CN110777127A

CN110777127A - 一种支链氨基酸转氨酶作为还原酶的应用

Info

Publication number: CN110777127A
Application number: CN201911188612.7A
Authority: CN
Inventors: 倪晔; 曹旭东; 韩瑞枝; 方红辉; 许国超; 吴彦霏
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2019-11-28
Filing date: 2019-11-28
Publication date: 2020-02-11

Abstract

本发明公开了一种支链氨基酸转氨酶作为还原酶的应用，属于酶工程技术领域。本发明提供了一种可用于不对称还原前手性芳香酮生成手性芳香醇的支链氨基酸转氨酶，利用此支链氨基酸转氨酶不对称还原前手性芳香酮生成手性芳香醇的立体选择性高，其中，利用此支链氨基酸转氨酶不对称还原1‑萘乙酮生成(S)‑1‑(1‑萘基)‑乙醇的ee值高达99％以上，不对称还原4‑氯苯基‑2‑吡啶基甲酮生成(R)‑4‑氯苯基‑2‑吡啶基甲醇的ee值高达99％以上，不对称还原N‑3‑Boc‑哌啶酮生成(S)‑N‑3‑Boc‑哌啶醇的ee值高达99％以上。

Description

一种支链氨基酸转氨酶作为还原酶的应用

技术领域

本发明涉及一种支链氨基酸转氨酶作为还原酶的应用，属于酶工程技术领域。

背景技术

手性芳香醇是合成(R)-氟西汀、(R)-沙丁胺醇等众多手性药物和精细化学品的关键手性中间体，因此，手性芳香醇在医药、化工领域具有极高的应用前景。

目前，常通过化学法不对称还原前手性芳香酮生成手性芳香醇，但是，利用化学法不对称还原前手性芳香酮生成手性芳香醇存在很多缺陷，例如，催化剂昂贵、易造成重金属污染、合成路线较长以及在反应条件苛刻等(具体可见参考文献：Reddy M S,Narender M,Rao K R.A new asymmetric synthetic route to substituted piperidines[J].Tetrahedron,2007,63(2):331-336.以及Monterde M I,Nazabadioko S,Rebolledo F,etal.Chemoenzymatic synthesis of azacycloalkan-3-ols[J].Tetrahedron Asymmetry,1999,10(17):3449-3455.)，不利于工业化生产。

与化学法相比，利用酶法不对称还原前手性芳香酮生成手性芳香醇不需要任何保护基，具有更好的立体选择性，并且，反应还可以一步完成，因此，利用酶法不对称还原前手性芳香酮生成手性芳香醇对实现手性芳香醇的工业化生产具有重要意义。

现有的可用于不对称还原前手性芳香酮生成手性芳香醇的酶包括短链醇脱氢酶、中链醇脱氢酶以及醛基酮还原酶等，但是，大部分的短链醇脱氢酶、中链醇脱氢酶以及醛基酮还原酶不对称还原前手性芳香酮生成手性芳香醇的立体选择性仍难以达到医药的大于95％的要求。

因此，急需开发立体选择性更高的生物酶催化剂以提高不对称还原前手性芳香酮生成手性芳香醇的立体选择性。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是提供一种立体选择性高的可不对称还原前手性芳香酮生成手性芳香醇的支链氨基酸转氨酶(Branched-chain amino acidaminotransferase,BCAT,EC 2.6.2.42)。

[技术方案]

为解决上述技术问题，本发明提供了一种支链氨基酸转氨酶作为还原酶的应用，所述支链氨基酸转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，编码所述支链氨基酸转氨酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述还原酶的应用包括将酮还原为手性醇或将酮还原为非手性醇。

本发明还提供了一种生产手性醇的方法，所述方法为将氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示的支链氨基酸转氨酶添加至含有酮的反应体系中进行反应；将反应液进行提取，得到手性醇。

在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中含有辅酶。

在本发明的一种实施方式中，所述辅酶为NAD(P)H和/或NADH。

在本发明的一种实施方式中，所述支链氨基酸转氨酶在反应体系中的添加量为0.1～1U/mL。

在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中，酮的浓度为1～50g/L。

在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中，辅酶的浓度为0.1～1mmol/L。

在本发明的一种实施方式中，所述酮为1-萘乙酮、N-3-Boc-哌啶酮或4-氯苯基-2-吡啶基甲酮。

在本发明的一种实施方式中，酮为1-萘乙酮时，所述手性醇为(S)-1-(1-萘基)-乙醇；酮为4-氯苯基-2-吡啶基甲酮时，所述手性醇为(R)-4-氯苯基-2-吡啶基甲醇；酮为N-3-Boc-哌啶酮时，所述手性醇为(S)-N-3-Boc-哌啶醇。

在本发明的一种实施方式中，所述反应的温度为25～35℃、pH为6.5～7.5。

本发明还提供了氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的支链氨基酸转氨酶、编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的支链氨基酸转氨酶的基因、含有编码氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示的支链氨基酸转氨酶的基因的重组质粒、携带编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的支链氨基酸转氨酶的基因的宿主细胞以及上述生产手性醇的方法在生产手性醇中的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒的载体为pET载体。

在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒的载体为pET-28a(+)载体。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为细菌、真菌、植物细胞或动物细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为大肠杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述手性醇为(S)-1-(1-萘基)-乙醇、(R)-4-氯苯基-2-吡啶基甲醇或(S)-N-3-Boc-哌啶醇。

[有益效果]

(1)本发明提供了一种可用于不对称还原前手性芳香酮生成手性芳香醇的支链氨基酸转氨酶，利用此支链氨基酸转氨酶不对称还原前手性芳香酮生成手性芳香醇的立体选择性高，其中，利用此支链氨基酸转氨酶不对称还原1-萘乙酮生成(S)-1-(1-萘基)-乙醇的ee值高达99％以上，不对称还原4-氯苯基-2-吡啶基甲酮生成(R)-4-氯苯基-2-吡啶基甲醇的ee值高达99％以上，不对称还原N-3-Boc-哌啶酮生成(S)-N-3-Boc-哌啶醇的ee值高达99％以上。

(2)本发明的支链氨基酸转氨酶不对称还原前手性芳香酮生成手性芳香醇的立体选择性高，因此，本发明的支链氨基酸转氨酶在生产手性芳香醇中具有极高的应用前景。

附图说明

图1：重组质粒pET28a-BlBTA的PCR扩增电泳图谱；其中，M：Marker，1：重组质粒酶切产物。

图2：重组质粒pET28a-BlBTA的质粒图谱。

图3：重组菌E.coli BL21/pET28a-BlBTA摇瓶诱导发酵获得的表达产物的SDS-PAGE电泳分析结果；其中，M：Blue Plus II Protein Marker，1：重组菌E.coli BL21/pET28a-BlBTA摇瓶诱导发酵获得的细胞破碎上清液，2：重组菌E.coli BL21/pET28a-BlBTA摇瓶诱导发酵获得的沉淀，3：纯酶。

图4：1-萘乙酮的结构示意图。

图5：N-3-Boc-哌啶酮的结构示意图。

图6：4-氯苯基-2-吡啶基甲酮的结构示意图。

图7：支链氨基酸转氨酶不对称还原1-萘乙酮生成(S)-1-(1-萘基)-乙醇的反应流程图。

图8：反应液中产物(S)-1-(1-萘基)-乙醇的HPLC图谱。

具体实施方式

下述实施例中涉及的大肠杆菌E.coli BL21(DE3)购自生工生物工程(上海)股份有限公司，pET-28a(+)质粒购自生工生物工程(上海)股份有限公司；下述实施例中涉及的NAD(P)H购自邦泰生物工程有限公司；下述实施例中涉及的1-萘乙酮购自麦克林公司；下述实施例中涉及的N-3-Boc-哌啶酮购自上海皓伯化工有限公司；下述实施例中涉及的4-氯苯基-2-吡啶基甲酮购自天津希恩思生化科技有限公司；下述实施例中涉及的葡萄糖脱氢酶(GDH)购自sigma公司；下述实施例中涉及的D-葡萄糖购自国药集团化学试剂有限公司。(上述菌株大肠杆菌E.coli BL21(DE3)可以购买得到，不需要进行用于专利程序的保藏)

下述实施例中涉及的培养基如下：

LB液体培养基：酵母粉5.0g·L^-1、胰蛋白胨10.0g·L^-1、NaCl 10.0g·L^-1、卡那霉素100mg·L^-1。

LB固体培养基：酵母粉5.0g·L^-1、胰蛋白胨10.0g·L^-1、NaCl 10.0g·L^-1、琼脂粉15g/L、卡那霉素50mg·L^-1。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

支链氨基酸转氨酶对前手性芳香酮的酶活的检测方法如下：

支链氨基酸转氨酶对1-萘乙酮的酶活：

取50μL蛋白浓度为1mg/mL的纯酶液加入含有2mmol·L^-11-萘乙酮、6mmol·L^-1NAD(P)H、100mmol·L^-1PBS缓冲液的反应体系中，得到反应体系(共0.5mL)，于30℃振荡反应30min；反应结束后，取样进行HPLC分析，同时以(S)-1-(1-萘基)-乙醇标准品做对照，确定产物出峰时间，并以此为依据进行酶活测定；

HPLC分析条件为：色谱柱Chiralcel OD-H(25cm×4.6mm,5μm)，流动相为V(正己烷):V(异丙醇)＝90:10，流速为0.8mL·min^-1，检测波长为254nm，柱温为30℃；

酶活和比酶活的计算公式如下：

式中，A_S为反应液中(S)-1-(1-萘基)-乙醇的摩尔浓度，V为反应液体积，t为转化时间(min)，酶活力的单位U＝μmol·min^-1(酶液中的蛋白浓度通过Bradford法测定，Bradford法记载于参考文献“Bradford,M.M.1976.A rapid and sensitive method forthe quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principleof protein-dyebinding.Anal.Biochem.72:248–254.”中)；

酶活的定义：在该条件下每分钟催化1-萘乙酮产生1μmol(S)-1-(1-萘基)-乙醇所需酶量为一个酶活力单位(1U)；

比酶活的定义：单位重量(mg)蛋白质所具有的酶活力单位数。

支链氨基酸转氨酶对N-3-Boc-哌啶酮的酶活：

取50μL蛋白浓度为1mg/mL的纯酶液加入含有2mmol·L^-1N-3-Boc-哌啶酮、6mmol·L^-1NAD(P)H、100mmol·L^-1PBS缓冲液的反应体系中，得到反应体系(共0.5mL)，于30℃振荡反应30min；反应结束后，取样进行HPLC分析，同时以(S)-N-3-Boc-哌啶醇标准品做对照，确定产物出峰时间，并以此为依据进行酶活测定；

HPLC分析条件为：色谱柱Superchiral AS-Y(15cm×4.6mm,5μm)，流动相为V(正己烷):V(乙醇)＝95:5，流速为0.8mL·min^-1，检测波长为210nm，柱温为30℃；

酶活和比酶活的计算公式如下：

式中，A_S为反应液中(S)-N-3-Boc-哌啶醇的摩尔浓度，V为反应液体积，t为转化时间(min)，酶活力的单位U＝μmol·min^-1(酶液中的蛋白浓度通过Bradford法测定，Bradford法记载于参考文献“Bradford,M.M.1976.A rapid and sensitive method for thequantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle ofprotein-dyebinding.Anal.Biochem.72:248–254.”中)；

酶活的定义：在该条件下每分钟催化N-3-Boc-哌啶酮产生1μmol(S)-N-3-Boc-哌啶醇所需酶量为一个酶活力单位(1U)；

比酶活的定义：单位重量(mg)蛋白质所具有的酶活力单位数。

支链氨基酸转氨酶对4-氯苯基-2-吡啶基甲酮的酶活：

取50μL蛋白浓度为1mg/mL的纯酶液加入含有2mmol·L^-14-氯苯基-2-吡啶基甲酮、6mmol·L^-1NAD(P)H、100mmol·L^-1PBS缓冲液的反应体系中，得到反应体系(共0.5mL)，于30℃振荡反应30min；反应结束后，取样进行HPLC分析，同时以(R)-4-氯苯基-2-吡啶基甲醇标准品做对照，确定产物出峰时间，并以此为依据进行酶活测定；

HPLC分析条件为：色谱柱Chiralcel OB-H(25cm×4.6mm,5μm)，流动相为V(正己烷):V(异丙醇)＝95:5，流速为1.0mL·min^-1，检测波长为254nm，柱温为30℃；

酶活和比酶活的计算公式如下：

式中，A_S为反应液中(R)-4-氯苯基-2-吡啶基甲醇的摩尔浓度，V为反应液体积，t为转化时间(min)，酶活力的单位U＝μmol·min^-1(酶液中的蛋白浓度通过Bradford法测定，Bradford法记载于参考文献“Bradford,M.M.1976.A rapid and sensitive method forthe quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principleof protein-dyebinding.Anal.Biochem.72:248–254.”中)；

酶活的定义：在该条件下每分钟催化4-氯苯基-2-吡啶基甲酮产生1μmol(R)-4-氯苯基-2-吡啶基甲醇所需酶量为一个酶活力单位(1U)；

比酶活的定义：单位重量(mg)蛋白质所具有的酶活力单位数。

支链氨基酸转氨酶不对称还原前手性芳香酮的立体选择性的检测方法如下：

支链氨基酸转氨酶不对称还原1-萘乙酮的立体选择性：

取50μL蛋白浓度为1mg/mL的纯酶液加入含有2mmol·L^-11-萘乙酮、6mmol·L^-1NAD(P)H、100mmol·L^-1PBS缓冲液的反应体系中，得到反应体系(共0.5mL)，于30℃振荡反应30min；反应结束后，取样进行HPLC分析，同时以(S)-1-(1-萘基)-乙醇标准品、(R)-1-(1-萘基)-乙醇标准品以及不加酶获得的反应液做对照，确定产物出峰时间，并以此为依据获得反应液中(S)-1-(1-萘基)-乙醇的摩尔浓度以及(R)-1-(1-萘基)-乙醇的摩尔浓度；

ee值的计算方法如下：

As：反应液中(S)-1-(1-萘基)-乙醇的摩尔浓度；A_R：反应液中(R)-1-(1-萘基)-乙醇的摩尔浓度。

支链氨基酸转氨酶不对称还原N-3-Boc-哌啶酮的立体选择性：

取50μL蛋白浓度为1mg/mL的纯酶液加入含有2mmol·L^-1N-3-Boc-哌啶酮、6mmol·L^-1NAD(P)H、100mmol·L^-1PBS缓冲液的反应体系中，得到反应体系(共0.5mL)，于30℃振荡反应30min；反应结束后，取样进行HPLC分析，同时以(S)-N-3-Boc-哌啶醇标准品、(R)-N-3-Boc-哌啶醇标准品以及不加酶获得的反应液做对照，确定产物出峰时间，并以此为依据获得反应液中(S)-N-3-Boc-哌啶醇的摩尔浓度以及(R)-N-3-Boc-哌啶醇的摩尔浓度；

ee值的计算方法如下：

As：反应液中(S)-N-3-Boc-哌啶醇的摩尔浓度；A_R：反应液中(R)-N-3-Boc-哌啶醇的摩尔浓度。

支链氨基酸转氨酶不对称还原4-氯苯基-2-吡啶基甲酮的立体选择性：

取50μL蛋白浓度为1mg/mL的纯酶液加入含有2mmol·L^-14-氯苯基-2-吡啶基甲酮、6mmol·L^-1NAD(P)H、100mmol·L^-1PBS缓冲液的反应体系中，得到反应体系(共0.5mL)，于30℃振荡反应30min；反应结束后，取样进行HPLC分析，同时以(S)-4-氯苯基-2-吡啶基甲醇标准品、(R)-4-氯苯基-2-吡啶基甲醇标准品以及不加酶获得的反应液做对照，确定产物出峰时间，并以此为依据获得反应液中(S)-4-氯苯基-2-吡啶基甲醇的摩尔浓度以及(R)-4-氯苯基-2-吡啶基甲醇的摩尔浓度；

ee值的计算方法如下：

As：反应液中(S)-4-氯苯基-2-吡啶基甲醇的摩尔浓度；A_R：反应液中(R)-4-氯苯基-2-吡啶基甲醇的摩尔浓度。

实施例1：支链氨基酸转氨酶的制备

具体步骤如下：

化学合成编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2(具体可见表1)所示的支链氨基酸转氨酶的基因(基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体可见表1)；将获得的基因与pET-28a(+)质粒经双酶切(BamH I、Xho I)后进行连接，连接产物转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，转化产物涂布于LB固体培养基，于37℃培养8～10h，在LB固体培养基上挑取5个转化子，接入LB液体培养基培养，于37℃培养10h后提取质粒，将提取得到的质粒进行酶切验证(验证结果见图1)以及测序验证，验证正确即获得重组质粒pET28a-BlBTA(质粒图谱见图2)以及重组菌E.coli BL21/pET28a-BlBTA。

将获得的重组菌E.coli BL21/pET28a-BlBTA涂布于LB固体培养基，于37℃培养8～10h，获得单菌落；挑取单菌落接入LB液体培养基，于37℃培养12～14h，获得种子液；将种子液按照2％(v/v)的接种量接入LB液体培养基，于37℃、200rpm培养至OD₆₀₀达到0.6～0.8后，在发酵液中加入终浓度为0.2mM的IPTG，于25℃继续摇瓶诱导培养10h，得到发酵液；将发酵液于4℃、8000rpm离心5min后，收集细胞；将收集得到的细胞悬浮于磷酸钾缓冲液(100mmol·L^-1，pH 7.0)中进行超声破碎，收集细胞破碎上清液和沉淀。

将细胞破碎上清液和沉淀进行SDS-PAGE分析，分析结果见图3。

由图3可知，细胞破碎上清液在37kDa处有一条与理论分子量一致的条带，说明支链氨基酸转氨酶表达成功。

表1支链氨基酸转氨酶的氨基酸序列以及编码支链氨基酸转氨酶的基因的核苷酸序列

实施例2：支链氨基酸转氨酶对前手性芳香酮的酶活以及支链氨基酸转氨酶不对称还原前手性芳香酮的立体选择性

具体步骤如下：

将实施例1获得的细胞破碎上清液使用亲和柱HisTrap FF crude(镍柱)进行纯化，纯化过程如下：先使用缓冲液A(20mmol·L^-1磷酸钠，500mmol·L^-1NaCl，20mmol·L^-1咪唑，pH 7.4)平衡镍柱，并实施例1获得的细胞破碎上清液过镍柱，继续使用缓冲液A洗脱未与镍柱结合的蛋白，待穿透峰流尽后，从缓冲液A到缓冲液B(20mmol·L^-1磷酸钠，500mmol·L^-1NaCl，500mmol·L^-1咪唑，pH 7.4)进行梯度洗脱，将结合到镍柱上的重组蛋白洗脱下来，获得支链氨基酸转氨酶的纯酶液。

将获得的纯酶液进行SDS-PAGE分析，分析结果见图3。

由图3可知，纯酶液在37kDa处有一条与理论分子量一致的单条带，说明亲和柱HisTrap FF crude(镍柱)纯化效果好，纯酶液中的杂蛋白较少。

检测支链氨基酸转氨酶对前手性芳香酮的比酶活，检测结果为：支链氨基酸转氨酶对1-萘乙酮(结构见图4)的比酶活为4.40±0.16U·g^-1、对N-3-Boc-哌啶酮(结构见图5)的比酶活为24.73±4.73U·g^-1、对4-氯苯基-2-吡啶基甲酮(结构见图6)的比酶活为3.26±0.70U·g^-1，说明支链氨基酸转氨酶表现出较广的底物谱，且对多种前手性芳香酮的比酶活高，可用于不对称还原多种前手性芳香酮生成多种手性芳香醇。

检测支链氨基酸转氨酶不对称还原前手性芳香酮的立体选择性，检测结果为：支链氨基酸转氨酶不对称还原1-萘乙酮(支链氨基酸转氨酶不对称还原1-萘乙酮生成(S)-1-(1-萘基)-乙醇的反应流程见图7，反应液中产物(S)-1-(1-萘基)-乙醇的HPLC图谱见图8)的立体选择性>99％(S)、不对称还原N-3-Boc-哌啶酮的立体选择性>99％(S)、不对称还原4-氯苯基-2-吡啶基甲酮的立体选择性>99％(R)，说明支链氨基酸转氨酶表现出较广的底物谱，且不对称还原多种前手性芳香酮生成多种手性芳香醇的立体选择性高，可用于不对称还原多种前手性芳香酮生成多种手性芳香醇。

实施例3：支链氨基酸转氨酶的酶学性质

具体步骤如下：

1、支链氨基酸转氨酶的最适pH

配制浓度为100mmol·L^-1的柠檬酸钠缓冲液(pH 5.0～6.0)、浓度为100mmol·L^-1的PBS缓冲液(pH 6.0～8.0)以及浓度为100mmol·L^-1的Gly-NaOH缓冲液(pH8.0～10.0)代替支链氨基酸转氨酶对前手性芳香酮的酶活的测定方法中的缓冲液，以1-萘乙酮为底物，测定实施例2获得的支链氨基酸转氨酶在不同pH下对前手性芳香酮的比酶活，以比酶活最高的为100％，其余比酶活与之相比计算相对酶活，以考察实施例2获得的支链氨基酸转氨酶的最适作用pH(检测结果见表2)。

由表2可知，实施例2获得的支链氨基酸转氨酶的最适作用pH为7。

表2实施例2获得的支链氨基酸转氨酶在不同pH下的相对酶活

2、支链氨基酸转氨酶的最适温度

以1-萘乙酮为底物，分别在20～50℃的条件下测定实施例2获得的支链氨基酸转氨酶的纯酶在不同温度下对前手性芳香酮的比酶活，以比酶活最高的为100％，其余比酶活与之相比计算相对酶活，以考察实施例2获得的支链氨基酸转氨酶的最适作用温度(检测结果见表3)。

由表3可知，实施例2获得的支链氨基酸转氨酶的最适作用温度为30℃。

表3实施例2获得的支链氨基酸转氨酶在不同pH下的相对酶活

温度	相对活力
		20	45.21％±3.98％
25	48.79％±4.08％
		30	100.00％±2.08％
35	84.81％±5.04％
		40	53.73％±4.15％
50	43.27％±8.05％

实施例4：(S)-1-(1-萘基)-乙醇的生产

具体步骤如下：

选择实施例2获得的支链氨基酸转氨酶BlBTA以5g/L的添加量添加至2mL的分别含有2mM、10mM、20mM 1-萘乙酮的100mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)中(除1-萘乙酮外，磷酸钾缓冲液中还含有20mMD-葡萄糖、2mMNAD(P)H、5U/mL葡萄糖脱氢酶GDH)，在30℃、pH 7.0、200rpm条件下反应24h，得到反应液。

分别检测实施例2获得的支链氨基酸转氨酶不对称还原1-萘乙酮生成(S)-1-(1-萘基)乙醇的立体选择性和转化率，检测结果见表4。

由表4可知，实施例2获得的支链氨基酸转氨酶BlBTA可很好的不对称还原不同浓度的前手性芳香酮生成手性芳香醇。

表7支链氨基酸转氨酶BlBTA催化1-萘乙酮的不对称还原

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种支链氨基酸转氨酶作为还原酶的应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 999

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgacagcgg gaaaacgggt tcccgcatca tcaattttta atcgtttaaa gcgttcattt 60

acaacagaaa ggtgtgctag agggatgggg gaccagaaag accagtggat cttcctaaac 120

gacaaactcg ttaaaaaaga agacgctaaa atatcagtct atgatcacgg atttttatac 180

ggggacggcg tgtttgaagg gatcagggta tacgacggca acatcttcag aatgcaagag 240

cacatggacc gcctctacga ttctgcgaga tcgatcatgc tggagattcc atatccacag 300

gaagaactga cacagcacgt actcaaaaca gtcgaaaaaa acgggctgaa agacgcttac 360

atccgcttgg tcgtttcaag aggagcaggt gacctcggac tcgatccaaa caattgttca 420

aacccgagtg tcatcataat tgtcgaacca ttggcaatat tcccgaaaca tttatatgaa 480

acggggattg acattgttac ggttccgaca agaaggaaca gacccgatgt gctgagccct 540

aaagtaaaat cgctgaacta cttaaacaat attcttgtcc ggatcgaggc gcatatggcg 600

ggtgtgacgg aagcgctcat gctcaatgat caaggctatg tcgccgaagg gtctgcggat 660

aacgtattta tttataaaaa cggaaagctc ttgacgcctc cgggctatat cggagcgctt 720

gaaggaatca cccggaatgc catcatcgaa atagcgcgag agctcggcta tgaagtgaaa 780

gaagagccgt ttacccgcca tgacgtatac acagccgagg aagtgttttt aaccggaacg 840

gctgcagaag tcatcgcggt cgtaaaagtt gacggccgca agatcgggga cggcaaaccg 900

ggagtccaca caaaccggat gcttgaaaag ttccgcgagc gcgtcgtccg tgaagggtta 960

aaagtcagcc tcaaagatca aagcttaagt gtcagttga 999

<210> 2

<211> 332

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Thr Ala Gly Lys Arg Val Pro Ala Ser Ser Ile Phe Asn Arg Leu

1 5 10 15

Lys Arg Ser Phe Thr Thr Glu Arg Cys Ala Arg Gly Met Gly Asp Gln

20 25 30

Lys Asp Gln Trp Ile Phe Leu Asn Asp Lys Leu Val Lys Lys Glu Asp

35 40 45

Ala Lys Ile Ser Val Tyr Asp His Gly Phe Leu Tyr Gly Asp Gly Val

50 55 60

Phe Glu Gly Ile Arg Val Tyr Asp Gly Asn Ile Phe Arg Met Gln Glu

65 70 75 80

His Met Asp Arg Leu Tyr Asp Ser Ala Arg Ser Ile Met Leu Glu Ile

85 90 95

Pro Tyr Pro Gln Glu Glu Leu Thr Gln His Val Leu Lys Thr Val Glu

100 105 110

Lys Asn Gly Leu Lys Asp Ala Tyr Ile Arg Leu Val Val Ser Arg Gly

115 120 125

Ala Gly Asp Leu Gly Leu Asp Pro Asn Asn Cys Ser Asn Pro Ser Val

130 135 140

Ile Ile Ile Val Glu Pro Leu Ala Ile Phe Pro Lys His Leu Tyr Glu

145 150 155 160

Thr Gly Ile Asp Ile Val Thr Val Pro Thr Arg Arg Asn Arg Pro Asp

165 170 175

Val Leu Ser Pro Lys Val Lys Ser Leu Asn Tyr Leu Asn Asn Ile Leu

180 185 190

Val Arg Ile Glu Ala His Met Ala Gly Val Thr Glu Ala Leu Met Leu

195 200 205

Asn Asp Gln Gly Tyr Val Ala Glu Gly Ser Ala Asp Asn Val Phe Ile

210 215 220

Tyr Lys Asn Gly Lys Leu Leu Thr Pro Pro Gly Tyr Ile Gly Ala Leu

225 230 235 240

Glu Gly Ile Thr Arg Asn Ala Ile Ile Glu Ile Ala Arg Glu Leu Gly

245 250 255

Tyr Glu Val Lys Glu Glu Pro Phe Thr Arg His Asp Val Tyr Thr Ala

260 265 270

Glu Glu Val Phe Leu Thr Gly Thr Ala Ala Glu Val Ile Ala Val Val

275 280 285

Lys Val Asp Gly Arg Lys Ile Gly Asp Gly Lys Pro Gly Val His Thr

290 295 300

Asn Arg Met Leu Glu Lys Phe Arg Glu Arg Val Val Arg Glu Gly Leu

305 310 315 320

Lys Val Ser Leu Lys Asp Gln Ser Leu Ser Val Ser

325 330

Claims

1.一种支链氨基酸转氨酶作为还原酶的应用，其特征在于，所述支链氨基酸转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.如权利要求1所述的一种支链氨基酸转氨酶作为还原酶的应用，其特征在于，编码所述支链氨基酸转氨酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.如权利要求1或2所述的一种支链氨基酸转氨酶作为还原酶的应用，其特征在于，所述还原酶的应用包括将酮还原为手性醇或将酮还原为非手性醇。

4.一种生产手性醇的方法，其特征在于，所述方法为将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的支链氨基酸转氨酶添加至含有酮的反应体系中进行反应，得到反应液；将反应液进行提取，得到手性醇。

5.如权利要求4所述的一种生产手性醇的方法，其特征在于，所述反应体系中含有辅酶。

6.如权利要求5所述的一种生产手性醇的方法，其特征在于，所述辅酶为NAD(P)H和/或NADH。

7.如权利要求4-6任一所述的一种生产手性醇的方法，其特征在于，所述反应的温度为25～35℃、pH为6.5～7.5。

8.氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的支链氨基酸转氨酶、编码氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示的支链氨基酸转氨酶的基因、含有编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的支链氨基酸转氨酶的基因的重组质粒、携带编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的支链氨基酸转氨酶的基因的宿主细胞以及权利要求4-7任一所述的生产手性醇的方法在生产手性醇中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述重组质粒的载体为pET载体。

10.如权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述宿主细胞为细菌或真菌、植物细胞或动物细胞。