KR102022137B1 - 효소적 산화환원 보조인자의 재생 방법 - Google Patents

효소적 산화환원 보조인자의 재생 방법 Download PDF

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Abstract

원 포트 반응으로 산화환원 보조인자 NAD+/NADH 및 NADP+/NADPH 의 효소적 재생 방법이고, 여기서 동일한 반응 배치에서 진행하는 적어도 2개의 효소적으로 촉매화된 산화환원 반응(생성물 형성 반응)의 결과로서, 상기 2개의 산화환원 보조인자 중 하나가 환원된 형태로 다른 하나는 산화된 형태로 각각 축적하고, a) 상기 환원된 보조인자를 그의 원래의 산화된 형태로 재전환시키는 재생 반응에서 산소 또는 식 R1C(O)COOH의 화합물이 환원되고, 및 b) 산화된 보조인자를 그의 원래의 환원된 형태로 재전환시키는 재생 반응에서, 식 R2CH(OH)R3의 화합물이 산화되며 여기서 상기 화합물에서 R1, R2 및 R3는 다른 의미를 갖는 것을 특징으로 한다.

Description

효소적 산화환원 보조인자의 재생 방법{METHOD FOR ENZYMATIC REDOX COFACTOR REGENERATION}
본 발명은, 원 포트 반응에서 산화환원 보조인자 NAD+/NADH 및 NADP+/NADPH의 효소적 재생 방법에 관한 것으로, 여기서 동일한 반응 배치(=생성물 형성 반응)에서 진행하는 적어도 2개의 효소적으로 더 촉매화된 산화환원 반응의 결과로서, 상기 2개의 산화환원 보조인자 중 하나가 환원 형태로 그리고 다른 것은 이것의 산화 형태로 각각 축적한다.
효소적으로 촉매화된 산화환원 반응은 산업적 작동, 예를 들어 키랄 알코올, α-아미노산 및 α-히드록시산의 제조에 사용된다. 산업상 산화환원 반응에서 사용된 효소들의 대다수는 NADH 또는 NADPH와 같은 보조인자를 사용한다. 효소적 산화환원 반응들 중에서, 산화환원 보조인자는 인시츄(in situ ) 보조인자 재생 시스템에 의해 재생된다. 이의 이유는 비싼 보조인자(NAD(P)+/NAD(P)H)를 단지 촉매적 함량으로 사용할 수 있기 때문이다. 적당한 탈수소효소(dehydrogenase) 및 다른 효소들의 이용가능성으로 인하여 그 결과 다양한 보조인자 재생 시스템이 발달한다.
지금까지 서술된 재생 시스템은 효소 결합, 기질-결합, 인비보(살아있는 유기물에서 자연 보조인자 재생 시스템), 광화학, 화학적 또는 전자-효소적인 것으로 분류될 수 있다. 여기 설명된 방법은 효소-결합 재생 시스템에 관한 것이다. 효소-결합 시스템의 장점은 높은 선택성, 다양한 생성물의 제조용 이용가능성 및 보조인자의 높은 재사용율(total turnover number, TTN)이다.
90년대 중반에, 효소-결합 보조인자 재생 시스템을 사용하는 제1 산업적 방법은 톤 단위로 사용되었다. 상기 방법에서, Candida boidinii의 포르메이트 탈수소효소가 사용되었다. 일반적으로 알려진 산업적 방법은 생성물 합성용 산화환원 효소 및 보조인자 재생용 추가 효소를 사용한다.
생성물의 형성 및 보조인자 재생을 위한 2개의 효소적 시스템(동시적으로 또는 연속해서)과 관련된 2개 이상의 효소적 산화환원 반응이, 중간 생성물 분리없이 하나의 반응 배치에서 진행되는 방법은, 이와 구별되어야만 한다. 최근에 그러한 효소적 캐스케이드 반응-여기서 원 포트 반응이라 함-은 많은 주목을 받아왔으며, 이는 그들이 효과적으로 작동 경비, 작동 시간 및 환경적 충격을 줄일 수 있기 때문이다. 게다가, 산화환원 반응의 효소적 캐스케이드는, 종래 화학적 방법에 의해서는 실행이 용이하지 않은 변형을 용이하게 한다.
그러나, 매우 분화된 반응 조건들이 가끔 개별적 변형을 위해 필요하기 때문에, 몇 가지 방법들(산화 및 환원)을 병행 보조인자 재생과 함께 하나의 원 포트 반응으로 동시에 수행하고자는 시도가 있었다. 지금까지는, 관련된 보조인자 재생 시스템과 함께 산화 및 환원 반응을 포함하는 단지 매우 작은 수의 원-포트 시도들이 수행되어 왔다.
문헌 (Advanced Synth. Catal., 2008, Volume 351, Issue 9, p. 1303-1311)에, 7α-히드록시스테로이드 탈수소효소 (HSDH), 7β-HSDH 및 12α-HSDH를 사용하는 원 포트 반응의 실험이 설명되어 있다. 상기 방법에서, 산화, 위치선택적 및 입체선택적 둘다 콜산의 위치 7 및 12에서 수행되었고, 이어서 위치- 및 입체 선택적 환원이 위치 7에서 일어났다. 두 과정 모두에서, 락테이트탈수소효소 (NAD+-종속성) 및 글루코오스 탈수소효소 (NADP+-종속성)가 보조인자 재생 시스템으로 사용되었다. 피루베이트 및 글루코오스가 공기질(cosubtrate)로서 사용되었다. 이 방법은 원래 진짜 원 포트 방법이 목적이었지만, 마지막에는 산화 및 환원 반응이 별도로 수행되었다. 그렇게 진행할 때, 산화적 및 환원적 단계를 칸막이화하는 것은 소위 "티백"-반응기 또는 막 반응기 어느 하나에서 일어난다. 상기 칸막이화하는 것은 NADPH-글루코오스 탈수소효소의 낮은 보조인자 선택성으로 인하여 부산물이 생성되는 것을 피하기 위하여 필요하다. 그러나, 원 포트 반응에서, 글루코오스 탈수소효소 NADP+는 부분적으로 또한 NAD+으로 전환하고, 이는 산화에 영향을 미친다. 설명된 방법에서, 단지 12.5 mM (~0,5%)의 기질 콜산이 사용되었으며, 이로 인하여 생태적 관점에서 상기 방법을 흥미롭지 않게 만든다.
게다가, 원 포트 시스템을 사용하는 중간체로서 프로키랄 케톤을 통해 이차 알코올의 라세미체의 탈라세미화를 수행하고자 하는 시도가 설명되어 있다 (J. Am. Chem. Soc., 2008, Volume 130, p. 13969-13972). 이차 알코올의 탈라세미화는 다른 보조인자 특이성을 사용하여 2개의 알코올 탈수소효소 (S- 및 R-특이적)를 통해 얻어졌다. 상기 시스템에서, NADP는 NADPH 옥시다제(과산화수소 생산)에 의해 재생되었고 NADH는 포르메이트 탈수소효소에 의해 재생되었다. 포르메이트 및 산소는 공기질로 사용되었다. 이 시스템에서, 4개 효소가 산화적 및 환원적 단계의 칸막이화없이 사용되었다. 이 방법의 단점은 0.2~0.5%로 사용된 매우 낮은 농도의 기질이며, 이는 산업적 목적에 부적당하다.
또 다른 원 포트 시스템은 WO 2009/121785 A2에 설명되어 있다. 상기 방법에서, 광학적으로 활성인 이차 알코올의 스테레오아이소머가 케톤으로 산화되고 이어서 대응하는 광학적 대립물로 환원되었으며, 여기서 반대적인 입체 선택성 및 다른 보조인자 특이성을 갖는 2개의 알코올 탈수소효소가 사용되었다. 보조인자는 단지 하나의 추가적인 효소만을 사용하여, 소위, "히드라이드-이송 시스템" 수단으로 재생되었다. 보조인자 재생을 위하여, 포르메이트 탈수소효소, 글루코오스 탈수소효소, 락테이트 탈수소효소와 같은 다양한 효소들이 사용되었다. 상기 방법의 단점은, 사용된 기질의 낮은 농도이다.
알려진 보조인자 재생 시스템과 관련한 효소적 원-포트 방법의 단점은 모두 매우 낮은 기질 농도이며, 이는 산업적 방법에 비효율적이다.
이와 대조적으로, 많은 개별 효소적 산화환원 반응들은 이미 보조인자 재생 시스템을 사용한 것으로 알려져 있다. 모든 미생물, 세포 용해물 또는 고립된 효소를 공존하는 NAD(P)H 또는 NAD(P)+ 재생과 함께 실험한 것이 설명되어 있다. 개별적 산화환원 반응을 위한 알려진 효소적 보조인자 재생 시스템은, 예를 들어 NADH를 위한 포르메이트 탈수소효소(공기질로서 포르메이트), NADH를 위한 Pseudomonas　sp.의 알코올 탈수소효소(공기질로서 2-프로판올), NADH 및 NADPH를 위한 수소화효소 (공기질로서 H2), NADPH를 위한 L.　mesenteroides의 글루코오스-6-포스페이트 탈수소효소(공기질로서 글루코오스-6-포스페이트), NADH 및 NADPH를 위한 글루코오스 탈수소효소(공기질로서 글루코오스), NADH를 위한 NADH 옥시다아제(공기질로서 O2) 및 NADH를 위한 포스파이트 탈수소효소(공기질로서 포스파이트)를 포함한다.
그러한 개별 산화환원 반응의 사용 예는, 키랄 히드록시 화합물의 생성이고, 적당한 프로키랄 케토 화합물로부터 시작한다. 상기 방법에서, 상기 보조인자는 추가적인 효소 수단으로 재생된다. 이들 방법들은 이들이 고립된 환원 반응을 구성하고 NAD(P)H를 재생한다는데 공통점이 있다(see e.g. EP 1 152 054).
보조인자 재생 시스템과 결합된, 히드록시스테로이드 탈수소효소를 사용하는 효소적 방법은, 보다 높은 기질 농도(약 >1%)로 수행되는 것으로서, 설명되어 있다 (EP 1 731 618; WO 2007/118644; Appl. Microbiol. Biotechnol., 2011 Volume 90 p. 127-135). 상기 방법에서, 보조인자 NAD(P)H 또는 NAD(P)는 다른 효소들의 수단, 예를 들어, 락테이트탈수소효소 (공기질로서 피루베이트), T.　 brockii 의 알코올 탈수소효소(공기질로서 이소프로판올), L.　 brevis, L.　minor, Leuconostoc carnosum , T.　에탄올 icus , Clostridium beijerinckii의 알코올 탈수소효소에 의해 재생되었다. 그러나 이들 공지된 방법들은, 단지 히드록시 화합물의 산화 또는 옥소 화합물의 환원을 위한 고립된 단일 반응에만 관련이 있다.
말레이트 탈수소효소 (말레이트 효소)를 사용하는 NADH를 위한 보조인자 재생 시스템은 이미 설명되어 있다(Can. J. Chem. Eng. 1992, Volume 70, p. 306-312). 상기 공보에서, 알라닌 탈수소효소에 의한 피루베이트의 환원적 아민화가 사용되었다. 보조인자 재생 동안 나타난 피루베이트가 그 이후에 생성물-형성 반응에 사용되었다.
WO 2004/022764에서, 말레이트 탈수소효소에 의해 NADH를 재생하는 것이 마찬가지로 설명되어 있다. 이전 설명된 공보에서와 다르게 말레이트의 산화적 탈카르복실화 동안 나타난 피루베이트가 더 사용되지는 않았다.
보조인자 재생 시스템과 관련된 D-자일로오스의 자일리톨로의 효소적 환원의 예가 설명되어 있다 (FEBS J., 2005, Volume 272, p. 3816- 3827). Pseudomonas sp.의 포스파이트 탈수소효소의 NADPH-종속적 돌연변이가 보조인자 재생효소로서 사용되었다. 이것은 또한 생성물의 형성을 위한 단일 반응이다.
키랄 엔안티오머적으로 풍부한 유기 화합물, 예를 들어 알코올 또는 아미노산의 효소적 생성물의 추가 예가 설명되어 있다(Organic Letters, 2003, Volume 5, p. 3649-3650; US 7,163,815; Biochem. Eng. J., 2008, Volume 39(2) p. 319-327; EP 1 285 962). 상기 시스템에서, Lactobacillus brevis 또는 Lactobacillus sanfranciscensis 의 NAD(P)H-종속적 옥시다아제가 보조인자 재생 효소로서 사용되었다. 시험들이 마찬가지로 생성물 형성을 위한 단일 반응을 구성한다.
WO 2011/000693에서, 4-안드로스텐-3,17-디온의 위치 17에서 산화환원 반응을 실행할 수 있게하는 17beta-히드록시스테로이드 탈수소효소뿐만 아니라 방법이 설명되어 있다. 다시, 이것은 고립된 환원 반응이다. 상기 언급된 개별적으로 진행하는 산화 또는 환원 반응은, 원 포트 반응의 장점, 예를 들어, 시간 및 물질 절약의 결과로서 비용 효능뿐만 아니라 효소적 캐스케이드 반응으로 인한 보다 우수한 재사용과 같은 장점이 부족하다.
본 발명의 목적은, 경제적 관점에서 하나의 반응 배치에서 2개 이상의 효소적으로 촉매화된 산화환원 반응들과 함께 수행하기 위하여, 산화환원 보조인자 NAD+/NADH 및/또는, 예를 들어 및, NADP+/NADPH를 재생하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 따라, 상기 목적은, 처음 언급된 종류의 방법으로 얻어지며, 이는 원 포트 반응으로 산화환원 보조인자 NAD+/NADH 및/또는, e.g. 및, NADP+/NADPH의 효소적 재생 방법이 제공되며, 여기서, 동일한 반응 배치(생성물-형성 반응)에서 적어도 2개의 효소적으로 촉매화된 산화환원 반응의 결과로서, 상기 2개의 산화환원 보조인자 중 하나가 그의 환원 형태로, 다른 하나는 산화 형태로 각각 축적하며, 상기 방법은 다음으로 특징되고,
a) 환원된 보조인자를 그의 원래 산화된 형태로 재전환시키는 재생 반응에서, 산소 또는 일반식 I의 화합물은 환원되며,
Figure 112014078413080-pct00001
I
R1은 선형 사슬 또는 분지된(C1-C4)-알킬기 또는 (C1-C4)-카르복시 알킬기이고, 및
b) 상기 산화된 보조인자가 그의 원래의 환원 형태로 재전환하는 재생 반응에서, (C4-C8)-시클로알칸올 또는 일반식 II의 화합물은 산화되고,
Figure 112014078413080-pct00002
II
여기서 R2 및 R3 는 독립적으로 H, (C1-C6) 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서, 알킬은 선형-사슬 또는 분지된, (C1-C6) 알케닐이고, 여기서 알케닐은 선형-사슬 또는 분지되어 있고, 1 내지 3의 이중 결합을 포함하며, 아릴, 특히 C6-C12 아릴, 카르복실, 또는 (C1-C4) 카르복시 알킬, 특히 시클로알킬, e.g. C3-C8 시클로알킬이다.
본 발명에 따라 제공된 방법은, 여기서 "본 발명에 따른(의) 방법"이라 한다.
도 1은 2-프로판올 및 피루베이트를 사용하여 보조인자 재생과 함께 중간체 3α-히드록시-7옥소-5β-콜란산을 통해 우르소데옥시콜산으로 키노데옥시콜산을 에피머화의 반응 도식을 나타낸다.
도 2는 말레이트 및 피루베이트를 사용하여 보조인자 재생과 함께 중간체 3α-히드록시-7옥소-5β-콜란산을 통해 우르소데옥시콜산으로 키노데옥시콜산을 에피머화하는 반응 도식을 나타낸다.
도 3은 2-프로판올 및 산소를 사용하여 보조인자 재생과 함께 중간체 3α-히드록시-7옥소-5β-콜란산를 통해 우르소데옥시콜산으로 키노데옥시콜산을 에피머화하는 반응 도식을 나타낸다.
도 4는 2-프로판올 및 피루베이트를 사용하여 보조인자 재생과 함께 프룩토오스로 글루코오스를 아이소머화하는 반응 도식을 나타낸다.
도 5는 2-프로판올 및 산소를 사용하여 보조인자 재생과 함께 프룩토오스로 글루코오스의 아이소머화하는 반응 도식을 나타낸다.
도 6은, 2-프로판올 및 피루베이트를 사용하여 보조인자 재생과 함께 중간체 3α, 7α-디히드록시-12-옥소-5β-콜란산 및 3α-히드록시-7,12-디옥소-5β-콜란산을 통해 3α,7β-디히드록시-12-옥소-5β-콜란산으로 콜란산을 에피머화하는 반응 도식을 나타낸다.
도 7은, 2-프로판올 및 산소를 사용하여 보조인자 재생과 함께 중간체 3α, 7β-디히드록시-12-옥소-5β-콜란산 및 3α-히드록시-7,12-디옥소-5β-콜란산를 통해 3α,7β-디히드록시-12-옥소-5β-콜란산으로 콜란산을 에피머화하는 반응 도식을 나타낸다.
도 8 및 도 9는 2-프로판올, 피루베이트 및 산소를 사용하여 보조인자 재생과 함께 중간체 3α,7β-디히드록시-12-옥소-5β-콜란산 및 3α-히드록시-7,12-디옥소-5β-콜란산을 통해 3α,7β-디히드록시-12-옥소-5β-콜란산으로 콜란산을 에피머화하는 반응 도식을 나타낸다.
도 10은 다른 중간체들 및 보조인자 재생 시스템을 통해 3α,7β-디히드록시-12-옥소-5β-콜란산으로 콜란산의 에피머화하는 가능한 반응 도식을 나타낸다. NAD+의 재생을 위하여, 대안적으로 락테이트 탈수소효소(기질로서 피루베이트) 및 NADH 옥시다아제(기질로서 산소)가 사용되었다. NADPH의 재생을 위하여 알코올 탈수소효소(기질로서 이소프로판올)가 사용되었다.
도 11은 2-프로판올 및 2-펜탄올(각각의 경우 알코올 탈수소효소)뿐만 아니라 피루베이트(락테이트탈수소효소) 및 산소 (NADH 옥시다아제)을 사용하여 보조 인자 재생과 함께 중간체 3α-히드록시-7옥소-5β-콜란산(7-케토리토콜란산=7K-LCA=KLC)를 통해 우르소데옥시콜란산으로 키노데옥시콜란산을 에피머화하는 반응 도식을 나타낸다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 원 포트 반응으로 산화환원 보조인자 NAD+/NADH 및/또는, e.g. 및, NADP+/NADPH의 효소적 재생을 위한 본 발명에 따른 방법을 제공하며, 여기서, 동일한 반응 배치(=생성물 형성 반응)에서 진행하는 적어도 2개의 추가의 효소적으로 촉매화된 산화환원 반응의 결과로서, 상기 2개의 산화환원 보조인자들 중 하나는 그의 환원된 형태로, 다른 하나는 그의 산화적 형태로 각각 축적하며, 상기 방법은 다음으로 특징되며,
a) 산화된 보조인자의 재생 동안, 일반식 I의 화합물은 환원되며,
Figure 112014078413080-pct00003
I
여기서 R1은 치환 또는 비치환 C1-C4 알킬기를 나타내며, 및
b) 환원된 보조인자의 재생 동안, 일반식 II의 화합물은 산화되며,
Figure 112014078413080-pct00004
II
여기서 R2 및 R3 는 서로 독립적으로 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되며
1) -H,
2) -(C1-C6) 알킬, 여기서 알킬은 선형-사슬 또는 분지되고,
3) -(C1-C6) 알케닐, 알케닐은 선형-사슬 또는 분지되고 및 선택적으로 3개 이하의 이중 결합을 포함하며,
4) -시클로알킬, 특히 C3-C8 시클로알킬,
5) -아릴, 특히 C6-C12 아릴,
6) -(C1-C4) 카르복시 알킬, 화합물 I의 경우에 피루베이트, 선택적으로 또한 카르복실이다.
또 다른 태양에서, 본 발명에 따른 방법에서, R2 및 R3은 서로 독립적으로 H, (C1-C6) 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 알킬은 선형-사슬 또는 분지된, (C1-C6) 알케닐이고, 여기서 알케닐은 선형-사슬 또는 분지되고 1 내지 3의 이중결합을 포함하며, 아릴, 특히 C6-C12 아릴, 카르복실, 또는 (C1-C4) 카르복시 알킬을 포함한다.
선행 기술에 비하여, 본 발명에 따른 방법은, 하나의 반응 배치에서 원하는 산화 및 환원 반응뿐만 아니라 동시에 보조인자 재생을 위한 관련 반응을 일어나게 하여 선행기술보다 매우 높은 기질 농도를 이용할 수 있게 하기 때문에, 화합물이 효소적으로 산화 및 환원 모두가 되어 있는 매우 커다란 진보를 이루는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 방법에서, 보조인자 NADH 및/또는 NADPH가 사용된다. 여기서, NAD+는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드의 산화된 형태를 나타내고 NADH는 환원된 형태를 나타내며, 반면에 NADP+는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트의 산화된 형태를 나타내며 NADPH는 환원된 형태를 나타낸다.
본 발명에 따른 방법에서 보조인자 재생의 일부가 아닌 효소적으로 촉매화된 산화환원 반응은, 여기서 "산화 반응" 및 "환원 반응"이라고 하는 생성물 형성에 관련이 있다. "산화 반응" 및 "환원 반응"은 용어 "생성물 형성 반응"으로 요약된다. 본 발명에 따른 생성물 형성 반응은, 각각의 경우에 적어도 하나의 산화 반응 및 적어도 하나의 환원 반응을 포함한다.
만약 NAD+ 가 산화 반응을 위한 보조인자로서 사용되면, NADPH는 환원 반응을 위한 보조인자이다. 만약 NADP+ 가 산화반응을 위한 보조인자로서 사용되면, NADH는 환원 반응을 위한 보조인자이다.
본 발명에 따른 방법에서, 산화 반응 및 환원 반응은 동일한 반응 배치에서 발생순으로 병행적 또는 발생순으로 연속, 바람직하게 발생순으로 병행하게 수행될 수 있다.
생성물을 형성하는 대상물을 갖는 사용된 화합물들은 여기서는 기질이라고 한다. 보조인자 재생 동안 반응된 화합물들은 여기서 공기질이라고 한다.
본 발명에 따른 반응에서, 하나의 기질뿐만 아니라 여러 개의 기질들이 사용될 수 있다. 이렇게 하는 동안, 환원 및/또는 산화 반응은 동일한 기질(분자 백본) 및 다른 기질, 바람직하게는 동일한 기질에서 일어날 수 있다. 게다가, 본 발명에 따른 방법에서, 환원 및/또는 산화 반응은 동일한 또는 다른 기능기에서 일어날 수 있다.
본 발명에 따른 방법은, 다수의 반응, 예를 들어 산화를 통해 스테레오아이소머릭 히드록시 화합물이 대응하는 케톤으로 그리고 이어진 환원으로 반대의 입체선택적 히드록시 화합물로 화합물 구성의 도치 반응에 적당하다.
생성물의 형성 및 보조인자 재생을 위한 2개의 효소적 시스템과 관련된 2개 이상의 효소적 산화환원 반응이 분리된 중간체 없이 하나의 반응 배치에서 진행하는 방법을 여기서 "원 포트 반응"이라 한다.
산 또는 산의 염을 언급하는 것은 여기서는 각각의 언급되지 않은 용어를 포함한다. 마찬가지로 산의 언급, 특히 담즙산을 언급하는 것은 여기서는 이로부터 유도된 모든 에스테르를 포함한다. 게다가 보호기들을 (부분적으로) 구비한 화합물들은 근본적인 물질들의 언급에 포함된다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 본 발명에 따른 방법은 산화 반응 및 환원 반응이 발생순으로 병행적으로 진행하는데 특징이 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 본 발명에 따른 방법은 산화 반응 및 환원 반응 모두가 동일한 분자 백본에서 일어나는 것에 특징이 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 본 발명에 따른 방법은 식 I의 화합물로서, (2-옥소산), 피루베이트(공기질)이 사용되며 이는 락테이트탈수소효소에 의해 락테이트로 환원되는 것에 특징이 있으며, 이는, 환원된 보조인자를 그의 원래의 산화 형태로 재전환시키는 재생 반응에서, 피루베이트가 락테이트탈수소효소에 의해 락테이트로 환원되는 것을 의미한다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 본 발명에 따른 방법은, 식 II(이차 알코올)의 화합물로서, 2-프로판올 (이소프로필 알코올, IPA) (공기질)이 사용되고, 이는 알코올 탈수소효소에 의해 아세톤으로 산화되는 것에 특징이 있으며, 이는 산화된 보조인자가 그의 원래의 환원 형태로 재전환하는 재생 반응에서, 2-프로판올이 알코올 탈수소효소에 의해 아세톤으로 산화되는 것을 의미한다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 본 발명에 따른 방법은, 산소가 사용되며 이는 NADH 옥시다아제에 의해 환원되는 것에 특징이 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 본 발명에 따른 방법은, 이차 알코올로서, 말레이트(공기질)가 사용되고, 이는 옥살로아세테이트-데카르복실레이팅 말레이트 탈수소효소(말레이트 효소)에 의해 피루베이트 및 CO2로 산화되는, 예를 들어 산화된 보조인자가 그의 원래의 환원 형태로 재전환되는 재생반응에서, 말레이트가 말레이트 탈수소효소에 의해 피루베이트 및 CO2로 산화되는 것에 특징이 있다.
본 실시예에서, 초기의 피루베이트는 추가 산화환원 반응에서 반응하고, 이는 생성물 형성에 관여하지 않으나 제2의 보조인자 재생 반응을 구성한다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 본 발명에 따른 방법은, 동일한 반응 배치에서 적어도 하나의 산화 반응 및 적어도 하나의 환원 반응을 일반식 III의 화합물에서 수행하기 위하여 사용되는데 특징이 있으며,
Figure 112014078413080-pct00005
III
여기서
R4은 수소, 메틸기, 히드록시기 또는 옥소기를 나타내고,
R5은 수소, 히드록시기, 옥소기 또는 메틸기를 나타내고,
R6은 수소 또는 히드록시기를 나타내고,
R7는 수소, -COR13를 나타내고, 여기서 R13은 C1-C4 알킬기이고, 이는 비치환 또는 히드록시기로 치환되고, 또는 비치환 또는 치환된, 특히 히드록시기로 치환된 C1-C4 카르복시 알킬기이고,
또는 R6 및 R7 는 함께 옥소기를 나타내고,
R8는 수소, 메틸기, 히드록시기 또는 옥소기를 나타내고,
R9는 수소, 메틸기, 히드록시기 또는 옥소기를 나타내고,
R10는 수소, 메틸기 또는 할로겐을 나타내고,
R11는 수소, 메틸기, 히드록시기, 옥소기 또는 할로겐을 나타내고, 및
R12는 수소, 히드록시기, 옥소기 또는 메틸기를 나타내고,
여기서 상기 구조적 요소는
Figure 112014078413080-pct00006
벤젠링 또는 6 탄소 원자 및 0, 1 또는 2 C-C-이중 결합을 포함하는 링을 나타내며;
여기서 기질은 바람직하게는 생성물 형성에 관련된 환원 반응을 위한 반응 배치에서 <5% (w/v)의 농도로 제공된다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 본 발명에 따른 방법은, 식 VII의 디하이드로에피안드로스테론 (DHEA)의 식 VIII의 테트토스테론으로의 효소적 전환이 일어나는데 특징이 있다:
Figure 112014078413080-pct00007
VII
Figure 112014078413080-pct00008
VIII
본 발명의 바람직한 실시예에서, 본 발명에 따른 방법은, 예를 들어 2개의 반대적 입체특이적 히드록시스테로이드 탈수소효소를 사용하여, 식 IV의 히드록시스테로이드 화합물 3α,7β-디히드록시-5β-콜란산(cholanic acid)[키노데옥시콜산(chenodeoxy cholic acid), CDC]이 산화를 통해 식 V의 케토리토콜산(ketolito cholic acid, KLC)으로 그리고 환원을 통해 식 VI의 3α,7β-디히드록시-5β-콜란산 (우르소데옥시콜산, UDC)으로 효소적 에피머화(epimerization)가 일어나는 것에 특징이 있다.
Figure 112014078413080-pct00009
IV
Figure 112014078413080-pct00010
V
Figure 112014078413080-pct00011
VI
본 발명의 바람직한 실시예에서, 본 발명에 따른 방법은, 예를 들어, 2개는 상대적인 입체 특이성을 갖는 3개의 입체특이적 히드록시스테로이드 탈수소효소를 사용하여, 식 IX의 3α,7α,12α-트리히드록시-5β-콜란산이
Figure 112014078413080-pct00012
IX
A) 산화를 통해 식 X의 3α,7α-디히드록시-12-옥소-5β-콜란산(12-옥소-CDC)를 얻고,
Figure 112014078413080-pct00013
X
이는 더 반응되어 식 XI의 α-히드록시-7,12-디옥소-5β-콜란산 (12옥소-KLC)를 얻고,
Figure 112014078413080-pct00014
XI
이어진 환원으로 식 XII의 스테레오아이소머적 히드록시 화합물 3α,7β-디히드록시-12-옥소-5β-콜란산 (12-케토-우르소데옥시콜란산)가 되거나
Figure 112014078413080-pct00015
XII
또는
B) 산화를 통하여 식 XIII의 3α,12α-디히드록시-7-옥소-5β-콜란산를 얻고
Figure 112014078413080-pct00016
XIII
이어서 효소적 산화에 의해 식 XI의 3α-히드록시-7,12-디옥소-5β-콜란산(12옥소-KLC)를 얻고, 이어진 환원으로 식 XII의 스테레오아이오머적 히드록시 화합물 3α,7β-디히드록시-12-옥소-5β-콜란산(12-케토-우르소데옥시콜사우어)을 얻거나,
또는
C) 산화를 통해 식 XIII의 3α, 12α-디히드록시-7-옥소-5β-콜란산을 얻고, 이어서 효소적 환원에 의해 식 XIV의 3α,7β, 12α-트리이드옥시(triydroxy)-5β-콜란산을 얻고,
Figure 112014078413080-pct00017
XIV
이어지는 산화에 의해 식 XII의 스테레오아이소머적 히드록시 화합물 3α,7β-디히드록시-12-옥소-5β-콜란산 (12-케토-우르소데옥시콜란산)을 얻거나;
또는 A), B) 및/또는 C)의 어떠한 조합의 효소적 에피머화에 사용된다는 것에 특징이 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 본 발명에 따른 방법은, C5- 또는 C6-당이 기질로 사용되고, 예를 들어 상기 방법은 C5- 또는 C6-당의 아이오머화를 위해 사용되는데 특징이 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 본 발명에 따른 방법은, 글루코오스가 환원을 통해 소르비톨 및 산화를 통해 프룩토오스로 되는 아이소머화가 일어나고, 예를 들어 상기 방법은 글루코오스가 환원을 통해 소르비톨 및 이어지는 산화를 통해 프룩토오스로 아이소머화되는데 사용되는 것에 특징이 있다.
본 발명에 따른 방법은 바람직하게는 수성 시스템으로 수행되고, 여기서 산화 및 환원 반응을 위한 기질은 현탁액의 형태로 및/또는 제2 액체상으로서 용해되지 않은 상태로 부분적으로 제공된다.
특별한 실시예에서, 본 발명에 따른 방법은, 생성물의 형성에 관련된 산화 반응을 위한 기질은 반응 배치에 적어도 5% (w/v) 이상, 바람직하게는 7% (w/v) 이상, 특히 바람직하게는 9% (w/v) 이상, e.g. 5% (w/v) 내지 20% (w/v), 예를 들어 5% (w/v) 내지 15% (w/v), e.g. 5% (w/v) 내지 12% (w/v), 예를 들어 5% (w/v) 내지 10% (w/v)의 농도로 제공되는 데 특징이 있다.
특정 실시예에서, 본 발명에 따른 방법은, 전체적으로 ≥70%, 특히 ≥90%의 재사용이 생성물 형성 반응에서 얻어지는데 특징이 있다.
본 발명에 따른 방법에서, 완충제가 상기 수성 시스템에 첨가될 수 있다. 적당한 완충제는 예를 들어 5 내지 10, 바람직하게는 6 내지 9의 pH를 갖는 포타슘 포스페이트, Tris-HCl 및 글리신이다. 추가로 또는 대안적으로, 상기 효소를 안정화시키는 이온들, 예를 들어 Mg2+ 또는 글리세롤과 같은 다른 첨가제가 상기 시스템에 추가될 수 있다. 본 발명에 따른 방법에서, 추가된 보조인자 NAD(P)+ 및 NAD(P)H의 농도가 통상 0.001　mM 및 10　mM, 바람직하게는 0.01　mM 및 1　mM의 사이이다.
사용된 효소에 따라, 본 발명에 따른 방법이 10℃ 내지 70℃, 바람직하게는 20℃ 내지 45℃의 온도 범위에서 수행될 수 있다.
히드록시스테로이드 탈수소효소 (HSDH)는, 스테로이드 뼈대에서 히드록시기를 대응하는 케토기로 산화시키는 것, 반대로 케토기를 대응하는 히드록시기로 환원시키는 것을 촉매화하는 효소인 것으로 이해된다.
히드록시스테로이드에서 산화환원 반응을 위해 사용될 수 있는 적당한 히드록시스테로이드 탈수소효소는 예를 들어 3α-HSDH, 3β-HSDH, 7α-HSDH, 7β-HSDH 또는 17β-HSDH이다.
7α-HSDH 활성을 갖는 적당한 효소는, 예를 들어 Clostridia (Clostridium absonum , Clostridium sordelii), Escherichia coli 또는 Bacteroides fragilis로부터 얻어질 수 있다.
7β-HSDH 활성을 갖는 적당한 효소는 예를 들어 Ruminococcus sp . 또는 Clostridium absonum로부터 얻어질 수 있다.
적당한 락테이트탈수소효소가 예를 들어 Oryctolagus cuniculus로부터 얻어질 수 있다.
적당한 알코올 탈수소효소는 예를 들어, Lactobacillus kefir로부터 얻어질 수 있다.
적당한 자일로오스 환원효소는 예를 들어 Candida tropicalis로부터 얻어질 수 있다.
적당한 소르비톨 탈수소효소는 예를 들어 양 간, Bacillus subtilis 또는 Malus domestica로부터 얻어질 수 있다.
적당한 NADH 옥시다아제는 예를 들어, Leuconostoc mesenteroides , Streptococcus mutans , Clostridium aminovalericum로부터 얻어질 수 있다.
본 발명에 따른 방법에서, 효소는 바람직하게는 E. col,에서 재조합적으로 과발현된 단백질로서 사용되고, 여기서 대응하는 세포 용해물은, 바람직하게는 어떠한 추가 정제도 없이 계속해서 사용된다. 이것으로 인해, 상기 효소 단위 1U은 분당 1μmol의 기질을 반응시키는데 필요한 효소함량에 대응한다.
다음 실시예에서, 모든 온도 데이터는 섭씨 온도(℃)로 주어진다. 다음 약어가 사용된다.
EtOAc 에틸 아세테이트
h 시간
IPA 이소프로필 알코올 (2-프로판올)
MeOH 메탄올
Rt 실온
실시예
락테이트탈수소효소 - 및 알코올 탈수소효소-종속 보조인자 재생 시스템을 사용하는, 7α- 히드록시스테로이드 탈수소효소 및 7β-히드록시스테로이드 탈수소효소에 의한 우르소데옥시콜산으로 키노데옥시콜산을 에피머화
0.5ml 차지(charge)는 50mg 키노데옥시콜산, Escherichia coli의 재조합 7α-히드록시스테로이드 탈수소효소 12U, Ruminococcus torques의 재조합 7β-히드록시스테로이드 탈수소효소 6U뿐만 아니라 0.5 mM NAD+ 및 0.3 mM NADPH를 포함한다. NAD+ 재생을 위하여, 재조합 락테이트탈수소효소 6U 및 및 350 mM 소듐 피루베이트이 사용된다. NADPH의 재생을 위하여, Lactobacillus kefir의 재조합 알코올 탈수소효소 6U 및 처음으로 2.4% IPA (w/v)가 사용된다. 반응은 연속적으로 흔들(850 rpm)면서, 25℃에서 수성 포타슘 포스페이트 완충제(100 mM, pH = 7.8)에서 수행된다. 개방 시스템이 계속 사용되어 아세톤의 증발을 용이하게 하고 반응을 우르소데옥시콜산으로 이동시킨다. 1.6% (w/v) IPA가 6시간 후에, 2.4% (w/v) IPA가 16시간 후에, 3.9% (w/v) IPA가 24시간 후에, 0.8% (w/v) IPA가 40시간 후에 추가적으로 투여된다. 게다가, 20㎕의 4-메틸-2-펜탄올이 24시간 후에 첨가된다. 200㎕의 2-펜탄올뿐만 아니라 1.6% (w/v) IPA가 46시간 후에 첨가된다. 48시간 후에, 반응 혼합물에서 모든 담즙산에서의 우르소데옥시콜산의 비는 97%이다.
실시예 2
락테이트탈수소효소 - 및 말레이트 탈수소효소-종속 보조인자 재생 시스템을 사용하여, 7α-히드록시스테로이드 탈수소효소 및 7β-히드록시스테로이드 탈수소효소에 의해 우르소데옥시콜산으로 키노데옥시콜산을 에피머화 .
0.5 ml 차지는 50 mg 키노데옥시콜산, Escherichia coli 의 재조합 7α-히드록시스테로이드 탈수소효소 20U, Ruminococcus torques의 재조합 7β-히드록시스테로이드 탈수소효소 20 U뿐만 아니라 1 mM NAD+ 및 1 mM NADPH을 포함한다. NAD+ 재생을 위하여, 락테이트탈수소효소 (Sigma-Aldrich) 10U가 사용되고, 및 반응을 시작하기 위하여, 16.5 mM 소듐 피루베이트가 사용된다. NADPH의 재생을 위하여, Escherichia coli 의 재조합 말레이트 탈수소효소 20 U 및 320 mM 소듐 말레이트가 사용된다. 반응은 25℃에서 연속적인 교반(850rpm)하면서, 수성 포타슘 포스페이트 완충제(100 mM, pH = 7.8)에서 수행된다. 개방 시스템을 계속해서 사용하여 초기 CO2가 빠져나갈 수 있게 한다. 20 U의 7α-HSDH 뿐만 아니라 10 U의 락테이트탈수소효소가 추가적으로 16 h 후 및 40 h 후에 투여된다. 10 U 7β-HSDH가 추가적으로 20 h, 24 h, 44 h 및 48 h 후에 투여된다. 게다가, 10 U의 말레이트 탈수소효소가 40 h 후 투여된다. 72h 후, 상기 반응 혼합물에서 모든 담즙산에서 우르소데옥시콜산의 비는 약 90%이다.
실시예 3
NADH 옥시다아제- 및 알코올 탈수소효소-종속 보조인자 재생 시스템을 사용하여, 7α- 히드록시스테로이드 탈수소효소 및 7β-히드록시스테로이드 탈수소효소에 의해 우르소데옥시콜산으로 키노데옥시콜산을 에피머화함 .
0.5 ml 차지는 50　mg 키노데옥시콜산, Escherichia coli의 재조합 7α-히드록시스테로이드 탈수소효소 12　U, Ruminococcus torques의 재조합 7β-히드록시스테로이드 탈수소효소 5　U뿐만 아니라 1　mM NAD+ 및 1　mM NADPH를 포함한다. NAD+의 재생을 위해서, Clostridium aminovalericum의 재조합 NADH 옥시다아제가 사용된다. NADPH의 재생하기 위하여, Lactobacillus kefir의 재조합 알코올 탈수소효소 5　U 및 처음으로 2 % IPA (w/v)가 사용된다. 상기 반응은 계속 흔들면서(850　rpm), 25℃에서 수성 포타슘 포스페이트 완충제(100　mM, pH　6)에서 수행된다. 개방 시스템을 계속 사용하여 아세톤의 증발을 용이하게 하고 상기 반응을 우르소데옥시콜산 쪽으로 이동시킨다.
2% IPA가 18 h, 22 h, 26 h 및 41 h후에 추가적으로 투여될뿐만 아니라 5% IPA가 41 h 및 48 h 후에 첨가된다. 20 U의 NADH 옥시다아제가 24 h 후에 추가적으로 투여되고, 및 7,5 U의 7β-히드록시스테로이드 탈수소효소뿐만 아니라 5 U의 알코올 탈수소효소가 41h 후에 추가적으로 투여된다. 48　h 후에, 상기 반응 혼합물에서 모든 답즙산에서 우르소데옥시콜산의 비가 약 95-98%이다.
실시예 4
담즙산의 재가공 및 분석학
실시예 1 내지 3에서 설명된 반응의 완결시에, 상기 반응 혼합물은 EtOAc에 의해 추출된다. 이어서, 상기 용매를 증발로 제거한다. 상기 증발 잔사를 MeOH:아세토니트릴:소듐 포스페이트 완충제 pH = 3, 0.78 g/l (40:30:37)의 혼합물에 용해되고, 우르소데옥시콜산으로 키노데옥시콜산을 전환하는 것이 HPLC로 모니터링된다. 이에 의하여, 역상 분리 컬럼(ZORBAX®clipse ® XDB C18, 흐름 0.8 ml/min) 및 광굴절 검출기(light-refraction detector, RID), Agilent 1260 Infinity ® 모두 Agilent Technologies Inc.에서 구입하여 사용된다.
실시예 5
NADPH 를 재활용하기 위한 알코올 탈수소효소 및 NAD + 재활용을 위한 락테이트탈수소효소를 사용하여, 자일로오스 환원효소 및 소르비톨 탈수소효소를 통해 프록토오스로 글루코오스의 전환
0.5 ml 차지는 50 mg/ml 글루코오스 및 Candida tropicalis의 재조합 자일로오스 환원효소 6 U (E. coli BL21 (DE3)에서 발현됨) 및 0.1 mM NADP+을 포함한다. 보조인자 재생을 위하여, 7% IPA 및 Lactobacillus kefir의 재조합 알코올 탈수소효소(E. coli BL21 (DE3)에서 발현됨)가 첨가된다. 효소는 세포 용해물 형태로 사용된다. 반응은, 계속적으로 흔들면서(900 rpm), 개방 시스템으로 반응은 40℃ 및 pH = 9 (50 mM Tris HCl-완충제)에서 24h 동안 일어난다. 개방 시스템은 아세톤의 제거를 유도하며, 이는 반응을 소르비톨 형성쪽으로 구동시킨다. 개방 시스템에서, 물 및 IPA이 역시 증발하고, 추가적으로 6h 및 21h 후에 투여된다. 이로 인하여 각 시간에 총 부피 0.5ml뿐만 아니라 7%(v/v)의 IPA 농도로 조절된다. 24h 후에, 반응 용기는 진공하에서 60℃에서 배양되어 효소를 불활성화하고 유기 용매를 증발시킨다. 실온까지 냉각한 후에, Bacillus subtilis (E. coli BL21 (DE3)에서 발현됨)의 재조합 소르비톨 탈수소효소가 최종 농도 5U/ml으로 첨가되고, 1mM 최종 농도로 ZnCl2 및 0.1mM의 최종 농도로 NAD+을 첨가한다. 보조인자 재생을 위하여, 5 U/ml (최종 농도)의 토끼 근육의 락테이트탈수소효소(Sigma Aldrich) 및 300 mM 피루베이트가 사용된다. 상기 차지는 물을 가지고 0.5ml 이하로 꼭대기까지 채워진다. 반응은 연속적으로 흔들면서(900rpm), 폐쇄 시스템 내에서 40℃에서 추가 24h 동안 일어난다. >90%의 D-프룩토오스로 D-글루코오스의 전환이 얻어진다.
실시예 6
NADPH 재활용을 위한 알코올 탈수소효소 및 NAD + 를 재활용하기 위한 NADH 옥시다아제를 사용하여, 자일로오스 환원 효소 및 소르비톨 탈수소효소를 통해 프룩토오스로 글루코오스를 전환함.
0.5 ml 차지는 50 mg/ml 글루코오스, Candida tropicalis (E. coli BL21 (DE3)에서 발현됨)의 재조합 자일로오스 환원 효소 6 U/ml 및 0.1 mM NADP+을 포함한다. 보조인자 재생을 위하여, 7% (v/v) IPA 및 Lactobacillus kefir (E. coli BL21 (DE3)에서 발현됨) 의 재조합 알코올 탈수소효소가 첨가된다. 효소는 세포 용해물의 형태로 사용된다. 반응은 계속적으로 흔들면서(900rpm), 개방 시스템으로 40℃ 및 pH = 8 (50 mM Tris HCl 완충제)에서 24h 동안 일어난다. 상기 개방 시스템은 아세톤 제거를 유도하여, 반응을 소르비톨 형성쪽으로 일어나게 한다.
개방 시스템에서, 물 및 IPA가 역시 증발하고 이들은 6h 및 21h 후에 투여된다. 이로 인하여 각 시간에 총 부피 0.5ml 뿐만 아니라 IPA-농도 7%(v/v)로 조절된다. 24h 후에, 반응 용기는 진공하에서 60℃에서 배양되어 효소를 불활성시키고 IPA뿐만 아니라 형성된 어떤 아세톤이라도 증발시킨다. 실온까지 냉각한 후에, Bacillus subtilis ( E. coli BL21 (DE3)에서 발현됨)의 재조합 D-소르비톨 탈수소효소가 최종 농도 5 U/ml로 첨가되고, 최종 농도 1mM의 CaCl2 및 최종 농도 0.1mM의 NAD+ 및 NADH 혼합물을 첨가시킨다. 보조인자 재생을 위하여, Leuconostoc mesenteroides (overexpressed in E. coli BL21 (DE3))의 NADH 옥시다아제 10 U/ml (최종 농도)가 사용된다. 효소가 세포 용해물 형태로 사용된다. 차지는 물로 0.5ml 이하까지 꼭대기까지 채워진다. 반응은 계속적으로 흔들면서(900rpm), 개방 시스템으로 40℃에서 24h 동안 일어나서 공기로부터 NADH 옥시다아제에 충분한 산소 공급을 보증한다. 개방 시스템에서 40℃에서 물을 증발시킨다. 그러므로 6h 및 21h 후에, 0.5ml 부피까지 물로 채워진다. ca.98%의 D-프룩토오스로 D-글루코오스의 전환이 얻어진다.
실시예 7
당의 재가공 및 분석학
차지는 효소를 불활성화하기 위하여 65℃에서 10min. 동안 배양하고 이어서 원심분리한다. 상청액을 0.2μM PVDF 필터로 여과되고 리간드-교환 HPLC (Agilent Technologies Inc.)에 의해 분석된다. 이렇게 하면서, 당 및 폴리올이 Showa Denko K.K. (Shodex ® Sugar SP0810)의 납 컬럼을 사용하여 80℃에서 0.5 ml/min 물 (VWR International GmbH, HPLC Grade)의 흐름 조건으로 분리된다. 광-굴절 검출기(RID, Agilent 1260 Infinity ® Agilent Technologies Inc.)를 사용하여 검출한다. Agilent Technologies Inc. 의 인라인 필터 및 프리컬럼으로서, 음이온-교환 컬럼(Shodex ® Axpak-WAG), 역상 컬럼(Shodex ® Asahipak ® ODP-50 6E) 및 Showa Denko K.K.의 슈거 프리컬럼이 사용된다.
실시예 8
락테이트탈수소효소 및 알코올 탈수소효소 종속 보조인자 재생 시스템을 사용하여, 12α- 히드록시스테로이드탈수소효소 , 7α- 히드록시스테로이드탈수 소 효소 및 7β- 히드록시스테로이드탈수소효소에 의해 3α,7β-디히드록시-12-옥소-5β- 콜란산으로 콜란산의 생체전환.
0,5　ml 차지는 25　mg의 콜란산, Eggertella lenta 또는 Lysinibacillus sphaericus의 재조합 12α-히드록시스테로이드 탈수소효소 12.5　U, Escherichia coli 의 재조합 7α-히드록시스테로이드 탈수소효소 16　U, Ruminococcus torques의 재조합 7β-히드록시스테로이드 탈수소효소 6　U뿐만 아니라 1　mM NAD+ 및 1　mM NADPH을 포함한다. NAD+ 재생을 위하여, Oryctolagus cuniculus (muscle isoform)의 재조합 락테이트탈수소효소 12.5　U 및 200 mM의 소듐 피루베이트가 사용된다. NADPH 재생을 위하여, Lactobacillus kefir의 재조합 알코올 탈수소효소 5　U 및 처음으로 2%의 IPA (w/v)가 사용된다. 반응은 계속적으로 흔들면서(850rpm), 25℃에서 수성 포타슘 포스페이트 완충제 (100 mM, pH 7.8)에서 수행된다. 개방 시스템이 더 사용되어 아세톤을 증발시키고 반응을 3α,7β-디히드록시-12-옥소-5β-콜란산으로 이동시킨다. 18 h 및 24 h 후에 2% IPA (w/v)가 추가적으로 투여된다. 48 h 후에, 사용된 콜란산의 61%가 3α,7α-디히드록시-12-옥소-5β-콜란산으로 반응된다.
실시예 9
락테이트 탈수소효소, NADH -옥시다아제 및 알코올 탈수소효소 종속 보조인자 재생 시스템을 사용하여 12α-히드록시스테로이드 탈수소효소, 7α-히드록시스테로이드 탈수소효소 및 7β-히드록시스테로이드 탈수소효소에 의해 3α,7β-디히드록시-12-옥소-5β- 콜란산으로 콜린산의 생체 전환.
0.5　ml 차지는 25　mg의 콜란산, Eggertella lenta 또는 Lysinibacillus sphaericus의 재조합 12α-히드록시스테로이드 탈수소효소 12,5　U, Escherichia coli의 재조합 7α-히드록시스테로이드 탈수소효소 16　U, Ruminococcus torques의 재조합 7β-히드록시스테로이드 탈수소효소 6　U뿐만 아니라 1　mM NAD+ 및 1　mM NADPH을 포함한다. NAD+ 재생을 위하여, Leuconostoc mesenteroides 재조합 NADH 옥시다아제 5　U 및 Oryctolagus cuniculus (muscle isoform) 재조합 락테이트탈수소효소 12.5　U 및 200 mM의 소듐 피루베이트가 사용된다. NADPH 재생을 위하여, Lactobacillus kefir의 재조합 알코올 탈수소효소 5　U 및 처음으로 2%의 IPA (w/v)가 사용된다. 반응은 계속적으로 흔들면서(850rpm), 25℃에서 수성 포타슘 포스페이트 완충제(100 mM, pH　7.8)에서 수행된다.
개방 시스템이 더 사용되어 아세톤을 증발시키고 상기 반응을 3α,7β-디히드록시-12-옥소-5β-콜란산으로 이동시킨다. 18 h 및 24 h 후에, 2　%의 IPA (w/v)가 추가적으로 투여된다. 48 h 후에, 사용된 콜린산의 70%가 반응되어 3α,7α-디히드록시-12-옥소-5β-콜란산이 된다.
실시예 10
락테이트탈수소효소 및 알코올 탈수소효소 종속 보조인자 재생 시스템을 사용하면서 7α- 히드록시스테로이드 탈수소효소 및 7β-히드록시스테로이드 탈수소효소를 사용하여 우르소데옥시 콜란산으로 키노데옥시 콜란산의 에피머화 .
망간 클로라이드( MnCl 2 ) 첨가의 장점
0,5 ml 차지는 50 mg의 키노데옥시 콜란산, Escherichia coli의 재조합 7α-히드록시스테로이드 탈수소효소 12 U, Ruminococcus torques의 재조합 7β-히드록시스테로이드 탈수소효소 6 U뿐만 아니라 0.5 mM NAD+ 및 0.3 mM NADPH을 포함한다. NAD+ 재생을 위하여, 6 U의 재조합 락테이트탈수소효소 및 350 mM의 소듐 피루베이트가 사용된다. NADPH 재생을 위하여, Lactobacillus kefir의 재조합 알코올 탈수소효소 6 U 및 처음으로 2.4%의 IPA (w/v)가 사용된다. 연속적으로 흔들면서(850rpm), 25℃에서 5 mM MnCl2를 가지고 수성 포타슘 포스페이트 완충제 (100 mM, pH = 7.8)에서 수행된다. 개방 시스템이 더 사용되어 아세톤을 증발시키고 상기 반응을 우르소데옥시 콜란산 쪽으로 이동시킨다. 6h 후 1.6% (w/v)의 IPA, 16h 후 2.4% (w/v)의 IPA 및 24h 후 3,9% (w/v)의 IPA가 추가적으로 투여된다. 36　h 후에 200㎕의 2-펜탄올뿐만 아니라 3% (w/v)의 IPA가 첨가되고 48 h 후에, 100㎕ 2-펜탄올 및 4 % (w/v)의 IPA가 추가적으로 투여된다. 64 h 후에 반응 혼합물에서 모든 담즙산에서 우르소데옥시 콜란산의 부분이 >99%이다. 특히,키노데옥시 콜란산의 부분이 ca. 0.3　%이다. MnCl2의 추가 없는 대조군 차치에서는, 키노데옥시 콜란산 부분이 ca. 2　%이고, 우르소데옥시 콜란산 부분이 ca. 97.5　%(5 실험 각각 평균값)이다.
실시예 11
알코올 탈수소효소 종속 보조인자 재생 시스템뿐만 아니라 조합된 락테이 트탈수소효소 및 NADH 옥시다아제 종속 보조인자 재생 시스템을 사용하면서, 7α-히드록시스테로이드 탈수소효소 및 7β-히드록시스테로이드 탈수소효소에 의해 우르소데옥시 콜란산으로 키노데옥시콜란산의 에피머화 .
0,5 ml 차지는 50 mg의 키노데옥시 콜란산, Escherichia coli의 재조합 7α-히드록시스테로이드 탈수소효소 12 U, Ruminococcus torques의 재조합 7β-히드록시스테로이드 탈수소효소 6 U뿐만 아니라 0.5 mM의 NAD+ 및 0.3 mM의 NADPH를 포함한다. NAD+의 재생을 위하여, 6 U의 재조합 락테이트탈 수소효소 및 350 mM의 소듐 피루베이트가 사용된다. NAD+의 재생을 위하여, 추가로 Leuconostoc mesenteroides의 재조합 NADH 옥시다아제 9　U뿐만 아니라 Clostridium aminovalericum의 재조합 NADH 옥시다아제 6　U가 사용된다. NADPH 재생을 위하여, Lactobacillus kefir의 재조합 알코올 탈수소효소 6 U 및 처음으로 2.4% (w/v)의 IPA가 사용된다. 계속해서 흔들면서(850 rpm), 반응은 25℃에서 수성 포타슘 포스페이트 완충제(100 mM, pH = 7.8) 내에서 수행된다. 개방 시스템이 더 사용되어 아세톤을 증발시키고 반응을 우르소데옥시 콜란산 쪽으로 이동시킨다. 6　h 후에, 1.6% (w/v)의 IPA, 16 h 후에 2.4% (w/v)의 IPA 및 24 h 후에 3.9% (w/v)의 IPA가 추가적으로 투여된다. 36　h 후에 200㎕의 2-펜탄올뿐만 아니라 3% (w/v)의 IPA가 첨가되고 48 h 후에 100㎕의 2-펜탄올 및 4 % (w/v)의 IPA가 추가적으로 투여된다. 64 h 후에, 반응 혼합물에서 모든 담즙산 내의 우르소데옥시 콜란산 부분은 >99%이다. 특히 키노데옥시 콜란산 부분은 ca. 0,2　%이다. NADH-옥시다아제 첨가가 없는 대조군 차지에서, 키노데옥시 콜란산 부분은 ca. 2　%이고 우르소데옥시 콜란산 부분은 ca. 97,5　% (실시예 11에서와 같은 동일한 대조군 차지; 5번 실험 각각의 평균값)이다.
실시예 12
알코올 탈수소효소 종속 보조인자 재생 시스템뿐만 아니라 조합된 락테이 트탈수소효소 및 NADH 옥시다아제 종속 보조인자 재생 시스템의 사용하에서 7α- 히드록시스테로이드 탈수소효소 및 7β-히드록시스테로이드 탈수소효소에 의한 우르소데옥시 콜란산으로의 키노데옥시 콜란산의 에피머화 . 2-펜탄올 및 2-프 로판올 의 첨가적 효과
50 ml 차지는, 5 g의 키노데옥시 콜란산, Escherichia coli의 재조합 7α-히드록시스테로이드 탈수소효소 24 U/ml, Ruminococcus torques의 재조합 7β-히드록시스테로이드 탈수소효소 12 U/ml뿐만 아니라 055 Mm의 NAD+ 및 0.3 mM의 NADPH를 포함한다. NAD+재생을 위하여, 12　U/ml 재조합 락테이트탈수소효소 및 350　mM의 소듐 피루베이트가 사용된다. NAD+ 재생을 위하여, 추가적으로 Leuconostoc mesenteroides의 재조합 NADH 옥시다아제 18　U/ml뿐만 아니라 Clostridium aminovalericum의 재조합 NADH 옥시다아제 12　U/ml가 사용된다. NADPH 재생을 위하여, Lactobacillus kefir의 재조합 알코올 탈수소효소 12 U/ml 및 초기에 1.5　% (w/v)의 IPA가 사용된다. 반응은 25℃에서 5　mM MnCl2을 갖는 수성 포타슘 포스페이트 완충제(100　mM, pH = 7.8)에서 수행된다. 3-목 피스톤에서, ca.100rpm로 KPG-교반기로 교반된다. 상기 반응으로부터 나온 아세톤의 제거는 반응 용기를 통해 공기 흐름(ca. 400-600　ml/min)에 의해 영향받는다. 동시에 2-프로판올이 또한 증발되기 때문에, 추가적인 투여가 필요하며, 예를 들어, 0.75　ml (1,5　h), 0.75　ml (3　h), 0.5　ml (4　h), 0.75　ml (6　h), 0.75　ml (8　h), 0.5　ml (11　h), 0.5　ml (14　h), 0.5　ml (17　h), 0.5　ml (21　h), 1　ml (23　h), 2.5　ml (25　h), 4　ml (29　h) 함량이 필요하다. ca. 30　h 후에 마찬가지로 20　ml 2-펜탄올 및 2　ml 2-프로판올이 첨가된다. 총 반응 시간의 46　h 후에, 7-케토리토콜란산 부분은 ca. 1　% (키노데옥시 콜란산, 우르소데옥시 콜란산 및 7-케토리토콜란산의 합과 관련됨)이다. 2-프로판올이 더 첨가된다: 3 ml (46　h), 4　ml (52　h), 4　ml (54　h) 뿐만 아니라 추가로 10　ml의 2-펜탄올이 첨가된다. 72　h 총 반응시간 후, 7-케토리토콜란산 부분은 0.2% 보다 낮아질 수 있다. 우르소데옥시 콜란산 부분은 >99　%이다.
실시예 13
담즙산의 작업 및 분석학
실시예 8 내지 12에 설명된 것과 같은 반응 종결 후에, 이 시험에 존재하는 담즙산은 실시에 4에 설명된 방법을 통해 분석될 수도 있다.
도면에서 다음 약어가 사용된다:
BsSDH Bacillus subtilis의 소르비톨 탈수소효소
CA = 3α, 7α, 12α-트리히드록시-5β-콜란산
7β-CA = 3α, 7β,12α-트리히드록시-5β-콜란산
Caoxo Clostridium aminovalericum NADH 옥시다아제
CDC, CDCA 3α, 7α-디히드록시-5β-콜란산
CtXR Candida tropicalis 자일오로스 환원효소
7α-HSDH 7α-히드록시스테로이드 탈수소효소
7β-HSDH 7β-히드록시스테로이드 탈수소효소
12α-HSDH = 12α-히드록시스테로이드탈수소효소
KLC 3α-히드록시-7-옥소-5β-콜란산
7K-LCA = 3α-히드록시-7-옥소- 5β-콜란산
LacDH 락테이트 탈수소효소 NAD(H)-종속
LkADH Lactobacillus kefir 알코올 탈수소효소 NADP(H)-종속
Lmoxid = Leuconostoc mesenteroides NADH-옥시다아제
MalDH E. coli 말레이트 탈수소효소 NADP(H)-종속
7옥소-CA = 3α,12α-디히드록시-7-옥소-5β-콜란산
12옥소-CDC = 3α,7α-디히드록시-12-옥소-5β-콜란산
12옥소-KLC = 3α-히드록시-7,12-디옥소-5β-콜란산
12옥소-UDC = 3α,7α-디히드록시-12-옥소-5β-콜란산
SISDH 양 간 소르비톨 탈수소효소
SmOxo Streptococcus mutans NADH 옥시다아제
UDC. UDCA 3α,7β-디히드록시-5β-콜란산

Claims (15)

  1. 원 포트 반응으로 산화환원 보조인자 NAD+/NADH 및 NADP+/NADPH의 효소적 재생을 위한 방법으로서, 여기서 동일한 반응 배치에서 진행하는 적어도 2개의 효소적으로 촉매화된 산화 환원 반응(생성물-형성 반응)의 결과로서, 상기 산화환원 보조인자 NAD+/NADH는, NADH로서 그의 환원 형태로 축적하고, NADP+/NADPH는 NADP+로서 그의 산화된 형태로 각각 축적하며,
    a) NADH를 그의 원래의 산화된 형태로 재전환시키는 재생 반응에서, 산소 또는 피루베이트는 NADH 옥시다아제 또는 락테이트 탈수소효소에 의해 각각 환원되고,
    및
    b) NADP+를 그의 원래의 환원된 형태로 재전환시키는 재생반응에서, 2-프로판올 또는 말레이트는 알코올 탈수소효소 또는 말레이트 탈수소효소로 각각 산화되는 것을 특징으로 하는 산화환원 보조인자의 효소적 재생방법.
  2. 제1항에 있어서,
    산화 반응 및 환원 반응이 동일한 기질(분자 백본)에서 일어나는 것을 특징으로 하는 산화환원 보조인자의 효소적 재생 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    산화 반응 및 환원 반응이 발생 순으로 병행적으로 진행하는 것을 특징으로 하는 산화환원 보조인자의 효소적 재생 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    NADP+를 NADPH로 재전환시키는 재생 반응에서, 2-프로판올이 알코올 탈수소효소에 의해 아세톤으로 산화되는 것을 특징으로 하는 산화환원 보조인자의 효소적 재생 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    NADH를 NAD+로 재전환시키는 재생 반응에서, 피루베이트는 락테이트 탈수소효소에 의해 락테이트로 환원되는 것을 특징으로 하는 산화환원 보조인자의 효소적 재생 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    NADP+를 NADPH로 재전환시키는 재생 반응에서, 말레이트가 말레이트 탈수소효소에 의해 피루베이트 및 CO2으로 산화되는 것을 특징으로 하는 산화환원 보조인자의 효소적 재생 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    일반식 III의 화합물에 대해 동일한 반응 배치에서 적어도 하나의 산화 반응 및 적어도 하나의 환원 반응을 각각 수행하기 위하여 사용되는 것을 특징으로 하는 산화환원 보조인자의 효소적 재생 방법:
    Figure 112019038795556-pct00022
    III
    여기서
    R4는 수소, 메틸기, 히드록시기 또는 옥소기를 나타내며,
    R5는 수소, 히드록시기, 옥소기 또는 메틸기를 나타내며,
    R6는 수소 또는 히드록시기를 나타내며,
    R7는 수소, -COR13를 나타내며, 여기서 R13는 C1-C4 알킬기이고 이는 비치환 또는 히드록시기로 치환되고, 또는 비치환 또는 히드록시기로 치환된 C1-C4 카르복시 알킬기이며,
    또는 R6 및 R7 는 함께 옥소기를 나타내며,
    R8는 수소, 메틸기, 히드록시기 또는 옥소기를 나타내며,
    R9는 수소, 메틸기, 히드록시기 또는 옥소기를 나타내며,
    R10 는 수소, 메틸기 또는 할로겐을 나타내며,
    R11는 수소, 메틸기, 히드록시기, 옥소기 또는 할로겐을 나타내며, 및
    R12는 수소, 히드록시기, 옥소기 또는 메틸기를 나타내며,
    여기서 상기 구조적 요소
    Figure 112019038795556-pct00023
    는
    벤젠링 또는 6 탄소원자 및 0, 1 또는 2 C-C-이중 결합을 포함하는 링을 나타내며, 상기 기질은 생성물 형성 반응과 관련된 환원 반응을 위한 반응 배치에서 <5% (w/v)의 농도로 제공되는 것을 특징으로 하는 산화환원 보조인자의 효소적 재생 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    식 VII의 디하이드로에피안드로스테론(DHEA)을
    Figure 112019038795556-pct00024
    VII
    식 VIII의 테트토스테론으로 전환시키기 위하여 사용된 것을 특징으로 하는 산화환원 보조인자의 효소적 재생 방법.
    Figure 112019038795556-pct00025
    VIII.
  9. 제7항에 있어서,
    산화에 의해 식 IV의 3α,7α-디히드록시-5β-콜란산 (키노데옥시콜산)을
    Figure 112019038795556-pct00026
    IV
    식 V의 케토리토콜산으로
    Figure 112019038795556-pct00027
    V
    및 이어서 환원으로 식 VI의 스테레오아이소머적 히드록시 화합물 3α,7β-디히드록시-5β-콜란산 (우르소데옥시콜산)로 에페머화하고,
    Figure 112019038795556-pct00028
    VI
    2개의 반대되는 입체 특이적 히드록시스테로이드 탈수소효소를 사용하고, 이로 인하여 산화 반응이 E. coli의 7α-히드록시스테로이드 탈수소효소에 의해 촉매화되거나 상기 환원 반응이 Ruminococcus torques의 7β-히드록시스테로이드 탈수소효소에 의해 촉매화되는 것을 특징으로 하는 산화환원 보조인자의 효소적 재생 방법.
  10. 제7항에 있어서,
    식 IX의 3α,7α,12α-트리히드록시-5β-콜란산(콜란산)이
    Figure 112019038795556-pct00029
    IX
    A) 산화를 통해 식 X의 3α,7α-디히드록시-12-옥소-5β-콜란산(12-옥소-CDC)을 얻거나
    Figure 112019038795556-pct00030
    X
    이는 추가로 반응되어 식 XI의 3α-히드록시-7,12-디옥소-5β-콜란산 (12옥소-KLC)을 얻고
    Figure 112019038795556-pct00031
    XI
    이어지는 환원으로 식 XII의 스테레오아이소머릭 히드록시 화합물 3α,7β-디히드록시-12-옥소-5β-콜란산 (12-케토-우르소데옥시콜란산)을 얻거나
    Figure 112019038795556-pct00032
    XII
    또는
    B) 산화를 통해 식 XIII의 3α,12α-디히드록시-7-옥소-5β-콜란산을 얻고,
    Figure 112019038795556-pct00033
    XIII
    이어서 효소적 산화로 식 XI의 3α-히드록시-7,12-디옥소-5β-콜란산(12옥소-KLC), 및 이어지는 환원으로 식 XII의 스테레오아이소머적 히드록시 화합물 3α, 7β-디히드록시-12-옥소-5β-콜란산(12-케토-우르소데옥시콜산)을 얻거나,
    또는
    C) 산화를 통해 식 XIII의 3α, 12α-디히드록시-7-옥소-5β-콜란산을 얻고 이어지는 효소적 환원에 의해 식 XIV의 3α,7β,12α-트리히드록시-5β-콜란산을 얻고
    Figure 112019038795556-pct00034
    XIV
    이어지는 산화로 식 XII의 스테레오아이소머적 히드록시 화합물 3α,7β-디히드록시-12-옥소-5β-콜란산 (12-케토-우르소데옥시콜란산)이 얻어지는 효소적 에피머화를 위해 사용되고;
    3 입체특이적 탈수소효소를 사용하며, 이들 중 2개는 반대적 입체특이성을 갖는 것을 특징으로 하는 산화환원 보조인자의 효소적 재생 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    환원을 통해 글루코오스가 소르비톨이 되고 이어지는 산화에 의해 프룩토오스가 되는 글루코오스의 아이소머화를 위하여 C5- 또는 C6-당의 아이소머화에 사용되는 것을 특징으로 하는 산화환원 보조인자의 효소적 재생 방법.
  12. 제1항에 있어서,
    생성물 형성에 관련된 산화 반응을 위한 기질은 동일한 배치에 적어도 5% (w/v) 이상의 농도로 제공되는 것을 특징으로 하는 산화환원 보조인자의 효소적 재생 방법.
  13. 제1항에 있어서,
    전체로서, 생성물 형성 반응에서 ≥70%의 재사용율이 얻어지는 것을 특징으로 하는 산화환원 보조인자의 효소적 재생 방법.
  14. 삭제
  15. 삭제
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