계면활성제는 계면활성제-물 혼합물에서 미셀을 형성할 수 있다.
계면활성제는 잔기 R1에 있어서 폴리(C1-4-알킬렌 글리콜) 기를 포함한다. 이러한 폴리(C1-4-알킬렌 글리콜) 기로는 특히 폴리(에틸렌 글리콜) 기 또는 폴리(프로필렌 글리콜) 기, 구체적으로 폴리(에틸렌 글리콜) 기가 있다. 폴리(C1-4-알킬렌 글리콜) 기는 또한 상이한 폴리(C1-4-알킬렌 글리콜) 기의 조합, 예컨대 폴리(에틸렌 글리콜)과 폴리(프로필렌 글리콜)의 조합으로 이루어질 수 있다. R1은 구체적으로 폴리(C2-3-알킬렌 글리콜) 기를 포함한다. 폴리(C1-4-알킬렌 글리콜) 기, 특히 폴리(에틸렌 글리콜) 기는 약 100 내지 약 10,000 g/mol의 범위, 특히 약 200 내지 약 5,000 g/mol의 범위, 구체적으로 약 250 내지 2500 g/mol, 약 400 내지 약 2,000 g/mol 또는 약 500 내지 1500 g/mol의 범위, 예컨대 약 550, 약 750 또는 약 1000 g/mol의 평균 분자량을 가질 수 있다.
잔기 R1의 폴리(C1-4-알킬렌 글리콜) 기는 공유 결합 또는 연결 기를 통하여 코어 구조의 산소 원자에 부착될 수 있다. 연결 기는 폴리(C1-4-알킬렌 글리콜) 기를 산소 원자에 부착하기에 적합한 임의의 화학적 링커일 수 있다. 구체적으로, 연결 기는 폴리(C1-4-알킬렌 글리콜) 기 및 코어 구조에 대한 에스테르 결합을 형성하는 디카르복실산일 수 있다. 예시적인 연결 기는 2 내지 20개의 탄소 원자를 갖는 디카르복실산, 예컨대 숙신산, 세바스산, 말론산, 글루타르산, 아디프산, 말레산 및 푸마르산을 포함한다.
특정 실시 형태에서, R1은 폴리(C1-4-알킬렌 글리콜) 기의 말단에 부착된 말단 기를 추가로 포함한다. 이러한 말단 기는 구체적으로 에테르, 에스테르 또는 아미드 결합을 통하여 폴리(C1-4-알킬렌 글리콜) 기에 부착된다. 말단 기는 특히 C1-16 알킬 또는 알케닐 기, 구체적으로 C1-8 알킬 기, 예컨대 C1-4 알킬 기이다. 특정 실시 형태에서, 말단 기는 에테르 결합을 통하여 폴리(C1-4-알킬렌 글리콜) 기에 부착된 메틸 기이다.
특정한 실시 형태에서, R1은 폴리(C1-4-알킬렌 글리콜) 기, 연결 기 및 말단 기로 이루어지며, 이는 본원에 기술된 바와 같다.
R2, R3, R4 및 R5는 독립적으로 수소 또는 C1-4-알킬, 구체적으로 수소, 메틸 또는 에틸, 특히 수소 또는 메틸이다. 특정 실시 형태에서, R5는 메틸이다. 특정 실시 형태에서, R4는 메틸이다. 특정 실시 형태에서, R4 및 R5는 메틸이다. 추가 실시 형태에서, R2 및 R3은 독립적으로 수소 또는 메틸이다. 특정한 실시 형태에서, R4 및 R5는 메틸이며, R2 및 R3은 독립적으로 수소 또는 메틸이다. 계면활성제가 화학식 I을 갖는 특정 실시 형태에서, R2, R3, R4 및 R5는 모두 메틸이다. 계면활성제가 화학식 II를 갖는 특정 실시 형태에서, R4 및 R5는 모두 메틸이다. 계면활성제가 화학식 III을 갖는 특정 실시 형태에서, R2는 수소이며, R3, R4 및 R5는 메틸이다.
R6은 C5-80-알킬 또는 C5-80-알케닐이다. R6은 선형 또는 분지형일 수 있으며, 방향족 기를 포함하는 환형 기를 포함할 수 있다. 특정 실시 형태에서, R6은 환형 기 또는 방향족 기를 포함하지 않는다. 구체적으로, R6은 분지형이다.
계면활성제가 화학식 I을 갖는 실시 형태에서, R6은 C5-30-알킬 또는 C5-30-알케닐, 특히 C8-25-알킬 또는 C8-25-알케닐, 구체적으로 C10-20-알킬 또는 C10-20-알케닐, 바람직하게는 C14-18-알킬 또는 C14-18-알케닐일 수 있다. 알케닐 기는 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합, 구체적으로 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 이중 결합, 예컨대 2개 또는 3개, 특히 3개의 이중 결합을 포함할 수 있다. 특정한 실시 형태에서, R6은 C16-알킬 또는 C16-알케닐, 구체적으로 4,8,12-트리메틸트리데실 또는 4,8,12-트리메틸-3,7,11-트리데카트리에닐이다. 특정 실시 형태에서, R5 및 R6을 지닌 탄소 원자는 R 배좌로 있다.
계면활성제가 화학식 II를 갖는 실시 형태에서, R6은 C5-20-알킬 또는 C5-20-알케닐, 특히 C6-18-알킬 또는 C6-18-알케닐, 구체적으로 C7-15-알킬 또는 C7-15-알케닐, 바람직하게는 C8-12-알킬 또는 C8-12-알케닐일 수 있다. 특정한 실시 형태에서, R6은 C10-알킬, 구체적으로 5-에틸-6-메틸헵탄-2-일이다.
계면활성제가 화학식 III을 갖는 실시 형태에서, R6은 C30-80-알킬 또는 C30-80-알케닐, 특히 C35-70-알킬 또는 C35-70-알케닐, 구체적으로 C40-60-알킬 또는 C40-60-알케닐, 바람직하게는 C45-55-알킬 또는 C45-55-알케닐일 수 있다. 알케닐 기는 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합, 구체적으로 5개, 8개 또는 10개의 이중 결합, 특히 10개의 이중 결합을 포함할 수 있다. 특정한 실시 형태에서, R6은 C50-알케닐, 구체적으로 3,7,11,15,19,23,27,31,35,39-데카메틸테트라콘타-2,6,10,14,18,22,26,30,34,38-데카에닐이다.
계면활성제가 화학식 I을 갖는 실시 형태에서, 계면활성제는 특히 비타민 E, 구체적으로 토코페롤, 특히 α-토코페롤로부터 유도된다. 상기 계면활성제의 특정한 예는 토코페롤 폴리에틸렌 글리콜 숙시네이트(TPGS), 구체적으로 DL-α-토코페롤 폴리에틸렌 글리콜 숙시네이트, 예컨대 TPGS-750-M, TPGS-1000, TPGS-1500, TPGS-400, TPGS-1100-M, TPGS-2000, TPGS-860-올레에이트, TPGS-PEG-PPG-PEG-1100 및 TPGS-PPG-PEG-70-부틸, 및 DL-α-토코페롤 폴리프로필렌 글리콜 숙시네이트, 예컨대 TPPG-1000 및 TPPG-1000-부틸; 및 세바스산의 폴리에틸렌 글리콜 α-토코페롤 디에스테르(PTS), 예컨대 PTS-600을 포함한다. 특정한 실시 형태에서, 상기 계면활성제는 TPGS-750-M, TPGS-1000 및 PTS, 구체적으로 TPGS-750-M으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
계면활성제가 화학식 II를 갖는 실시 형태에서, 계면활성제는 특히 유비퀴놀로부터 유도된다. 상기 계면활성제의 특정 예는 폴리에틸렌글리콜 유비퀴놀 숙시네이트(PQS), 구체적으로 mPEG2000과 같은 mPEG를 포함하는 PQS를 포함한다.
계면활성제가 화학식 III을 갖는 실시 형태에서, 계면활성제는 특히 시토스테롤, 구체적으로 β-시토스테롤로부터 유도된다. 상기 계면활성제의 특정 예는 β-시토스테롤 메톡시에틸렌글리콜 숙시네이트(Nok), 구체적으로, mPEG550과 같은 mPEG를 포함하는 Nok를 포함한다.
수성 반응 혼합물 중 계면활성제의 농도는 구체적으로 적어도 0.01% (w/w), 구체적으로 적어도 0.02% (w/w), 특히 적어도 0.5% (w/w) 또는 적어도 1% (w/w)이다. 특정한 실시 형태에서, 수성 반응 혼합물 중 계면활성제의 농도는 0.01 내지 20% (w/w)의 범위, 구체적으로 0.02 내지 15% (w/w)의 범위, 0.1 내지 10% (w/w), 0.2 내지 7.5% (w/w) 또는 0.5 내지 5% (w/w)의 범위, 특히 0.75 내지 3% (w/w)의 범위, 예컨대 약 1% (w/w), 약 1.5% (w/w) 또는 약 2% (w/w)이다. 특정한 실시 형태에서, 계면활성제-물 혼합물 중 계면활성제의 농도는 그의 임계 미셀 농도보다 더 크다.
특정 실시 형태에서, 수성 반응 혼합물은 완충제를 추가로 포함한다. 구체적으로 완충제는 반응 혼합물의 pH를 중성 pH에서 또는 대략 중성 pH에서 유지하는 데 적합해야 한다. 구체적으로, 완충제는 트리스(TRIS), 포스페이트, 시트레이트, 아세테이트 및 암모니아로 이루어진 군으로부터 선택된다. 수성 반응 혼합물은 바람직하게는 효소가 활성을 갖고 안정한 pH 및/또는 효소 반응에 적합한 pH를 갖는다. 특정 실시 형태에서, 상기 pH 값은 4.0 내지 10.0, 구체적으로 6.0 내지 8.0, 특히 6.5 내지 7.5의 범위, 예컨대 약 7.0이다.
반응 혼합물 중 기질은 효소 반응을 수행하는 데 적합한 임의의 기질일 수 있다. 구체적으로 기질은 반응 혼합물에서 수행될 효소 반응의 유형에 따라 달라진다. 반응 혼합물은 또한 1가지 초과의 기질, 예컨대 2가지의 기질 또는 3가지의 기질을 포함할 수 있다. 특정한 실시 형태에서, 효소 반응의 기질 및/또는 생성물은 수-혼화성이 아니거나 단지 부분적으로 수-혼화성이다. 단지 부분적으로 수-혼화성인 화합물은 구체적으로, 실온에서 단지 20 g/l 이하, 특히 10 g/l 이하 또는 5 g/l 이하의 농도로 물과 혼화성이다. 기질은 화학 반응의 수행을 위하여 실행가능한 임의의 농도로 사용될 수 있다. 구체적으로, 기질은 고농도로 사용된다. 예를 들어, 반응 혼합물 중 기질의 농도는 적어도 0.1 M, 구체적으로 적어도 0.5 M, 적어도 1.0 M, 적어도 1.1 M, 적어도 1.2 M, 적어도 1.3 M, 적어도 1.5 M, 적어도 1.7 M 또는 적어도 2.0 M이다. 당업자라면 적합한 기질 및 이의 농도를 선택할 수 있다.
특정 실시 형태에서, 수성 반응 혼합물은 추가적으로 공용매를 포함할 수 있다. 공용매는 구체적으로 유기 용매 또는 추가 계면활성제 또는 이들의 혼합물일 수 있다.
유기 용매는 임의의 유기 용매일 수 있다. 바람직하게는, 이것은 효소 반응을 방해하지 않거나 억제하지 않을 것이다. 특정 실시 형태에서, 유기 용매는 수-혼화성이거나 부분적으로 수-혼화성이다. 유기 용매는 특히 비양성자성 유기 용매이다. 유기 용매의 비제한적 예는 아세톤, 테트라하이드로푸란(THF) 및 이의 유도체, 예컨대 메틸 테트라하이드로푸란, 피리딘, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜(PPG), 구체적으로, 평균 분자량이 약 100 g/mol 내지 약 2000 g/mol인 PEG, 예컨대 PEG200, PEG600, PEG1000 및 PEG2000, 이의 유도체, 예컨대 모노- 또는 디알킬 PEG, 구체적으로 모노- 또는 디메틸 PEG, 모노- 또는 디에틸 PEG 및 모노- 또는 디프로필 PEG를 포함한다. 추가의 예는 아세토니트릴, 디메틸포름아미드(DMF), 디클로로메탄(DCM), 톨루엔, 및 알코올, 예컨대 C1-10 지방족 알코올, 구체적으로 2-부틸 알코올을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 반응 혼합물 중 유기 용매의 양은 0.1% 내지 50% (v/v), 구체적으로 1% 내지 40% (v/v), 2% 내지 30% (v/v), 4% 내지 25% (v/v) 또는 5% 내지 20% (v/v)의 범위이다.
상기 추가 계면활성제는 임의의 계면활성제일 수 있다. 바람직하게는, 이것은 효소 반응을 방해하지 않거나 억제하지 않을 것이다. 특정 실시 형태에서, 계면활성제의 친수성 부분은 폴리알킬렌 글리콜 모이어티, 특히 폴리에틸렌 글리콜 모이어티 또는 폴리프로필렌 글리콜 모이어티를 포함한다. 폴리알킬렌 모이어티, 특히 폴리에틸렌 글리콜 모이어티는 약 100 내지 약 10,000 g/mol의 범위, 특히 약 300 내지 약 3,000 g/mol의 범위, 구체적으로 약 400 내지 약 2,000 g/mol의 범위의 평균 분자량을 가질 수 있다. 폴리알킬렌 글리콜 모이어티를 포함하는 상기 추가 계면활성제의 특정 예는 트리톤(Triton) X-100; 폴리에틸렌 글리콜 알킬 에테르, 예컨대 Brij 계면활성제, 구체적으로 Brij 30, Brij 35, Brij 52, Brij 56, Brij 58, Brij 72, Brij 76, Brij 78, Brij 92, Brij 96, Brij 98, 크레모포르(Cremophor) A6, 크레모포르 A25 및 테시트(Thesit); 폴리에틸렌 글리콜 에스테르, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (15)-하이드록시스테아레이트(솔루톨(Solutol) HS 15); 폴리소르베이트 또는 트윈(Tween)으로도 공지된 폴리에틸렌 글리콜 소르비탄 지방산 에스테르, 예컨대 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 21, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60, 폴리소르베이트 61, 폴리소르베이트 65, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 81, 폴리소르베이트 85 및 폴리소르베이트 120; 콜레스테릴 PEG 숙시네이트, 예컨대 콜레스테릴 PEG1000 숙시네이트; (데옥시) 콜릭 PEG, 예컨대 콜릭 PEG1000 및 데옥시-콜릭 PEG1000; 크로만올 폴리에틸렌 글리콜 숙시네이트, 예컨대 크롬(Chrom)-400 및 크롬-1000; 및 기타 PEG 유도체, 예컨대 C4-아조-PEG; 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB); 상 전이 계면활성제, 예컨대 소듐 데옥시콜레이트; 및 옥탄산 및 기타 장쇄 알킬 산, 구체적으로 C6-20 알킬 사슬 산을 포함한다. 수성 반응 혼합물 중 상기 추가 계면활성제의 농도는 구체적으로 0.1 내지 10% (w/w)의 범위일 수 있다. 특정 실시 형태에서, 상기 추가 계면활성제의 농도는 0.5 내지 5% (w/w)의 범위, 특히 0.8 내지 4% (w/w), 1 내지 3% (w/w) 또는 1.5 내지 2.5% (w/w)의 범위, 예컨대 약 2% (w/w)이다.
본 발명의 기술은, 매우 큰 규모 또는 매우 작은 규모와 같이 반응 혼합물 중에 높은 기질 농도가 요구되는 응용에 특히 유용하다. 일 실시 형태에서, 반응 혼합물은 공업적 규모의 것이다. 이것은 예를 들어 적어도 1 l, 구체적으로 적어도 10 l, 적어도 100 l, 또는 적어도 1000 l의 부피를 가질 수 있다. 또 다른 실시 형태에서, 반응 혼합물은 마이크로규모의 것이다. 이것은 예를 들어 10 ml 이하, 구체적으로 1 ml 이하, 100 μl 이하, 10 μl 이하 또는 1 μl 이하의 부피를 가질 수 있다.
반응 혼합물은 화학 반응의 수행을 위한 충전 또는 배치(batch) 혼합물이다. 특정 실시 형태에서, 반응 혼합물은 효소 반응의 생성물을 전혀 포함하지 않거나 단지 잔류량의 임의의 효소 반응 생성물을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 이것은 상당한 양의 효소 반응 생성물을 또한 함유할 수 있다.
제2 양태에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는, 효소 반응을 수행하는 방법을 제공한다:
(a) 본원에 기술된 바와 같은 수성 반응 혼합물을 제공하는 단계, 및
(b) 효소 반응이 진행되게 하는 단계.
반응 혼합물은 특히 효소, 효소 기질 및 계면활성제를 포함하며, 여기서 계면활성제는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다:
(i) 하기 화학식 I을 갖는 계면활성제:
[화학식 I]
Figure 112019071434070-pct00013
(ii) 하기 화학식 II를 갖는 계면활성제:
[화학식 II]
Figure 112019071434070-pct00014
및
(iii) 하기 화학식 III을 갖는 계면활성제:
[화학식 III]
Figure 112019071434070-pct00015
여기서,
R1은 폴리(C1-4-알킬렌 글리콜) 기를 포함하며;
R2, R3, R4 및 R5는 독립적으로 수소 또는 C1-4-알킬이며;
R6은 C5-80-알킬 또는 C5-80-알케닐이다.
수성 반응 혼합물은 구체적으로, 본원에 기술된 임의의 특징들, 실시 형태들 및 실시예들(이들의 조합을 포함함)을 나타낼 수 있다.
효소 반응은 화학 반응을 촉매하기 위해 효소를 사용하여 수행될 수 있는 임의의 화학 반응일 수 있다. 구체적으로, 유기 화학 합성 반응이 예를 들어 적어도 부분적으로 소수성인 화합물을 이용하여 수행될 수 있다. 예시적인 화학 반응은 환원 반응, 산화 반응, 아미노화 반응, 니트릴화 반응, 가수분해 반응, 에스테르화 반응 및 아미드화 반응, 예컨대 아실화를 포함한다. 수성 반응 혼합물 중 효소 및 기질은 특정 화학 반응에 적합하다. 구체적으로, 효소 및 기질은 효소 반응이 원하는 대로 진행되도록 특정하게 선택된다. 적합한 효소 및 기질은 본원에 기술되어 있다.
특정 실시 형태에서, 효소 반응은 효소 반응을 수행하기에 적합한 반응 조건 하에 단계 (b)에서 진행되게 한다. 구체적으로, 반응 조건은 80℃ 이하, 특히 60℃ 이하, 45℃ 이하, 또는 40℃ 이하의 온도를 포함한다. 구체적으로, 효소 반응은 10℃ 내지 50℃, 구체적으로 20℃ 내지 45℃ 또는 25℃ 내지 40℃의 온도에서 수행된다. 예를 들어, 효소 반응을 약 37℃, 약 30℃ 또는 대략 실온에서 진행시킬 수 있다. 특정한 실시 형태에서, 반응 혼합물은 교반되며, 구체적으로, 효소 반응 과정 중에 교반된다.
더욱이, 반응 조건은 구체적으로 4.0 내지 10.0, 구체적으로 5.0 내지 9.5, 5.5 내지 9.0, 6.0 내지 8.5 또는 6.5 내지 8.0의 범위의 pH 값을 포함한다. 특정 실시 형태에서, pH는 효소 반응 중에 일정하게, 구체적으로, 요구되는 대략적인 pH 값의 +/- 1.0 pH 단위 내에서, 특히 +/- 0.5 pH 단위 내에서 유지된다. 그러나, 다른 실시 형태에서, pH 값은 1.0 초과의 pH 단위만큼, 구체적으로 1.5 초과의 pH 단위 또는 심지어 2.0 초과의 pH 단위만큼 변화시킨다. 본원에 기술된 바와 같은 수성 반응 혼합물은 pH의 변동이 효소 반응에 유의하게 영향을 주지 않도록 효소를 안정화시킬 수 있다.
효소 반응을 수행하는 방법은 효소 반응 생성물을 단리하는 추가 단계를 포함할 수 있다. 구체적으로, 이 단계는 효소 반응의 완료 후에 수행된다. 상기 생성물은 구체적으로, 수성 반응 혼합물의 하나 이상의 다른 성분, 구체적으로, 본질적으로 모든 다른 성분으로부터 분리된다. 예를 들어, 상기 생성물은 잔존하는 기질, 부산물, 효소, 계면활성제, 조효소, 보조 인자 및/또는 유기 용매로부터 분리된다. 생성물의 단리는 예를 들어 용매의 증발, 응집 또는 결정화 및 여과, 상 분리, 크로마토그래피 분리 및 기타의 것을 비롯한 본 기술 분야에 공지된 수단 및 기술에 의해 달성될 수 있다.
본 발명은 수성 반응 혼합물 중 기질 및 생성물의 용해도를 향상시키며 효소의 안정성을 증강시킨다. 이에 의해, 효소 반응의 수율이 증가되며, 효소 반응에 의해 수득되는 원하지 않는 부산물의 양이 감소된다. 이를 고려하면, 추가 양태에서 본 발명은 효소 및 효소 기질을 포함하는 수성 혼합물에 계면활성제를 첨가하는 것을 포함하는, 효소 반응의 수율을 증가시키는 데 있어서의 계면활성제의 용도를 제공하며, 여기서 계면활성제는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다:
(i) 하기 화학식 I을 갖는 계면활성제:
[화학식 I]
Figure 112019071434070-pct00016
(ii) 하기 화학식 II를 갖는 계면활성제:
[화학식 II]
Figure 112019071434070-pct00017
및
(iii) 하기 화학식 III을 갖는 계면활성제:
[화학식 III]
Figure 112019071434070-pct00018
여기서,
R1은 폴리(C1-4-알킬렌 글리콜) 기를 포함하며;
R2, R3, R4 및 R5는 독립적으로 수소 또는 C1-4-알킬이며;
R6은 C5-80-알킬 또는 C5-80-알케닐이다.
추가 양태에서, 본 발명은 효소 및 효소 기질을 포함하는 수성 혼합물에 계면활성제를 첨가하는 것을 포함하는, 효소 반응의 안정성을 증가시키는 데 있어서의 계면활성제의 용도를 제공하며, 여기서 계면활성제는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다:
(i) 하기 화학식 I을 갖는 계면활성제:
[화학식 I]
Figure 112019071434070-pct00019
(ii) 하기 화학식 II를 갖는 계면활성제:
[화학식 II]
Figure 112019071434070-pct00020
및
(iii) 하기 화학식 III을 갖는 계면활성제:
[화학식 III]
Figure 112019071434070-pct00021
R1은 폴리(C1-4-알킬렌 글리콜) 기를 포함하며;
R2, R3, R4 및 R5는 독립적으로 수소 또는 C1-4-알킬이며;
R6은 C5-80-알킬 또는 C5-80-알케닐이다.
효소 반응의 증가된 안정성은 구체적으로 반응 혼합물 중 효소의 증가된 안정성을 포함한다.
효소 반응을 수행하는 방법 및 이와 마찬가지로 수성 반응 혼합물을 위한, 본원에 기술된 실시 형태들, 특징들 및 실시예들(이들의 조합을 포함함)은 효소 반응의 수율 및/또는 안정성을 증가시키는 데 있어서의 계면활성제의 용도에 적용된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "포함하다"라는 표현은 그의 문자 그대로의 의미 외에, "본질적으로 ~로 이루어지다" 및 "~로 이루어지다"라는 표현을 또한 포함하며 구체적으로 이를 지칭한다. 따라서, "포함하다"라는 표현은, 구체적으로 열거된 요소를 "포함하는" 요지가 추가 요소를 포함할 수 있고/있거나 실제로 포함하는 실시 형태와, 구체적으로 열거된 요소를 "포함하는" 요지가 추가 요소를 포함하지 않는 실시 형태를 나타낸다. 이와 마찬가지로, "갖다"라는 표현은 "본질적으로 ~으로 이루어지다" 및 "~으로 이루어지다"라는 표현을 또한 포함하고 구체적으로 이를 지칭하는 "포함하다"라는 표현으로 이해되어야 한다.
본원에 기술된 수치 범위는 이 범위를 정의하는 수를 포함한다. 본원에 제공된 제목은 명세서를 전체적으로 참조하여 읽을 수 있는 본 발명의 다양한 양태 또는 실시 형태를 제한하는 것이 아니다. 일 실시 형태에 따르면, 방법의 경우 특정 단계들을 포함하는 것으로, 또는 조성물의 경우 특정 성분들을 포함하는 것으로 본원에 기술된 요지는 각각의 단계 또는 성분으로 이루어진 요지를 나타낸다. 본원에 개시된 특정 양태들 및 실시 형태들을 선택하여 조합하는 것이 바람직하며, 특정 실시 형태들의 각각의 조합에서 생긴 특정 요지도 본 발명에 속한다.
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실시예
실시예 1: 케토리덕타아제를 사용한 벤질 (R)-4-하이드록시-2-(4-(메톡시카르보닐)페닐)피페리딘-1-카르복실레이트의 합성
반응물의 용해도의 증가 및 반응 선택성의 향상과 같은 유익한 효과를 가지고서 효소 활성을 조정하는 데 있어, 계면활성제를 생체 촉매 작용에 적용하였다. 다수의 계면활성제(이온성 리퀴드를 포함함), SDS 및 트리톤 X가 넓은 범위의 생물변환에 이용되었지만, 립슈츠(Lipshutz) 연구실에서 개발된 대안적인 계면활성제로서의 TPGS-750-M은 생체 촉매 작용에서 연구된 적이 없었다. 반응식 1에 나타낸 바와 같은 케토리덕타아제(KRED) 매개 반응의 연구 중에, 낮은 용해도의 출발 케톤 1 및 생성물인 알코올 2 둘 다는 이러한 불균일 반응에 적합한 반응 매질을 찾아내는 데 있어 상당한 노력을 필요로 하였다.
[반응식 1]
Figure 112019071434070-pct00022
첫째, 수성 용액 형태의 다수의 공용매 시스템(TPGS, PEG400 및 DMSO를 포함함)을 병렬 스크리닝 조건 하에 상기 반응에 이용하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 2.5시간 내의 상기 반응의 제1기 중에, TPGS는 PEG400 및 DMSO보다 더 양호하게 작동하며, 이때 전환율의 차이는 10%였다. 반응이 더 진행됨에 따라, 반응은 TPGS에서 유의하게 더 빠르며, 대략 40%의 전환율 차이가 관찰되었다(6시간 내의 PEG400 및 DMSO에서의 반응과 비교하여). 22시간 후, 반응은 TPGS에서 본질적으로 완전한 전환에 이르렀으며(100%), 반면에 PEG400 및 DMSO에서의 반응은 각각 82% 및 86%의 전환율에서 멈추었다. 이러한 현상은 PEG400 및 DMSO 시스템 둘 다의 유기 용매 첨가제에서의 케토리덕타아제의 더 낮은 안정성이 반영된 것이었다.
당해 스크리닝 결과를 이용하여, 그램 규모로 반응을 추가로 최적화하였다. 특히, TPGS 및 DMSO 시스템의 성능을 비교하였다. 따라서, 5 w%의 효소 로딩을 이용하여 40℃에서 각각 2% TPGS 및 15% DMSO 수성 용액에서 반응을 실시하였다. 반응은 TPGS 시스템에서 18시간 후에 93% 전환율에 도달한 반면 DMSO 시스템에서는 20시간 후에 더 낮은 80% 전환율에 도달하였다. 더 중요하게는, 추가의 25시간 후 TPGS에서 반응이 계속되어 98.8% 전환율에 도달하였다. 그러나, DMSO에서는 반응을 98.6% 전환율까지 추진하기 위하여 추가의 2 중량%의 효소를 첨가해야 한다(엔트리 1, 표 1). 이러한 관찰은 DMSO와 비교하여 TPGS에서의 효소의 활성이 더 크고 더 안정한 성질을 명백하게 입증하였다. 또 다른 흥미로운 관찰은, TPGS의 반응 시스템에서 24시간 동안 pH 4.7 하에 효소를 우연히 노출시키고 pH를 7까지 재조정한 후, 효소가 반응을 동일 활성으로 더 촉매하기에 여전히 충분한 활성을 갖는다는 것이었다(엔트리 2, 표 1). 탁월한 안정성은 TPGS와 단백질 사이의 분자적 상호작용에 의해 제공될 수 있었으며, 효소의 촉매 활성 부위는 수성 반응 매질로부터 보호된다.
Figure 112019071434070-pct00023
마지막으로, TPGS에서의 반응은 규모 확대에 더 용이하며, 입자 크기의 감소를 위한 밀링 또는 용액의 사전형성 없이 고체 형태로 화합물 1을 첨가할 수 있다. 전형적인 실험 절차는 다음과 같다: 실온에서 pH/ORP 제어 장치를 갖춘 기계적 교반 반응기에서, 완충수 중 TPGS-750-M의 탈기 2 중량% 용액 (34 mL, 10 v; 74 mL의 2 중량% TPGS-750-M 수용액, 1.6 g의 Na2HPO4.12H2O 및 0.5 g의 NaH2PO4.2H2O로부터 제조한 스톡 용액)에 글루코스 (3.2 g, 18 mmol, 2.0 당량)를 첨가하였다. 상기 현탁물을 실온에서 20분 동안 교반시키고, 생성된 혼합물에 NADP (59 mg, 68% 순도), GDH (33 mg) 및 케토리덕타아제 (0.16 g, 5 중량%의 기질 1)를 순차적으로 첨가하였다. 그 후 기질 1 (3.3 g, 9 mmol, 1.0 당량)을 첨가하고, 1 M 수성 NaOH의 첨가에 의해 반응 혼합물의 pH를 6.8~7.2까지 조정하였다(실온에서). 생성된 반응 혼합물을 40℃까지 가열하고, HPLC로 결정되는 반응 완료시까지 40℃에서 43시간 동안 교반시켰다. 반응이 진행됨에 따라, 생성물 2가 반응 혼합물로부터 석출되어 현탁물을 형성하였다. 생성된 현탁물을 40℃에서 여과시키고, 생성된 습윤 케이크를 물로 세척하고, 건조시켜 생성물 2를 황백색 고형물로서 제공하였다 (2.8 g, 순도: 97%, 수율: 85%).
[반응식 2]
Figure 112019071434070-pct00024
결론적으로, 우수한 반응 동역학 및 공정 완건성을 비롯하여 케토리덕타아제 매개된 생물변환에서의 첨가제로서의 TPGS의 유익한 효과가 밝혀졌다. 넓은 범위의 생체촉매적 변환에 적용되는 경우 TPGS에서의 근본적인 효소 안정성에 의해 유사한 이점이 발견될 것이다.
실시예 2: 케토리덕타아제를 사용한 (R)-5-플루오로-3-(3-플루오로페닐)-2-(1-하이드록시에틸)-4H-크로멘-4-온의 합성
[반응식 3]
Figure 112019071434070-pct00025
반응 혼합물:
20 mg의 기질 3
효소: 케토리덕타아제 KRED-EW-109 (양: 표 2 참조)
20 mg의 D-글루코스
0.4 mg (2%(m/m))의 글루코스 데하이드로게나아제(GDH)
0.2 mg (1%(m/m))의 NADP
0.1 M PBS (양: 표 2 참조)
0.1 M PBS 중 2% TPGS-750-M (m/m) (양: 표 2 참조)
DMSO (양: 표 2 참조)
반응 조건: pH 7.0, 30℃
Figure 112019071434070-pct00026
실시예 3: 케토리덕타아제를 사용한 1-페닐에탄올의 합성
[반응식 4]
Figure 112019071434070-pct00027
반응 혼합물:
20 μl의 아세토페논
효소: 케토리덕타아제 KRED-EW-124 (양: 표 3 참조)
20 mg의 D-글루코스
0.4 mg (2%(m/m))의 글루코스 데하이드로게나아제(GDH)
0.2 mg (1%(m/m))의 NADP
0.1 M PBS (양: 표 3 참조)
0.1 M PBS 중 2% TPGS-750-M (m/m) (양: 표 3 참조)
DMSO (양: 표 3 참조)
반응 조건: pH 7.0, 30℃
Figure 112019071434070-pct00028
실시예 4: 엔 리덕타아제를 사용한 (S)-3-(3-브로모피리딘-4-일)-5-메틸시클로헥산-1-온의 합성
[반응식 5]
Figure 112019071434070-pct00029
반응 혼합물:
20 μl의 기질 5
효소: 엔 리덕타아제 ENE012 (양: 표 4 참조)
20 mg의 D-글루코스
0.4 mg (2%(m/m))의 글루코스 데하이드로게나아제(GDH)
0.2 mg (1%(m/m))의 NAD
0.1 M PBS (양: 표 4 참조)
0.1 M PBS 중 2% TPGS-750-M (m/m) (양: 표 4 참조)
톨루엔 (양: 표 4 참조)
반응 조건: pH 7.0, 30℃
Figure 112019071434070-pct00030

Claims (44)

  1. 효소, 효소 기질, 및 하기 화학식 I을 갖는 계면활성제를 포함하고, 효소 기질은 수-혼화성이 아니거나 실온에서 단지 20 g/l 이하의 농도로 물과 혼화성인, 수성 반응 혼합물:
    [화학식 I]
    Figure 112022097440619-pct00031

    (여기서,
    R1은 폴리(C1-4-알킬렌 글리콜) 기를 포함하며;
    R2, R3, R4 및 R5는 독립적으로 수소 또는 C1-4-알킬이며;
    R6은 C5-80-알킬 또는 C5-80-알케닐임).
  2. 제1항에 있어서, R1은 공유 결합 또는 연결 기를 통하여 코어 구조의 산소 원자에 부착되고 말단 C1-4-알킬 기를 선택적으로 포함하는 폴리(C1-4-알킬렌 글리콜) 기인 반응 혼합물.
  3. 제2항에 있어서, 연결 기는 코어 구조 및 폴리(C1-4-알킬렌 글리콜) 기에 대한 에스테르 결합을 형성하는 디카르복실산인 반응 혼합물.
  4. 제3항에 있어서, 연결 기는 탄소 원자수 2 내지 20의 디카르복실산, 숙신산 또는 세바스산인 반응 혼합물.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 말단 C1-4-알킬 기는 메틸인, 반응 혼합물.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리(C1-4-알킬렌 글리콜) 기는 폴리(에틸렌 글리콜) 기인 반응 혼합물.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리(C1-4-알킬렌 글리콜) 기의 평균 분자량은 250 내지 2500 g/mol, 500 내지 1500 g/mol, 550 g/mol, 750 g/mol 또는 1000 g/mol인 반응 혼합물.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, R5는 메틸인 반응 혼합물.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, R4는 메틸인 반응 혼합물.
  10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, R2 및 R3은 독립적으로 수소 또는 메틸인 반응 혼합물.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, R2, R3, R4 및 R5는 모두 메틸인, 반응 혼합물.
  12. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, R6은 분지형 또는 선형인 반응 혼합물.
  13. 제12항에 있어서, R6은 분지형인 반응 혼합물.
  14. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, R6은 C8-25-알킬, C8-25-알케닐, C14-18-알킬 또는 C14-18-알케닐인, 반응 혼합물.
  15. 제14항에 있어서, R6은 C16-알킬, C16-알케닐, 4,8,12-트리메틸트리데실 또는 4,8,12-트리메틸-3,7,11-트리데카트리에닐인, 반응 혼합물.
  16. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 계면활성제는 비타민 E-유도된 화합물인 반응 혼합물.
  17. 제16항에 있어서, 계면활성제는 D-α-토코페롤 폴리(에틸렌 글리콜) 숙시네이트, TPGS-750-M, TPGS-1000, PTS 또는 PTS-600인 반응 혼합물.
  18. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 효소는 리덕타아제, 트랜스퍼라아제, 데하이드로게나아제, 리파아제, 및 에스테라아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 반응 혼합물.
  19. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 효소는 케토리덕타아제, 엔 리덕타아제, 트랜스아미나아제, 알코올 데하이드로게나아제, 아미노산 데하이드로게나아제, 및 페닐알라닌 암모니아 라이아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 반응 혼합물.
  20. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 효소 반응의 수행에 필요한 조효소 또는 보조 인자를 추가로 포함하는 반응 혼합물.
  21. 제20항에 있어서, 조효소 또는 보조 인자는 알코올 데하이드로게나아제, NAD, NADP, FAD 및 피리독살 모노포스페이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 반응 혼합물.
  22. 제20항에 있어서, 효소는 케토리덕타아제이며, 기질은 케톤이고, 보조 인자는 NADP인 반응 혼합물.
  23. 제20항에 있어서, 효소는 엔 리덕타아제이며, 기질은 탄소-탄소 이중 결합을 포함하는 화합물이고, 보조 인자는 NAD인 반응 혼합물.
  24. 제20항에 있어서, 효소는 트랜스아미나아제이며, 기질은 케톤이고, 보조 인자는 피리독살 모노포스페이트인 반응 혼합물.
  25. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 반응 혼합물 중 계면활성제의 농도는 그의 임계 미셀 농도보다 더 큰 반응 혼합물.
  26. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 반응 혼합물 중 계면활성제의 농도는 0.01% (w/w) 이상, 0.02% (w/w) 이상, 0.5% (w/w) 이상 또는 1% (w/w) 이상인 반응 혼합물.
  27. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 반응 혼합물 중 계면활성제의 농도는 0.1% 내지 10% (w/w), 0.5% 내지 5% (w/w) 또는 0.75% 내지 3% (w/w)의 범위 또는 2% (w/w)인 반응 혼합물.
  28. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 효소는 기질의 양의 0.1% 내지 50%, 0.5% 내지 35% 또는 1% 내지 20%의 범위의 양으로 존재하는 반응 혼합물.
  29. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 완충제를 추가로 포함하는 반응 혼합물.
  30. 제29항에 있어서, 완충제는 트리스(TRIS), 포스페이트, 시트레이트, 아세테이트 및 암모니아로 이루어진 군으로부터 선택되는 반응 혼합물.
  31. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 효소 반응에 적합한 pH 값을 갖는 반응 혼합물.
  32. 제31항에 있어서, pH 값은 4.0 내지 10.0, 6.0 내지 8.0 또는 6.5 내지 7.5의 범위 또는 7.0인 반응 혼합물.
  33. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 공업적 규모인 반응 혼합물.
  34. 제33항에 있어서, 부피가 10 l 이상, 100 l 이상 또는 1000 l 이상인 반응 혼합물.
  35. 다음의 단계를 포함하는, 효소 반응을 수행하는 방법:
    (a) 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 반응 혼합물을 제공하는 단계, 및
    (b) 효소 반응이 진행되게 하는 단계.
  36. 제35항에 있어서, 반응을 80℃ 이하의 온도에서 수행하는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 반응을 10℃ 내지 50℃ 또는 20℃ 내지 45℃의 범위의 온도에서 수행하는 방법.
  38. 제35항에 있어서, 반응 혼합물의 pH는 반응 중에 1.0 이상 또는 2.0 이상만큼 변화하는 방법.
  39. 효소 및 효소 기질을 포함하는 수성 혼합물에 계면활성제를 첨가하는 것을 포함하는, 효소 반응의 수율을 증가시키는 데 있어서 계면활성제를 사용하는 방법으로서, 계면활성제는 하기 화학식 I을 갖고, 효소 기질은 수-혼화성이 아니거나 실온에서 단지 20 g/l 이하의 농도로 물과 혼화성인 것인 방법:
    [화학식 I]
    Figure 112022097440619-pct00034

    (여기서,
    R1은 폴리(C1-4-알킬렌 글리콜) 기를 포함하며;
    R2, R3, R4 및 R5는 독립적으로 수소 또는 C1-4-알킬이며;
    R6은 C5-80-알킬 또는 C5-80-알케닐임).
  40. 효소 및 효소 기질을 포함하는 수성 혼합물에 계면활성제를 첨가하는 것을 포함하는, 효소 반응의 안정성을 증가시키는 데 있어서 계면활성제를 사용하는 방법으로서, 계면활성제는 하기 화학식 I을 갖고, 효소 기질은 수-혼화성이 아니거나 실온에서 단지 20 g/l 이하의 농도로 물과 혼화성인 것인 방법:
    [화학식 I]
    Figure 112022097440619-pct00037

    (여기서,
    R1은 폴리(C1-4-알킬렌 글리콜) 기를 포함하며;
    R2, R3, R4 및 R5는 독립적으로 수소 또는 C1-4-알킬이며;
    R6은 C5-80-알킬 또는 C5-80-알케닐임).
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서, 반응 혼합물은 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 반응 혼합물인 방법.
  42. 삭제
  43. 삭제
  44. 삭제
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