JP7272808B2 - 抗皮膚老化剤のスクリーニング方法 - Google Patents
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細胞骨格制御因子の発現の増大及び/又は発現の減少抑制を指標とする、Collagen Iの発現増大及び/又は発現減少抑制作用を有する抗皮膚老化剤のスクリーニング方法である。すなわち、本発明は、Collagen Iの発現増大及び/又は発現減少抑制作用を有する抗皮膚老化剤のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
細胞骨格制御因子の発現の増大及び/又は発現の減少抑制を指標とする、Collagen Iの発現の増大及び/又は発現の減少抑制作用を有する抗皮膚老化剤のスクリーニング方法である。
前記細胞骨格制御因子がアクチン関連タンパク質3B(actin-related protein 3 homolog B、ACTR3B)、リムキナーゼ-1(LIM kinase-1、LIMK1)、及びスーパービリン(surpervillin、SVIL)からなる群から選択される1又は2以上であることを特徴とする。
前記抗皮膚老化剤は、皮膚支帯(Retinacula cutis)の本数が減ることを抑制する作用を有するものであることを特徴とする。
ここで、『皮膚支帯(Retinacula cutis)の本数が減ること』は、皮膚支帯(Retinacula cutis)の構成要素であるCollagen Iが減少することにより、皮膚支帯(Retinacula cutis)が消滅する現象を指す。
前記抗皮膚老化剤が、生理老化に基づく肌状態の改善作用を有するものであることを特徴とする。
前記肌状態が、シワの増加、肌のタルミ、ハリの低下、肌の弾力性の低下からなる群から選択される1又は2以上であることを特徴とする。
前記細胞が、線維芽細胞及び/又は腱細胞であることを特徴とする。
細胞に物質を適用する適用工程と、
適用工程後に前記細胞の細胞骨格制御因子の発現量を測定する測定工程と、
前記測定工程の測定結果に基づき、細胞骨格制御因子の発現の増大及び/又は発現の減少抑制を計測する計測工程と、
を有することを特徴とする。
2種以上の物質を、2以上の細胞群に対し各々適用する適用工程と、
適用工程後に各々の前記細胞の細胞骨格制御因子の発現量を測定する測定工程と、
測定結果に基づき、細胞骨格制御因子の発現の増大及び/又は発現の減少抑制を計測する計測工程と、
を有することを特徴とする。
前記細胞が、線維芽細胞及び/又は腱細胞であることを特徴とする。
前記細胞は、皮膚支帯(Retinacula cutis)に存在する細胞であることを特徴とする。
ここで、細胞は、線維芽細胞及び/又は腱細胞であることが好ましく、また、皮膚支帯に存在する細胞であることがより好ましい。
例えば、前記細胞骨格制御因子をコードする遺伝子の発現量は、当該遺伝子の配列に特異的に結合する配列を有するDNA断片をプライマーとして用いてPCRを行い、定量的な検出を行う。なお、前記細胞骨格制御因子をコードする遺伝子配列は、公開されているので、当業者は適宜プライマーを設計することが可能である。
細胞に物質を適用する適用工程と、
適用工程後に前記細胞の細胞骨格制御因子の発現量を測定する測定工程と、
前記測定工程の測定結果に基づき、細胞骨格制御因子の発現の増大及び/又は発現の減少抑制を計測する計測工程と、
を有する実施の形態とすることが好ましい。
2種以上の物質を、2以上の細胞群に対し各々適用する適用工程と、
適用工程後に各々の前記細胞の細胞骨格制御因子の発現量を測定する測定工程と、
測定結果に基づき、細胞骨格制御因子の発現の増大及び/又は発現の減少抑制を計測する計測工程と、
を有する実施の形態とすることが好ましい。
また、植物由来の抽出物は、自生若しくは生育された植物、漢方生薬原料等として販売されるものを用いた抽出物、市販されている抽出物等を挙げることができる。
ここで、『皮膚支帯(Retinacula cutis)の本数が減ること』は、皮膚支帯(Retinacula cutis)の構成要素であるCollagen Iが減少することにより、皮膚支帯(Retinacula cutis)が消滅する現象を指す。
ここで、生理老化に基づく肌状態としては、シワの増加、肌のタルミ、ハリの低下、肌の弾力性の低下を好ましく挙げることができる。ここで、肌のタルミとは、皮膚および皮下組織の弾力性の低下によって生ずる肌の変形をさす。
本発明は、細胞骨格制御因子の発現量が少ないほど、皮膚支帯(Retinacula cutis)の本数が少ないと判定することを特徴とする、皮膚支帯(Retinacula cutis)の本数の推定方法にも関する、
また、同一被験者から取得した複数の細胞骨格制御因子の発現量に基づき、相対的に皮膚支帯(Retinacula cutis)の本数を推定する実施の形態としてもよい。
また、被験者から取得した細胞骨格制御因子の発現量に関する情報を、既に用意された指標と照らし合わせることにより、皮膚支帯(Retinacula cutis)の本数を推定する実施の形態としてもよい。
本発明は、細胞骨格制御因子の発現量を指標とする、皮膚における加齢の程度の推定方法にも関する。
ここで、細胞骨格制御因子の発現量が多いほど、皮膚における加齢していないと判定するための方法は特に限定されない。
また、同一被験者から取得した複数の細胞骨格制御因子の発現量に基づき、相対的に、皮膚における加齢の程度を推定する実施の形態としてもよい。
また、被験者から取得した細胞骨格制御因子の発現量を、既に用意された指標と照らし合わせることにより、皮膚における加齢の程度を推定する実施の形態としてもよい。
試験1では、生理老化と、Collagen Iとの関連を調べた。
まず、若齢者(20-30代)及び老齢者(60-90代)のヒト正常非露光部組織を、凍結組織包理剤(OCTコンパウンド)で凍結処理し、組織切片を用意した。
静置後PBSで洗浄し、VECTASTAIN Universal ABC-AP Kit(VECTOR Laboratories 社製)およびAlkaline Phosphatase Substrate KitI <VECTOR Red> (VECTOR Laboratories 社製)を用い、処理した。
以上の工程により封入した組織切片について、Collagen Iの染色度合いの観察を行った。
老齢者(生理老化の影響が大きい)の非露光部の皮膚支帯では若齢者(生理老化の影響が小さい)の非露光部の皮膚支帯に比して、Collagen Iの量少ないことがわかった(図1 参照)。
以上より、加齢による影響(生理老化)によって、Collagen Iが減少することが分かった。
試験2では、生理老化と細胞骨格制御因子と関連を調べた。
ヒト正常皮下組織(若齢 (20-30代)、老齢 (60-80代))を、RNAlater(QIAGEN 社製)を用いて固定処理した。
ここで、遺伝子発現量は、内在性コントロールをβ-actinとし、比較CT法を用いて算出した。
図3に示した通り、加齢によって、アクチン関連タンパク質3B(actin-related protein 3 homolog B、ACTR3B)、リムキナーゼ-1(LIM kinase-1、LIMK1)、及びスーパービリン(surpervillin、SVIL)が減少することがわかった。
すなわち、図2、図3及び観察の結果、アクチン関連タンパク質3B(actin-related protein 3 homolog B、ACTR3B)、リムキナーゼ-1(LIM kinase-1、LIMK1)、及びスーパービリン(surpervillin、SVIL)の減少によって、皮膚支帯(Retinacula cuti)の本数が少なくなることがわかった。
試験3では、Collagen Iと細胞骨格制御因子の関連を調べた。
(1-1)若齢由来の皮膚支帯細胞における、細胞骨格制御因子をノックダウンした際の細胞変化評価
ヒト正常皮下組織から取得した細胞をOG(アウトグロース)法により培養した。培養した細胞から、皮膚支帯(Retinacula cutis)細胞のみをCell Sorter SH800(SONY 社製)を用い、単離した。
調製したSilence Select Pre-designed siRNA(Thermo Fisher Scientific 社製)を、Lipofectammin RNAiMAX Transfection Reagent(Thermo Fisher Scientific 社製)を用い、培養後の皮膚支帯(Retinacula cutis)細胞に導入した。
なお、下記表1はSVILを標的とするsiRNA、下記表2はLIMK1を標的とするsiRNA、下記表3はACTR3Bを標的とするsiRNAの配列である。
また、各表中の配列番号は、19塩基対の配列番号を示す。
0.2%Triton-X/PBSによる処理の後、PBSで洗浄し、Alexa Fluor(登録商標) 568 Phallodin(Thermo Fisher Scientific 社製)を用い、染色した。
結果を図4に示す。
図4に示した通り、アクチン関連タンパク質3B(actin-related protein 3 homolog B、ACTR3B)、リムキナーゼ-1(LIM kinase-1、LIMK1)、及びスーパービリン(surpervillin、SVIL)のノックダウンによって、皮膚支帯(Retinacula cutis)細胞内のアクチンが凝集することがわかった。
ヒト正常皮下組織から取得した細胞をOG(アウトグロース)法により培養した。培養した細胞から、皮膚支帯(Retinacula cutis)細胞のみをCell Sorter SH800(SONY 社製)を用い、単離した。
調製したSilence Select Pre-designed siRNA(Thermo Fisher Scientific 社製)を、Lipofectammin RNAiMAX Transfection Reagent(Thermo Fisher Scientific 社製)を用い、培養後の皮膚支帯(Retinacula cutis)細胞に導入した。
ここで、遺伝子発現量は、内在性コントロールをβ-actinとし、比較CT法を用い、算出した。
結果を図5に示す。
図5に示した通り、アクチン関連タンパク質3B(actin-related protein 3 homolog B、ACTR3B)、リムキナーゼ-1(LIM kinase-1、LIMK1)、及びスーパービリン(surpervillin、SVIL)のノックダウンによって、Collagen Iの遺伝子発現量が減少することがわかった。
試験4では、上記知見を基にした、スクリーニング手法の検討を行った。
(1-1)準備工程
ヒト正常皮下組織から取得した細胞をOG(アウトグロース)法により培養した。培養した細胞から、皮膚支帯(Retinacula cutis)細胞のみをCell Sorter SH800(SONY 社製)を用い、単離した。
別途、ヒト正常皮膚の皮下組織を除去し、処理した皮膚に15mm径の穴あけを行い、ポピドンヨード(povidone iodine)で洗浄後、PBSで洗浄した。
ヒト正常皮膚中心部に配置したセルカルチャーインサート(スタンディングタイプ: サーモフィッシャーサイエンティフィック 社製)を、(1-1)で用意した皮膚支帯(Retinacula cutis)細胞を播種した24穴プレートに設置し、24時間培養した。
24時間培養後、培地を除いた後、PBSで洗浄した。その後、RNeasy Mini Kit(QIAGEN 社製)を用いてRNAを回収し、SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit(Invitrogen 社製)を用いてcDNAを合成した。
配列番号2 オーバーハングsiRNA
配列番号3 オーバーハングsiRNA
配列番号4 オーバーハングsiRNA
配列番号5 オーバーハングsiRNA
配列番号6 オーバーハングsiRNA
Claims (9)
- 細胞骨格制御因子の発現の増大及び/又は発現の減少抑制を指標とし、
前記細胞骨格制御因子が、アクチン関連タンパク質3B(actin-related protein 3 homolog B、ACTR3B)、リムキナーゼ-1(LIM kinase-1、LIMK1)、及びスーパービリン(surpervillin、SVIL)からなる群から選択される1又は2以上である、
Collagen Iの発現の増大及び/又は発現の減少抑制作用を有する抗皮膚老化剤のスクリーニング方法。 - 前記抗皮膚老化剤は、皮膚支帯(Retinacula cutis)の本数が減ることを抑制する作用を有するものであることを特徴とする、請求項1に記載のスクリーニング方法。
- 前記抗皮膚老化剤が、生理老化に基づく肌状態の改善作用を有するものであることを特徴とする、請求項1又は2に記載のスクリーニング方法。
- 前記肌状態が、シワの増加、肌のタルミ、ハリの低下、肌の弾力性の低下からなる群から選択される1又は2以上であることを特徴とする、請求項3に記載のスクリーニング方法。
- 細胞に物質の投与を適用する適用工程と、
適用工程後に前記細胞の前記細胞骨格制御因子の発現量を測定する測定工程と、
前記測定工程の測定結果に基づき、前記細胞骨格制御因子の発現の増大及び/又は発現の減少抑制を計測する計測工程と、
を有し、
前記細胞が、皮膚支帯に存在する細胞であることを特徴とする、請求項1~4の何れか1項に記載のスクリーニング方法。 - 2種以上の物質を、2以上の細胞の群に対し各々適用する適用工程と、
適用工程後に各々の前記細胞の細胞骨格制御因子の発現量を測定する測定工程と、
測定結果に基づき、細胞骨格制御因子の発現の増大及び/又は発現の減少抑制を計測する計測工程と、
を有し、
前記細胞が、皮膚支帯に存在する細胞であることを特徴とする、請求項1~4の何れか1項に記載のスクリーニング方法。 - 細胞骨格制御因子の発現の増大及び/又は発現の減少抑制を指標とし、
前記細胞骨格制御因子が、アクチン関連タンパク質3B(actin-related protein 3 homolog B、ACTR3B)、リムキナーゼ-1(LIM kinase-1、LIMK1)、及びスーパービリン(surpervillin、SVIL)からなる群から選択される1又は2以上である、
生理老化に基づく肌状態の改善作用を有する抗皮膚老化剤のスクリーニング方法。 - 細胞骨格制御因子の発現量が少ないほど、皮膚支帯(Retinacula cutis)の数が少ないと判定することを特徴とし、
前記細胞骨格制御因子が、アクチン関連タンパク質3B(actin-related protein 3 homolog B、ACTR3B)、リムキナーゼ-1(LIM kinase-1、LIMK1)、及びスーパービリン(surpervillin、SVIL)からなる群から選択される1又は2以上である、
皮膚支帯(Retinacula cutis)の本数の推定方法。 - 細胞骨格制御因子の発現量を指標とし、
前記細胞骨格制御因子が、アクチン関連タンパク質3B(actin-related protein 3 homolog B、ACTR3B)、リムキナーゼ-1(LIM kinase-1、LIMK1)、及びスーパービリン(surpervillin、SVIL)からなる群から選択される1又は2以上である、
皮膚における加齢の程度の推定方法。
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US20150238466A1 (en) | 2012-06-28 | 2015-08-27 | Ramot At Tel-Aviv University Ltd. | Lim kinase inhibitors |
JP2017112918A (ja) | 2015-12-24 | 2017-06-29 | ポーラ化成工業株式会社 | 皮下組織構造の改善成分のスクリーニング方法 |
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TSUKAHARA, K. et al.,Relationship Between the Depth of Facial Wrinkles and the Density of the Retinacula Cutis,JAMA DERMATOLOGY,2012年01月,Vol.148/No.1,p.39-46 |
田松裕一,顔のシワ深さと皮膚構造の関係,鹿児島大学歯学部紀要,2017年03月25日,Vol.37,p.9-13 |
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