CN104237541A - 一种微流体器件及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种微流体器件及其在检测低丰度细胞、低丰度蛋白以及低丰度核酸生物标记的应用，微流体器件包括具有入口通道与出口通道的至少一个微流控室，微流控室内设置众多微结构元素，例如至少4位数的微结构和/或至少2位数的微通道等，其中，至少部分微结构元素具有富集或捕获功能。采用上述方案，本发明采用微结构元素实现吸附及捕获结构，可通过物理吸附与捕获或者化学吸附与捕获完成，使得微流体器件有效应用于富集和检测低丰度细胞、低丰度蛋白以及低丰度核酸生物标记等，适用于细胞释放、DNA、mDNA、RNA与NGS分析等，本发明结合细胞尺寸和比重以及抗体亲和的物理和化学原理，提高捕获成功率，具有很高的市场应用价值。

Description

一种微流体器件及其应用

技术领域

本发明涉及微流体技术，尤其涉及的是，一种微流体器件及其在检测低丰度细胞、低丰度蛋白以及低丰度核酸生物标记的应用。

背景技术

微流体技术是指在微观尺寸下控制、操作和检测复杂流体的技术，在生物、化学等科学实验中，经常需要对流体进行操作，如样品DNA的制备、液相色谱、PCR反应、电泳检测等操作都是在液相环境中进行。如果要将样品制备、生化反应、结果检测等步骤集成到生物芯片上，则实验所用流体的量就从毫升、微升级降至纳升或皮升级，这时功能强大的微流体装置就非常重要，从生物医学的角度看，微流体器件可大量节省试剂的用量，提高生产率、改善分析的有效性。

但是，现有的微流体器件没有针对检测低丰度细胞、低丰度蛋白以及低丰度核酸生物标记设计，因此，现有技术需要改进。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种新的微流体器件及其在检测低丰度细胞、低丰度蛋白以及低丰度核酸生物标记的应用。

本发明的技术方案如下：一种微流体器件，其包括具有入口通道与出口通道的微流控室，所述微流控室内设置众多微结构元素，其中，至少部分所述微结构元素中，具有吸附结构。

优选的，每一所述微结构中，其相异位置的横切面相异设置。

优选的，所述微结构为圆台形。

优选的，方阵排列各所述微结构。

优选的，所述微流控室内设置若干排微结构。

优选的，每排微结构中，各相邻微结构等距设置。

优选的，各排微结构变距设置。

优选的，所述微流体器件还设置若干功能区，每一所述功能区设置若干微结构。

本发明的又一技术方案如下：任一上述微流体器件在检测低丰度细胞、低丰度蛋白以及低丰度核酸生物标记的应用。

优选的，所述低丰度细胞为循环肿瘤细胞。

本发明的又一技术方案如下：任一上述微流体器件在细胞释放、DNA、mDNA、RNA、二代测序(NGS)分析的应用。

采用上述方案，本发明采用微结构吸附和/或捕获结构，可通过物理捕获或者化学吸附完成，使得微流体器件有效应用于检测低丰度细胞、低丰度蛋白以及低丰度核酸生物标记等，具有很高的市场应用价值。

附图说明

图1为本发明的一个实施例的圆台形微结构的示意图；

图2为本发明的一个实施例的方阵排列各所述微结构的示意图；

图3为本发明的一个实施例的各排微结构变距设置的示意图；

图4为本发明的又一个实施例的各排微结构变距设置的示意图；

图5、图6分别为本发明实施例的微结构排列示意图；

图7、图8分别为本发明实施例的检测应用示意图；

图9、图10分别为本发明实施例的流体方向示意图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面结合附图和具体实施例，对本发明进行更详细的说明。需要说明的是，当元件被表述“固定于”另一个元件，它可以直接在另一个元件上、或者其间可以存在一个或多个居中的元件。当一个元件被表述“连接”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件、或者其间可以存在一个或多个居中的元件。本说明书所使用的术语“垂直的”、“水平的”、“左”、“右”以及类似的表述只是为了说明的目的。

除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本说明书中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是用于限制本发明。本说明书所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明的一个实施例是，一种微流体器件，其包括具有入口通道(inlet)与出口通道(outlet)的至少一微流控室(microfluidic chamber)，例如，微流控室由塑料、玻璃或单晶硅材料制成。例如，微流体器件包括共用入口通道与出口通道的若干微流控室；和/或，微流体器件包括若干分别具有入口通道与出口通道的微流控室。

所述微流控室内设置众多微结构元素，例如至少4位数的微结构和/或至少2位数的微通道等；其中，微结构可理解为微结构元素或者微结构单元等；例如，至少部分所述微结构元素具有吸附、富集或捕获功能；并且，至少部分所述微结构元素中，具有吸附结构，用于实现吸附与捕获功能；又如，至少部分所述微结构元素中，具有捕获结构，用于实现吸附与捕获功能。例如，若干微结构元素具有吸附与捕获结构，例如化学吸附部；又如，若干微结构元素的组合，具有吸附与捕获结构，例如物理吸附部或者物理捕获部，请参考图7、图8；又如，若干微结构元素的组合，具有化学吸附结构和/或物理吸附、捕获结构。本发明各实施例采用微结构元素实现吸附及捕获结构，可通过物理吸附与捕获或者化学吸附与捕获完成；或者里，可理解为物理捕获与化学吸附，从而实现特定分子或者集团等的吸附、富集或捕获功能。这样，适用于细胞释放、DNA、mDNA、RNA与NGS分析等，本发明结合细胞尺寸和比重以及抗体亲和的物理和化学原理，提高了捕获成功率。优选的，所述微结构为微柱，例如，微结构元素包括微结构；又如，微结构元素包括微结构、微通道和/或由微结构组成的微通道等元素；又如，微结构元素包括微结构以及由微结构组成的微通道等元素；或者，微结构为类似于微结构的微型单元，如半球体、椭球体、棱锥体或其结合等。下面主要以微结构为例进行说明，例如，所述微结构为微柱，但是需要指出的是，微柱不作为对其他微结构元素或者微结构的限制。例如，所述微流控室内设置至少4位数的微结构，例如，微流控室内布有数千到数万个微结构；例如，微流控室高50至250微米，又如，微流控室中的微结构高50至250微米；优选的，微流控室中，每一微结构的高度与所述微流控室的高度相等。例如，其中，至少部分所述微结构设置吸附部，用于实现吸附与捕获功能。例如，吸附部设置若干固定位；又如，如图7、图8所示，若干微结构组成一吸附与捕获结构。例如，至少部分所述微结构设置至少一所述吸附部；又如，部分所述微结构仅设置一所述吸附部；又如，若干组微结构分别组成一物理吸附与捕获结构并且形成一组物理吸附与捕获结构，和/或，若干微结构设置至少一化学吸附结构；例如，若干组微结构分别组成一物理吸附与捕获结构并且形成一组物理吸附与捕获结构，其中，部分微结构设置至少一化学吸附与捕获结构；这样，可以根据待吸附目标灵活设置微结构，结合细胞尺寸和比重以及抗体亲和的物理和化学原理，从而确保吸附与捕获的准确度，提高捕获成功率。

例如，微结构为圆柱形，即为一微柱，其直径为10至100微米。又如，微结构可以是单一直径的直柱，但不局限于直柱。自上而下，微结构直径可以逐渐变大，变小，或者大小交替变化。例如，如图1所示，所述微结构为圆台形。又如，微结构的横切面形状可以是圆形、椭圆形、星形和/或其他规则形状，但不局限于规则形状，例如也可以是不规则形状。又如，所述微结构为圆柱形与圆台形的组合，又如，所述微结构为圆柱形与椭圆柱形的组合；又如，所述微结构为椭圆台形与椭圆柱形的组合；又如，所述微结构为棱柱形与椭圆柱形的组合，优选的，所述棱柱形上设置至少一所述吸附部；又如，所述微结构的外表面设置若干凹部，用于设置所述吸附部，和/或，还用于设置其他功能团。优选的，相邻凹部之间还设置一凸部，其高度小于所述凹部的深度，这样，有利于设置多种不同的吸附与捕获集团。例如，所述凹部的深度为所述微结构最大厚度的5％至10％。

优选的，每一所述微结构中，其相异位置的横切面相异设置。例如，上部的横切面的面积，小于下部的横切面的面积。例如，所述微结构为圆台形，其上部的横切面的面积，小于下部的横切面的面积。又如，上部的横切面为椭圆形，下部的横切面为圆形。又如，上部的横切面为星形、中部的横切面为椭圆形，下部的横切面为三角形与弓形的组合。这样，根据具体的低丰度细胞、低丰度蛋白以及低丰度核酸生物标记，合理设置微结构的形状与分布，使其能够有效捕捉全部流液中数量低至个位数的低丰度细胞、低丰度蛋白以及低丰度核酸生物标记。

优选的，方阵排列各所述微结构。例如，如图2所示，各所述微结构排列成4行6列的方阵。例如，微流控室内，微结构的布局可以是方阵排列。横排数列，柱与柱之间距离横向为x，纵向为y。x，y可以相等，也可以不等；x，y选自10至100微米。

优选的，所述微流控室内设置若干排微结构。优选的，每排微结构中，各相邻微结构等距设置。优选的，各排微结构变距设置。例如，微流控室内，微结构的布局以排展开。每一排的微结构都等距排布，柱间距10至100微米。如图3所示，排与排之间变距排布，排间距10至100微米。又如，如图4所示，排与排之间不仅变距还可以横移，横移距离不等于柱间距。横移方向可以是单方向，左或者右；也可以是左右变化。或者，微流控室内，微结构的布局以列展开。每一列的微结构都等距排布，柱间距10至100微米。列与列之间变距排布，列间距10至100微米。又如，列与列之间不仅变距还可以纵移，纵移距离不等于柱间距。纵移方向可以是单方向，上或者下；也可以是上下变化。优选的，微流控室内，微结构或者其他微结构元素(或称为微结构单元)的排列也可运用计算机辅助设计完成，并由实验数据印证。又如，部分微结构的排列分别如图5、图6所示。

为了一次捕捉多种目标或者实现多种目的，例如，优选的，所述微流体器件还设置若干功能区，每一所述功能区设置若干微结构；其中，各功能区的功能相同或者相异设置。例如，同一功能区的各微结构设置相同的吸附部，各功能区的微结构设置相异的吸附部；例如，微流控室内，微结构的布局也可以以功能单元为单位。功能单元的排列可运用相似上述行列的布局方法，例如，每个功能单元，可由2、3、4、5、30、60、120、250、560或更多个微结构或者其他微结构元素组成。各功能区可按其所实现的功能分为分流、流速控制、流量控制、循环肿瘤细胞捕捉、其他目标细胞捕捉、非目标细胞滤除等。例如，单个功能区单元可以是单功能区，也可以是多功能区。例如，所述微流控室设置流体控制功能区与预定义目标细胞捕捉功能区，其中，所述流体控制功能区用于控制流体的流量，所述预定义目标细胞捕捉功能区用于捕捉预定义目标细胞；优选的，所述微流控室还包括非目标细胞滤除功能区，用于滤除非目标细胞，以减少干扰。又如，所述微流控室设置用于分流的分流功能区、用于控制流速的流速控制功能区、用于控制流量的流量控制功能区、用于设置目标对象的预定义目标细胞捕捉功能区、用于滤除非目标细胞的非目标细胞滤除功能区等；又如，所述微流控室设置分流功能区、流速控制功能区、流量控制功能区、循环肿瘤细胞捕捉功能区、预定义目标细胞捕捉功能区、非目标细胞滤除功能区等；例如，分流功能区、流速控制功能区、流量控制功能区、循环肿瘤细胞捕捉功能区、预定义目标细胞捕捉功能区、非目标细胞滤除功能区顺序设置。又如，所述微流控室顺序设置分流功能区、流速控制功能区、流量控制功能区、循环肿瘤细胞捕捉功能区、非目标细胞滤除功能区。又如，所述微流控室顺序设置分流功能区、流量控制功能区、流速控制功能区、循环肿瘤细胞捕捉功能区、非目标细胞滤除功能区。又如，各功能区中，分流功能区距离所述入口通道最近；又如，所述分流功能区设置于所述入口通道与所述流速控制功能区之间。又如，所述功能单元中两个微结构的排列排列方向与流体流向成一定角度，此角度与柱间距一同优化达到最佳效果。例如，至少一功能区中，三个微结构成三角形分布，形成一个三微结构单元。其中，该三角形的内角大小、边长以及相对于流体流向夹角根据待捕捉目标确定，例如，该三角形内角大小、边长以及相对于流体流向夹角一同优化以达到最佳效果；优选的，该三角形为正三角形。或者，优化多边形内角、外角、边长及相对于流体流向的夹角，以达到最佳的功能区效果。例如，流体方向分别如图9、图10所示。优选的，单元内微结构优化由计算机辅助设计完成，并由实验数据印证。一个较好的例子是，至少一功能区中，具有多边形结构，该多边形结构包括若干个规则排列的正六边形微结构区，每一微结构区包括六个微结构，六个微结构排列为一正六边形；其中，各相邻的正六边形共用一对边，即共用两个微结构。

优选的，各所述微结构为水滴形，用于具有较低的阻力，这样，在微结构布局设计中保持高总体流速，以提高样品处理吞吐量；又如，各所述微结构在流体的流向设置弧形区，例如，其弧度为30度至60度，以控制低剪切应力，以避免细胞破损；优选的，对称设置两个所述弧形区；又如，为提高循环肿瘤细胞-微结构接触，以提高细胞捕捉效率，还设置多个吸附部；并且，采用具有弧形区的吸附部，其弧长小于降低白细胞-微结构接触，以减低背景噪声。

例如，所述吸附部设置至少一捕捉配体，采用化学吸附与捕获或物理吸附与捕获在微结构表面和微流控室的内表面。例如，捕捉配体设置蛋白、核酸、肽链和/或适配体。例如，捕捉配体在微结构和/或微流控室表面的吸附与捕获通过物理吸附与捕获完成，此时，适当的pH酸碱度和离子强度是必须条件，具体根据待捕捉细胞或者蛋白等的表面受体而定，可以根据有限的试验确定对应的pH酸碱度和离子强度。又如，捕捉配体在微结构及微流控室表面的吸附与捕获可通过直接化学吸附完成，微结构和/或微流控室表面设置经化学活化形成活性官能团，该官能团与捕捉配体反应，以实现捕捉配体的表面吸附与捕获。具体的官能团根据待吸附与捕获目标设置即可，例如，化学活化可经过氧等离子体处理、氨等离子体处理、紫外光处理或有机化学完成。和/或，捕捉配体在微结构及微流控室表面的吸附与捕获可通过间接方法化学吸附。例如，基底层吸附设置在微结构表面，优选的，基底层还吸附设置在微流控室表面；并且，捕捉配体吸附在所述基底层表面，两次吸附与捕获可以是物理和/或化学吸附。优选的，针对循环肿瘤细胞表面抗原的抗体，所述吸附部设置至少一捕捉配体，采用化学吸附或物理吸附在微结构表面和微流控室的内表面。又如，所述吸附部仅设置一捕捉配体；这样，通过与循环肿瘤细胞表面受体的反应，表面受体如抗原等，来捕捉循环肿瘤细胞。经多次试验进行验证，发现对循环肿瘤细胞具有极好的捕捉效果，可以达到在仅具有1个CTC(Circulating TumorCell，循环肿瘤细胞)细胞的1mL的样本中成功捕捉该细胞。

下面对基底层吸附与捕获进一步做出示例说明。基底层吸附与捕获的一个例子是，抗生物素蛋白(Avidin)或抗生物素蛋白类似物，例如StreptAvidin、NeutrAvidin等；例如化学吸附于氧等离子体活化的微结构和/或微流控室表面，并且，生物素化的捕捉配体继而通过生物素-康生物素蛋白相互作用吸附于其表面。基底层吸附与捕获的又一个例子是，采用碳水化合物化学吸附于氧等离子体活化的微结构和/或微流控室表面，然后采用捕捉配体化学吸附于碳水化合物的表面。基底层吸附与捕获的又一个例子是，双功能团交联剂的一端与微结构和/或微流控室表面反应，另一端与捕捉配体反应，继而化学吸附于捕捉配体于表面。优选的，基底层吸附与捕获的又一个例子是，上述各实施例的有效组合。这样，在实际应用中，可以达到较好的吸附效果。

捕捉到的循环肿瘤细胞可以通过破坏捕捉适配体和细胞表面受体的相互作用来释放和收集。比如抗体和抗原之间的相互作用可以通过调节媒介酸碱性，离子强度，和加入表面活性剂来大大弱化。弱化后，捕捉的循环肿瘤细胞得以释放，易于收集。和/或，捕捉到的循环肿瘤细胞可以通过破坏基底层来释放和收集。比如碳水化合物基底层可以被水解酶在适宜的酸碱度，离子强度和温度下水解。基底层溶解后，捕捉到的循环肿瘤细胞脱离表面，易于收集。和/或，捕捉到的循环肿瘤细胞可以通过破坏交联剂来释放和收集。比如，紫外光裂解交联剂可在紫外光下裂解。交联剂裂解后，捕捉到的循环肿瘤细胞脱离表面，易于收集。又如，当捕捉剂吸附同时使用了基底层和交联剂，捕捉到的循环肿瘤细胞的释放可以通过合并以上三种方法。

循环肿瘤细胞计数可以在细胞捕捉之后，释放之前完成；也可以在释放之后完成；经纯化后释放的循环肿瘤细胞可用于细胞培养，以得到更多细胞；可用于分子诊断分析，以获取癌症遗传学信息。具体的释放、培养，可采用现有技术实现，本发明在此不作赘述。

本发明的又一实施例是，任一上述微流体器件在检测低丰度细胞、低丰度蛋白以及低丰度核酸生物标记的应用；上述各实施例的微流体器件，非常适用于低丰度细胞、低丰度蛋白以及低丰度核酸生物标记的检测与分离。例如，血样可直接通过微流体器件处理，也可经过预处理再进入微流体器件。预处理可以是血液分离，通常通过离心分离完成。离心分离后，收集，悬浮白细胞层，再用于微流体器件。预处理也可以是加入缓冲试剂，调节血样物理化学性质，再用于微流体器件。优选的，所述低丰度细胞为循环肿瘤细胞。CTC是存在于癌症患者血液循环系统中的游离癌细胞，被认为是癌症转移的一个重要因素，CTC在血液循环系统中的含量极少，一般在1ml血液中只有几个，晚期患者的CTC数量会增加。目前发展最为成熟的CTC检测技术仍然存在自身的局限性，如现有的基于免疫磁珠的CTC检测技术，现有的类似设备均是基于肿瘤细胞表面的特异生物标记物而将肿瘤细胞从血液样本中分离出来，在检测前必须先了解待测癌细胞的分子特征，设计出携带针对性抗体的免疫磁珠。而采用本发明各相关实施例，无需事先了解这些肿瘤细胞的分子特征，但其目标不是以往技术中的癌细胞本身，而是血液中的免疫细胞，血液样本流经微流控室，留下CTC。例如，这样的一种应用模式是，目前不管是国内还是国外，给病人上化疗药物以后，一般都要等三个月才可以去评估病人的治疗效果。因为只有经过三个月后，肿瘤的大小才能有比较明显的变化。通过实验以及国内外发表的论文可以看出，凭经验给病人上的化疗药物在很多情况下是无效的。很多情况下，经过三个月以后，肿瘤细胞非但没有减小反而继续长大。这对病人来讲就白白耽误了三个月的时间，乃至于让病人的身体药不对症承受不良副作用三个月时间。这样的三个月对于肿瘤病人来讲，可能就意味着有很大概率步入最终死亡。而随着本发明各实施例的CTC技术的应用，病人不用再等三个月，大约只需等三周，即可通过测定CTC数目的变化，如果CTC数目是显著下降的，说明化疗药物是有效的，如果CTC数目还在增加说明药物是无效的，这时医生就应该采取新的治疗方案，这样，大大提高了病人的生存几率，具有极好的应用价值。又如，所述低丰度细胞为胎儿细胞(fetalcell)等，以此类推，不再赘述。

本发明的又一实施例是，任一上述微流体器件在细胞释放、DNA、mDNA、RNA、二代测序(NGS)分析的应用，基本的应用方式与上述类似，在此不再赘述。

进一步地，本发明的实施例还包括，上述各实施例的各技术特征，相互组合形成的微流体器件及其在检测低丰度细胞、低丰度蛋白和/或低丰度核酸生物标记的应用，以及任一上述微流体器件在细胞释放、DNA、mDNA、RNA和/或二代测序(NGS)分析的应用。

需要说明的是，本发明的说明书及其附图中给出了本发明的较佳的实施例，但是，本发明可以通过许多不同的形式来实现，并不限于本说明书所描述的实施例，这些实施例不作为对本发明内容的额外限制，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。并且，上述各技术特征继续相互组合，形成未在上面列举的各种实施例，均视为本发明说明书记载的范围；进一步地，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (10)

1.一种微流体器件，其包括具有入口通道与出口通道的至少一微流控室，所述微流控室内设置众多微结构元素，其特征在于，至少部分所述微结构元素中，具有吸附结构。

2.根据权利要求1所述微流体器件，其特征在于，每一所述微结构中，其相异位置的横切面相异设置。

3.根据权利要求1所述微流体器件，其特征在于，所述微结构为圆台形。

4.根据权利要求1所述微流体器件，其特征在于，方阵排列各所述微结构。

5.根据权利要求1所述微流体器件，其特征在于，所述微流控室内设置若干排微结构。

6.根据权利要求5所述微流体器件，其特征在于，每排微结构中，各相邻微结构等距设置。

7.根据权利要求6所述微流体器件，其特征在于，各排微结构变距设置。

8.根据权利要求1所述微流体器件，其特征在于，还设置若干功能区，每一所述功能区设置若干微结构。

9.如权利要求1至8任一所述微流体器件在检测低丰度细胞、低丰度蛋白、低丰度核酸生物标记的应用。

10.如权利要求1至8任一所述微流体器件在细胞释放、DNA、mDNA、RNA、二代测序分析的应用。