CN111040994A - 一种高效分离脂肪来源脂肪间充质干细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高效脂肪来源脂肪间充质干细胞的分离方法，将脂肪块破碎后加PBS洗涤离心去除杂质，加消化液消化后，再洗涤离心用细胞筛去除杂质，加入红细胞裂解液后，继续洗涤离心，最后用荧光标记抗体进行流式细胞分选得到纯度高的脂肪间充质干细胞。通过本方法分离、筛选得到ADSCS得到的细胞量较多，在培养传代5‑6代后，还具有良好的细胞形态，并具有三向分化能力，且小鼠急性肝损模型中同空白对比，显示出细胞具有较好的急性肝损伤修复能力。

Description

一种高效分离脂肪来源脂肪间充质干细胞的方法

技术领域

本发明属于生物细胞技术领域，涉及一种高效分离脂肪来源脂肪间充质干细胞的方法。

背景技术

干细胞具有自我更新和多向分化的能力，且可以持久利用，存在于各种组织和器官中,如 骨髓、脂肪、肌肉、血液、肝脏、皮肤等。随着不断的研究发展，干细胞被越来越多地应用 于白血病、老年性痴呆、帕金森病、糖尿病、脊柱损伤以及退变性功能紊乱等疾病的治疗,其 帮助恢复组织器官功能的辅助治疗作用也越来越受到重视。干细胞作为细胞载体将在基因治 疗以及细胞治疗领域发挥重要作用。比如已有研究表明骨髓和人脐带来源的间充质干细胞 (MSC)有多向分化的能力，如成脂分化、成骨分化、成软骨分化。Zuk等人提出并证实了 脂肪组织可作为成体干细胞的来源，Crisan等人从脂肪组织中提取出血管周细胞具有MSC同 样的表面标记物CD73、CD90、CD105、CD34、CD146，以及相同的形态和功能。也有研究 表明脂肪间充质干细胞因其能旁分泌多种生长因子、获取方便、具有免疫调节等作用,常被用 于组织修复和功能重建。类似于骨髓，脂肪组织来源于胚胎间质并由大量的基质组成，容易 进行分离，但人脂肪组织比骨髓更具有普遍性、可重复利用性、自我更新性、易获取性及获 取时患者的低不适性，脂肪来源干细胞在在再生医学研究中具有广泛的应用前景，并已成功 的用于动物骨损伤的修复，因此脂肪来源的脂肪间充质干细胞可作为一类有较好前景的临床 研究对象。组织获取方式的不同虽然会导致细胞功能稍微有些差异，可用于脂肪间充质干细 胞提取的脂肪来源包括皮下脂肪垫、抽脂术和关节镜手术，其中来源于中胚层的皮下脂肪容 易获取、能自我修复填充、安全性高、细胞获得率高，是最有优势的，而通过关节镜手术获 取的脂肪来源干细胞成软骨能力更强，在软骨修复及再生中有很好的临床意义。

目前有文献报道了将人的脂肪间充质干细胞移植到小鼠、大鼠、兔子、狗等多个物种的 模型,均有显著的疗效。最新的生物3D打印技术更是为脂肪间充质干细胞的应用打开了新局 面，研究人员利用该技术成功将脂肪间充质干细胞应用到裸鼠体内的异位成骨,初步证明了 体内成骨的3D打印技术路线的可行性。因应用干细胞通常需要经过先分离纯化以后再经体外 培养来富集细胞,以原位注射、静脉注射或者三维塑型后移植的方式进行细胞治疗，所以在 初期细胞的分离纯化收到尤为重要，不同的分离方法获取细胞数目、活率及纯度都大相径庭， 而这些更影响所获得干细胞的功能、分化能力和分化效果。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种简单、高效分离脂肪来源脂肪间充质干细胞的方 法，分离得到的细胞得率高。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1.一种高效脂肪来源脂肪间充质干细胞的分离方法，包括以下步骤：

1)将脂肪块加适量PBS后剪碎，再加双倍体积的PBS，充分混合离心，去除下面血水层以及沉淀物；再加入1-2倍体积的PBS吹打洗涤脂肪成分，离心；

2)加入等体积的含有1x双抗的DMEM溶液，混匀，4℃放置12-20小时(可选择，收 取样本较晚的情况下，不影响实验结果)；

3)室温放置10-30分钟后离心，取上层脂肪加入等体积的消化液，混匀于37℃震荡消化 30min；

4)消化完成后离心弃上清，沉淀加入10-20ml含10％FBS的DMEM溶液，混匀后用100μm的细胞筛去除杂质，离心去上清；再加PBS洗涤后，离心去上清；

5)加入1X红细胞裂解液，混匀，室温放置3-5min；再加入2-4倍体积的PBS，室温离心去上清；加入DMEM溶液重悬细胞，40μm的细胞筛过滤，离心去上清；

6)用细胞染色分析液重悬细胞，加入荧光标记的CD31,CD45,CD34和CD146抗体进行流式细胞分选。

进一步，所述消化液为1mg/ml II型胶原酶、0.002％脱氧核糖核酸酶I、5ug/ml木瓜蛋 白酶、2ug/ml中性蛋白酶。

进一步，流式细胞分选时还包括荧光标记的IgG的同型对照。

进一步，CD31和CD45为PE标记,CD34为APC标记，CD146为FITC标记。

进一步，流式细胞分选时还包括荧光标记的IgG的同型对照，所述同型对照为PE-IgG Control，APC-IgG Control，FITC-IgG Control。

进一步，CD31,CD45,CD34按每10⁶细胞加入量为20μl。

进一步，CD146按每106细胞加入量为5μl。

进一步，所述离心为400-800g，离心5-10分钟。

进一步，所述细胞染色分析液为1xPBS含有2％的FBS和1x FcRblock。

2.由上述分离方法得到的脂肪间充质干细胞。

本发明的有益效果在于：本发明提供的一种简单、高效分离脂肪来源脂肪间充质干细胞 的方法，通过消化液以II型胶原酶为主，辅以脱氧核糖核酸酶I、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶 可更好的分离出ADSCs，提高其收率和活性，结合进一步通过流式筛选出纯度更好的ADSCs。 通过本方法分离、筛选得到ADSCs得到的细胞量较多，每ml组织可得6.3×10⁵cells，细胞 活性均>85％，且细胞纯度很高，检测结果显示CD90、CD105、CD73和CD44呈强阳性，比 例皆接近100％。在培养传代5-6代后，还具有良好的细胞形态，并具有成脂分化、成骨分化 和成软骨分化等三向分化能力。充分证明本发明分离得到的ADSCs细胞不仅靠分离提取得 到，还可以经传代细胞培养繁殖得到更大量，可用于制备软骨组织修复的药物中应用。本发 明分离得到的ADSCs细胞在小鼠急性肝损模型中同空白对比，显示出细胞具有较好的急性肝 损伤修复能力。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

1.图1为流式分选结果图；

2.图2为分离得到的细胞培养状态图；

3.图3为分离得到的细胞培养5-6代后流式检测图；

4.图4为分离得到的细胞培养5-6代后成脂分化能力检测图；

5.图5为分离得到的细胞培养5-6代后成骨分化能力检测图；

6.图6为分离得到的细胞培养5-6代后成软骨分化能力检测图；

7.图7为小鼠急性肝损伤模型中，空白组和对照组的Hmox-1、GST、ALB、CK19和Nrf2表达对比图；

8.图8为小鼠急性肝损伤模型中，空白组和对照组的小鼠肝组织石蜡切片HE染色图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实 验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

1).细胞提取：

a.取样，称量记录样本重量，将脂肪块(来源于西南医院全膝关节置换术病人，已获伦理委员会批准)移入超净台，加适量PBS(磷酸盐缓冲液)，用解剖剪剪碎 组织块后，加双倍体积的PBS，充分混合后移入50ml离心管中，4℃600g离心 10min，去除下面血水层以及沉淀物；

b.加入等体积的PBS吹打洗涤脂肪成分，4℃600g离心10min。

c.加入等体积的含有1x双抗(Penicillin-Streptomycin Solution，青霉素-链霉素溶 液，厂家：Hyclone)的DMEM溶液，混匀，4℃过夜(可选择，收取样本较 晚的情况下，不影响实验结果)。

d.取出盛有脂肪的离心管室温放置10min后，室温600g离心10min。

e.将上层脂肪移入新离心管内，加入等体积的消化液，消化液为1mg/ml II型胶原酶(1mg/ml Collagenase type II)、0.002％脱氧核糖核酸酶I(Deoxyribonuclease I)、5ug/ml木瓜蛋白酶(Papain)、2ug/ml中性蛋白酶(Neutral Protease)；混 匀脂肪组织，封口膜密封盖子。

f.摇床震荡消化，37℃，240RPM，30min。

g.消化完成后，取出离心管，室温下600g离心10min。

h.小心去除上清，加入共约10-20ml的DMEM溶液(含10％FBS)，混匀沉淀细胞， 用100μm的细胞筛去除杂质；室温600g离心5min，去上清。

i.加入10ml PBS,室温600g离心5min，去上清。

j.加入适量的1X红细胞裂解液(100ml消化的脂肪组织对应10ml的裂解液)，混匀，室温放置3min。

k.加入2倍体积的PBS，室温400g离心5min。

l.去上清，加入适量DMEM溶液重悬细胞，40μm的细胞筛过滤。

m.台盼蓝染色，用红细胞计数板进行细胞计数，计算细胞得率及活率。

实施例2流式检测/筛选：

1.制备细胞染色分析液：1xPBS含有2％的FBS和1x FcR block(厂家：美天旎，130-059-901)(100倍稀释)。

2.新提取的细胞经400g离心5min，尽量去除上清得细胞沉淀。

3.用300μl细胞染色分析液重悬细胞。

4.准备3个EP管，每管加入细胞悬液100μl，标号：1，2，3。

5.分别加入抗体：

管1：避光分别加入同型对照PE-IgG Control(BD，559320)，APC-IgG Control(BD，555751)，FITC-IgG Control(BD，555909)(20μl for 10⁶cells)；

管2：避光加入适量FITC-CD146(5μl for 10⁶cells)；

管3：避光分别加入4种抗体PE-CD31(BD,555446)、PE-CD45(BD，555483)、APC-CD34(BD，555824)(20μl for 10⁶cells)和FITC-CD146(BD,560848)(5μl for 10⁶cells)；

充分混匀后，置于冰上避光孵育20-30min。

6.孵育完成后，每管加入1ml PBS，10℃400g离心5min，去上清，用300ul的PBS溶液重悬细胞，用于流式分析，分选结果如图1所示，其中CD31为血管内皮细胞标记物，取 阴性，CD45为淋巴细胞标记物，取CD31和CD45阴性的细胞是为去除淋巴细胞和内皮细胞；CD34和CD146呈阳性。

分选后的ADSCs(adipose-derived stem cells，脂肪间充质干细胞)细胞悬液于10℃400g 离心5min，去上清。用含20％FBS和1x双抗的DMEM重悬细胞，后转置培养箱37℃，5％CO₂培养。表1为96份样本的按照本方法得到的ADSCs相关数据。

表1

实施例3功能验证

1.得率和活性：此方法获得的细胞数平均为6.3×10⁵/ml组织，细胞活性均>85％。

得率(cells/ml)＝总细胞数/脂肪体积(ml)

活率(％)＝活细胞数/总细胞数×100％

所分离得到的细胞培养后如图2所示，图2分别为培养第4天，第6天和第8天的细胞状态图。分离得到的细胞在分离8小时开始缓慢贴壁并缓慢生长，细胞呈椭圆状，24小时后换液去除未贴壁的以及死细胞，开始的0-3天生长速度缓慢，4天后可呈对数生长，细胞形态多样，圆三角形或菱形，第6天细胞可达到90％的丰度，即可开始传代培养，细胞多呈长梭形或长三角形；第8天的细胞可生长融合至100％，细胞呈长梭形并成簇生长，状态良好。细胞附图中所用标尺均为100μm。

2.流式检测：取培养至第5-6代的ADSCS，PBS洗后，加入胰酶消化，3min后，完全 培养基终止消化，800rpm 5min得到细胞沉淀，制备细胞染色分析溶液：1xPBS含有2％的 FBS和100倍稀释的FcRblock。用800μl细胞染色分析液重悬细胞。准备7个EP管，每管 加入细胞悬液100μl，标号：1，2，3、4、5、6、7，避光分别加入一下抗体：FITE Mouse Anti-Human CD90,PE Mouse Anti-Human CD44,PerCP-CyTM5.5 Mouse Anti-Human CD105,APC Mouse Anti-Human CD73，同同型对照hMSC Positive Isotype Control Cocktail,hMSC NegativeIsotype Control Cocktail及空白(1μl for 10⁵cells)(试剂盒BD，562245)，充分混匀后，置于冰上避 光孵育20-30min，孵育完成后，每管加入1ml PBS，10℃400g离心5min，去上清，用300ul 的PBS溶液重悬细胞，用于流式检测。检测结果如图3所示。检测结果显示此方法分离筛选 得到的细胞纯度非常高，CD90、CD105、CD73和CD44呈强阳性，比例皆接近100％；而CD24、CD45、CD11b、CD19呈阴性。本发明通过优化细胞提取分离方法的步骤及消化液中 酶的配比，使最终筛选得到的细胞收率高，细胞纯度好，并具有三向分化能力。

3.三向分化能力：取培养至第5-6代的ADSCS，PBS洗后，加入胰酶消化，3min后， 完全培养基终止消化，800rpm 5min得到细胞沉淀，完全培养基悬浮细胞。

成脂分化：细胞以2×10⁴/每孔的密度接种于12孔板，转置培养箱，待细胞生长融合至 80％时，更换成人脂肪来源间充质干细胞成脂分化培养基，隔天换液一次。成脂分化14天后， 弃去分化液，PBS洗后，4％多聚甲醛固定20min，PBS洗3次后，油红O染色20min，PBS洗3次，镜下观察，如图4所示，诱导14天后的细胞经油红O染色后可明显着色出现红色 脂滴，充分说明本发明分离方法获得的ADSCS成功分化为脂肪细胞。

成骨分化：细胞以2×10⁴/每孔的密度接种于12孔板，转置培养箱，待细胞生长融合至 80％时，更换成人脂肪来源间充质干细胞成骨分化培养基，隔天换液一次。成骨分化21天后， 弃去分化液，PBS洗后，4％多聚甲醛固定20min，PBS洗3次后，茜素红染色20min，PBS 洗3次，镜下观察，如图5所示。

成软骨分化：取2×10⁵的细胞悬液于离心管内，800rpm 5min得到细胞沉淀，去除上清， 每管加入1ml成人脂肪来源间充质干细胞成软骨分化基础培养基，悬浮细胞，800rpm5min 得到细胞沉淀，去除上清，每管缓慢沿壁加入1ml成人脂肪来源间充质干细胞成软骨分化完 全培养基，转置培养箱，24h后，轻弹管底，使细胞球悬浮于培养基内，隔天换液一次，小 心不要吸除细胞球。诱导分化21天后，取出分化后的软骨球，PBS洗后用4％多聚甲醛固定 24h，脱水后石蜡包埋，切片，并对切片样本进行阿尔新蓝染色，封片后镜下观察，如图6所 示。综合图4-图6所示结果，充分说明本发明所提供细胞分离方法由脂肪组织分离得到的 ADSCS细胞具有较好的成脂分化、成骨分化及成软骨分化能力。

实施例4

急性肝损伤的修复能力：

取6周的雌性C57小鼠，连续2天通过腹腔注射10％的CCl4溶液(10μl/g，橄榄油稀释), 构建小鼠急性肝损伤模型。小鼠分为2组：空白组和实验组，每组8只，实验组：每只小鼠 尾静脉注射100μl 2×10⁶ADSCS细胞悬液，空白组：每只小鼠尾静脉注射100μl生理盐水。 14d后，脊椎脱臼处死小鼠，取肝脏。

(1)提取RNA：取20g的肝脏组织，液氮研磨后移入1ml Trizol溶液中，充分混匀后，静置20分钟，12000rmp离心15分钟，此时溶液分为三层，取上层清液至另一无酶EP管内， 加入400μl的异丙醇，缓慢混匀后静置20分钟，12000rmp离心10分钟，去上清，加入1ml 75％乙醇溶液，12000rmp离心5分钟，去上清，室温静置1分钟，用30μl的DEPC水溶解RNA 沉淀并测定浓度，并用PrimeScriptTM RT Master Mix反转录为cDNA，通过qPCR检测 Hmox-1、GST、ALB、CK19和Nrf2的表达。

其中qPCR所用正反引物序列如下：

Hmox-1(F：TACCTTCCCGAACATCGACA，R：TCTGCAGGGGCAGTATCTTG)；

GST(F：GGCAGCCAAACCTAAGCTC,R：CCCTGGTCTGTGTCAGCATC)；

ALB(F：TCGCTACACCCAGAAAGCAC,R:CAGCAGACACACACGGTTCAG)；

CK19(F:TGCTGAAGCCACCTACCTTG,R:ATACTCCTGGTTCTGGCGCT)；

Nrf2(F:TGGGTTCAGTGACTCGGAAA,R:GACCAGGACTCACGGGAACT)。

检测结果如表1所示，空白组和实验组对照图如图7所示，由图7可知，实验组的Hmox-1、 GST、ALB、CK19和Nrf2的表达均比空白组高，充分说明：在急性肝损伤模型中，本方法 提取的ADSCs具有一定的肝损伤修复能力，综合自体来源细胞具有更小的排他反应的特点， 该ADSCs具有潜在的临床使用价值。

(2)再对空白组和实验组的肝组织石蜡切片进行HE染色，比较两组的损伤修复差异。 结果如图8所示显示，此方法获得的ADSCS细胞具有较好的急性肝损伤修复能力。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述 优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和 细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种高效脂肪来源脂肪间充质干细胞的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将脂肪块加适量PBS后剪碎，再加双倍体积的PBS，充分混合离心，去除下面血水层以及沉淀物；再加入1-2倍体积的PBS吹打洗涤脂肪成分，离心；

2)加入等体积的含有1x双抗的DMEM溶液，混匀，4℃放置12-20小时；

3)室温放置10-30分钟后离心，取上层脂肪加入等体积的消化液，混匀于37℃震荡消化30-60min；

4)消化完成后离心弃上清，沉淀加入10-20ml含10％FBS的DMEM溶液，混匀后用100μm的细胞筛去除杂质，离心去上清；再加PBS洗涤后，离心去上清；

5)加入1X红细胞裂解液，混匀，室温放置3-5min；再加入2-4倍体积的PBS，室温离心去上清；加入DMEM溶液重悬细胞，40μm的细胞筛过滤，离心去上清；

6)用细胞染色分析液重悬细胞，加入荧光标记的CD31,CD45,CD34和CD146抗体进行流式细胞分选。

2.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，消化液为1mg/ml II型胶原酶、0.002％脱氧核糖核酸酶I、5ug/ml木瓜蛋白酶、2ug/ml中性蛋白酶。

3.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，流式细胞分选时还包括荧光标记的IgG的同型对照。

4.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，CD31和CD45为PE标记,CD34为APC标记，CD146为FITC标记。

5.根据权利要求2所述的分离方法，其特征在于，流式细胞分选时还包括荧光标记的IgG的同型对照，所述同型对照为PE-IgG Control，APC-IgG Control，FITC-IgG Control。

6.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，CD31,CD45,CD34按每10⁶细胞加入量为20μl。

7.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，CD146按每10⁶细胞加入量为5μl。

8.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述离心为400-800g，离心5-10分钟。

9.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述细胞染色分析液为1xPBS含有2％的FBS和1x FcR block。

10.由权利要求1-8任一项所述的分离方法制备得到的脂肪间充质干细胞。

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