CN113462519A - 一种微流控芯片的aptes修饰方法及其捕获外泌体的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种微流控芯片的APTES修饰方法及其捕获外泌体的应用。该方法采用动态修饰，通过流体将待修饰分子APTES修饰在微流控芯片内。经修饰制备好的微流控芯片可真空密封保存，因此其保存更简单、方便，产品货架期长。经修饰制备好的微流控芯片可用于外泌体的富集和纯化。同时，该方法对芯片材质的要求低，通用性好，如聚二甲基硅氧烷（PDMS）、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)等传统方法不易修饰的材质也适用。此外，其修饰步骤少，较大地缩短了芯片的制备和修饰时间。且修饰时试剂利用率高，浪费少，可有效降低成本。其可望应用于生物与医学分析等领域。
Description
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，涉及一种微流控芯片表面修饰方法及其捕获外泌体的应用。
背景技术
微流控芯片技术是分析研究领域的重要手段之一，但目前在生物医学中的应用面临一个重要问题，即在适用生物医学对芯片材料表面功能要求的同时，还要满足大规模集成制作一次性芯片的要求。在微流控芯片的制备中，玻璃、硅和石英是目前应用较广泛的材料，但其制作成本较高。因此，热塑性高聚物如聚二甲氧基硅烷(PDMS)、聚碳酸酯(PC)、聚甲基丙烯酸酯(PMMA)、聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)、氢化聚苯乙烯(PS-H)等，在微流控芯片的制备中占据越来越重要的位置。
微流控芯片的表面修饰是其在生物学领域应用的第一步，其可以赋予微流控芯片更多特性，如更强的亲/疏水性、捕获特定分子的能力等。目前已有多种修饰方法见诸报道，如采用共价连接的方法，通过多步反应将抗体修饰于PDMS微流控芯片内表面，或预先在微流控芯片内镀金，再通过Au-S键修饰抗体，或通过光致还原法，在芯片内表面生长多枝分子，再将待修饰的分子连接于该多枝分子。这类方法的特点是，待修饰分子的连接条件较为苛刻，需要在特定溶液下活化，且操作步骤繁琐，导致PMMA、PC等材质的微流控芯片难以修饰。等离子体是物质的一种高能态，其活性粒子的能量一般都接近或超过碳-碳或其它含碳键的键能，有足够的能量引起聚合物内的各种化学键发生断裂或重新组合。等离子体处理系统可使表面处理变得简单，对所处理的材料无严格要求，可处理形状复杂的材料，对材料表面的作用仅涉及几到几百纳米，只改变材料表面性质，而不影响基体性能，具有普遍适用性。等离子体处理技术的主要缺点是难以在材料表面引入特异的功能基团，等离子体处理后的芯片表面带有大量羟基基团，保存较困难。因此芯片制备并修饰后须立即使用，导致产品货架期短，不利于批量化生产。因此，需要提供一种新的微流控芯片的修饰方法，在等离子体处理后进行化学修饰可以引入稳定、特异的功能基团。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种微流控芯片的APTES动态修饰方法及其捕获外泌体的应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种微流控芯片的动态修饰方法，包括：
1)利用3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)和微流控芯片通道内表面发生硅烷化反应，实现对微流控芯片通道内表面进行正电荷修饰；
2)向修饰有正电荷的微流控芯片通道内加入带有外泌体的样品，实现对外泌体的抓取。利用缓冲液PBS对微流控芯片进行冲洗，得到吸附于微流控芯片通道表面的纯外泌体，实现外泌体富集的目的。
本发明中，所述步骤1）中微流控芯片内通道APTES动态修饰方法，其特征在于：
微流控芯片通道内表面放入等离子发生器中，抽真空至0-20Pa，通入氧气流速至50-200 毫升/分钟，调整放电功率在100-300W，进行射频放电1-50秒。将一定浓度的APTES涂覆在芯片表面，孵育2-6小时（37°C）或者12-24小时（4°C），APTES硅氧烷键与等离子体处理后芯片表面的羟基缩合，以使APTES铺设于微流控芯片内。
所述步骤1)中，在真空状态、手动注射或注射泵注射模式下将将一定浓度的APTES灌注到微流控芯片内，以保证APTES修饰的均一性和可重复性。
所述步骤1)中：所述微流控芯片内部的流体通道为微米级别，在微流控芯片结构设计上，芯片结构可遵循鱼骨型芯片设计原理或遵循确定性侧向位移原理，设计微流控芯片内流体以层流或湍流运行，从而保证微球铺设的均一性。
所述步骤1)中：所述微流控芯片为鱼骨型芯片，包括上层的鱼骨结构层和下层的通道层；鱼骨结构层中设有若干间隔布置的鱼骨形横梁，通道层中设有若干均匀分布的支撑柱；支撑柱间的间隙形成流体通道。所述鱼骨结构层的高度为30～100微米，所述通道层的高度为30～120微米；所述鱼骨形横梁的宽度为30～120微米，高度为30～100微米，相邻的鱼骨形横梁间的间距为80～120微米。所述支撑柱为长方体、圆柱体、“Y”型、三角柱及其他不同形状的支撑体。
所述步骤1)中：在微流控芯片的制备上，微流控芯片材质可为聚二甲氧基硅烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)或聚碳酸酯(PC)中的一种或至少两种的组合，制备方法可采用光刻模板、压印模板或注塑模板方法，以保证芯片制作方便、成本低廉、质量可靠。
本发明中，所述步骤2）中是将APTES动态修饰后的微流控芯片应用于捕获循环肿瘤外泌体。
所述步骤2)中：将所述动态修饰的微流控芯片置于流体驱动环境中，将待捕获的样品注入所述动态修饰的微流控芯片内，上样流速为0.5～5mL/h，通过微流控芯片通道表面修饰的带正电荷的APTES捕获所述循环肿瘤外泌体；随后改变pH微环境，用缓冲液将捕获的循环肿瘤外泌体从微流控芯片中洗脱，以实现对循环肿瘤外泌体的富集和无损释放。
所述步骤2)中：任一项所述的方法制备得到的动态修饰的微流控芯片，采用工业或家用真空包装机抽真空后保存，达到保存更简单、方便的目的，延长产品货架期。
所述步骤2)中；本发明所获得的外泌体允许各种后续分子分析，包括Elisa，western blot，基因组的提取，鉴定，扩增和测序。
需要说明的是，微流控芯片的种类、材质及结构不限于本发明的描述。如采用其他方法或材料制备的微流控芯片或商品化的微流控芯片，也可用于本发明。
本技术方案与背景技术相比，它具有如下优点：
本发明采用动态修饰方法，在等离子体处理后引入稳定、特异的APTES功能基团。本发明方法所富集外泌体允许各种后续分子分析，包括Elisa，western blot，基因组的提取，鉴定，扩增和测序。较大地缩短了芯片制备时间，试剂浪费少，利用率高，可有效降低成本。制备得到的动态修饰的微流控芯片，采用工业或家用真空包装机抽真空后保存，达到保存更简单、方便的目的，延长产品货架期。该动态修饰方法对微流控芯片材质无特殊要求，可应用于PMMA、PC等传统方法不易修饰的材料，通用性好，有利于产品的批量化生产，为其商业化应用奠定了基础。
附图说明
图1 微流控芯片的结构示意图，其中A为上层鱼骨结构通道层结构示意图，B为“Y”结构通道层结构示意图，C为合并上下层通道的微流控芯片结构示意图；
图2 微流控芯片的实物显微结构图，其中A为上层鱼骨结构图，B为“Y”结构通道层结构图，C为合并上下层通道的微流控芯片结构图；
图3 富集外泌体的微流控芯片实物照片图；
图4 APTES修饰前后的接触角变化；
图5 APTES修饰浓度变化对外泌体富集效率的影响。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1
微流控芯片的设计与制备
本发明芯片的设计如图1所示。该鱼骨型芯片由两层组成：下层通道层和上层鱼骨结构层。通道层的支撑柱为“Y”型，通道层高度为100微米，“Y”型主的宽度30微米，间距40微米；鱼骨结构层中，鱼骨横梁宽度为100微米，两条鱼骨横梁间隔同样为140微米，横梁高度为50微米，即鱼骨结构层高度为50微米，如图1为采用PDMS材质制作的真实微流控芯片图，附图2为微流控芯片的实物显微结构图。
芯片设计完成后，制作光刻掩模版并采用SU-8 3025光刻胶制作光刻模具。随后，将二甲氧基硅烷(DMS)单体与聚合引发剂混匀后倒入模具，加热固化后将芯片从模具上撕下，并采用等离子键合法将微流控芯片键合于PMMA底板上，即得鱼骨型微流控芯片，常温保存备用。
实施例2
微流控芯片的APTES修饰
APTES溶解到无水乙醇溶液中(需要现用现配)配成表面修饰液，浓度为0.5-2％(V/V)。微流控芯片通道内表面放入等离子发生器中，抽真空至2 Pa，通入氧气流速至50毫升/分钟，调整放电功率在200 W，进行射频放电20秒。在真空状态下将0.5-2％APTES的乙醇溶液涂覆在芯片表面，孵育2小时（37°C），APTES硅氧烷键与等离子体处理后芯片表面的羟基缩合，以使APTES铺设于微流控芯片内。去除液体，PBS冲洗三遍。如附图4和5可见APTES修饰前后的接触角变化和APTES修饰浓度变化对外泌体富集效率的影响。
实施例3
APTES动态修饰的微流控芯片捕获循环肿瘤外泌体
将乳腺癌病人血清标本(约200ul/份)自-80℃冰箱取出化冻后，3000g离心15分钟；将含有循环肿瘤外泌体的血液样品或者缓冲溶液通过进样孔注入，当外泌体进入捕获微阵列，由于其表面电荷与微阵列表面修饰2% APTES聚合物电荷相吸，循环肿瘤外泌体和微阵列实现多次接触，最终进行捕获；如附图3所示，富集外泌体的微流控芯片实物照片图。在所述的循环肿瘤外泌体捕获芯片体系中，可通过改变流经微阵列洗脱液的pH值对捕获的循环肿瘤外泌体进行释放，。用微量蛋白定量检测试剂盒对外泌体总蛋白进行检测。用透射显微电镜对所分离的血清外泌体进行鉴定，可见电镜下所分离到的外泌体表现为圆形形态，大小较一致的颗粒，直径在30-150nm，通过动态光散射(DLS)技术对外泌体粒径分布情况进行分析，可见其峰值为140 nm左右。随后，进行Western blot，可检测到外泌体表面标志性蛋白CD63，CD9,EpCAM的表达。以上结果表明本发明成功提取了血清中的外泌体。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，不能以此限定本发明的保护范围，即大凡依本发明权利要求书及发明内容所做的简单的等效变化与修改，皆仍属于本发明专利申请的保护范围。
Claims (8)
1.一种微流控芯片的APTES动态修饰方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）利用3-氨基丙基三乙氧基硅烷APTES和微流控芯片通道内表面发生硅烷化反应，实现对微流控芯片通道内表面进行正电荷修饰；
2）向修饰有正电荷的微流控芯片通道内加入带有外泌体的样品，实现对外泌体的抓取；
3）利用缓冲液PBS对微流控芯片进行冲洗，得到吸附于微流控芯片通道表面的纯外泌体，实现外泌体富集的目的。
2.根据权利要求1所述的微流控芯片的动态修饰方法，其特征在于：所述步骤1）微流控芯片通道内表面进行正电荷修饰的具体方法包括以下步骤：
微流控芯片通道内表面放入等离子发生器中，抽真空至0-20Pa，通入氧气流速至50-200 毫升/分钟，调整放电功率在100-300W，进行射频放电1-50秒；在真空状态下、用手动注射或注射泵注射的方式将一定浓度的APTES涂覆在芯片表面，37℃孵育2-6小时或者4℃孵育12-24小时，APTES硅氧烷键与等离子体处理后芯片表面的羟基缩合，以使APTES铺设于微流控芯片内。
3.根据权利要求1所述的微流控芯片的动态修饰方法，其特征在于：所述微流控芯片为鱼骨型芯片，包括上层的鱼骨结构层和下层的通道层；鱼骨结构层中设有若干间隔布置的鱼骨形横梁，通道层中设有若干均匀分布的支撑柱；支撑柱间的间隙形成流体通道。
4.根据权利要求3所述的微流控芯片的动态修饰方法，其特征在于：所述鱼骨结构层的高度为30～100微米，所述通道层的高度为30～100微米；所述鱼骨形横梁的宽度为30～120微米，高度为30～100微米，相邻的鱼骨形横梁间的间距为80～120微米；支撑柱的高度为30～100微米。
5.根据权利要求1所述的微流控芯片的动态修饰方法，其特征在于：所述微流控芯片的材质为聚二甲氧基硅烷、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙烯、聚丙烯或聚碳酸酯中的一种或至少两种的组合；所述微流控芯片通过雕刻、光刻模板、压印模板或注塑模板方法制备得到。
6.一种根据权利要求1至5中任一项所述的方法制备得到的动态修饰的微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片采用工业或家用真空包装机抽真空后保存。
7.一种根据权利要求1至5中任一项所述的方法制备得到的动态修饰的微流控芯片的应用，其特征在于，所述微流控芯片在捕获循环肿瘤外泌体上的应用。
8.根据权利要求7所述的微流控芯片的应用，其特征在于：所述应用包括：所述芯片通道表面动态修饰物质为APTES；具体步骤包括：将所述动态修饰的微流控芯片置于流体驱动环境中，将待捕获的样品注入所述动态修饰的微流控芯片内，上样流速为0.5～5mL/h，通过微流控芯片通道表面修饰的带正电荷的APTES捕获所述循环肿瘤外泌体；随后改变pH微环境，用缓冲液将捕获的循环肿瘤外泌体从微流控芯片中洗脱，以实现对循环肿瘤外泌体的富集和无损释放。
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