CN110055158A - 一种微流控芯片的动态修饰方法及其捕获CTCs的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种微流控芯片的动态修饰方法及其捕获CTCs的应用。该方法采用动态修饰，通过微球将待修饰分子修饰在微流控芯片内。微球偶联的待修饰分子与制备好的微流控芯片可分别保存，因此其保存更简单、方便，产品货架期长。同时，该方法对芯片材质的要求低，通用性好，如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)等传统方法不易修饰的材质也适用。此外，其修饰步骤少，较大地缩短了芯片的制备和修饰时间。且修饰时试剂利用率高，浪费少，可有效降低成本。其可望应用于生物与医学分析等领域。

Description

一种微流控芯片的动态修饰方法及其捕获CTCs的应用
技术领域
本发明涉及一种微流控芯片的动态修饰方法及其捕获CTCs的应用，特别涉及将生物识别分子偶联于微球表面，后将其均匀修饰与微流控芯片内的方法。
背景技术
微流控芯片是一种可以在微米尺度精确操控流体的实验平台。得益于其微米级别的芯片结构，微流控芯片可以操控细胞尺寸级别的流体，从而更精准地控制单个细胞的行为，这是宏观实验平台无法实现的，从而为其在分析和研究全血中的稀有细胞等领域奠定了基础。同时，由于芯片尺寸较小，其所消耗的试剂量小，且流体流速较高，即其可以更低的成本和更短的时间完成更小尺寸的流体操控任务，从而获取宏观实验平台难以获得的单细胞的信息。在微流控芯片的制备中，玻璃、硅和石英是目前应用较广泛的材料，但其制作成本较高。因此，热塑性高聚物如聚二甲氧基硅烷(PDMS)、聚碳酸酯(PC)、聚甲基丙烯酸酯(PMMA)、聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)、氢化聚苯乙烯(PS-H)等，在微流控芯片的制备中占据越来越重要的位置。
微流控芯片的生物修饰是其在生物学领域应用的第一步，其可以赋予微流控芯片更多特性，如更强的亲/疏水性、捕获特定分子的能力等。目前已有多种修饰方法见诸报道，如采用共价连接的方法，通过多步反应将抗体修饰于PDMS微流控芯片内表面，或预先在微流控芯片内镀金，再通过Au-S键修饰抗体，或通过光致还原法，在芯片内表面生长多枝分子，再将待修饰的分子连接于该多枝分子。这类方法的特点是，待修饰分子的连接条件较为苛刻，如需要等离子体活化或紫外光照激发等，导致PMMA、PC等材质的微流控芯片难以修饰。而易于修饰的PDMS材质的微流控芯片质地软，产品重现性差，批量化生产时的产量和成品率严重受限。且该方法修饰步骤较多，成功率较低，为获得较好的修饰效果，就不得不加大修饰试剂的浓度和用量，导致试剂浪费严重。此外，一经修饰，待修饰分子即被固定于芯片内表面，其保存较困难。因此芯片制备并修饰后须立即使用，导致产品货架期短，不利于批量化生产。因此，需要提供一种新的微流控芯片的修饰方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种微流控芯片的动态修饰方法及其捕获CTCs的应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：
一种微流控芯片的动态修饰方法，包括：
1)微球与待修饰分子的偶联：将待修饰分子偶联于微球表面，形成待修饰分子-微球结合物；待识别分子可通过化学方法如生物素-亲和素反应、碳氨反应、二硫键连接等与微球偶联。
2)微流控芯片的动态修饰：将待修饰分子-微球结合物铺设于微流控芯片内，得到动态修饰的微流控芯片。
一实施例中：所述微球为磁性微球或非磁性微球。磁性微球(例如磁珠)可在磁场环境(例如放置于磁铁上等)中固定在芯片；若采用其他类型的非磁性微球，可以通过共价连接的方式，例如通过微球上的抗体等共价连接至活化后的芯片表面，从而将微球固定在芯片；当然，磁珠也可通过类似的共价连接方式进行固定。
一实施例中：所述非磁性微球为琼脂糖微球或镍微球。
一实施例中：所述微球的直径为1～100微米级别，优选地，为1～30微米级别。
一实施例中：所述待修饰分子为抗体或核酸适体中的至少一种。
一实施例中：所述步骤2)中，通过手动注射或注射泵注射的方式将待修饰分子-微球结合物高速注入微流控芯片内，以使待修饰分子-微球结合物铺设于微流控芯片内，并保证铺设的均一性和可重复性。
需要注意的是，待修饰分子-微球结合物或含有待修饰分子-微球结合物的溶液的总体积应与芯片的容量相等，因此将待修饰分子-微球结合物或含有待修饰分子-微球结合物的溶液全部通入芯片时，正好铺满芯片，从而将待修饰分子-微球结合物铺设在芯片内。
一实施例中：所述微流控芯片内部的流体通道为微米级别。
一实施例中：在微流控芯片结构设计上，芯片结构可遵循鱼骨型芯片设计原理或遵循确定性侧向位移原理(DLD)，设计微流控芯片内流体以层流或湍流运行，从而保证微球铺设的均一性。
一实施例中：所述微流控芯片为鱼骨型芯片，包括上层的鱼骨结构层和下层的通道层；鱼骨结构层中设有若干间隔布置的鱼骨形横梁，通道层中设有若干均匀分布的支撑柱；支撑柱间的间隙形成流体通道。
一实施例中：所述鱼骨结构层的高度为30～60微米，所述通道层的高度为30～60微米。
一实施例中：所述鱼骨形横梁的宽度为80～120微米，高度为30～60微米，相邻的鱼骨形横梁间的间距为80～120微米。
一实施例中：所述支撑柱的高度为30～60微米。
一实施例中：所述支撑柱为长方体型。
一实施例中：所述通道层还包括底板，所述若干支撑柱设在该底板上。
一实施例中：在微流控芯片的制备上，微流控芯片材质可为聚二甲氧基硅烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)或聚碳酸酯(PC)中的一种或至少两种的组合，制备方法可采用光刻模板、压印模板或注塑模板方法，以保证芯片制作方便、成本低廉、质量可靠。
需要说明的是，微流控芯片的种类、材质及结构不限于本发明的描述。如采用其他方法或材料制备的微流控芯片或商品化的微流控芯片，也可用于本发明。本发明的关键点在于通过磁珠等类型的微球将待修饰分子动态修饰于芯片。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之二是：
一种根据上述方法制备得到的动态修饰的微流控芯片。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之三是：
一种上述的动态修饰的微流控芯片的应用，特别是在捕获循环肿瘤细胞(CTCs)上的应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之四是：
一种利用上述的动态修饰的微流控芯片捕获循环肿瘤细胞的方法，包括：将待捕获的样品注入所述动态修饰的微流控芯片内，通过微流控芯片内的待修饰分子-微球结合物捕获所述循环肿瘤细胞。
一实施例中：所述微球为磁性微球时，所述方法包括：将所述动态修饰的微流控芯片置于磁场环境中，将待捕获的样品注入所述动态修饰的微流控芯片内，上样流速为0.5～5mL/h，优选0.5～2mL/h，通过微流控芯片内的待修饰分子-微球结合物捕获所述循环肿瘤细胞；随后撤去磁场环境，用缓冲液将捕获的循环肿瘤细胞从微流控芯片中洗脱，以实现对循环肿瘤细胞的捕获。
本技术方案与背景技术相比，它具有如下优点：
本发明采用动态修饰方法，预先将待修饰分子(如抗体)偶联于微球表面(如磁性微球或琼脂糖微球)，形成待修饰分子-微球结合物，再将该待修饰分子-微球结合物均匀铺设于微流控芯片内，可实现动态地在微流控芯片内修饰目标分子目的。微流控芯片制作并封装后，无需立即修饰，可于常温保存，货架期长。待修饰分子-微球结合物可在待修饰分子要求的最佳条件下保存或临用时再制备，从而较好地保存待修饰分子的生物活性。即微流控芯片、待修饰分子和微球可以分开包装运输，更灵活方便。临用时，将待修饰分子-微球结合物铺设于芯片内即可使用，修饰步骤少，较大地缩短了芯片制备时间，试剂浪费少，利用率高，可有效降低成本。且因待修饰分子是通过微球修饰于芯片，无需将待修饰分子直接连接至微流控芯片内表面，因此该动态修饰方法对微流控芯片材质无特殊要求，可应用于PMMA、PC等传统方法不易修饰的材料，通用性好，有利于产品的批量化生产，为其商业化应用奠定了基础。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1为动态修饰的鱼骨型芯片原理图，其中a为鱼骨型芯片俯视图；b为微流控芯片仰视图；c为鱼骨型芯片侧视图；d为鱼骨型芯片前视图，在图c和d中，1表示鱼骨结构层，2表示通道层，3指示液流方向，4指示芯片入口方向，5指示芯片出口方向；e为以PDMS材料制作芯片后剖面显微成像图，其中内嵌小图显示鱼骨结构层高度约为47.35μm，通道层支撑柱高度为51.65μm；f为鱼骨型芯片成品，深色区域显示微流控芯片通道。
图2为向鱼骨芯片内动态修饰抗体-磁珠结果，其中a为芯片入口区、中间区和出口区抗体-磁珠分布情况，可见抗体-磁珠修饰均匀性好；b为分别于芯片的入口区、中间区和出口区个选取15个区域，计数并计算磁珠密度后绘制而成的磁珠密度热图，证实芯片修饰的均一性好。
图3为动态修饰抗体-磁珠后的鱼骨型芯片捕获加样于健康人全血的SW480细胞结果，其中a为不同上样流速下对SW480细胞的捕获效率，可见上样流速为2mL/h时，其捕获效率最佳，超过98％；b为捕获并以PBS洗去血细胞后，在芯片入口(图中Front area)、中间(图中Middle area)和出口(图中End area)位置所捕获到的细胞(虚线圆圈内)；c为撤去磁铁后，以10mL/h流速洗脱所捕获的细胞的释放效率，超过95％的细胞均能被无损释放；d为释放后的细胞。
图4为实施例1的鱼骨型芯片的结构示意图，其中a为通道层结构示意图，b为鱼骨结构层结构示意图，c为b中A处放大示意图；图中1表示鱼骨结构层，2表示通道层，3指示液流方向，4指示芯片入口，5指示芯片出口。
具体实施方式
下面通过实施例具体说明本发明的内容：
实施例1鱼骨型芯片的设计与制备
本发明中以鱼骨型芯片为例，说明微流控芯片的制作与修饰方法。芯片的设计如图1所示。其中a为俯视图，b为仰视图，c为侧视图，d为前视图。该鱼骨型芯片由两层组成：下层通道层和上层鱼骨结构层。通道层的支撑柱为长方体型，通道层高度为50微米，鱼骨结构层中，鱼骨横梁宽度为100微米，两条鱼骨横梁间隔同样为100微米，横梁高度为50微米，即鱼骨结构层高度为50微米，因此该微流控芯片流道总高度为100微米，如图1e为采用PDMS材质制作的真实微流控芯片剖面显微镜成像图。
芯片设计完成后，制作光刻掩模版并采用SU-8 3050光刻胶制作光刻模具。随后，将二甲氧基硅烷(DMS)单体与聚合引发剂混匀后倒入模具，加热固化后将芯片从模具上撕下，并采用等离子键合法将微流控芯片键合于PMMA底板上，即得鱼骨型微流控芯片(如图1f所示)，常温保存备用。
实施例2抗体-磁珠体系的制备并将其修饰于鱼骨型微流控芯片内
本发明中采用磁珠作为待修饰抗体的载体，待修饰抗体为上皮细胞黏附因子(EpCAM)对应抗体。EpCAM在大多数癌症中高表达，因此其常被用作免疫亲合法捕获循环肿瘤细胞的肿瘤标志物。EpCAM抗体于磁珠的连接方式为常用的生物素-链霉亲和素反应(Biotin-SA)，其反应条件温和、速度快、结合力强，因此在生物分子偶联中应用广泛。本发明中所用生物素化的EpCAM抗体(Anti-EpCAM-Biotin)和SA偶联的磁珠(SA-MB)均已商品化，较大地简化了实验步骤。取SA-MB溶液，磁分离后去除上清液，沉淀部分加入Anti-EpCAM-Biotin溶液，于37℃孵育30min后，再次磁分离，去除上清液，沉淀部分加入与上清液等体积的PBS，即得抗体-磁珠，4℃保存备用。使用时，取2.5mg/mL的抗体-磁珠溶液40μL，从微流控芯片入口迅速注入芯片内，即完成芯片修饰，修饰后情况如图2a所示。为验证抗体-磁珠修饰均一性，分别于入口、中间和出口部分各取15个部位，计数磁珠密度，并绘制分布热图(图2b)。由磁珠分布热图可知，动态修饰的磁珠在芯片内分布均匀，入口、中间和出口处磁珠密度差异在误差范围内。
实施例3动态修饰的鱼骨芯片捕获循环肿瘤细胞
由于结直肠癌细胞系SW480可高表达EpCAM，因此本发明首先采用作为模型细胞，模拟癌症患者体内的循环肿瘤细胞，以验证动态修饰后的鱼骨芯片捕获循环肿瘤细胞的捕获效率和释放效率。SW480细胞培养条件为：90％DMEM培养液+10％胎牛血清(FBS)，并加入终浓度为100 U/mL的青霉素和0.1mg/mL的链霉素；37℃细胞培养箱，CO2浓度5％；细胞每两天传代一次。细胞生长至培养皿面积的70～80％时，即可使用。使用时，去除原细胞培养基，以PBS清洗后加入0.2％EDTA水溶液，于37℃消化1min，去除EDTA溶液后再加入1mL PBS，轻轻吹打混匀细胞。离心(1300rpm，3min)后去除上清液，细胞以100μL PBS重悬后，加入钙黄绿素溶液(终浓度1μg/mL)，37℃染色30min后，再次离心去除上清液。染色后细胞以100μLPBS重悬备用。
取染色后SW480细胞，以健康人全血稀释至浓度约为200个/mL。取实施例2中制备的动态修饰芯片，置于磁铁上，以不同流速(分别0.5，1，2，5ml/h)从入口通入1mL SW480细胞溶液，并在入口处准确计数通入的细胞数。上样结束后，保持芯片置于磁铁上，并以上样流速从入口处通入200μL PBS，以洗去血细胞和未捕获的细胞。然后于荧光显微镜下计数捕获的细胞数。计数完成后，撤去磁铁，以10mL/h流速从入口处通入200μL PBS，以洗脱释放捕获的细胞，并在出口处收集释放的细胞。不同流速下细胞捕获效率如图3a所示，可知当上样流速为0.5mL/h时，其捕获效率已超过90％。而由于鱼骨形结构的存在，随流速增大，血样在芯片内形成湍流越显著，增强的湍流可有效增大血样的混匀程度，同时增加血样中的循环肿瘤细胞(本实验中的SW480细胞)与动态修饰于芯片底部的抗体-磁珠的接触机会，从而增加其被捕获的概率。因此，随上样速度从0.5mL/h增加至2mL/h，对SW480的捕获效率也轻微增加至约98％(捕获后细胞如图3b所示)。然而由于抗体-磁珠为动态修饰，其仅靠磁力被固定于芯片底部。继续增大流速，则导致抗体磁珠所受液流的拽力超过其所受的磁力，而被液流冲出芯片。这也是本发明中释放捕获后的细胞的原理。实验结果显示，当血样流速增大至5mL/h时，其捕获效率急剧降低至约33％，表明2mL/h为该芯片的最佳上样流速。而释放效率结果如图3c所示。撤去磁铁后，以PBS高速冲洗可有效释放被动态修饰的抗体-磁珠捕获的细胞(释放后的细胞如图3d所示)，其释放效率可达93％以上。该结果证实本发明的动态修饰方法可以有效地捕获血样中的循环肿瘤细胞，并无损地释放所捕获的细胞，以用于循环肿瘤细胞的下游分析。
此外，本实施例之中发现，磁珠的密度即溶液条件下的磁珠的浓度会影响修饰的磁珠在芯片内分布的均一性。在低于饱和浓度时，磁珠浓度越大则均一性越好，越能充分利用芯片的内部空间；当磁珠浓度达到饱和后则修饰达到饱和，继续增大磁珠浓度对均一性影响不大。同时，磁珠浓度同样会影响对循环肿瘤细胞的捕获效率，本实施例之中，磁珠浓度在2.5mg/mL以上时可以实现对肿瘤细胞80％以上的捕获效率。如果不考虑捕获效率，而侧重捕获产物的纯度和经济性，可以适当降低磁珠浓度以降低成本。
以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (10)

1.一种微流控芯片的动态修饰方法，其特征在于：包括：
1)微球与待修饰分子的偶联：将待修饰分子偶联于微球表面，形成待修饰分子-微球结合物；
2)微流控芯片的动态修饰：将待修饰分子-微球结合物铺设于微流控芯片内，得到动态修饰的微流控芯片。
2.根据权利要求1所述的微流控芯片的动态修饰方法，其特征在于：所述微球为磁性微球或非磁性微球，所述非磁性微球为琼脂糖微球或镍微球；所述微球的直径为1～100微米级别；所述待修饰分子为抗体或核酸适体中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的微流控芯片的动态修饰方法，其特征在于：所述步骤2)中，通过手动注射或注射泵注射的方式将待修饰分子-微球结合物注入微流控芯片内，以使待修饰分子-微球结合物铺设于微流控芯片内。
4.根据权利要求1所述的微流控芯片的动态修饰方法，其特征在于：所述微流控芯片为鱼骨型芯片，包括上层的鱼骨结构层和下层的通道层；鱼骨结构层中设有若干间隔布置的鱼骨形横梁，通道层中设有若干均匀分布的支撑柱；支撑柱间的间隙形成流体通道。
5.根据权利要求4所述的微流控芯片的动态修饰方法，其特征在于：所述鱼骨结构层的高度为30～60微米，所述通道层的高度为30～60微米；所述鱼骨形横梁的宽度为80～120微米，高度为30～60微米，相邻的鱼骨形横梁间的间距为80～120微米；支撑柱的高度为30～60微米。
6.根据权利要求1所述的微流控芯片的动态修饰方法，其特征在于：所述微流控芯片的材质为聚二甲氧基硅烷、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙烯、聚丙烯或聚碳酸酯中的一种或至少两种的组合；所述微流控芯片通过光刻模板、压印模板或注塑模板方法制备得到。
7.一种根据权利要求1至6中任一项所述的方法制备得到的动态修饰的微流控芯片。
8.一种权利要求7所述的动态修饰的微流控芯片的应用。特别是在捕获循环肿瘤细胞(CTCs)上的应用。
9.一种利用权利要求7所述的动态修饰的微流控芯片捕获循环肿瘤细胞的方法，其特征在于：包括：将待捕获的样品注入所述动态修饰的微流控芯片内，通过微流控芯片内的待修饰分子-微球结合物捕获所述循环肿瘤细胞。
10.根据权利要求9所述的利用动态修饰的微流控芯片捕获循环肿瘤细胞的方法，其特征在于：所述微球为磁性微球；所述方法包括：将所述动态修饰的微流控芯片置于磁场环境中，将待捕获的样品注入所述动态修饰的微流控芯片内，上样流速为0.5～5mL/h，通过微流控芯片内的待修饰分子-微球结合物捕获所述循环肿瘤细胞；随后撤去磁场环境，用缓冲液将捕获的循环肿瘤细胞从微流控芯片中洗脱，以实现对循环肿瘤细胞的捕获。
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