JP6049862B2 - フィブリン３及び／又はサルコグリカンγを指標としたセルライトの評価方法及びセルライト効果薬剤の評価方法 - Google Patents
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Description
本発明は、フィブリン３及び／又はサルコグリカンγを指標としたセルライトの評価方法、及びセルライト効果薬剤の評価方法に関する。
「セルライト」（gynoid lipodystrophy）は、主に女性の腹部、大腿部、臀部に観察される皮膚の凸凹の皮膚外観を呈する組織を指し、皮膚外観を著しく損なうことから美容上特に問題となっている。セルライトの発症機序は、学術的・医学的には未だ完全には解明されておらず、単に皮下脂肪の蓄積と考えられている。Mirrashed, F. やQuerleux, B.らのＭＲＩを用いた非侵襲解析によると、脂肪細胞や脂肪組織自体の形態的変化はセルライト皮膚で認められなかったが、セルライト皮膚では皮下脂肪組織の一部が真皮層にまで深く突起していることが明らかにされている（非特許文献１、２）。
成人女性の４０％がセルライトを持つとされており、美的外観を大幅に損なうことから、セルライトの軽減、予防、治療に対するニーズは高く、国内外含めセルライト対応製品やエステ療法が市場に既に存在している。しかしながら、セルライトを規定する組織学的特徴やその形成機構が解明できていないことから、そのような製品は、効果データに乏しい製品であったり、単に脂肪量を減少させることを目的にしたスリミング剤が主である。したがって、セルライトの軽減、予防、治療に対して実効を示すものは非常に少ない状況にあり、セルライトに特化した商品は今まで上市されていないのが現状である。
セルライト外観を改善する薬剤や処置方法について、データを伴って開示している文献は少ないが、ニコチンアミド、共役化リノール酸、スルホ−カルビオースについては、セルライト患部に塗布して、セルライトを軽減する薬剤としてデータを伴って開示されており（特許文献１及び２、並びに非特許文献８）、さらに１〜４ＭＨｚの超音波刺激がセルライトを軽減する処置として開示されている（特許文献３）。これらの文献は、セルライトを軽減する効果を示すデータを開示している一方で、その効果メカニズムについては明確に示されておらず、セルライトの減少が単に脂肪量の減少による効果なのか、あるいは脂肪減少以外のメカニズムが働いているのかについては依然として不明である。
セルライトに関する研究は非侵襲的な手法を用いた皮膚組織の調査が主に行われている。しかしながら、Ｎ数が少ない問題点に加え、非侵襲的な手法の性質上、断片的な情報しか得られておらず、統合的に調査されているとはいい難い状況である。
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Ana B R R et al., JEADV (2000) 14, 251-262
以上の背景から、セルライトの評価方法の開発、セルライト改善を目的とした薬剤の開発、並びにそのような薬剤の評価方法の開発が求められている。
本発明者らは、セルライトの組織学的特徴と形成機序の解明を目的として、さらに具体的には、多数のセルライト組織皮膚組織を用いてセルライト特有の現象を組織レベルで捉えること、さらには分子生物学的手法を用いてセルライト特有の現象の形成機序を解明することを目的として研究を行った。
より具体的に、本発明者らは、セルライト外観を示す女性の臀部、大腿部皮膚バイオプシー組織（以下、セルライト皮膚という）２５例、セルライト外観を示さない女性の臀部、大腿部皮膚バイオプシー組織（以下、女性コントロール皮膚という）１９例を用いて、ヘマトキシリン・エオジン染色、シリウスレッド染色、及びエラスチカワンギーソン染色を行い、組織解析を行った。
この組織解析により、セルライト皮膚で有意に乳頭構造が減退していること、真皮層の上部にある真皮乳頭層が女性コントロール皮膚と比べて薄くなっていること、セルライトではコラーゲンを含む膠原線維量には顕著な変化が認めらない一方で、エラスチン線維の減少と乱れが生じている傾向があること、さらには脂肪細胞や脂肪組織自体の形態的変化はセルライト皮膚で認められなかったが、脂肪突起という局在変化が見られたこと、が明らかになった。
以上の組織学における新知見より、セルライトの原因は、脂肪量の増大により皮膚内部で脂肪突起が生じる点、そしてそれに対してクッションの役割を果たすべき真皮に弾性の低下と薄化という変化が生じたためその役割を果たせず、皮膚内凸凹が外観化する点の２点にあることが推測された。したがって、セルライトの形成には、突起脂肪という局在変化のみならず、これまで全く着目されてこなかった真皮層における変化を伴うことが明らかとなり、従来の痩身や脂肪燃焼を目的にしたスリミング薬剤ではセルライトの改善には不十分である一方で、真皮での変化に対応する効果薬剤又は処理が、セルライト改善には必要であるという新たな知見を得ることができた。
本発明者らはさらに、セルライト皮膚と女性コントロール皮膚との間における真皮線維の変化の原因を明らかにするために、真皮の構成に最も重要な役割を果たし、その性質を決定する真皮線維芽細胞の遺伝子発現レベルを解析した。より具体的に、ヒト組織全層由来のＲＮＡを用いた解析では、皮膚全層の大多数を占める線維芽細胞以外の細胞、器官による、一種のノイズが原因で線維芽細胞の性質を的確に捉えられないため、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション法（非特許文献４及び５）を用いて、皮膚組織切片から真皮線維芽細胞のｍＲＮＡを抽出し、遺伝子マイクロアレイを行った。その結果、発現量がセルライト皮膚、女性コントロール皮膚間で変動する複数の遺伝子を見出すことに成功した。
これらの複数の遺伝子について更に定量的ＰＣＲを行って、セルライト皮膚の線維芽細胞での発現状況をより詳細に調べた結果、セルライト皮膚においてフィブリン３、サルコグリカンγが大きく発現低下していることが確認でき（図４及び６）、さらに免疫組織染色を行っても同様の傾向が観察された（図３及び５）。
フィブリン３は弾性線維の形成に関る細胞外タンパク質の一種であり、エラスチン線維の形成に関ることが、一般的な機能として知られている（非特許文献６，７）。一方、プロテオグリカンの一種であるサルコグリカンγについて、皮膚での機能は明らかとなっていないが、機能欠損個体の表現型より筋細胞膜を保護することが一般的機能として知られている。
したがって、フィブリン３の発現低下は、弾性線維、特にエラスチン線維の形成の異常を介し、そしてサルコグリカンγの発現低下は、線維芽細胞の細胞膜保護機能の機能低下を介して、セルライトの形成に関わると考えられるが、本発明はこれらのメカニズムに限定されるものではない。
さらに本発明者らは、セルライト外観を改善することが知られているニコチンアミド、共役化リノール酸を培養細胞に添加したところ、用量依存的にフィブリン３、サルコグリカンの発現の亢進することから、これらの薬剤は、セルライトで発現低下したフィブリン３、サルコグリカンγの発現を賦活亢進することで、真皮線維の変化を正常に戻し、セルライト外観を改善することができると結論づけた（図７及び８）。また、セルライト外観を改善することが知られている１Ｍｈｚの超音波刺激を培養細胞に与えたところ、フィブリン３の発現に変化は認められなかったものの、サルコグリカンγの発現を亢進することを見出した。したがって、本発明者らは、サルコグリカンγの発現を介してセルライトの真皮線維の変化を正常に戻していると結論づけた（図９）。
以上の本発明者らによる研究並びに明らかにされた新たな知見により、本発明者らはフィブリン３とサルコグリカンγの発現低下はセルライトが形成される原因であると結論づけ、フィブリン３及び／又はサルコグリカンγを指標としたセルライトの診断評価方法、及びフィブリン３及び／又はサルコグリカンγを指標とした、セルライト減少、改善、予防、又は治療薬剤の評価方法を発明するに至った。
したがって、本発明は以下の発明に関する：
［１］採取された皮膚サンプルにおけるフィブリン３及び／又はサルコグリカンγの発現量を指標としたセルライトの評価方法。
［２］前記皮膚サンプルが、真皮である、項目［１］に記載の評価方法。
［３］前記皮膚サンプルが、真皮の線維芽細胞である、項目［１］又は［２］に記載の評価方法。
［４］培養細胞において、フィブリン３及び／又はサルコグリカンγを指標とすることによる、セルライト改善、予防、又は治療薬剤の評価方法。
［５］以下の：
培養細胞に、候補薬剤を添加する工程；
フィブリン３及び／又はサルコグリカンγの発現量を決定する工程；及び
対照におけるフィブリン３及び／又はサルコグリカンγの発現量と、候補薬剤添加後におけるフィブリン３及び／又はサルコグリカンγの発現量とを比較する工程；
を含む、項目［４］に記載の評価方法
［６］前記培養細胞が、真皮の線維芽細胞である、項目［４］又は［５］に記載の評価方法。
［７］前記比較工程において、フィブリン３及び／又はサルコグリカンの発現量が亢進した場合に、候補薬剤がセルライトの抑制活性を有すると判断する、項目［４］〜［６］のいずれか一項に記載の方法。
［８］フィブリン３及び／又はサルコグリカンγの発現量を指標とすることによる、セルライト軽減のための美容方法の評価方法。
［９］以下の：
美容方法の適用前に、皮膚真皮のフィブリン３及び／又はサルコグリカンγの発現量を測定する工程；
美容方法を適用する工程；
美容方法適用後に、皮膚真皮のフィブリン３及び／又はサルコグリカンγの発現量を測定する工程；及び
美容方法の適用前後において、皮膚真皮のフィブリン３及び／又はサルコグリカンγの発現量を比較する工程
を含む、項目［８］に記載の評価方法。
［１０］前記比較工程において、フィブリン３及び／又はサルコグリカンγの発現量が亢進した場合に、美容方法がセルライトの抑制活性を有すると判断する、項目［９］に記載の評価方法。
［１１］前記皮膚真皮のフィブリン３及び／又はサルコグリカンγの発現量の測定が、レーザーマイクロダイセクションにより取得されたサンプルにおいて、定量的ＰＣＲを用いて行われる項目［１０］に記載の評価方法。
［１］採取された皮膚サンプルにおけるフィブリン３及び／又はサルコグリカンγの発現量を指標としたセルライトの評価方法。
［２］前記皮膚サンプルが、真皮である、項目［１］に記載の評価方法。
［３］前記皮膚サンプルが、真皮の線維芽細胞である、項目［１］又は［２］に記載の評価方法。
［４］培養細胞において、フィブリン３及び／又はサルコグリカンγを指標とすることによる、セルライト改善、予防、又は治療薬剤の評価方法。
［５］以下の：
培養細胞に、候補薬剤を添加する工程；
フィブリン３及び／又はサルコグリカンγの発現量を決定する工程；及び
対照におけるフィブリン３及び／又はサルコグリカンγの発現量と、候補薬剤添加後におけるフィブリン３及び／又はサルコグリカンγの発現量とを比較する工程；
を含む、項目［４］に記載の評価方法
［６］前記培養細胞が、真皮の線維芽細胞である、項目［４］又は［５］に記載の評価方法。
［７］前記比較工程において、フィブリン３及び／又はサルコグリカンの発現量が亢進した場合に、候補薬剤がセルライトの抑制活性を有すると判断する、項目［４］〜［６］のいずれか一項に記載の方法。
［８］フィブリン３及び／又はサルコグリカンγの発現量を指標とすることによる、セルライト軽減のための美容方法の評価方法。
［９］以下の：
美容方法の適用前に、皮膚真皮のフィブリン３及び／又はサルコグリカンγの発現量を測定する工程；
美容方法を適用する工程；
美容方法適用後に、皮膚真皮のフィブリン３及び／又はサルコグリカンγの発現量を測定する工程；及び
美容方法の適用前後において、皮膚真皮のフィブリン３及び／又はサルコグリカンγの発現量を比較する工程
を含む、項目［８］に記載の評価方法。
［１０］前記比較工程において、フィブリン３及び／又はサルコグリカンγの発現量が亢進した場合に、美容方法がセルライトの抑制活性を有すると判断する、項目［９］に記載の評価方法。
［１１］前記皮膚真皮のフィブリン３及び／又はサルコグリカンγの発現量の測定が、レーザーマイクロダイセクションにより取得されたサンプルにおいて、定量的ＰＣＲを用いて行われる項目［１０］に記載の評価方法。
本発明により、フィブリン３及び／又はサルコグリカンγの発現量を指標とすることにより生体におけるセルライトを適切に評価することが可能になる。またフィブリン３及び／又はサルコグリカンγの発現を指標とすることにより、薬剤のセルライト抑制又は減少活性について評価が可能となり、セルライトの治療剤、予防剤又は軽減剤についてスクリーニングが可能となる。
本発明は、採取された皮膚サンプルにおけるフィブリン３及び／又はサルコグリカンγの発現量を指標としたセルライトの評価方法に関する。より具体的に、採取された皮膚サンプルは、特に真皮組織、さらに好ましくは真皮の線維芽細胞である。皮膚サンプルは任意の方法で取得されてもよいが、目的の細胞のみを取得する観点から、レーザーマイクロダイセクションにより採取することが好ましい。
本発明のセルライトの評価方法は、様々な重篤度のセルライトを患う対象から得た皮膚サンプル中のフィブリン３及び／又はサルコグリカンγの発現量を測定し、発現量と重篤度との関係を予め明らかにすることにより、対象におけるセルライトを評価することが可能になる。セルライトの重篤度をセルライトの外観から０〜４のグレードに分類する方法が知られている（非特許文献１）。この分類方法におけるセルライトの重篤度の分類の基準は以下の通りである：
しかしながら、重篤度の分類は、上記の分類方法によるものに限られるべきでなく、任意の分類が用いられてもよい。例えば皮膚外観に現れていないセルライトを、組織病理学的及び臨床的所見に従って分類する方法も本技術分野において知られている（非特許文献１０）。この分類方法では、セルライトの重篤度は、例えば以下の表の通りに分類することができる：
これらの分類方法等における各グレードと、フィブリン３及び／又はサルコグリカンγの発現量とを予め関連づけておくことにより、対象におけるセルライトの評価が可能になる。
本発明のフィブリン３及び／又はサルコグリカンγの発現量を指標とすることにより、皮膚表面上に現れていない初期のセルライトを評価し、診断することができ、セルライトの早期発見及び予防に特に有用となる。セルライトの早期発見が可能になれば、皮膚表面上にセルライトが出現する前、すなわち皮膚の外観を損なう前に予防・対策を講じることが可能であり特に好ましい。
本発明の別の態様では、本発明は、培養細胞において、フィブリン３及び／又はサルコグリカンγを指標とすることによる、セルライト改善、予防、又は治療薬剤の評価方法に関する。より具体的に、当該セルライト改善、予防、又は治療薬剤の評価方法は、以下の：
培養細胞に、候補薬剤を添加する工程；
フィブリン３及び／又はサルコグリカンγの発現量を決定する工程；及び
対照におけるフィブリン３及び／又はサルコグリカンγの発現量と、候補薬剤添加後におけるフィブリン３及び／又はサルコグリカンγの発現量とを比較する工程；
を含む。さらに比較工程において、又は比較工程の後に、フィブリン３及び／又はサルコグリカンγの発現が亢進した場合に、候補薬剤がセルライトの抑制活性を有すると判定する工程が含まれてもよい。
培養細胞に、候補薬剤を添加する工程；
フィブリン３及び／又はサルコグリカンγの発現量を決定する工程；及び
対照におけるフィブリン３及び／又はサルコグリカンγの発現量と、候補薬剤添加後におけるフィブリン３及び／又はサルコグリカンγの発現量とを比較する工程；
を含む。さらに比較工程において、又は比較工程の後に、フィブリン３及び／又はサルコグリカンγの発現が亢進した場合に、候補薬剤がセルライトの抑制活性を有すると判定する工程が含まれてもよい。
本発明のセルライト改善、予防、又は治療薬剤の評価方法は、多くの種類の候補薬剤を含む候補薬剤ライブラリー、例えば化合物ライブラリー、抽出物ライブラリーなど、を用いることにより、セルライト減少活性を有する候補薬剤を選択することができるスクリーニング法に用いることができる。したがって、本発明のセルライト改善、予防、又は治療薬剤の評価方法は、これらの薬剤のスクリーニング方法でもある。
本発明のさらに別の態様では、本発明は、フィブリン３及び／又はサルコグリカンγを指標とすることによる、セルライト軽減・改善のための美容方法の評価方法にも関する。より具体的に当該美容方法の評価方法は、以下の：
美容方法の適用前に、皮膚真皮のフィブリン３及び／又はサルコグリカンγの発現量を測定する工程；
美容方法を適用する工程；
美容方法適用後に、皮膚真皮のフィブリン３及び／又はサルコグリカンγの発現量を測定する工程；及び
美容方法の適用前後において、皮膚真皮のフィブリン３及び／又はサルコグリカンγの発現量を比較する工程
を含む。美容方法としては、化粧料の適用、運動、マッサージ、超音波処理など特に限定されないが、これらの美容方法の適用前後で、皮膚真皮、特に皮膚真皮の線維芽細胞におけるフィブリン３及び／又はサルコグリカンγの発現量が亢進した場合に美容方法が、セルライトの軽減・改善に有効であると判定することができる。このような美容方法の評価方法は、単に個人的に行われるのみならず、医師以外の化粧料販売員やエステティシャンにより提供される。
美容方法の適用前に、皮膚真皮のフィブリン３及び／又はサルコグリカンγの発現量を測定する工程；
美容方法を適用する工程；
美容方法適用後に、皮膚真皮のフィブリン３及び／又はサルコグリカンγの発現量を測定する工程；及び
美容方法の適用前後において、皮膚真皮のフィブリン３及び／又はサルコグリカンγの発現量を比較する工程
を含む。美容方法としては、化粧料の適用、運動、マッサージ、超音波処理など特に限定されないが、これらの美容方法の適用前後で、皮膚真皮、特に皮膚真皮の線維芽細胞におけるフィブリン３及び／又はサルコグリカンγの発現量が亢進した場合に美容方法が、セルライトの軽減・改善に有効であると判定することができる。このような美容方法の評価方法は、単に個人的に行われるのみならず、医師以外の化粧料販売員やエステティシャンにより提供される。
本発明において、指標となるフィブリン３及び／又はサルコグリカンγの発現量は、一般に遺伝子発現の研究で使用できる方法であれば、任意の方法で測定することができ、例えば定量的ＰＣＲによるｍＲＮＡ量の測定、ノーザンブロット法によるｍＲＮＡ量の測定、ウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法、又は免疫沈降法によるタンパク質量の測定であってもよい。レーザーマイクロダイセクションにより採取した少量のサンプルから測定を行う観点から、定量的ＰＣＲによるｍＲＮＡの測定が特に好ましい。
本発明の方法において、指標となるフィブリン３とサルコグリカンγの発現量は、それぞれ単独で使用されてもよいし、フィブリン３とサルコグリカンγの両方を指標として用いてもよい。
本発明において、フィブリン３及び／又はサルコグリカンγの発現亢進とは、対照におけるフィブリン３及び／又はサルコグリカンγの発現量に対して、候補薬剤添加後のフィブリン３及び／又はサルコグリカンγの発現量が増加していることをいい、好ましくは２０％以上、より好ましくは３５％以上、さらに好ましくは５０％以上発現量が増加した場合のことをいう。発現量の増加は、統計学的に有意であることが好ましい。
真皮とは、表皮の下部に存在する構造であり、表皮と真皮とは基底膜によって隔てられている。真皮には線維芽細胞が存在しており、解剖学的には、乳頭層、網状層といった二層の構造を有している。
培養細胞は、皮膚細胞由来の細胞であれば任意の細胞であってもよいが、セルライトに関連する細胞として、特に真皮の細胞、さらに好ましくは真皮の線維芽細胞由来の培養細胞が好ましい。
実施例１：組織切片の調製
セルライト外観を示す臀部、大腿部皮膚バイオプシー組織（以下、セルライト皮膚とする）２５例、セルライト外観を示さない臀部、大腿部皮膚バイオプシー組織（以下、コントロール皮膚とする）１９例を用いて組織解析を行った。全てのバイオプシー皮膚組織は、女性から採取されたものである。バイオプシー皮膚組織を凍結組織包埋剤OTCコンパウンド（Sakura Finetek）にて包埋し、凍結切片作成装置クライオスタット（Leica）にて凍結切片スライドを作成した。
セルライト外観を示す臀部、大腿部皮膚バイオプシー組織（以下、セルライト皮膚とする）２５例、セルライト外観を示さない臀部、大腿部皮膚バイオプシー組織（以下、コントロール皮膚とする）１９例を用いて組織解析を行った。全てのバイオプシー皮膚組織は、女性から採取されたものである。バイオプシー皮膚組織を凍結組織包埋剤OTCコンパウンド（Sakura Finetek）にて包埋し、凍結切片作成装置クライオスタット（Leica）にて凍結切片スライドを作成した。
実施例２：組織化学染色
実施例１で得た組織切片を風乾後、各組織切片につきエラスチカワンギーソン染色を、エラスチカワンギーソン染色キット（Ｍｅｒｃｋ社）を用いて説明書に記載の方法に従い行った。エラスチカワンギーソン染色の結果により、コントロール皮膚に比較してセルライト皮膚において真皮内のエラスチン繊維の配列が乱れ、エラスチン繊維が凝集及び過疎が生じることがわかった（図１）。この点をより明らかに示すため、染色した組織切片の中から、無作為にセルライト組織１４例、コントロール組織９例の組織切片を選択し、２人の観察者により盲検下でスコアリングを行った。スコアはあらかじめ５段階に設定し、スコアが最高の５ではエラスチン繊維が豊富で真皮内に整然と配列、スコアが最低の１では繊維が非常に過疎で、配列も乱れていると設定した。２人のスコア結果の平均値をセルライト、コントロールに分けてプロットし傾向を確認した結果、セルライトではエラスチン繊維の乱れ、凝集及び過疎が生じている傾向が示された（図２）。この結果により、本発明者らは、脂肪突起による皮膚内の凹凸に対して、クッションの役割を果たすべき真皮のエラスチン線維が凝集及び過疎を生じることで、皮膚内の脂肪突起による凹凸が皮膚表面に現れてセルライトを形成すると結論づけた。
実施例１で得た組織切片を風乾後、各組織切片につきエラスチカワンギーソン染色を、エラスチカワンギーソン染色キット（Ｍｅｒｃｋ社）を用いて説明書に記載の方法に従い行った。エラスチカワンギーソン染色の結果により、コントロール皮膚に比較してセルライト皮膚において真皮内のエラスチン繊維の配列が乱れ、エラスチン繊維が凝集及び過疎が生じることがわかった（図１）。この点をより明らかに示すため、染色した組織切片の中から、無作為にセルライト組織１４例、コントロール組織９例の組織切片を選択し、２人の観察者により盲検下でスコアリングを行った。スコアはあらかじめ５段階に設定し、スコアが最高の５ではエラスチン繊維が豊富で真皮内に整然と配列、スコアが最低の１では繊維が非常に過疎で、配列も乱れていると設定した。２人のスコア結果の平均値をセルライト、コントロールに分けてプロットし傾向を確認した結果、セルライトではエラスチン繊維の乱れ、凝集及び過疎が生じている傾向が示された（図２）。この結果により、本発明者らは、脂肪突起による皮膚内の凹凸に対して、クッションの役割を果たすべき真皮のエラスチン線維が凝集及び過疎を生じることで、皮膚内の脂肪突起による凹凸が皮膚表面に現れてセルライトを形成すると結論づけた。
実施例１で取得した組織切片を風乾後、フィブリン３、サルコグリカンγの免疫組織染色を以下の通りに行った。組織切片を４％ＰＦＡにて１５分固定した後、ＰＢＳで洗浄し、CSAII Biotin-free Tyramide Signal Amplification system (DAKO) を用いてＤＡＫＯ社のプロトコールに従って免疫染色を実施した。用いた抗体は、抗ヒトフィブリン３抗体（santacruz）、抗ヒトサルコグリカンγ抗体（Abcam）である。ＤＡＢ染色後、封入剤とカバーガラスにより封入し、蛍光顕微鏡（Olympus）などの顕微鏡を用い観察及び写真を撮影した（図３及び５）。
実施例３：皮膚組織切片からの線維芽細胞由来の微量ＲＮＡの抽出並びにｃＤＮＡ合成及び増幅
凍結切片作成装置クライオスタット（Leica）で作成した組織切片を、PEN membrane glass slides (molecular device ) を用いて、組織切片スライドを作成した。次に、Frozen section staining kit (Arcturus)を用い染色を行った。組織切片スライドをＲＮＡ分解酵素非含の蒸留水（以下蒸留水）（invitrogen）で調製した７５％エタノールで３０秒、蒸留水で３０秒浸し、１００μｌのHistogene staining solution (Arcturus) で20秒間染色した。蒸留水で３０秒間洗浄後、７５％、９５％、１００％のエタノール系列と、キシレンにそれぞれ３０秒間浸し、脱水した。染色、脱水した組織切片スライドをレーザーマイクロダイセクション装置 Veritas（Arctutus）にセットし、血管やその他附属器官が混入しないよう真皮に局在するシングルセルである線維芽細胞を含む領域をマイクロダイセクションした。続けて、Rneasy Plus Micro kit (Qiagen) を用いて、微量ＲＮＡの抽出、精製を行った。マイクロダイセクションした線維芽細胞を含む領域片を、１％メルカプトエタノールのRLT plus buffer ３５０μｌの入った５００μｌチューブに入れてＲＮＡ抽出した。その後は、Ｑｉａｇｅｎ社のプロトコールに従い、微量ＲＮＡを精製、単離した。氷冷後、次のｃＤＮＡ合成プロセスに進んだ。WTOvation Pico System ( NuGEN) を用いて、提供されたプロトコールに従って、抽出したＲＮＡを鋳型にして１本鎖ｃＤＮＡ合成し、そして増幅を行った。バイオアナライザー2100（Agilent）によりｃＤＮＡ合成、増幅が行われていることを確認した。濃度を核酸定量装置Nanodrop(Thermo scientific)により測定した。
凍結切片作成装置クライオスタット（Leica）で作成した組織切片を、PEN membrane glass slides (molecular device ) を用いて、組織切片スライドを作成した。次に、Frozen section staining kit (Arcturus)を用い染色を行った。組織切片スライドをＲＮＡ分解酵素非含の蒸留水（以下蒸留水）（invitrogen）で調製した７５％エタノールで３０秒、蒸留水で３０秒浸し、１００μｌのHistogene staining solution (Arcturus) で20秒間染色した。蒸留水で３０秒間洗浄後、７５％、９５％、１００％のエタノール系列と、キシレンにそれぞれ３０秒間浸し、脱水した。染色、脱水した組織切片スライドをレーザーマイクロダイセクション装置 Veritas（Arctutus）にセットし、血管やその他附属器官が混入しないよう真皮に局在するシングルセルである線維芽細胞を含む領域をマイクロダイセクションした。続けて、Rneasy Plus Micro kit (Qiagen) を用いて、微量ＲＮＡの抽出、精製を行った。マイクロダイセクションした線維芽細胞を含む領域片を、１％メルカプトエタノールのRLT plus buffer ３５０μｌの入った５００μｌチューブに入れてＲＮＡ抽出した。その後は、Ｑｉａｇｅｎ社のプロトコールに従い、微量ＲＮＡを精製、単離した。氷冷後、次のｃＤＮＡ合成プロセスに進んだ。WTOvation Pico System ( NuGEN) を用いて、提供されたプロトコールに従って、抽出したＲＮＡを鋳型にして１本鎖ｃＤＮＡ合成し、そして増幅を行った。バイオアナライザー2100（Agilent）によりｃＤＮＡ合成、増幅が行われていることを確認した。濃度を核酸定量装置Nanodrop(Thermo scientific)により測定した。
実施例４：フィブリン３及びサルコグリカンγの定量的ＰＣＲ
合成したｃＤＮＡを鋳型に反応試薬LightCycler（商標） FastStart DNA MasterPLUS SYBR Green (Roche)、反応装置LightCycler(Roche)あるいはAB 7900 HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems)を用いて定量的RT-PCRを行った。組成条件はRoche社のプロトコールに従って行った。プライマーのアニール温度は６０℃に設定し、ΔΔCt 手法を用いて、定量化した。
合成したｃＤＮＡを鋳型に反応試薬LightCycler（商標） FastStart DNA MasterPLUS SYBR Green (Roche)、反応装置LightCycler(Roche)あるいはAB 7900 HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems)を用いて定量的RT-PCRを行った。組成条件はRoche社のプロトコールに従って行った。プライマーのアニール温度は６０℃に設定し、ΔΔCt 手法を用いて、定量化した。
定量的ＰＣＲに用いたプライマー対の配列情報は、以下の通りであった：
Ｇ３ＰＤＨ フォワード： 5’-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3’
リバース： 5’-TGGGATTTCCATTGATGACA-3’
１８Ｓ ｒＲＮＡ フォワード：5’-CGGCTACCACATCCAAGGAA-3’
リバース： 5’-GCTGGAATTACCGCGGCT-3’
フィブリン３ フォワード： 5’-GCTTCCGTTGTTATCCACGAAATCC-3’
リバース： 5’-CTGTATCTGGAAGATGTCTGATGGC-3’
サルコグリカンγ フォワード：5’-GAGGCCAGAGAATCAGTATGTCTAC-3’
リバース： 5’-CCATCTTTTGTTACACACAAGTGGCC-3’
Ｇ３ＰＤＨ、１８Ｓ ｒＲＮＡは内部標準として用い、各遺伝子それぞれの定量時において、いずれかを用い対照群のｃＤＮＡ量を補正した。女性コントロール皮膚と、セルライト皮膚とのあいだでフィブリン３の発現量、及びサルコグリカンγの発現量をそれぞれ比較した。結果を図４及び６に示す。
Ｇ３ＰＤＨ フォワード： 5’-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3’
リバース： 5’-TGGGATTTCCATTGATGACA-3’
１８Ｓ ｒＲＮＡ フォワード：5’-CGGCTACCACATCCAAGGAA-3’
リバース： 5’-GCTGGAATTACCGCGGCT-3’
フィブリン３ フォワード： 5’-GCTTCCGTTGTTATCCACGAAATCC-3’
リバース： 5’-CTGTATCTGGAAGATGTCTGATGGC-3’
サルコグリカンγ フォワード：5’-GAGGCCAGAGAATCAGTATGTCTAC-3’
リバース： 5’-CCATCTTTTGTTACACACAAGTGGCC-3’
Ｇ３ＰＤＨ、１８Ｓ ｒＲＮＡは内部標準として用い、各遺伝子それぞれの定量時において、いずれかを用い対照群のｃＤＮＡ量を補正した。女性コントロール皮膚と、セルライト皮膚とのあいだでフィブリン３の発現量、及びサルコグリカンγの発現量をそれぞれ比較した。結果を図４及び６に示す。
実施例５：既存のセルライト改善薬剤の添加実験
ヒト皮膚組織由来の線維芽細胞を24 well TypeI collagen coated dish (IWAKI) に播種し、７０〜８０％コンフルエントになるまで１０％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ（Gibco/invitrogen）で３７℃、５％ＣＯ2条件下で培養した。無血清培地に半日間置換した後、異なる濃度の共役リノール酸（sigma）（０．００１％ｖ／ｖ、０．０１％ｖ／ｖ）、あるいはニコチンアミド（sigma）(０．０００５％ｗ／ｖ、０．００５％ｗ／ｖ）を含む無血清培地に置換し、２４時間後にRNeasy mini kit (Qiagen) を用いてQiagen社のプロトコールに従ってＲＮＡを回収した。なお、コントロールとして、無添加の無血清培地にて置換し、２４時間後にＲＮＡを回収したものを用いた。回収したＲＮＡは濃度を核酸定量装置Nanodrop(Thermo scientific)により測定した。比較対象群のＲＮＡ濃度をそろえた上で、Applied Biosystems社のプロトコールに従いｃＤＮＡ合成キット High capacity cDNA reverse transcription kit (Applied Biosystems)を用いてＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。実施例４に記載の方法を用いて、既存の各セルライト改善薬剤を使用した際のフィブリン３の発現量、及びサルコグリカンγの発現量の変化を図７及び図８に示した。
ヒト皮膚組織由来の線維芽細胞を24 well TypeI collagen coated dish (IWAKI) に播種し、７０〜８０％コンフルエントになるまで１０％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ（Gibco/invitrogen）で３７℃、５％ＣＯ2条件下で培養した。無血清培地に半日間置換した後、異なる濃度の共役リノール酸（sigma）（０．００１％ｖ／ｖ、０．０１％ｖ／ｖ）、あるいはニコチンアミド（sigma）(０．０００５％ｗ／ｖ、０．００５％ｗ／ｖ）を含む無血清培地に置換し、２４時間後にRNeasy mini kit (Qiagen) を用いてQiagen社のプロトコールに従ってＲＮＡを回収した。なお、コントロールとして、無添加の無血清培地にて置換し、２４時間後にＲＮＡを回収したものを用いた。回収したＲＮＡは濃度を核酸定量装置Nanodrop(Thermo scientific)により測定した。比較対象群のＲＮＡ濃度をそろえた上で、Applied Biosystems社のプロトコールに従いｃＤＮＡ合成キット High capacity cDNA reverse transcription kit (Applied Biosystems)を用いてＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。実施例４に記載の方法を用いて、既存の各セルライト改善薬剤を使用した際のフィブリン３の発現量、及びサルコグリカンγの発現量の変化を図７及び図８に示した。
実施例６：培養細胞への超音波処理
ヒト皮膚組織由来の線維芽細胞を３５ｍｍ well dish (Becton, Dickinson and Company)に播種し、７０〜８０％コンフルエントになるまで１０％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ（Gibco/invitrogen）で３７℃、５％ＣＯ2条件下で培養した。無血清培地に半日間置換した後、新鮮な無血清培地に置換し、０．５ｍｍの距離で１ＭＨｚの超音波刺激を、超音波美容機（松下電工）を用いて与えた。なお刺激時間は、細胞に直接刺激することを踏まえて20秒間という短い時間に設定した。刺激２４時間後にQiagen社のプロトコールに従ってＲＮＡを回収した。回収したＲＮＡは濃度を核酸定量装置Nanodrop(Thermo scientific)により測定した。比較対象群のRNA濃度をそろえた上で、Applied Biosystems社のプロトコールに従いｃＤＮＡ合成キット High capacity cDNA reverse transcription kit (Applied Biosystems)を用いてＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。実施例３に記載の方法を用いて、超音波処理を行った際のフィブリン３の発現量、及びサルコグリカンγの発現量の変化を図９に示した。
ヒト皮膚組織由来の線維芽細胞を３５ｍｍ well dish (Becton, Dickinson and Company)に播種し、７０〜８０％コンフルエントになるまで１０％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ（Gibco/invitrogen）で３７℃、５％ＣＯ2条件下で培養した。無血清培地に半日間置換した後、新鮮な無血清培地に置換し、０．５ｍｍの距離で１ＭＨｚの超音波刺激を、超音波美容機（松下電工）を用いて与えた。なお刺激時間は、細胞に直接刺激することを踏まえて20秒間という短い時間に設定した。刺激２４時間後にQiagen社のプロトコールに従ってＲＮＡを回収した。回収したＲＮＡは濃度を核酸定量装置Nanodrop(Thermo scientific)により測定した。比較対象群のRNA濃度をそろえた上で、Applied Biosystems社のプロトコールに従いｃＤＮＡ合成キット High capacity cDNA reverse transcription kit (Applied Biosystems)を用いてＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。実施例３に記載の方法を用いて、超音波処理を行った際のフィブリン３の発現量、及びサルコグリカンγの発現量の変化を図９に示した。
Claims (6)
- 採取された皮膚サンプルにおけるフィブリン３及び／又はサルコグリカンγの発現量を指標としたセルライトの重篤度の評価方法。
- 前記皮膚サンプルが、真皮である、請求項１に記載の評価方法。
- 前記皮膚サンプルが、真皮の線維芽細胞である、請求項１に記載の評価方法。
- 培養細胞において、フィブリン３及び／又はサルコグリカンγを指標とすることによる、候補薬剤のセルライト抑制、改善、予防、又は治療活性の評価方法であって、フィブリン３及び/又はサルコグリカンγの発現が亢進した場合に、前記候補薬剤がセルライトの抑制、改善、予防、又は治療活性を有すると判定する、前記評価方法。
- 以下の：
培養細胞に、候補薬剤を添加する工程；
フィブリン３及び／又はサルコグリカンγの発現量を決定する工程；及び
対照におけるフィブリン３及び／又はサルコグリカンγの発現量と、候補薬剤添加後におけるフィブリン３及び／又はサルコグリカンγの発現量とを比較する工程；
を含む、請求項４に記載の評価方法。 - 前記培養細胞が、真皮の線維芽細胞である、請求項４又は５に記載の評価方法。
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