JP6572198B2 - 皮膚弾性改善剤の評価又は選択方法 - Google Patents
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BRG−1を発現可能な組織又は細胞に、被験物質を適用すること;
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を含む方法を提供する。
BRG−1を発現可能な組織又は細胞に、被験物質を適用すること;
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該測定結果に基づいて、BRG−1の発現もしくは活性、又はBRG−1をコードする遺伝子の発現を増強させる被験物質を、皮膚のシワ又はたるみ予防又は改善剤として評価及び/又は選択すること、
を含む方法を提供する。
BRG−1を発現可能な組織又は細胞に、被験物質を適用すること;
該組織又は細胞における、BRG−1の発現もしくは活性、又はBRG−1をコードする遺伝子の発現を測定すること;
該測定結果に基づいて、BRG−1の発現もしくは活性、又はBRG−1をコードする遺伝子の発現を増強させる被験物質を、皮膚のハリの低下予防又は改善剤として評価及び/又は選択すること、
を含む方法を提供する。
BRG−1を発現可能な組織又は細胞に、被験物質を適用すること;
該組織又は細胞における、BRG−1の発現もしくは活性、又はBRG−1をコードする遺伝子の発現を測定すること;
該測定結果に基づいて、BRG−1の発現もしくは活性、又はBRG−1をコードする遺伝子の発現を変化させる被験物質を、真皮細胞外マトリクス形成制御剤として評価及び/又は選択すること、
を含む方法を提供する。
BRG−1を発現可能な組織又は細胞に、被験物質を適用すること;
該組織又は細胞における、BRG−1の発現もしくは活性、又はBRG−1をコードする遺伝子の発現を測定すること;
該測定結果に基づいて、BRG−1の発現もしくは活性、又はBRG−1をコードする遺伝子の発現を変化させる被験物質を、弾性線維形成制御剤として評価及び/又は選択すること、
を含む方法を提供する。
BRG−1を発現可能な組織又は細胞に、被験物質を適用すること;
該組織又は細胞における、BRG−1の発現もしくは活性、又はBRG−1をコードする遺伝子の発現を測定すること;
該測定結果に基づいて、BRG−1の発現もしくは活性、又はBRG−1をコードする遺伝子の発現を変化させる被験物質を、コラーゲン線維形成制御剤として評価及び/又は選択すること、
を含む方法を提供する。
BRG−1を発現可能な組織又は細胞に、被験物質を適用すること;及び
該組織又は細胞における、BRG−1の発現もしくは活性、又はBRG−1をコードする遺伝子の発現を測定すること、
を含む。
BRG−1を発現可能な組織又は細胞に、被験物質を適用すること;
該組織又は細胞における、BRG−1の発現もしくは活性、又はBRG−1をコードする遺伝子の発現を測定すること;
該測定結果に基づいて、BRG−1の発現もしくは活性、又はBRG−1をコードする遺伝子の発現を増強させる被験物質を、皮膚弾性改善剤として評価及び/又は選択すること、
を含む、方法。
BRG−1を発現可能な組織又は細胞に、被験物質を適用すること;
該組織又は細胞における、BRG−1の発現もしくは活性、又はBRG−1をコードする遺伝子の発現を測定すること;
該測定結果に基づいて、BRG−1の発現もしくは活性、又はBRG−1をコードする遺伝子の発現を増強させる被験物質を、皮膚のシワ又はたるみ予防又は改善剤として評価及び/又は選択すること、
を含む、方法。
BRG−1を発現可能な組織又は細胞に、被験物質を適用すること;
該組織又は細胞における、BRG−1の発現もしくは活性、又はBRG−1をコードする遺伝子の発現を測定すること;
該測定結果に基づいて、BRG−1の発現もしくは活性、又はBRG−1をコードする遺伝子の発現を増強させる被験物質を、皮膚のハリの低下予防又は改善剤として評価及び/又は選択すること、
を含む、方法。
BRG−1を発現可能な組織又は細胞に、被験物質を適用すること;
該組織又は細胞における、BRG−1の発現もしくは活性、又はBRG−1をコードする遺伝子の発現を測定すること;
該測定結果に基づいて、BRG−1の発現もしくは活性、又はBRG−1をコードする遺伝子の発現を変化させる被験物質を、真皮細胞外マトリクス形成制御剤として評価及び/又は選択すること、
を含む、方法。
BRG−1を発現可能な組織又は細胞に、被験物質を適用すること;
該組織又は細胞における、BRG−1の発現もしくは活性、又はBRG−1をコードする遺伝子の発現を測定すること;
該測定結果に基づいて、BRG−1の発現もしくは活性、又はBRG−1をコードする遺伝子の発現を変化させる被験物質を、弾性線維形成制御剤として評価及び/又は選択すること、
を含む、方法。
BRG−1を発現可能な組織又は細胞に、被験物質を適用すること;
該組織又は細胞における、BRG−1の発現もしくは活性、又はBRG−1をコードする遺伝子の発現を測定すること;
該測定結果に基づいて、BRG−1の発現もしくは活性、又はBRG−1をコードする遺伝子の発現を変化させる被験物質を、コラーゲン線維形成制御剤として評価及び/又は選択すること、
を含む、方法。
好ましくは、哺乳動物から採取された皮膚組織、真皮組織、真皮細胞、及びそれらの培養物であり、
より好ましくは、哺乳動物から採取された真皮線維芽細胞又はその培養物である、
〔1〕〜〔13〕のいずれか1項記載の方法。
米国テキサス州ダラス近郊在住の60歳代の健康な女性15名(Caucasian、Asian、Hispanic及びAfrican Americanを含む)を被験者とした。各被験者の上腕内側部及び前腕外側部の皮膚の弾性(Ur/Uf)を、キュートメーター(SEM 575;Courage and Khazaka)を用いて計測した。
24ウェルプレートに、正常ヒト真皮線維芽細胞(クラボウ)を1×105cells/ウェルの細胞密度で播種した。24時間後、Lipofect Amine 2000試薬(Invitrogen)を用いて、定法に従ってControl siRNA(非特異的配列)、又はBRG−1特異的配列siRNA(Invitrogen)を細胞に導入した。24時間後、500μLのDMEM培地(Invitrogen)に交換して細胞を培養し、5日後、培養上清及び細胞を回収した。細胞をCell Lysis Buffer(Cell Signaling Technology)で回収した後、超音波破砕を行い、細胞溶解液を得、BCA Protein Assay Kit(Thermo Fisher Scientific)を用いてタンパク定量を行った。
得られた細胞溶解液については、タンパク定量値を基にタンパク量を揃え、常法に従って抗ヒトBRG−1抗体(Santa Cruz Biotechnology)によるウェスタンブロッティング解析を行い、BRG−1発現を調べた。また、培養上清については、細胞溶解液のタンパク定量値を参照して、細胞に由来するタンパク量が等しくなるように希釈し、常法に従って抗ヒトCollagen I抗体(Santa Cruz Biotechnology)、抗ヒトMMP−1抗体(AbD Serotec)、抗ヒトTIMP−1抗体(Gene−Tex Inc.)、及び抗ヒトMFAP−4抗体(AdipoGen International)によるウェスタンブロッティング解析を行い、Collagen I、MMP−1(Matrix metalloproteinase−1;Collagen分解酵素)、TIMP−1(Tissue Inhibitor of Metalloproteinase−1;生体内におけるMMPインヒビター)、及びMFAP−4(microfibrillar−associated protein 4;エラスチン形成の必須因子)の発現を調べた。
24ウェルプレートの各ウェルにカバーガラスを設置し、その上に1×105cells/ウェルの細胞密度で線維芽細胞を播種した。24時間後、実施例2と同様の手順でControl siRNA、又はBRG−1特異的配列siRNAを細胞に導入した。24時間後に、500μLの10%FBS添加DMEM/F12培地(Sigma−Aldrich)に交換し、細胞を培養した。7日後、細胞を氷冷メタノールで固定化した後、BRG−1と弾性線維の免疫染色を下記手順で行った。
・BRG−1
ウサギ抗ヒトBRG−1抗体(Santa Cruz Biotechnology)とAlexa Fluo 488標識抗ウサギIgG抗体(Invitrogen)を用いて細胞の免疫染色を行った。カバーガラスに接着した細胞をProLong Gold antifade reagent with DAPI(Invitrogen)を用いてスライドガラス上にマウントし、蛍光顕微鏡を用いてBRG−1発現(励起波長:488nm、観察波長:525nm)及び核(励起波長:350nm、観察波長:470nm)を観察した。
・弾性線維
マウス抗ヒトFibrillin−1抗体(Millipore)及びウサギ抗Elastin抗体(Elastin Product Company)と、Alexa Fluo 546標識抗マウスIgG抗体(Invitrogen)及びAlexa Fluo 488標識抗ウサギIgG抗体(Invitrogen)を用いて細胞の免疫染色を行った。カバーガラスに接着した細胞をProLong Gold antifade reagent with DAPI(Invitrogen)を用いてスライドガラス上にマウントし、蛍光顕微鏡を用いて弾性線維の構成分子であるフィブリリン−1(励起波長:546nm、観察波長:573nm)、エラスチン(励起波長:488nm、観察波長:525nm)及び核(励起波長:350nm、観察波長:470nm)を観察した。
Claims (3)
- 光老化による皮膚弾性低下の改善剤の評価及び/又は選択方法であって:
BRG−1を発現可能な組織又は細胞に、被験物質を適用すること;
該組織又は細胞における、BRG−1の発現もしくは活性、又はBRG−1をコードする遺伝子の発現を測定すること;
該測定結果に基づいて、BRG−1の発現もしくは活性、又はBRG−1をコードする遺伝子の発現を増強させる被験物質を、光老化による皮膚弾性低下の改善剤として評価及び/又は選択すること、
を含む、方法。 - 光老化による皮膚のシワ又はたるみの予防又は改善剤の評価及び/又は選択方法であって:
BRG−1を発現可能な組織又は細胞に、被験物質を適用すること;
該組織又は細胞における、BRG−1の発現もしくは活性、又はBRG−1をコードする遺伝子の発現を測定すること;
該測定結果に基づいて、BRG−1の発現もしくは活性、又はBRG−1をコードする遺伝子の発現を増強させる被験物質を、光老化による皮膚のシワ又はたるみの予防又は改善剤として評価及び/又は選択すること、
を含む、方法。 - 光老化による皮膚のハリの低下の予防又は改善剤の評価及び/又は選択方法であって:
BRG−1を発現可能な組織又は細胞に、被験物質を適用すること;
該組織又は細胞における、BRG−1の発現もしくは活性、又はBRG−1をコードする遺伝子の発現を測定すること;
該測定結果に基づいて、BRG−1の発現もしくは活性、又はBRG−1をコードする遺伝子の発現を増強させる被験物質を、光老化による皮膚のハリの低下の予防又は改善剤として評価及び/又は選択すること、
を含む、方法。
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