CN112680485A - 固定化重组大肠杆菌将L-缬氨酸转化为α-酮缬氨酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了固定化重组大肠杆菌将L‑缬氨酸转化为α‑酮缬氨酸的方法，属于生物工程技术领域。本发明将能够表达L‑氨基酸脱氨酶的基因工程菌包埋在纳米四氧化三铁‑聚乙烯醇‑海藻酸钠复合载体中，将固定化细胞用于L‑缬氨酸转化为α‑酮缬氨酸。所得固定化细胞稳定性好，连续使用8批次后，仍具有较高的活力，对底物的利用率高，降低了生产成本。

Description

固定化重组大肠杆菌将L-缬氨酸转化为α-酮缬氨酸的方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及固定化重组大肠杆菌将L-缬氨酸转化为α-酮缬氨酸的方法。

背景技术

α-酮缬氨酸(KIV)是生物合成中的重要中间体广泛应用于食品、饲料、医药和化学合成等行业。目前，KIV可通过化学合成法、微生物发酵法和酶转化法合成。化学法合成KIV步骤多，且需要苛刻的生产条件。微生物发酵法存在发酵周期长、产量低等缺点。相比而言，酶转化法具有底物转化率高、产量高、产物易分离、环境污染小等优点，适合KIV的生产。

固定化技术是现代生物技术及其工业化环节中的一种核心技术。日本的千佃一郎在1960年开始研究固定化氨基酰化酶，并在1969年将其首次运用到工业化生产中，这在国际上是个突破。细胞固定化技术是指利用各种理化方法将游离细胞定位在有限的空间内并使其保持活力和可以反复利用的一种技术。固定化细胞有许多优点，能够长期保持细胞活力，可以反复利用，反应完成后，还易与产物分离，极大地提高了工业生产效率。当然，固定化细胞也存在一些缺点，主要表现为：①必须保持菌体的完整，防止菌体的自溶，否则会影响产物的纯度；②必须抑制细胞内蛋白酶的分解作用；③由于细胞内有多种酶存在，往往有副产物形成，为防止副产物必须抑制其他酶活力；④细胞膜或细胞壁会造成底物渗透与扩散的障碍。

重组大肠杆菌E.coli BL21(pET-28a-PmLAAD)内含有L-氨基酸脱氨酶，尚无利用固定化重组大肠杆菌E.coli BL21(pET-28a-PmLAAD)催化L-缬氨酸转化为α-酮缬氨酸的方法。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是提供一种固定化重组大肠杆菌E.coli BL21(pET-28a-PmLAAD)催化L-缬氨酸转化为α-酮缬氨酸的方法。

[技术方案]

本发明提供一种固定化重组大肠杆菌将L-缬氨酸转化为α-酮缬氨酸的方法，所述重组大肠杆菌是能够表达L-氨基酸脱氨酶的基因工程菌，该方法采用包埋法，将重组大肠杆菌包埋在纳米四氧化三铁-聚乙烯醇-海藻酸钠复合载体中，将固定化细胞用于L-缬氨酸转化为α-酮缬氨酸。包埋细胞时，可以控制纳米四氧化三铁、聚乙烯醇、海藻酸钠三种材料的使用剂量，来获得比较好的固定化效果。

所述方法包括如下步骤：

(1)细胞悬液的制备：将重组大肠杆菌E.coli BL21(pET-28a-PmLAAD)进行扩大培养，并将菌体清洗后，用生理盐水溶液重悬得到菌悬液；

(2)微生物细胞的固定化：取纳米四氧化三铁，在超声的协助下使其溶于水中，之后取聚乙烯醇和海藻酸钠，加入到纳米四氧化三铁水溶液中并加热使聚乙烯醇和海藻酸钠溶解，所得到的混合物中，聚乙烯醇和海藻酸钠的最终浓度分别为2-4％和6-10％，纳米四氧化三铁的浓度是0.1g/L；

将所得到的混合物灭菌，并加入菌悬液，使得混合液中细胞浓度为0.5-2％(g/100mL)，混匀后，将混合液滴加到含有2％氯化钙的饱和硼酸溶液中，静置4-12h，过滤收集得到固定化菌体，并用去离子水反复冲洗固定化菌体3-4次；

(3)固定化细胞转化L-缬氨酸：混合固定化菌体、反应液和底物L-缬氨酸，进行转化反应；

(4)固定化细胞的重复利用性：在某一批次的反应结束后，从反应液中回收固定化菌体，经过清洗后，将固定化菌体再次投入新一批次的反应；每一批次转化反应进行20-32h。

具体地，可以采用以下步骤和条件：

(1)细胞悬液的制备：将重组大肠杆菌种子液按体积比2％的接种量接种到TB培养基中，诱导培养12-16h；培养结束后，将培养物离心并收集得到菌体，将菌体用去离子水清洗两次后，用生理盐水溶液重悬菌体；

(2)微生物细胞的固定化：取纳米四氧化三铁，在超声的协助下使其溶于水中，之后取聚乙烯醇和海藻酸钠，加入到纳米四氧化三铁水溶液中并加热使聚乙烯醇和海藻酸钠溶解，所得到的混合物中，聚乙烯醇和海藻酸钠的最终浓度分别为2-4％和6-10％，纳米四氧化三铁的浓度是0.1g/L；将所得到的混合物放入灭菌锅中，于121℃灭菌10min；待混合液冷却至室温时，立即加入用生理盐水配置的菌悬液，使得混合液中细胞浓度为0.5-2％(OD₆₀₀＝8)，混匀后，将混合液用蠕动泵从20cm高处滴入到含有2％氯化钙的饱和硼酸溶液中，静置4-12h，用纱布过滤收集得到固定化菌体，其直径为2.5-4.5mm，用去离子水反复冲洗固定化菌体3-4次；

(3)固定化细胞转化L-缬氨酸：在摇瓶中依次加入固定化细胞(菌体)、反应液和底物L-缬氨酸，进行转化反应；

(4)固定化细胞的重复利用性：固定化细胞在上述步骤(3)所述条件下进行反应，20-32h转化1批次，每批次反应结束后，用纱布将固定化细胞过滤出来，用去离子水清洗固定化细胞，然后开始下一批次反应。

作为优选，步骤(1)中所述的TB培养基的组成为：甘油4g/L，胰蛋白胨12g/L，酵母粉24g/L，KH₂PO₄ 2.31g/L，K₂HPO₄·3H₂O 16.42g/L。

作为优选，步骤(1)中培养的条件为：接种量为2％，诱导时间为12h。

作为优选，步骤(3)中反应液的组成为NaCl 8g/L，KH₂PO₄ 0.2g/L，KCl 0.2g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g/L。

作为优选，步骤(3)中所述的固定化细胞浓度为20g/L反应液。

作为优选，步骤(3)中所述的转化反应的时间为24h，反应温度是35℃，转速200rpm，pH＝8.5。

作为优选，步骤(3)中底物的浓度是100g/L。

[有益效果]

(1)本发明的方法首次采用固定化重组大肠杆菌细胞生产α-酮缬氨酸，以纳米四氧化三铁、聚乙烯醇和海藻酸钠作为载体，所获得的固定化细胞稳定性好，连续使用8批次后，仍具有较高的活力。

(2)本发明以纳米四氧化三铁作为固定化载体的成分之一，由于使用海藻酸钠-聚乙烯醇进行固定化时，存在机械强度不高，传质效率不高，反应两批之后，固定化小球会发生破碎，使用纳米四氧化三铁可以降低传质限制，增大固定化小球内部的比表面积，改善固定化小球的机械强度，兼具吸附法和包埋法的优点。

(2)本发明同游离细胞相比，固定化细胞易从反应液中分离出来，对底物的利用率高，降低了生产成本。

(3)本发明的方法实现了菌体的重复利用，减少了菌体的培养次数，降低了菌体培养过程中的能源消耗，从而降低了生产成本。

附图说明

图1为固定化细胞与游离细胞的热稳定性。

图2为固定化重组大肠杆菌转化L-缬氨酸的重复使用批次。

具体实施方式

重组大肠杆菌E.coli BL21(pET-28a-PmiLAAD)的构建方法参见专利：一种高产α-酮异戊酸的方法，CN109371070A。

实施例1：制备固定化重组大肠杆菌细胞并转化L-缬氨酸生成α-酮缬氨酸

(1)：细胞悬液的制备

将大肠杆菌种子液按2％的接种量接种到TB培养基中(培养基组成为:甘油4g/L，胰蛋白胨12g/L，酵母粉24g/L，KH₂PO₄ 2.31g/L，K₂HPO₄·3H₂O 16.42g/L)于摇瓶中培养24h，培养条件为25℃。之后，离心培养物得到菌体，用去离子水清洗菌体2次后，并用PBS缓冲液重悬菌体，菌悬液中菌体的浓度是OD600＝8。

(2)：微生物细胞的固定化

取纳米四氧化三铁，在超声的协助下使其溶于水中，之后取聚乙烯醇和海藻酸钠，加入到纳米四氧化三铁水溶液中并加热使聚乙烯醇和海藻酸钠溶解，所得到的混合物中，聚乙烯醇和海藻酸钠的最终浓度分别为6％(g/100mL)和2％(g/100mL)，纳米四氧化三铁的浓度是0.1g/L，将混合物放入灭菌锅中121℃灭菌20min。

待混合液冷却至室温时，立即加入配制好的菌悬液，使得混合液中细胞浓度为0.5-2％。混匀后，将混合物用蠕动泵从15cm高处滴入到含有2％氯化钙的饱和硼酸溶液中，然后放入4℃冰箱中固化4h，固化结束后得到固定化菌体，其直径约为3mm，用筛子过滤并用无菌蒸馏水反复冲洗固定化菌体3-4次，以清除过量的钙离子和没有固定的细胞。

(3)：固定化细胞转化L-缬氨酸

将30g/L的固定化菌体和100g/L的底物L-缬氨酸悬浮于20ml的转化液中(转化液组成：NaCl 8g/L，KH₂PO₄ 0.2g/L，KCl 0.2g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g/L)，于35℃，转速200rpm，pH＝8.5条件下进行转化反应24h。24h后，取部分反应液离心，用高效液相色谱仪检测固定化细胞的转化率。将离心所得的上清液稀释10倍，过0.22μm的水膜，然后用高效液相色谱进行检测，将所得峰面积带入标样(酮缬氨酸，纯度95％，购自阿拉丁)峰面积，计算出所得缬氨酸的产量，计算转化率(即产物与底物投加量之比)。

对照例1不添加纳米四氧化三铁制备固定化重组大肠杆菌细胞并转化L-缬氨酸生成α-酮缬氨酸

制作方法：1.0g湿菌体悬浮于5mL生理盐水，形成的菌悬液与15mL海藻酸钠-聚乙烯醇混合溶液混匀，海藻酸钠终质量浓度为30g/L，聚乙烯醇终质量浓度为100g/L。将注射器缓慢滴入到200mL含3.0％CaCl₂溶液中，室温中放置8h使其硬化。倾去CaCl₂溶液，生理盐水洗涤3次，于4℃冰箱保存备用。

之后将所得固定化细胞投入反应，将30g/L的固定化菌体和100g/L的底物L-缬氨酸悬浮于20ml的转化液中(转化液组成：NaCl 8g/L，KH₂PO₄ 0.2g/L，KCl 0.2g/L，Na₂HPO₄·12H₂O2.9g/L)，转化24h。所得结果如表1所示：

表1

实施例2：制备固定化重组大肠杆菌细胞并转化L-缬氨酸生成α-酮缬氨酸

将30g/L的固定化菌体和100g/L的底物L-缬氨酸悬浮于20ml的转化液中(转化液组成：NaCl 8g/L，KH₂PO₄ 0.2g/L，KCl 0.2g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g/L)，分别于20、25、30、35、40、45、50℃，转速200rpm，pH＝8.5条件下进行转化反应24h。24h后，取部分反应液离心，将离心得到的上清液稀释10倍，过0.22μm的水膜后，用高效液相色谱仪检测固定化细胞的转化率。

结果如图1所示，游离细胞在30℃时转化率最高，随着温度升高，转化率逐渐降低；固定化细胞则在35-50℃时，转化率变化不大，说明固定化细胞的热稳定性好于游离细胞。

实施例3：制备固定化重组大肠杆菌细胞并转化L-缬氨酸生成α-酮缬氨酸

将30g/L的固定化菌体和100g/L的底物L-缬氨酸悬浮于20ml的转化液中(转化液组成：NaCl 8g/L，KH₂PO₄ 0.2g/L，KCl 0.2g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g/L)，于35℃，转速200rpm，pH＝8.5条件下进行转化反应24h，第一批次的反应结束，用pH8.5的PBS缓冲液清洗固定化细胞，将清洗后的固定化细胞在相同条件下进行反复转化。每批次反应结束后，取部分反应液离心，将离心得到的上清液稀释10倍，过0.22μm的水膜后，高效液相色谱仪检测固定化细胞的转化率。

结果如图2所示，固定化细胞转化10批后，固定化细胞转化率保持在50％以上。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种固定化重组大肠杆菌用于将L-缬氨酸转化为α-酮缬氨酸的方法，其特征在于，所述重组大肠杆菌是能够表达L-氨基酸脱氨酶的基因工程菌，将重组大肠杆菌包埋在纳米四氧化三铁-聚乙烯醇-海藻酸钠复合载体中，将固定化细胞用于L-缬氨酸转化为α-酮缬氨酸。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)细胞悬液的制备：将重组大肠杆菌制成菌悬液；

(2)微生物细胞的固定化：取纳米四氧化三铁，在超声波的协助下使其溶于水中，之后取聚乙烯醇和海藻酸钠，并加入到纳米四氧化三铁水溶液中，加热使聚乙烯醇和海藻酸钠溶解，纳米四氧化三铁、水、聚乙烯醇和海藻酸钠的混合物中，聚乙烯醇和海藻酸钠的最终浓度分别为2-4％和6-10％，纳米四氧化三铁的浓度是0.1g/L；

将所得到的混合物灭菌，并加入菌悬液，使得混合液的OD₆₀₀＝8，混匀后，将混合液滴加到含有2％氯化钙的饱和硼酸溶液中，静置4-12h，过滤收集得到固定化菌体，并清洗固定化菌体3-4次；

(3)固定化细胞转化L-缬氨酸：混合固定化菌体、反应液和底物L-缬氨酸，进行转化反应。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还对固定化细胞进行重复利用性：在某一批次的反应结束后，从反应液中回收固定化菌体，经过清洗后，将固定化菌体再次投入新一批次的反应；每一批次转化反应进行20-32h。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组大肠杆菌是E.coli BL21(pET-28a-PmLAAD)。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固定化菌体的直径为2.5-4.5mm。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中反应液的组成为NaCl 8g/L，KH₂PO₄ 0.2g/L，KCl 0.2g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g/L。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的固定化菌体的浓度为50-150g/L反应液，底物L-缬氨酸的浓度为65-100g/L。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的转化反应的时间为24h，反应温度是35℃，转速200rpm，pH＝8.5。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(3)中底物的浓度是100g/L。

10.应用权利要求1-9任一项所述的方法得到固定化重组大肠杆菌。

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