WO2013053210A1

WO2013053210A1 - 果胶酶的固定化载体与制备和固定化果胶酶的方法

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Publication number: WO2013053210A1
Application number: PCT/CN2012/070180
Authority: WO
Inventors: 王宝维; 卢燕燕; 葛文华; 张名爱; 岳斌
Original assignee: 青岛农业大学
Priority date: 2011-10-10
Filing date: 2012-01-10
Publication date: 2013-04-18
Also published as: CN102337258A; CN102337258B

Abstract

一种果胶酶的固定化载体与制备方法和固定化果胶酶的方法。是对果胶酶实现均匀酶解、异相回收、重复利用能力的载体，是含铁量50%〜70%的、粒径受控超声波、且与时间呈线性正相关，粒径为10〜80nm的纳米级磁性淀粉微球。应用于果胶酶，特别是应用于鹅源草酸青霉果胶酶固定化。首先制备淀粉乳，FeCl₃、FeCl₂与淀粉乳均匀混合，调pH值，超声处理后搅拌，酸中和，95%乙醇洗涤，磁铁分离，真空干燥。果胶酶固定化步骤：果胶酶溶液制备；载体活化；果胶酶的固定化和分离干燥固定化果胶酶。本发明的载体大大提高了酶使用效率，降低原材料和能源消耗，防止环境污染，有利工业化生产，而广泛用于果汁、蔬菜汁加工等领域。

Description

果胶酶的固定化载体与制备和固定化果胶酶的方法

技术领域

本发明涉及一种果胶酶的固定化载体与制备方法和固定化果胶酶的方法，属酶工程领域。

背景技术

磁性高分子微球是一类性能优良的功能高分子材料，是以合成高分子或生物高分子为载体，通过吸附和包埋 Fe₂0₃、 Fe₃0₄或其它磁性粒子，形成具有磁性的功能高分子材料。磁性高分子微球是核壳式结构的微小胶囊，制备磁性微球的磁核主要是 Fe₃0₄等金属氧化物，壳层主要由两类物质组成：一类是合成高分子，主要有聚乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酞胺、聚乙烯醇、硝化纤维及聚乙烯醉縮丁醛等，不可生物降解；另一类是生物高分子，主要有淀粉、明胶、白蛋白、聚乳酸、藻酸钙等，可生物降解。磁性高分子微球的壳层与磁核的结合主要是通过范德华力、氢键、配位键的作用，高分子借助于这些作用力，牢牢地束缚于金属氧化物晶体表面，形成坚实的球状结构，作为固定化酶载体的顺磁性高分子微球。

果胶酶（Pectina_Se，PE ) 由于反应条件温和，专一性强，催化效率高，反应容易控制，被广泛用于食品、酿酒、环保、医药及纺织工业领域，已成为世界四大酶制剂之一。游离果胶酶在使用过程中易随环境的变化变性失活，且不易从反应体系中分离重复使用。酶固定化技术是实现酶重复连续使用和改善其稳定性的有效手段。

酶工程领域中果胶酶的固定化载体和制备方法向来是重要研究课题。其中固定化载体主要有一、化学方法的水解法（即共沉淀法），将一定比例的 FeCl₃ 和 FeCl₂和到合成高分子溶液中，加上碱性溶液，使生成 Fe₃0₄磁性粒子，该方法制得的磁性高分子微球粒子的粒径分布较宽，不均匀；二、物理方法中包括高能球磨方法、悬浮聚合法与反相悬浮再生法的三种，其获得磁性高分子材料中的磁性粒子互相作用，极易团聚，难以实现超顺磁性能。

关于果胶酶的研究有 CN102010858A (—种果胶酶固定化的载体及固定化方法），主要是以海藻酸钠磁性微球为载体，该载体有 Fe₃0₄磁粉、海藻酸钠、戊二醛三部分组成，由于专门加入 Fe₃0₄磁粉，属物理方法合成，因此极易团聚，粒径较大，难以实现超顺磁性能，外部形貌成片状，不利于果胶酶的结合，官能团特征不明显，不利于定向选择交联剂。所以寻求更加实用和有效的果胶酶固定化载体，进一步优化酶固定化工艺是非常必要的。

又，由于鹅源草酸青霉果胶酶是从鹅肠道提取的一种草酸青霉发酵产生的果胶酶，是属于动物源果胶酶，与由黑曲霉发酵产生的市售果胶酶来源不同，已有技术至今未有更适合的载体，为鹅源草酸青霉果胶酶的科学利用提供依据。发明内容

本发明目的是提供一种果胶酶的固定化载体及其制备方法，以弥补现有技术的不足。

本发明的另一目的是将该载体应用于果胶酶的固定化，特别是将其应用于鹅源草酸青霉果胶酶的固定化，为动物源果胶酶的科学高效利用提供新方法，以用来弥补传统技术的不足。

本发明是对共沉淀法的改进，即利用混合共沉淀法制备纳米级磁性淀粉微球载体，在溶解有 Fe²⁺、 Fe³⁺的混合溶液中加入沉淀剂碱溶液，并与淀粉乳混合反应，生成组分均匀的沉淀，沉淀热分解得到纳米级磁性淀粉微球。以达到其一通过溶液中的各种化学反应直接得到组分均一的纳米粉体，其二是容易制备粒度小而且分布均匀的纳米粉体，以增大比表面积，利于载体官能团与果胶酶非活性基团的紧密结合，利于和果胶酶的紧密结合。

本发明中又利用超声波作用，不但弥补共沉淀法中粒径不均匀的不足，而且可以通过改变超声波处理时间、频率、功率条件来有效控制粒径的大小，从而得到需要的目标粒径的纳米级磁性淀粉微球，以进一步提高微粒作为载体的靶向性，实现有目的的选择不同粒径的载体进行不同种酶的固定。处理难以固定化的果胶酶,如鹅源草酸青霉果胶酶等.

本发明的载体还能对鹅源草酸青霉果胶酶进行固定化，鹅源草酸青霉果胶酶是青岛农业大学优质水禽研究所从鹅盲肠筛选到 1株真菌 F67(2006年)，经中国科学院微生物研究所鉴定为草酸青霉，以该菌为发酵菌种制备的果胶酶，由于制酶菌种不同，最适温度、最适 pH等理化条件不同。研究鹅源草酸青霉果胶酶的固定化，研究其固定化后的重复使用率及最适作用条件，对于经济高效、科学合理的利用鹅源草酸青霉果胶酶有重大意义。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种果胶酶固定化载体，是具有对果胶酶实现均匀酶解、异相回收、重复利用能力的载体，其特征在于该载体是含铁量 50%〜70%的、粒径可受超声波控制的、且与时间呈线性正相关，粒径范围为 ΙΟηπ！〜 80nm 的纳米级磁性淀粉微球。

上述果胶酶固定化载体（即纳米级磁性淀粉微球载体）的制备方法如下：

( 1 ) 首先用去离子水和淀粉搅拌分散成浓度为 30%〜50%的淀粉乳；

(2 ) 按 1 : 1〜1： 2的比例称取 FeCl₃、 FeCl₂，用去离子水溶解定容至淀粉乳的 10〜15倍，倒入淀粉乳，置 65°C水浴中升温，滴加 0.5M碱溶液调至 pH 值为 9〜13；

( 3 )将上述调好 pH的混合液体用超声处理 20min~50min; 将混匀后的液体置于 65°C水浴中搅拌，静置冷却至室温，用酸溶液中和至中性；

(4) 将上述中和后的固液混合物用 95%乙醇洗涤 3次，然后利用剩余磁化强度为 12.3T的磁铁使磁性淀粉微球与液体分离，倾去上清液，在 -20°C〜- 45°C、 20Pa〜100Pa下真空冷冻干燥即得到纳米级磁性淀粉微球载体。

本发明的固定化载体应用于果胶酶的固定化，特别是应用于动物源果胶酶的固定化——鹅源草酸青霉果胶酶固定化。

所述步骤（1 ) 中的淀粉为谷类淀粉、薯类淀粉或者其他类淀粉。其淀粉乳 pH值为自然 pH。

所述步骤（2) 中的可溶性盐为 Fe₂(S0₄)₃、 FeS0₄或者 FeP0₄、 Fe₃(P0₄)₂。所述步骤（2) 中的碱溶液为 NaOH、 KOH及其他碱溶液，也可为碱性盐溶液。

所述步骤（3 )中的超声处理条件为 10W~950W、 20KHz〜25KHz、 20~50min，超声处理时间越长，功率越大，纳米级磁性淀粉微球载体的粒径越小。

所述步骤（3 ) 中的酸溶液为醋酸、稀硫酸或者稀盐酸。

所述步骤（4) 中的真空冷冻干燥条件为 -20°C〜- 45°C、 20Pa〜： L00Pa。

与现有技术相比，本发明有如下的优点：

( 1 ) 本发明的载体，采用可生物降解、对环境友好、含有大量羟基的天然再生资源淀粉作为壳层，具有良好的生物兼容性，可以很好地保持酶的活性和稳定性，提高了酶的使用效率。

(2) 本发明的载体，直接利用？₆( 1₃与？₆( 1₂在碱性作用下反应生成 Fe₃0₄ 磁分子，与淀粉在反应过程中结合，且无需在厌氧环境下进行，使磁分子与淀粉结合更紧密，更有利于工业化生产，降低成本。

(3 ) 本发明的载体，利用真空冷冻干燥，减少鼓风加热干燥中载体中羟基、羧基官能团的活性损失，制备的载体中有效官能团回收率更高。

(4) 本发明的载体可以使果胶酶重复使用，能够降低原材料和能源消耗，减少工业废渣废液排放，防止环境污染，可广泛用于果汁、蔬菜汁加工等领域，是一项具有广谱重大开发价值的酶固定化载体。

本发明的果胶酶固定化方法，包括如下步骤和工艺条件：

( 1 ) 果胶酶溶液制备：称取 1~3份果胶酶，去离子水溶解，定容至 100倍体积。

(2 ) 磁性淀粉微球载体活化：称取 1份磁性玉米淀粉微球载体，加入 20倍体积的 2.5%~7.5%的戊二醛，使磁性微球充分浸没在戊二醛溶液中，于摇床中 30°C、 200r/min震荡交联 6h~8h，产物用去离子水充分洗涤，利用剩余磁化强度为 12. 3T的磁铁使磁性淀粉微球与液体分离，倾去上清液，在 -20°C〜- 45°C、 20Pa〜100Pa下真空冷冻干燥，即得到活化的磁性淀粉微球。

(3 ) 果胶酶的固定化：称取已活化的磁性淀粉微球 1份、 1%的鹅源草酸青霉果胶酶溶液 1~5份，用 pH为 3~5的缓冲液定容至 25倍体积，于 30°C、转速 200r/min下在摇床中固定化 2h~6h。 (4)固定化果胶酶分离干燥：将步骤（3 )所得产物用剩余磁化强度为 12. 3T 的磁铁使磁性淀粉微球与液体分离，倾去上清液，用缓冲液反复洗涤直至上清液中检测不到蛋白质为止，在 _20°C〜- 45°C、 20Pa〜100Pa下真空冷冻干燥，即得磁性固定化果胶酶。

所述步骤（1 ) 中果胶酶溶液制备中定容的体积由固体果胶酶的酶活决定，稀释至果胶酶溶液酶活为 1000u/ml。

所属步骤（2) 中的缓冲溶液可以为 pH3~5醋酸 -醋酸钠缓冲溶液、磷酸-磷酸二氢钠缓冲溶液等。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

( 1 ) 本发明的载体为纳米级磁性淀粉微球，粒径大小和分布均匀，使固定化果胶酶均匀发生反应。

(2 ) 本发明利用真空冷冻干燥，使酶活保存率更高。

(3 ) 本发明利用响应面筛选试验确定的磁性淀粉微球固定化最佳条件，得出的结果可更好的用于实际生产预测。

(4) 本发明利用的鹅源草酸青霉果胶酶是动物源果胶酶，对动物源果胶酶的科学高效利用具有重要意义，具有较高的经济效益和社会效益。

附图说明

图 1 本发明超声处理 50min的纳米级磁性淀粉微球载体的粒径图。（经超声处理 50min的微球粒径 30~60nm比例较大，分布范围窄）

图 2 本发明固定化鹅源草酸青霉果胶酶的粒径图。（固定化酶的粒径 70~170nm比例较大，分布范围较广）

图 3 本发明的扫描电镜下超声处理的纳米级磁性淀粉微球载体形态图。 (粒径均匀，球形，团聚少，结晶良好，分散程度好。）

图 4本发明的扫描电镜下固定化鹅源草酸青霉果胶酶微球形态图。（固定化酶粒径变大，与戊二醛与果胶酶发生交联。）

图 5本发明纳米级磁性淀粉微球载体 FT-IR 图谱。（磁性淀粉微球含有 1628cm- ¹羟基、 3421cm⁴羧基、 580cm⁴Fe₃O₄特征吸收峰）

图 6本发明的固定化鹅源草酸青霉果胶酶的 FT-IR图谱。（除含有载体吸收峰外，还含有 1690~1500cm- 1475~1000cm- ¹双键伸縮振动区 X-H面内弯曲振动区）

具体实施方式

实施例 1

用去离子水和可溶性淀粉搅拌分散成浓度为 30%的淀粉乳。按 1 : 1.5的比例称取 FeCl₃、 FeCl₂, 用去离子水溶解定容至淀粉乳的 10倍，倒入淀粉乳，置 65°C水浴中升温。达到温度后滴加 0.5M NaOH溶液调 pH值为 10，在 25 KHz、 900W功率下超声波浪处理 30min。将处理后的液体置于 65°C水浴中搅拌 1.5h，反应结束后静置冷却至室温，用冰醋酸中和至中性，用 95%乙醇洗涤 3次，利用剩余磁化强度为 12.3T的磁铁使磁性淀粉微球与液体分离，倾去上清液，在 -45 °C、 20Pa下真空干燥，得到磁性淀粉微球载体。该载体经激光衍射粒度仪检测，粒径为 10.29nm〜80.45nm,具有顺磁性，又经傅里叶红外光谱仪检测，如图 5所示，该载体有较明显的 580cm- 6₃0₄、 1628cm⁴羟基、 3421cm⁴羧基特征吸收峰，因此是果胶酶固定化的良好载体，如图 3所示扫描电镜照片，该载体粒径均匀、团聚少、结晶良好，是果胶酶固定化的良好载体。

实施例 2

用去离子水和玉米淀粉搅拌分散成浓度为 40%的淀粉乳。按 1 : 2的比例称取 Fe₂(S0₄)₃、 FeS0₄，用去离子水溶解定容至淀粉乳的 15倍，倒入淀粉乳，置 65°C水浴中升温。达到温度后滴加 0.5M KOH溶液调 pH值为 11， 20KHz、 450W 功率下超声处理 20min。将处理后的液体置于 65°C水浴中搅拌 2h，反应结束后静置冷却至室温，用冰醋酸中和至中性，用 95%乙醇洗涤 3次，利用剩余磁化强度为 12.3T的磁铁使磁性淀粉微球与液体分离，倾去上清液，在 -45 °C、 20Pa 下真空干燥，得到磁性淀粉微球载体。经激光衍射粒度仪检测，该载体粒径为 14.35nm〜80.31nm，具有顺磁性,经傅里叶红外光谱仪检测，如图 5所示，该微球有较明显的 580cm- 6₃0₄、 1628cm- ¹羟基、 3421cm- ¹羧基特征吸收峰，如图 3 所示扫描电镜照片，该载体粒径均匀、团聚少、结晶良好，是果胶酶的固定化的良好载体。

实施例 3

称取 5%戊二醛交联的活化磁性载体 1份、 1%的鹅源草酸青霉果胶酶溶液 3 份，用 pH为 4的缓冲液定容至 25倍体积，于 30°C、转速 200r/min下在摇床中振荡反应 3h，用剩余磁化强度为 12. 3T的磁铁使磁性淀粉微球与液体分离，倾去上清液，用缓冲液反复洗涤直至上清液中检测不到蛋白质为止，在 _20°C〜 -45°C、 20〜100Pa下真空冷冻干燥，即得磁性固定化果胶酶。利用激光衍射粒度仪、扫描电镜、傅里叶红外光谱仪、 X衍射仪测得结果可知，固定化果胶酶与磁性淀粉微球载体相比粒径变大，官能团有所变化，说明果胶酶已交联到磁性淀粉载体上。用次碘酸钠法测定酶活回收率，酶活回收率为 85. 6%, 适用 pH为 3-5 , 游离酶在 40°C以后酶活显著下降，而固定化酶在 50°C时显著下降，果胶酶固定化重复使用 5次相对酶活仍为 69. 6%，重复使用 8次相对酶活为 60. 1%。实施例 4

称取 7. 5%戊二醛交联的活化磁性载体 2份、 1%的鹅源草酸青霉果胶酶溶液 4份，用 pH为 4的缓冲液定容至 25倍体积，于 30°C、转速 200r/min下在摇床中振荡反应 2h，用剩余磁化强度为 12. 3T的磁铁使磁性淀粉微球与液体分离，倾去上清液，用缓冲液反复洗涤直至上清液中检测不到蛋白质为止，在 _20°C〜 -45°C、 20〜100Pa下真空冷冻干燥，即得磁性固定化果胶酶。利用激光衍射粒度仪、扫描电镜、傅里叶红外光谱仪、 X衍射仪测得结果可知，固定化果胶酶与磁性淀粉微球载体相比粒径变大，官能团有所变化，说明果胶酶已交联到磁性淀粉载体上。用次碘酸钠法测定酶活回收率，酶活回收率为 85. 2%, 适用 pH为 3-5 , 游离酶在 40°C以后酶活显著下降，而固定化酶在 50°C时显著下降，果胶酶固定化重复使用 5次相对酶活仍为 70. 6%，重复使用 8次相对酶活为 59. 7%。实施例 5

称取 2. 5%戊二醛交联的活化磁性载体 5份、 1%的鹅源草酸青霉果胶酶溶液 5份，用 pH为 4的缓冲液定容至 25倍体积，于 30°C、转速 200r/min下在摇床中振荡反应 6h，用剩余磁化强度为 12. 3T的磁铁使磁性淀粉微球与液体分离，倾去上清液，用缓冲液反复洗涤直至上清液中检测不到蛋白质为止，在 _20°C〜 -45°C、 20Pa〜100Pa下真空冷冻干燥，即得磁性固定化果胶酶。利用激光衍射粒度仪、扫描电镜、傅里叶红外光谱仪、 X衍射仪测得结果可知，固定化果胶酶与磁性淀粉微球载体相比粒径变大，官能团有所变化，说明果胶酶已交联到磁性淀粉载体上。用次碘酸钠法测定酶活回收率，酶活回收率为 86%, 适用 pH为 3-5 , 游离酶在 40°C以后酶活显著下降，而固定化酶在 50°C时显著下降，果胶酶固定化重复使用 5次相对酶活仍为 70. 2%, 重复使用 8次相对酶活为 60. 4%。实施例 6 固定化市售黑曲霉果胶酶

称取 5%戊二醛交联的活化磁性载体 1份、 1%的市售黑曲霉果胶酶溶液 3份，用 pH为 4的缓冲液定容至 25倍体积，于 30°C、转速 200r/min下在摇床中振荡反应 3h，用剩余磁化强度为 12. 3T的磁铁使磁性淀粉微球与液体分离，倾去上清液，用缓冲液反复洗涤直至上清液中检测不到蛋白质为止，在 -20°C〜- 45°C、 20〜100Pa下真空冷冻干燥，即得磁性固定化果胶酶。利用激光衍射粒度仪、扫描电镜、傅里叶红外光谱仪、 X衍射仪测得结果可知，固定化果胶酶与磁性淀粉微球载体相比粒径变大，官能团有所变化，说明果胶酶已交联到磁性淀粉载体上。用次碘酸钠法测定酶活回收率，酶活回收率为 84. 7%, 适用 pH为 3~5，游离酶在 40 °C以后酶活显著下降，而固定化酶在 45°C时显著下降，果胶酶固定化重复使用 5次相对酶活仍为 69. 4%，重复使用 8次相对酶活为 58. 9%。表明，本发明也可以应用于其它来源的果胶酶。

工业实用性

本发明的载体为纳米级磁性淀粉微球，粒径大小和分布均匀，使固定化果胶酶均匀发生反应；利用真空冷冻干燥，使酶活保存率更高。确定的磁性淀粉微球固定化最佳条件，得出的结果可更好的用于实际生产预测。本发明利用的鹅源草酸青霉果胶酶是动物源果胶酶，对动物源果胶酶的科学高效利用具有重要意义，具有较高的经济效益和社会效益。

Claims

WO 2013/053210 权利要求书 PCT/CN2012/070180

1、一种果胶酶固定化载体，是具有对果胶酶实现均匀酶解、异相回收、重复利用能力的载体，其特征在于该载体是含铁量 50%〜70%的、粒径可受超声波控制的、且与时间呈线性正相关，粒径范围为 ΙΟηπ！〜 80nm 的纳米级磁性淀粉微球。

2、权利要求 1的固定化载体的制备方法，其特征在于制备步骤如下：

(2) 按 1 : 1〜1： 2的比例称取可溶性盐 FeCl₃、 FeCl₂，用去离子水溶解定容至淀粉乳的 10〜15倍，倒入淀粉乳，置 65°C水浴中升温，滴加 0.5M碱溶液调至 pH值为 9〜13；

(3 ) 将上述调好 pH的混合液体用超声波处理 20min~50min再置于 65°C水浴中搅拌，静置冷却至室温，用酸溶液中和至中性；

(4) 将上述中和后的固液混合物用 95%乙醇洗涤 3次，然后利用剩余磁化强度为 12.3T的磁铁使磁性淀粉微球与液体分离，倾去上清液，在 -20°C〜- 45°C、 20Pa〜100Pa下真空冷冻干燥即得固定化载体。

3、如权利要求 2所述的固定化载体的制备方法，其特征在于上述步骤（3 ) 中的超声处理条件为， 10W~950W、 20KHz~25KHz、 20min~50min。

4、如权利要求 2所述的固定化载体的制备方法，其特征在于上述步骤（4) 中的真空冷冻干燥条件为 -20°C〜- 45°C、 20Pa〜： L00Pa。

5、如权利要求 2所述的固定化载体的制备方法，其特征在于上述步骤（2) 中的为 Fe₂(S0₄)₃、 FeS0₄或者 FeP0₄、 Fe₃(P0₄)₂。

6、如权利要求 2所述的固定化载体的制备方法，其特征在于上述步骤（2) 中的碱溶液为 NaOH、 KOH及其他碱溶液，或者为碱性盐溶液。

7、如权利要求 2所述的固定化载体的制备方法，其特征在于上述步骤（3 ) 中的酸溶液为醋酸、稀硫酸或者稀盐酸。

8、权利要求 1的固定化载体的用途，其特征在于该固定化载体应用于果胶酶的固定化，特别是应用于鹅源草酸青霉果胶酶固定化。

9、利用权利要求 1的固定化载体进行果胶酶固定化方法，其特征在于步骤如下：

( 1 ) 果胶酶溶液制备：称取 1~3份果胶酶，去离子水溶解，定容至 100倍体积；

(2) 磁性淀粉微球载体活化：称取 1份纳米级果胶酶磁性淀粉微球载体，加入 20倍体积的 2.5%~7.5%的戊二醛，使磁性微球充分浸没在戊二醛溶液中，于摇床中 30°C、 200r/min震荡交联 6h~8h，产物用去离子水充分洗涤，利用剩余磁化强度为 12.3T的磁铁使磁性淀粉微球与液体分离，倾去上清液，在 -20°C〜 -45°C、 20Pa〜100Pa下真空冷冻干燥，即得到活化的固定化载体； WO 2013/053210 权利要求书 PCT/CN2012/070180

(3 ) 果胶酶的固定化：称取已活化的纳米级磁性淀粉微球载体载体 1份、 1%的鹅源草酸青霉果胶酶溶液 1~5份，用 pH为 3~5的缓冲液定容至 25倍体积，于 30°C、转速 200r/min下在摇床中固定化 2h~6h;

(4)固定化果胶酶分离干燥：将步骤（3 )所得产物用剩余磁化强度为 12.3T 的磁铁使磁性淀粉微球与液体分离，倾去上清液，用缓冲液反复洗涤直至上清液中检测不到蛋白质为止，在 -20°C〜- 45°C、 20Pa〜100Pa下真空冷冻干燥，即得磁性固定化果胶酶。

10、如权利要求 9所述的果胶酶固定化方法，其特征在于上述步骤（2) 中的缓冲溶液为 pH3~5醋酸-醋酸钠缓冲溶液或者磷酸-磷酸二氢钠缓冲溶液。