JPH10502531A - デヒドロゲナーゼを用いる２−ヒドロキシカルボン酸のキラル合成 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ラクトバシルス・デルブルエッキイ亜種ブルガリクスから入手し得る酵素であって、３−位が非置換で４−位または高位が置換されていてもよい２−ケト酸の(Ｒ)−ヒドロキシ誘導体の生成を触媒する２−ヒドロキシカルボン酸デヒドロゲナーゼが特に開示される。

Description

【発明の詳細な説明】 デヒドロゲナーゼを用いる２−ヒドロキシ カルボン酸のキラル合成 この発明はキラル合成に関する。特にこの発明は、ラクトバシルス・デルブル エッキイ(Ｌactobacillus delbrueckii)亜種ブルガリクス(Ｂulgaricus)から入 手される酵素であってクローン化される広範な特異性を有する２−ヒドロキシカ ルボン酸デヒドロゲナーゼ、その配列変異体(sequence variants)および２−ヒ ドロキシ基に関する(Ｒ)−異性体の製造触媒としての該酵素の使用に関する。 以下に説明するように、本発明にはいくつかの観点がある。第一に、本発明に よる酵素は上記の入手源から常套法によって単離されるが、例えば、大腸菌系に おけるクローニングによって大量に生産される。第二に、このようにして得られ る酵素は(Ｒ)−２−ヒドロキシ酸の製造に有用であるが、基質による酵素活性の 阻害を抑制するように変性されたその配列変異体はさらに別の利点をもたらす。 このような変異体は部位特異的突然変異誘発(site directed mutagenesis)に よって調製してもよい。第三に、本発明による酵素は３−位が非置換で４位また は高位が脂肪族基、芳香族基、ヘテロ環基および含窒素基を含む広範囲の置換基 によって置換されていてもよい２−ケト酸の(Ｒ)−ヒドロキシ誘導体および例え ばエステルの製造触媒として使用してもよい。 本発明の一つの態様においては、ラクトバシルス・デルブルエッキイ亜種ブル ガリクスから入手され得る酵素であって、３−位が非置換で４−位または高位が 置換されていてもよい２−ケト酸の(Ｒ)−ヒドロキシ誘導体の生成を触媒する２ −ヒドロキシカルボン酸デヒドロゲナーゼが提供される。 本発明の別の態様においては、ラクトバシルス・デルブルエッキイ亜種ブルガ リクスからの単離またはクローニングを含む該酵素の製造法が提供される。 本発明の他の態様においては、基質による酵素活性の阻害を抑制するような変 性法によって製造してもよい該酵素の配列変異体が提供される。例えば、一つの 好ましい態様においては、ヒスチジン２０６はグルタミンによって置換させても よい。 本発明のさらに別の態様においては、部位特異的突然変異誘発を含む該変異体 の製造法が提供される。 本発明のさらに別の態様においては、該酵素または上記方法によって調製して もよい該配列変異体を２−ケト酸と接触させることを含む２−ケト酸の(Ｒ)−ヒ ドロキシ誘導体の製造法が提供される。好ましくは、pＨのような製造条件は最 大生成速度が得られるように調整する。 例えば、本発明による酵素またはスタフィロコックス・エピデルミジス(Ｓtap hylococcus epidermidis)およびその他の入手源から得られるＬＤＨは３−シク ロペンチル−２(Ｒ)−ヒドロキシプロパン酸の製造に使用してもよい。 本発明の特徴と範囲を概括したが、以下、本発明をさらに詳述する。 キラル２−ヒドロキシ酸の合成は極めて重要である。この種の化合物は、Ｃ− ２におけるキラリティーを保持する種々の化合物に変換してもよい用途の広い合 成中間体である。この種の化合物にはエポキシド、アルキルエステル、ヒドラジ ニルエステル、α−Ｎ−アルコキシアミノエステルおよびα−アミノエステルが 含まれる。２−位における求核置換を含む反応は、その場で生成して選択された 求核剤と直接反応する対応する２−トリフレートエステルを経由しておこなうの が最適である。 キラル２−ヒドロキシ酸および側鎖に付加的なプロキラル(prochiral)官能基 を有するエステルは、２つ以上のキラル中心を有する化合物の合成を可能にする 。Ｃ−２のヒドロキシル基はこのための分子内調整要素となり、プロキラル官能 基の立体選択的変換を促進する。 キラル形の２−ヒドロキシ酸とエステルの合成法の開発のために多くの研究が なされており、例えば、以下に説明するような化学的および酵素的方法が挙げら れる。化学的方法の主要な問題点は、水の影響を受けやすい試薬を重要な変換過 程において低温で使用しなければならないという技術的なものである。生成物の キラリティーは化学量論的な意味において、キラル助剤に起因するか(基質制御) 、またはバルキーなキラル還元剤に起因する(試薬制御)。キラルボランカリウム ９−０−ＤＩＰＧＦ−９−ＢＢＮＨ[ブラウンら、Ｊ.Ｏrg．Ｃhem．、第５１巻 、 第３３９６頁〜第３３９８頁(１９８６年)参照]を用いる２−ケトエステルの非 対称還元には化学量論量の錯体還元剤が必要であり、現在では(Ｓ)−絶対配置を 有する２−ヒドロキシエステルが得られているにすぎない。オキサジリジンオキ シダントを用いるキラルオキサゾリドンエノレートのヒドロキシル化[エバンス ら、Ｊ.Ａm．Ｃhem．Ｓoc．、第１０７巻、第４３４６頁〜第４３４８頁(１９８ ５年)参照]の場合には、ホモキラル２−ヒドロキシエステルを得るために、メタ ノリシスの前に２−ヒドロキシイミドのクロマトグラフィーによる分割が必要で ある。この方法によるヒンダード誘導体(例えば、ＲがＰrまたはt-Ｂuである誘 導体)の収率は低い。キラル２−アルコキシカルバニオンのカルボキシル化[チャ ンおよびチェン、Ｔet．Ｌett．、第３１巻、第１９８５頁〜第１９８８頁(１９ ９０年)参照]には化学量論量の高価な還元剤(Ｒ)−ＢＩＮＡＰ−Ｈの使用とトラ ンスメタレーション後の危険なスズ残渣の廃棄が必要である。キラルオキサザボ ロリジンによって触媒されるエノンの鏡像体選択的還元の場合には[コレイおよ びバクシ、Ｔet．Ｌett．、第３１巻、第６１１頁〜第６１４頁(１９９０年)参 照]、上記の方法とは対照的に、キラリティーは触媒源に起因する。触媒の光学 鏡像体により、反対の鏡像体の相補的合成経路が得られる。４種の化学的変換を 含む方法には、最初に生成するキラルアルコールの２−ヒドロキシエステルへの 変換が必要であり、これには明らかにコスト高と収率低下が伴う。 キラル２−ヒドロキシ酸を生成する酵素の既知の用法には(Ｒ)−オキシニトリ ラーゼおよびリパーゼに基づく合成経路が含まれる。加水分解によるキラルシア ノヒドリンの(Ｒ)−オキシニトリラーゼを触媒とする合成法[ツァイグラーら、 Ｓynthesis、第５７５頁〜第５７８頁(１９９０年)参照]によれば、(Ｒ)−２− ヒドロキシ酸のみが得られる。可変的な鏡像体選択率が低い(７４％)この酵素反 応には毒性の高い無水シアン化水素の調製が必要である。シュードモナス・フル オレスセンス(Ｐseudomonas fluorescens)リパーゼによって触媒されるラセミ 体２−ヒドロキシエステルの分割法[カラリチスら、Ｊ.Ｑrg．Ｃhem．、第５５ 巻、第８１２頁〜第８１５頁(１１９０年)参照]は、酵素を用いる多くの動的異 性体分割法の一つである。この方法には、特定の鏡像体の収率が最大で５０％で あるという本質的欠点がある。実際は、光学的に高い純度を得るためには変換率 は注意深く制御されなければならないので収率はさらに低下する。 １９５０年以来、(Ｒ)−ヒドロキシ酸デヒドロゲナーゼによって触媒される２ −オキソカルボン酸の還元については多くの研究がなされている。この種の研究 のために、種々のバクテリアから単離された酵素が使用されている。特定の２− オキソ酸に対する特定の酵素活性はＵＶスペクトロスコピーによって測定し、ミ ハエリス定数(Ｋm)と触媒回転(k_cat)によって定量化してもよい。 上記のアッセイ法は、酸化補因子ＮＡＤ に比べて還元補因子ＮＡＤＨが３４ ０nmにおいて強い吸光度を示すことおよびＮＡＤＨの濃度と共に吸光度が低減す ることに基づく。ＮＡＤＨの濃度に直接比例する吸光度の低減を利用してオキソ 酸の酵素的還元速度を評価してもよい。この方法は酵素の純度およびＮＡＤＨ活 性の酸化が所望の生成物の生成に関連するという仮定を含むいくつかの要因によ って制限される。 生体触媒還元の重要な要因は非常に高い鏡像体の純度と高い化学的収率である 。文献に記載されている大部分の反応においてはこれらの要因については詳述さ れていないので、該要因の有用性について例示的に説明する。生体触媒還元反応 を工業的に利用する場合には、さらに別の基準、例えば、他の方法に比べて高い 費用効果等が満たされなければならない。この基準は一般的には、高濃度基質の 酵素による還元速度と長期安定性に関係する。 多くの基質は光学的試験によって同定される。数種の酵素の場合には、生成す る２−ヒドロキシ酸の鏡像体選択率を決定するために分取的な実験をおこなった 。この分取のための反応の場合には、触媒量のＮＡＤＨを再生系と併用する。こ の反応には第二の酵素[通常はフォーメートデヒドロゲナーゼ(ＦＤＨ)]が必要で あり、既に報告されているようにフォーメートイオンの二酸化炭素への酸化にお いてＮＡＤ を利用する[シェークドおよびホワイトサイズ、Ｊ.Ａm．Ｃhem．Ｓ oc．、第１０２巻、第７１０４頁〜第７１０５頁(１９８０年)参照]。 (Ｒ)−絶対配置を有する２−ヒドロキシ酸を得るために、Ｒ−ラクテートデヒ ドロゲナーゼ(Ｒ−ＬＤＨ)によって触媒される２−オキソ酸の還元反応が研究さ れている。最近の研究はロイコノストック・メセンテロイデス(Ｌeuconostoc m esenteroides)から得られるＲ−ＬＤＨ(ＬＭ−Ｒ−ＬＤＨ)およびスタフィロコ ックス・エピデルミディス(Ｓtaphylococcus epidermidis)から得られるＲ−Ｌ ＤＨ(ＳＥ−Ｒ−ＬＤＨ)に関心が集中している。わずかに１０種の化合物のみが 測定可能な活性を示すことが知られており、このうち以下の表１に示す５種の化 合物のみが分取規模の反応において還元されている。 文献１:シモンら、Ａppl．Ｂiochem．Ｂiotechnol．、第２２巻、第１６９頁 〜第１７９頁(１９８９年) 文献２:キムおよびキム、Ｊ.Ｃhem．Ｓoc．Ｃhem．Ｃommun．、第３２６頁〜 第３２７頁(１９９１年) 文献３:米国特許第５,０９８,８４１号明細書 本発明の場合には、光学的実験と分取規模の還元反応を本発明による酵素を用 いて利用することによって酵素の基質特異性を予測して確認した。その結果、該 酵素は疎水性閉鎖部位からクレフト(cleft)によって分離された触媒中心を有し ており、該クレフトは該疎水性閉鎖部位中の４−位の炭素原子から離れていて３ −位の炭素原子を包囲していることが判明した。従って、この酵素は実用的にも 動力学的実験によっても広範な基質特異性を示すことが証明され、該基質特異性 は、４−位または高位に存在する構造と分子組成が広範囲に異なる極めて多くの 置換基に適合し得る。この酵素の結合ポケット(binding pocket)に対する二区 画モデルを図１に示す。動力学的測定によって決定された本発明による酵素の基 質特異性を以下の表２に示す。 ２−オキソカルボン酸デヒドロゲナーゼをキラル還元用触媒として使用するこ とは、従来はわずかに限定された範囲の２−オキソカルボン酸基質のみに制限さ れていた。その他の化合物は特定の分光光度的実験に付され、酵素活性によって 還元されるものと推論されていた。これらの反応の成功に関する分析はおこなわ れていない。基質として研究された化合物は、２−オキソカルボン酸デヒドロゲ ナーゼを用いる有用な還元反応の可能性の限界にあるものと予想されていた。 ホモキラル２−ヒドロキシ酸は、基質特異性が古典的好奇心以上の要求に基づ く方法に必要な回転速度の予想された制限を克服するのに十分に広範であるなら ば、２−オキソカルボン酸デヒドロゲナーゼを用いて直接的に製造することがで きた。本発明は、望ましい範囲の基質特異性と著しく改良された回転速度を示す 酵素およびより有用な利点を有するその配列変異体を提供する。 前述のように、本発明は、例えば、以下に例示するようなホモキラル２−ヒド ロキシカルボン酸またはその塩類の製造手段を提供する(この種の化合物は高収 率で、しかも９８％よりも高いeeで調製することができる)： この種の２−(Ｒ)−ヒドロキシカルボン酸またはこれらの塩類(例えば、ナト リウム塩もしくはカリウム塩)の調製の結果を以下の表３に示す。ラクトバシル ス・デルブルエッキイ亜種ブルガリクスから得られた(Ｒ)−２−ヒドロキシ酸デ ヒドロゲナーゼをこれらの化合物の調製に用いた。このような還元はリサイクリ ングＮＡＤＨ反応と共におこなうことが多い。 前述の説明から明らかなように、ラクトバシルス・デルブルエッキイ亜種ブル ガリクスから得られる本発明による２−ヒドロキシ酸デヒドロゲナーゼを用いる 鏡像体選択的還元用の２−オキソカルボン酸基質が本発明において同定された。 本発明による酵素は、以下の表４に示す配列情報によってさらに定義される。 さらに、２−位に(Ｒ)−絶対配置を有する２−ヒドロキシ酸を単離してその特 性を評価するために分取規模の還元反応をおこなった。これらの化合物はラクト バシルス・デルブルエッキイ亜種ブルガリクスからの遺伝子によって発現された Ｒ−２−ヒドロキシ酸デヒドロゲナーゼおよび標準的フォーメート／フォーメー トデヒドロゲナーゼを用いて補因子ＮＡＤＨをその場でリサイクルさせる還元に よって調製した。いずれの反応の場合も、最適pＨは希塩酸を定期的に添加する ことによって維持した。 還元の立体選択性は、(＋)−ＭＰＴＡモスヘア誘導体[デールら、Ｊ.Ｏrg．Ｃ hem．、第３４巻、第２５４３頁〜第２５４９頁(１９６９年)参照]と比較のため の標準ラセミ体の¹Ｈ−ＮＭＲおよび¹⁹Ｆ−ＮＭＲスペクトロスコピー並びに毛 管ＧＣ分析によって決定した。この方法は２−ヒドロキシ酸誘導体のキラル分析 に関する標準的文献記載のプロトコルに基づくものであり、０.５％以下の少な いジアステレオ異性体を十分に検出できる感度である。モスヘア誘導体は、２− ヒドロキシ酸をエーテルジアゾメタンを用いてエステル化した後、(＋)−ＭＴＰ Ａ−Ｃlを用いてアシル化することによって調製した。この酵素還元に対しては 、基質は遊離酸に対する溶解性と安定性を改良するために塩形態で使用した。 ラクトバシルス・デルブルエッキイ亜種ブルガリクスからの広範な 基質特異性を有する２−(Ｒ)−ヒドロキシ酸デヒドロゲナーゼ [ 同義語;２−(Ｒ)−ヒドロキシ酸:ＮＡＤ−オキシドレダクターゼ] の調製 この酵素のための遺伝子はＬ．ブルガリクス(菌株ＬＭＧ６９０１＝ＮＣＩＢ １１７７８)からクローンpＧＩＮ００３を経て単離した[バーナードら、ＦＥＢ Ｓ Ｌett．、第２９０巻、第６１頁〜第６４頁(１９９１年)参照]。終止コドン の次の合成的ＢspＨＩ部位とＳstＩ部位との間の１kbフラグメントをポリメラー ゼ連鎖反応によって増幅させた後、ＮcoＩ−ＳstＩ消化pＯＴＳＮco１２プラス ミドに結合させた。このプラスミドはpＧＩＮ１１３と呼ばれており、大腸菌Ａ Ｒ５８の形質転換に用いた。ここで用いた２−(Ｒ)−ヒドロキシ酸デヒドロゲナ ーゼは前記の表４に示すアミノ酸配列を有する。表４に示す配列またはヌクレオ チド配列データ(ＧenＢankへの登録番号:Ｘ６５２２２)と９０％以上の同一性を 有する(Ｒ)−ヒドロキシ酸デヒドロゲナーゼも上記反応に使用してもよい。 酵素の一般的な精製法は次の通りである[バーナードら、Ｅur．Ｊ．Ｂiochem ．、第２２４巻、第４３９頁〜第４４６頁(１９９４年)参照]:ルリア肉汁中で増 殖させたセルラインＡＲ５８[pＧＩＮ１１３]の培養物(２リットル)から細胞(湿 潤重量:２１.１g)を収集した。この培養細胞を４２℃で３時間誘発させた後、３ ７℃で一夜増殖させ、次いで遠心分離(６０００Ｇ)によって細胞を収集した。固 まった細胞を５０mＭトリエタノールアミン緩衝液(ＴＥＡ)(pＨ６.５)に再懸濁 させ、これにＤＮＡseＩ(ベーリンガー・マンハイム社製グレードIIの酵素)３mg を添加した後、懸濁液を音波処理に付した。細胞残渣を３００００Ｇで４５分間 の遠心分離処理に付すことによって分離した。上澄み液を５０mＭクエン酸ナト リウム緩衝液(pＨ４.５)に対する透析処理に一夜付した。沈殿物は４℃での遠心 分離処理(３００００Ｇ;４５分間)によって除去した。透明溶液をＳ−セファロ ースクロマトグラフィーカラムを用いて処理した。活性酵素は保持されず、再前 部に出現した。酵素溶液はＴＥＡに対する透析処理に１８時間付した後、Ｑ−セ ファロースカラム(pＨ６.５)を用いて処理した。酵素は、ＴＥＡ中にＮaＣlを０ 〜０.５Ｍ添加する直線勾配により溶離させた。精製手順を以下の表５にまとめ て示す。 精製された酵素の基質特異性は、種々の２−ケト酸(前記の表２参照)の還元の 動力学によって測定した。野生型酵素の場合には、ピルベートとケトイソバレレ ート以外の全ての基質について基質阻害がみられた。Ｌ．ブルガリクスからのＲ −ヒドロキシ酸デヒドロゲナーゼの好ましい基質は、３−位の炭素原子が疎水性 の「尾」で置換された３Ｃ２−ケトカルボキシル「頭」を含む共通の構造的特徴を有 しており、例えば、シクロペンチルメチルピルベートが好ましい例である。より 強い疎水性の「尾」を有する基質(ケトカプロエート、ケトイソカプロエート、フ ェニルピルベート、ケトバレレート)は、１−炭素置換基のみを有するケトブチ レートよりも好ましい基質である。非置換３Ｃ−プルベートおよび３−炭素分枝 状５Ｃ−ケトイソバレレートはいずれも好ましいものではない。このような知見 は、酵素の活性部位の特性を示す図１の作成に利用した。分取規模の実験と動力 学的評価から次のことが明らかとなった。即ち、該酵素はケト酸基質を還元して 芳香族アミン置換基を含むγ−Ｒ基を有して広範な基質特異性を示すＲ−ヒドロ キシ酸を生成させるが、該酵素の分取的有用性は酵素反応に適合する溶剤に対す る基質の溶解性に関係する置換基によって制限されてもよい。 以上、単離およびクローン化した酵素について例示的に説明したので、次に配 列変異体について例示的に説明する。 ＬＢ２ＨＡＤＨのグルタミン２０６変異体 部位特異的突然変異体は次の突然変異誘発性オリゴヌクレオチドおよびプロメ ガ社製の「変更部位突然変異生成」キットを用いてpＧＩＮ１１３[バーナードら、 Ｅur．Ｊ．Ｂiochem．、第２２４巻、第４３９頁〜第４４６頁(１９９４年)参照 ]から調製した： 酵素は野生型に関しては精製した。 上記の方法により、その他の部位特異的突然変異体Ｒ２３５Ｋ、Ｄ２５９Ｎお よびＥ２６４Ｑを調製した。 ４−シクロペンチル−２−ケトブタノエートを基質として用いた場合のk_cat( ０.２mＭ ＮＡＤＨ)は２５s^-1(野生型)および１１５s^-1(Ｑ２０６)であり、Ｋm は８μＭ(野生型)および７０μＭ(Ｑ２０６)であり、Ｋiは２mＭ(野生型)および １００mＭ以上(Ｑ２０６)であり、またν(Ｑ２０６)／ν(野生型)は４５(７０m Ｍ基質)であった。 基質を高濃度(２０mＭ)で形質転換させるこの酵素の利点を図２に示す。図２ はＨ２０６Ｑと他の変異体をＨ２０６(野生型)と比較するものであり、Ｖmaxは Ｈ２０６Ｑによって８倍増大する。従って、このような変異体を利用する場合に は、野生型のものを利用する場合に比べて酵素の使用量が少なく、化学プラント の規模も小さくできるという実用的利点が得られる。 高度に精製した酵素と純粋な基質の使用は、相対的製造特性の優れたインジケ ーターとなる。表２の動力学的データから得られるベンジルピルベートに関する 結果および前記の調製例においては、反応は２５０ユニットの酵素を用いて２４ 時間以内に完結するが、ＷＯ９３／１３２１５号公報に記載のデータによれば、 スタフィロコックス・エピデルミジスから得られるＬＤＨを５００ユニット使用 する場合、反応の完結には７７時間が必要である。３−シクロペンタニル−２( Ｒ)−ヒドロキシプロパン酸の製造反応において、ＲＬＢ２ＨＡＤＨを用いる場 合とスタフィロコックス・エピデルミジスから得られるＬＤＨを用いる場合を比 較したところ、前者の場合には７２時間の反応において収率は９９％であるのに 対し、後者の場合には１２日間の反応において収率は６０％であった。同様に、 保護アミン(Ｒ)−Ｎ−カルボベンゾキシ−４−アミノ−２−ヒドロキシ酪酸の製 造 反応において、ＲＬＢ２ＨＡＤＨを用いる場合とステフィロコックス・エピデル ミジスから得られるＬＤＨを用いる場合の反応完結に必要な時間はそれぞれ１日 および７日であった。 これらの製造データの比較から明らかなように、スタフィロコックス・エピデ ルミジスから得られる２−(Ｒ)−ヒドロキシ酸デヒドロゲナーゼに関する先行技 術(ＷＯ９３／１３２１５号公報および米国特許第５,０９８,８４１号)に比べて 、本発明によるＲＬＢ２ＨＡＤＨは改良された効果を示す。 これらの製造に関するデータは、ＲＬＢ２ＨＡＤＨの広範な基質データと基質 適合性を示す動力学的データを裏付けるものである。 表２および表３に示すように、本発明による酵素における特異的なアミノ酸の 変化とpＨの変化から得られる動力学的特性の分析によれば、酵素機構における 重要な要因、例えば、活性部位ヒスチジンの荷電状態の存在等は基質阻害を最小 限に抑制し、これによって高濃度の生成物が得られる反応条件を簡単化する。 ＬＢ２ＨＡＤＨおよび変異体を用いるケトイソカプロエートの還元 精製酵素を使用することにより、ＶmaxのpＨ依存性の分析は、２−ケトイソカ プロエート(２０mＭ)および補因子(０.２mＭ)を用いておこなった。結果は図２ に示す。この場合、Ｈ２０６Ｑに対するＶmaxの値は、比較を明確にするために １０で割った値で示す。これらのデータから明らかなように、Ｈ２０６Ｑ変異体 の触媒特性は改良されており、また、ＬＢ２ＨＡＤＨの他の配列変異体は類似の 触媒活性で所望の反応を進行させる。以下の表６に示すＬＢ２ＨＡＤＨとＨ２０ ６Ｑの定常状態での速度定数は標準的なストップトフロー法を用いて得られたも のである。 本発明の有用性をさらに以下の実施例によって説明する。 ( Ｒ)−２−ヒドロキシ−４−フェニルブタン酸の合成 ２−オキソ−４−フェニルブタン酸ナトリウム(２００mg;１.０mmol)およびギ 酸ナトリウム(０.１７g;２.５mmol)をトリス緩衝液(５mＭ;pＨは２Ｍ ＨＣlを用 いて７.５に調整した)に溶解させた溶液に、ＮＡＤＨ(１４mg;０.０２mＭ)、ジ チオトレイトール(１Ｍ水溶液５.０μl)、酵母から得られたフォーメートデヒド ロゲナーゼ(１０mg;５Ｕ;ベーリンガー・マンハイム社製)およびラクトバシルス ・デルブルエッキイ亜種ブルガリクスから単離されたＲ−ラクテートデヒドロゲ ナーゼ(１６mg:;２５０Ｕ;以下の調整法参照)を室温下、窒素ガス雰囲気中で該 溶液に順次添加した。この混合物を窒素ガス雰囲気下において２４時間攪拌した [この場合、１Ｍ ＨＣl(０.９ml)を定期的に添加して系のpＨを６〜６.５に維持 した]。反応混合物の体積を真空下で半減させ、系のpＨを２にした後、酢酸エチ ル を用いて処理し(４×７０ml)、次いでブライン(７０ml)で洗浄することによって (Ｒ)−２−ヒドロキシ−４−フェニルブタン酸を白色固体として１７７mg得た( 収率９２％)。テトラクロロメタンからの再結晶により、(Ｒ)−２−ヒドロキシ −４−フェニルブタン酸を無定形の白色固体として得た。標記化合物の融点は１ １３〜１１４℃であり、また、[α]_D ²²値(ｃ＝２.２１、ＥtＯＨ)は−８.４であ った。これに対応するメチルエステルのモスヘア誘導体の¹Ｈ−ＮＭＲおよび毛 管ＧＣ分析によれば、eeが９９.５％よりも高いホモキラル生成物が得られたこ とが判明した。 δ(２７０ＭＨz,ＣＤＣl₃)７.３２−７.１８(５Ｈ,m,５−Ｐh),４.２７(１Ｈ, dd,Ｊ＝８.１,４Ｈ₂,２−Ｈ),２.８３−２.７９(２Ｈ,m,４−Ｈ₂),２.２６−１. ９８(２Ｈ,m,３−Ｈ₂);m／z１８０(m ,９％),１６２(２),１１７(１４),１０５( １００),９１(５７)。 ２−ヒドロキシ−４−フェニル−ブタノエートから調製した(Ｒ)−モスヘア誘 導体の¹Ｈ−ＮＭＲの化学シフト(δ)を以下に示す： ３−シクロペンチル−２−オキソプロパン酸の合成 (１)ＰＰh₃,Ｂr₂,ＣＨ₂Ｃl₂ (２)(ｉ)Ｍg,ＴＨＦ;(ii)ジエチルオキサレート,ＴＨＦ／Ｅt₂Ｏ (３)０.９eq．ＮaＯＨ,Ｈ₂Ｏ／ＥtＯＨ,２４時間 ３−シクロペンタニル−２−オキソプロパン酸(１)は前述のようにして調製し た(約２g)。シクロペンタンメタノール(a)を臭素とトリフェニルホスフィンと反 応させた。溶媒としては最初はニトロベンゼンを使用した。しかしながら、生成 物は¹Ｈ−ＮＭＲによって検出されたが、ニトロベンゼンから分離したので、ジ クロロメタンを用いてシクロペンタンブロモメタン(b)を８２％の収率で回収し た。 ブロミド(b)からのグリニャール試薬の合成とその後のジエチルオキサレート との反応によってα−ケトエチルエステル(c)を８４％の収率で得た(約１.５g) 。水酸化ナトリウムのエタノール溶液(０.９当量)を用いて化合物(c)を加水分解 することによって、所望の化合物(１)のナトリウム塩を白色固体として得た(収 率９５％)。 ＲＬＢ２ＨＡＤＨを用いる触媒還元による３−シクロペンタニル−２(Ｒ)−ヒ ドロキシプロパン酸の合成 ３−シクロペンタニル−２−オキソプロパン酸のナトリウム塩(１)(０.１１lg ;０.６２mmol)およびギ酸ナトリウム(０.０８８g;１.３mmol)を水性トリス緩衝 液(２５ml)に溶解させた溶液を窒素ガスを１.５時間吹き込む脱酸素処理に付し た。次いで、ジチオトレイトール(２μl)、ＲＬＢ２ＨＡＤＨの水溶液(５mg／ml )１ml、フォーメートデヒドロゲナーゼ(１３mg)およびβ−ニコチンアミドアデ ニンジヌクレオチド(１１mg)を順次添加した。混合物を窒素雰囲気下で７２時間 撹拌した。溶液のpＨは希塩酸(０.１Ｍ)の添加によって６〜７に維持した。溶液 のpＨが変化しなくなったときに、１Ｍ硫酸の添加によってpＨを２〜３にした。 混合物を酢酸エチルを用いて抽出し(３×２５ml)、有機相を一緒にし、ブライン (２５ml)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いる乾燥処理に付した後、真空下で 濃 縮することによって化合物(２)を透明オイルとして０.１２９g得た(収率;９８. ８％)。該生成物の特性は次の通りである： [α]_D−１.５０(c２,ＣＨＣl₃);δＨ(２７０ＭＨz;ＣＤＣl₃)５.９０−５.２ ０(１Ｈ,s br,ＣＯＯＨ),４.２７(１Ｈ,dd,Ｊ６.０ ４.８,ＣＨ(ＯＨ)),２.０５ (１Ｈ,sep,Ｊ７.０,ＣＨ),１.９０−１.７０(４Ｈ,m,−ＣＨ₂−),１.６８−１. ３９(４Ｈ,m,−ＣＨ₂−),１.２８−１.１０(２Ｈ,m,−ＣＨ₂−),δＣ(７５ＭＨz ;ＣＤＣl₃)１８０.０,７０.３,４０.６,３６.５,３３.２,３２.４,２５.４,２５ .２;m／z(Ｅ.Ｉ.)１５８(Ｍ ,１.６４％),１１３(３８),９５(１００)および８ ３(４６)． スタフィロコッルス・エピデルミジスからのＬＤＨを用いる対応する反応にお ける生成物の収率は６０％であった(反応時間:１２日間)。 ベンジル３−シクロペンタニル−２(Ｒ)−ヒドロキシプロパノエートの合成 ３−シクロペンタニル−２(Ｒ)−ヒドロキシプロパン酸(２)(０.０４９g;０. ３２mmol)をメタノール／水(９:１;４ml)に加えた溶液のpＨを炭酸セシウムの２ ０％水溶液を用いて処理することによって７に調整した。溶媒を真空下で除去し た後、乾燥ＤＭＦ(２ml)を残渣に添加し、溶媒を真空下で再度除去することによ って化合物(２)のセシウム塩を得た。この塩を乾燥ＤＭＦ(２もり)に懸濁させ、 次いでベンジルプロミド(０.０４９g;３４.２μl;０.２８８mmol)を窒素雰囲気 下(０℃)で滴下し、混合物を０℃で２時間撹拌し、さらに室温で２０時間撹拌し た。溶媒を真空下で除去し、残渣をジエチルエーテル(１５ml)と水(１５ml)に分 配させた。有機相を炭酸水素ナトリウム溶液を用いて洗浄し(３×５ml)、次いで ブラインを用いて洗浄し(２×５ml)、無水硫酸ナトリウムを用いる乾燥処理に付 し、溶媒を真空下で除去した後、フラッシュクロマトグラフィーを用いる精製処 理[シ リカ;石油エーテル(６０〜４０):酢酸エチル＝９：１]に付すことによって化合 物(３)を透明オイルとして０.０４８g得た(収率:６１％)。該生成物の特性は以 下の通りである：[α]_D＋８.５(c４.９,ＣＨＣl₃);δＨ(２７０ＭＨz;ＣＤＣl₃) ７.４０−７.２９(５Ｈ,m,Ｐh),５.２１(２Ｈ,s,ＣＨ ₂Ｐh),４.７０(１Ｈ,s,ＯＨ ),４.２２(１Ｈ,dd,Ｊ,１１.８ ６.７,ＣＨ(ＯＨ)),２.６６(２Ｈ,d,Ｊ６,ＣＨ ₂ Ｃ＝Ｏ),２.００(１Ｈ,sep,Ｊ７.５,ＣＨ),１.８２(２Ｈ,m,−ＣＨ₂−),１. ７８−１.６７(４Ｈ,m,−(ＣＨ₂)₂−),１.１７−１.０３(２Ｈ,m,−ＣＨ₂−);δ Ｃ(７５ＭＨz;ＣＤＣl₃)１７５.５,１２６.９,１２７.６,１２８.５,１２８.９, １２９.０,１２９.１,７０.３,６７.２,６５.３,３６.２,３２.９,３２.２,２５ .０,２４.９;m／z(Ｅ.Ｉ.)２４８(Ｍ ,０.８７％),１８１(２５),１１３(１５), ９１(６０),８４(１００):実測値:Ｍ,２４８.１４２３６８,Ｃ₁₅Ｈ₂₀Ｏ₃計算値 Ｍ ,２４８.１４１２４５). ＲＬＢ２ＨＡＤＨを用いる触媒還元によって得られたベンジル３−シクロペン タニル−２(Ｒ)−ヒドロキシプロパノエートの(Ｒ)−２−メトキシ−２−トリフ ルオロメチル−２−フェニルアセチル(ＭＴＰＡ)誘導体の合成 ベンジル３−シクロペンタニル−２(Ｒ)−ヒドロキシプロパノエート(０.０３ ９g;０.１５５mmol)を乾燥ジクロロメタンに溶解させ、これにピリジン(１２５ μl)、４,４−ジメチル−アミノピリジン(１mg)およびＭＴＰＡＣl(０.０７８g; ５８μl;０.３１mmol)を窒素雰囲気下で添加した。混合物を室温で２０時間撹拌 した。反応混合物にジエチルエーテル(２０ml)を添加して白色沈澱物を形成させ た。この混合物を水(５ml)、硫酸銅飽和水溶液(２×５ml)、炭酸水素ナトリウム 飽和水溶液(５ml)およびブライン(５ml)を用いて順次洗浄し、次いで無水硫酸ナ トリウムを用いる乾燥処理に付した後、溶媒を真空下で除去することによって化 合物(４)を透明オイルとして０.０９１g得た(収率１２６％)。該生成物の特性は 以下の通りである:δＨ(２７０ＭＨz;ＣＤＣl₃)７.６２−７.１１(１０Ｈ,m,Ｐh ),５.２１(２Ｈ,s,−ＣＨ ₂Ｐh),３.６１(３Ｈ,s,−ＯＣＨ ₃),２.２８−１.９８( １Ｈ,m,ＣＨ),１.９４−１.７２(２Ｈ,m,−ＣＨ₂−),１.６０−１.４４(４Ｈ,m, −(ＣＨ₂)₂−),１.４４−１.０１(４Ｈ,m,−(ＣＨ₂)₂−);m／z(Ｅ.Ｉ.)４６４( Ｍ⁺,非検出),３９５(０.４),３７３(０.６),３５７(０.６),２３０(４),２１３( １),１８９(１００),１０５(１６)および９１(８６);δＦ(５００ＭＨz;ＣＤＣl₃ )−７１.４７(ＣＦ₃)e.e.１６１２:１(９９.８％)． スタフィロコックス−エピデルミジスからのＬＤＨを用いて得られた生成物に 対するee分析は９９.５％であった。 ＲＬＢ２ＨＡＤＨを用いる(Ｒ)−Ｎ−カルボベンゾキシ−４−アミノ−ヒドロ キシ酪酸の合成 Ｎ−カルボベンズオキシ−４−アミノ−２−オキソ酪酸ナトリウム(５)(６７m g;０.２５mmol)およびギ酸ナトリウム(１７mg;０.２５mmol)を水性トリス緩衝液 (２０cm³)に溶解させた溶液を窒素ガスを吹き込む脱酸素処理に３０分間付した 。乾燥重量が２mgの酵素ＲＬＢ２ＨＡＤＨを含むトリス緩衝液(０.５cm³)、β− ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(２mg)、フォーメートデヒドロゲナーゼ (２mg)およびジチオトレイトール(１Ｍ;１μl)を添加し、混合物を窒素雰囲気中 、室温下で撹拌した(反応は１日で完結した)。反応中の系のpＨは希塩酸(０.１ Ｍ)の添加によって６.５〜７.０に維持した。系のpＨが変化しなくなったときに 、混合物を真空下で濃縮した。飽和ブライン(５cm³)と濃塩酸(０.５cm³)を添加 し、混合物を酢酸エチルを用いて抽出した(３×２０cm³)。有機相を一緒にし、 無水硫酸ナトリウムを用いる乾燥処理に付した後、真空下で濃縮することによっ て(Ｒ )−Ｎ−カルボベンズオキシ−４−アミノ−２−ヒドロキシ酪酸(６)を灰色がか った白色固体として５５mg得た(収率８９％)。該生成物の特性は以下の通りであ る:m.p.７０.５℃(酢酸エチル-石油エーテル),文献値m.p.７６.５−７８℃(エタ ノール);[α]_D−４.１(c１０.０,クロロホルム,２５℃),文献値[α]_D−５.０(c １,クロロホルム);(実測値％:Ｃ,５６.８;Ｈ,６.１;Ｎ,５.５．Ｃ₁₂Ｈ₁₅Ｏ₅Ｎに 対する計算値Ｃ,５６.９;Ｈ,５.９;Ｎ,５.５);実測値:Ｍ ＋１,２５４.１０２３ .Ｃ₁₂Ｈ₁₆Ｏ₅Ｎに対する計算値Ｍ＋１２５４.１０２８);δＨ１.８８(１Ｈ,m,ＣＨ ＣＨＯＨ),２.０４(１Ｈ,m,ＣＨＣＨＯＨ),３.３７(２Ｈ,m,ＣＨ ₂ＮＨ),４.２ ６(１Ｈ,m,ＣＨＯＨ),５.０７(２Ｈ,s,ＣＨ ₂Ｐh),５.４５(１Ｈ,m,ＮＨ)および ７.３７(５Ｈ,m,Ｐh);δＣ３３.６(ＣＨ₂ＣＨＯＨ),３７.３(ＣＨ₂ＮＨ),６７. ０(ＣＨＯＨ),６８.２(ＣＨ₂Ｐh),１２７.９,１２８.０,１２８.４,１３６.１( Ｐh),１５７.３(ＮＣＯ₂ＣＨ₂Ｐh)および１７７.８(ＣＯ₂Ｈ);m／z(Ｃ.Ｉ.)２５ ４(Ｍ ＋１,１.５％),２１０(１０),１４６(２０),１０２(２３),９１(１００) および７９(３０)． ＲＬＢ２ＨＡＤＨの代わりにスタフィロコックス・エピデルミジスからのＬＤ Ｈを用いる対応する反応は７日間で終了し、化学収率は９３％であった。 上記の手順に準拠して以下の化合物を合成した。 ＲＬＢ２ＨＡＤＨを用いる(Ｒ)−２−ヒドロキシ−４−メチルペンタン酸(８) の合成 ４−メチル−２−オキソ−ペンタン酸のナトリウム塩(７)(１５２mg;１mmol) 、ＲＬＢ２ＨＡＤＨ(１３.８mg;２７６Ｕ)およびＨＣl(１ml;１mmol;１eq．)を 使用し、反応を２４時間おこなうことによって化合物(８)を１１４mg(０.８７mm ol)得た(収率８７％,ee＞９９.５％)。生成物の特性は次の通りである:δＨ¹(２ ７ ０ＭＨZ)ppm:６.６３(１Ｈ,br s,２−ＯＨ),４.２９(１Ｈ,br t,Ｊ＝６.５Ｈz, ２−Ｈ),１.９５−１.８５(１Ｈ,m,４−Ｈ),１.６４−１.６(２Ｈ,m,３−Ｈ₂), ０.９８−０.９５(６Ｈ,２xs,５−Ｈ₃および５'−Ｈ₃)． ( Ｒ)−(２Ｒ)−２−Ｏ(ＭＴＰＡ)−４−メチルペンタン酸メチルエステル(１ ０)の合成 (Ｒ)−２−ヒドロキシ−４−メチルペンタン酸メチルエステル(９)(１７mg;０ .１１７mmol)、(Ｒ)−(＋)−ＭＴＰＡ(６６μl;０.３５１mmol;３eq．)およびピ リジン(２１μl;０.２５７mmol;２.２eq．)を用いて化合物(１０)を３０mg得た( 収率８３％)。該化合物の特性は次の通りである： δＨ¹(４００ＭＨz)ppm:７.６５−７.４１(５Ｈ,m,Ｐh),５.１９(１Ｈ,dd,Ｊ ＝−３.７,１０Ｈz,２−Ｈ)．３.７９(３Ｈ,s,−ＣＯ₂Ｍe),３.６６(３Ｈ,s,Ｏ Ｍe),１.８７−１.８０(１Ｈ,m,４−Ｈ),１.６６−１.５３(２Ｈ,m,３−Ｈ₂),０ ．８４,０.８３(６Ｈ,２xd,Ｊ＝６.４ＨzおよびＪ＝６.４Ｈz,５−Ｈ₃および５' −Ｈ₃);δＦ¹⁹(５００ＭＨz)ppm:−７１.５４(s,ＣＦ₃)．

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:225） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ウィリス，クリスティン・ルイーズ イギリス、ビーエス５・１ティエス、ブリ ストル、キャントックス・クロウズ（番地 の表示なし） スクール・オブ・ケミスト リー、ユニバーシティ・オブ・ブリストル 内 (72)発明者 ジョンセン，ケイジ イギリス、ビーエス６・６ユーエイ、ブリ ストル、チャペル・グリーン・レイン１番 (72)発明者 ヘイトリー，マーティン・ジョン イギリス、ビーエス８・１ティエス、ブリ ストル、キャントックス・クロウズ（番地 の表示なし） スクール・オブ・ケミスト リー、ユニバーシティ・オブ・ブリストル 内

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ラクトバシルス・デルブルエッキイ亜種ブルガリクスから入手され得る酵 素であって、３−位が非置換で４−位または高位が置換されていてもよい２−ケ ト酸の(Ｒ)−ヒドロキシ誘導体の生成を触媒する２−ヒドロキシカルボン酸デヒ ドロゲナーゼ。 ２．ラクトバシルス・デルブルエッキイ亜種ブルガリクスからの単離またはク ローニングを含む請求項１記載の酵素の製造方法。 ３．基質による酵素活性の阻害を抑制するように変性された請求項１記載の酵 素もしくは請求項２記載の製法によって製造される酵素の配列変異体。 ４．Ｈ２０６Ｑ、Ｒ２３５Ｋ、Ｄ２５９ＮおよびＥ２６４Ｑから選択される請 求項３記載の変異隊。 ５．部位特異的突然変異誘発を含む請求項３記載の変異体の製造法。 ６．請求項１記載の酵素、請求項２記載の製法によって製造される酵素、請求 項３もしくは４記載の配列変異体または請求項５記載の製法によって製造される 変異体を２−ケト酸と接触させることを含む２−ケト酸の(Ｒ)−ヒドロキシ誘導 体の製造方法。