JP6736364B2 - シミ改善成分のスクリーニング方法 - Google Patents
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Description
シミ部位における真皮の組織学的所見では、その周辺部では真皮マトリックスの崩壊、血管、炎症細胞の増加が観察されている。また、メラニンを多く含んだマクロファージと考えられる遊走性を失った細胞も認められている。このことから、真皮に落ちたメラニンはマクロファージによって貪食され、その場に留まってしまうことで消えにくいシミになっていると考えられている(非特許文献2)。
真皮に存在するメラニンを除去する方法としては、レーザー、液体窒素などの美容外科的を用いる方法が主流である。これらの方法では施術に痛みが伴うこと、さらに費用もかかるため心理的にも経済的にも負担が大きい。また、レーザー等でシミを一時的に取り除くことができても、再発する場合も少なくない。
以上の知見に基づき、本発明を完成させるに至った。
第2には、シミ改善成分のスクリーニング方法において用いることのできる指標の決定方法を提供する。
第3には、培養線維芽細胞にメラノソームを添加する工程を含み、第2発明で決定した指標を用いたシミ改善成分のスクリーニング方法を提供する。
第4には、特定のメラニン産生関連遺伝子及び/又はタンパク質を指標とするシミ改善成分のスクリーニング方法を提供する。
第5には、培養線維芽細胞にメラノソームを添加し、
(1)メラノソームを取り込ませた培養線維芽細胞の培養上清を培養皮膚細胞に添加する又は、
(2)メラノソームを取り込ませた培養線維芽細胞と線維芽細胞以外の培養皮膚細胞を共培養し、
特定のメラニン産生関連遺伝子及び/又はタンパク質を指標とするシミ改善成分のスクリーニング方法を提供する。
第6には、培養線維芽細胞にメラノソームを添加し、
(1)メラノソームを取り込ませた培養線維芽細胞の培養上清を培養メラノサイトに添加する又は、
(2)メラノソームを取り込ませた培養線維芽細胞と培養メラノサイトを共培養し、
培養メラノサイトにおけるメラニン産生量を指標とするシミ改善成分のスクリーニング方法を提供する。
第7には、培養線維芽細胞にメラノソームを取り込ませたときに発現量が上昇する遺伝子及び/又はタンパク質の内メラニン産生への関与が既知である遺伝子及び/又はタンパク質を皮膚細胞に添加し、前記遺伝子及び/又はタンパク質の受容体もしくは前記遺伝子及び/又はタンパク質によって誘導される既知のメラニン関連因子の発現を指標とするシミ改善成分のスクリーニング方法を提供する。
以下、スクリーニング方法の説明において、使用する細胞に関し、単に「線維芽細胞」等と記載する場合があるが、特に言及をしない限り、培養した細胞を指している。
本発明に用いる培養線維芽細胞は、理化学研究所のCELL BANKやJCRB細胞バンクなど等で購入することができる。例えば、正常ヒト皮膚由来線維芽細胞を使用することができ、培養に用いる培地も各社がそれぞれ細胞種に対して推奨している培地を使用して差し支えない。試験に用いるこれらの細胞は、細胞活動が正常に行えるという点で、継代数が1〜8までが好ましいが、それ以降のものでも増殖性などが著しく低下せず、細胞形態が異常でなければ使用できる。
本発明に用いる皮膚細胞は、ヒト皮膚線維芽細胞以外の皮膚細胞であって、ヒト皮膚線維芽細胞周辺に存在する細胞であれば限定されず、正常皮膚由来のケラチノサイト、メラノサイト、血管内皮細胞を用いることが好ましいが、HaCaTのような株化細胞や、メラノーマのようなガン化細胞を用いても問題ない。これらの細胞はクラボウ、サーモフィッシャーサイエンティフィック、ロンザ等で購入することができる。培養に用いる培地も各社がそれぞれの細胞種に対して推奨している培地を使用して差し支えない。その他継代数に関しては、1〜3までが好ましいが、それ以降のものでも増殖性などが著しく低下せず、細胞形態が異常でなければ使用できる。
本願の目的を達成することができれば、使用する皮膚細胞は1種でも良いし、複数種使用しても問題ない。
例えば、第5の発明において、皮膚細胞を使用する場合には、血管内皮細胞や、ケラチノサイトそれぞれ独立して使用しても良いし、ケラチノサイトとメラノサイトが共存する3次元皮膚モデルを使用することもできる。
又、第6の発明において、メラノサイトを使用する場合には、メラノサイトを単独で使用しても良いし、メラノサイトとケラチノサイトが共存する三次元皮膚モデルを使用することもできる。
三次元皮膚モデルとしては、例えば、MEL−300−A(MatTek社製クラボウ)の皮膚モデルカップ等が使用できる。
メラノソームは、培養線維芽細胞が貪食することができれば特に限定されないが、本発明ではメラニンも含む概念で用いる。
メラノソームとしては、特に限定されないが、ヒト、マウスなどのメラノサイトもしくはメラノーマより抽出、精製したもの等が使用できる。
培養線維芽細胞にメラノソームを取り込ませるには、培地にメラノソームを添加するだけで良い。メラノソームを適量添加すると、培養線維芽細胞は容易にメラノソームの取り込みを行う。
培養線維芽細胞がメラノソームを取り込んだか否かの確認は、任意の方法で行うことができるが、例えば、フォンタナマッソン染色によりメラニンを染色する方法を用いて確認することができる。また、染色しなくとも、十分な量のメラノソームが添加されている場合、明視野での顕微鏡観察でも細胞内にメラノソームが取り込まれている様子が確認できる。細胞の状態、添加するメラノソームの量にもよるが、線維芽細胞への取り込みが顕微鏡ではっきり確認できるのは、メラノソーム添加後概ね1日程度である。
もっとも、発明者らは、培養線維芽細胞にメラノソームを添加後、遅くとも1時間後には取り込みがされていることをタイムラプス動画撮影にて確認しているので、上記確認作業を行わなくても、メラノソームを添加すれば、線維芽細胞はメラノソームを取り込んでいると判断しても差し支えない。
本願のスクリーニング方法において、線維芽細胞にメラノソームを取り込ませる場合には、用いた培養線維芽細胞の一部がメラノソームを取り込んでいれば良く、すべての線維芽細胞がメラノソームを取り込んでいる必要はない。
被験物質は特に限定されないが、植物乾燥物より抽出したエキスや、市場にある製品化されたエキス等を用いることができる。エキスの抽出の方法は、特に限定されない。又、被験物質は植物エキスに限らず、真皮線維芽細胞に添加出来るものであれば特に限定はなく、動物由来エキス、菌類の培養物、又はこれらの酵素等処理物、化合物又はその誘導体等であっても被験物質として用いることが出来、液状の他、粉末状、ジェル状等であっても差し支えない。また、そのままでは培地に溶解しない場合は、界面活性剤等の可溶化剤を適宜使用することにより溶解させることで被験物質として用いることができる。
添加濃度については、被験物質添加から24時間後に明らかに細胞が死滅していなければ、どの濃度でも問題ない。なお、被験物質に、抽出溶媒として1,3−ブチレングリコールやエタノールが含まれている場合は、抽出溶媒のみを同濃度になるように細胞に添加したサンプルも用意し、その影響を考慮することが好ましい。
遺伝子発現量は、回収した培養細胞からTotal RNAを抽出し、このTotal RNA中に含まれる標的遺伝子のmRNA発現量を測定することによって定量することができる。
シミ改善効果を有する成分を選別する際に用いる指標は、培養線維芽細胞にメラノソームを添加し、培養線維芽細胞がメラノソームを取り込むことで、遺伝子発現量及び/又はタンパク質発現量が変化しているものを指標にすることができる。更に詳しくは、培養線維芽細胞がメラノソームを取り込むことで、遺伝子発現量が増加しているもの、好ましくは2倍以上、更に好ましくは4倍以上増加している遺伝子を選択することが好ましく、中でも、メラノサイトにおけるメラニン産生促進効果が既知である遺伝子及び/又はそれに対応するタンパク質を指標とすることが好ましい。
シミ改善成分の選別をするには、指標とする遺伝子及び/又はタンパク質の発現量を抑える成分や、指標とする遺伝子及び/又はタンパク質の作用を減じる成分を選択すれば良い。効果成分の選別は、希望する効果の程度に応じて各発現量の抑制の程度を調整すればよい。このとき、メラノソームを添加していない培養線維芽細胞の遺伝子及び/又はタンパク質発現も考慮して、メラノソームを添加していない細胞遺伝子及び/又はタンパク質の発現に変動を与えないものを選択するのがさらに好ましい 。
<メラノソームの調製>
ヒト由来メラノーマ細胞HM3KOを5%のCO2下、37℃のインキュベーター内で、5%FBSを含むD−MEM培地(Invitrogen社製Gibco)を用いて培養した。
100%コンフルエント近くになり、メラニン産生が進んだ細胞を、トリプシンを用いて7.0×106cells/ tubeになるようにエッペンドルフチューブに回収、遠心(1000g、4℃、3分)によって細胞ペレットを作成した。その後ペレットをPBS(−)にて洗浄した。
これを10分ごとに攪拌しながら、20分室温にて静置した。この分散溶液を遠心分離(1000g、4℃、3分)、不要物を沈殿させ、メラノソームを含む上清を回収した。
回収した上清を再度、遠心分離し(1000g、4℃、3分)、上清を回収した。
この上清を遠心分離し(20000g、4℃、3分)、得られた沈殿をメラノソームリッチ画分とした。上清を吸引除去し、メラノソームのペレットをPBSにて2度洗浄した。(20000g、4℃、3分)これにPBSを添加し、50回以上ピペッティングすることによってメラノソームを分散させた。このメラノソーム懸濁液をメラノソームとした。
ヒト由来正常真皮線維芽細胞を、1.25×104cell/mLになるように10%FBSを含むD−MEM培地(Invitrogen社製Gibco)に懸濁し、12ウェル細胞培養プレートに播種した。5%のCO2下、37℃のインキュベーター内で培養した。
培養後、メラノソームを添加した線維芽細胞及びメラノソームを添加していない線維芽細胞(コントロール)から、RNeasy Mini Kit (QIAGEN)を用いて、Total RNAを抽出した。このTotal RNAに対してPrime Script RT RCR Kit (TaKaRa) を用いて逆転写を行い、cDNAを合成した。得られたcDNAにおけるmRNAの発現を次世代シーケンサー(Ion ProtonTMシステム Thermofisher Scientific)にて網羅的に解析した。得られたデータは、EdgeRを用いて解析を行い、メラノソーム添加後の遺伝子発現のリード数が50以上かつFDR値が0.05以上かつコントロールに対して、メラノソーム添加時の遺伝子発現量の変化が2倍以上の遺伝子を抽出した(表1)。その結果、120個の遺伝子が選択され、その中にはメラノサイトのチロシナーゼ活性をあげることでメラニン産生を増加させることが報告されているCCL−2、血管内皮細胞に作用し、メラニン産生促進因子として有名なET−1の遺伝子発現量を増加させることが知られているIL−8等が含まれていた。
一方、線維芽細胞において産生されることが知られており、かつメラニン産生への関与も既知であるKITLGの遺伝子発現量には、殆ど変化はなかった。このことは、線維芽細胞がメラノソームを取り込んだ場合、すべてのメラニン産生関連因子の遺伝子発現を増加させるのではなく、特定の因子にのみ影響を与えていることを示している。
次にこれらの遺伝子発現変化が、タンパク質発現にまで影響しているかを確認した。以下、代表してIL−8および量について述べる。
[0032][0033]と同様の実験を行い(ただし、ELISAでのバックグラウンド低減のため培地中の血清は抜いた状態で培養した)、メラノソーム添加から96時間培養した。なお、遺伝子発現を解析した際には培地に50μLのメラノソームを添加したもののみの変動を確認したが、今回の実験ではそれに加えて25μL、12.5μLのメラノソームを添加したサンプルも作成した。メラノソームの添加から96時間後に、培養上清に存在するIL−8およびCCL−2をELISAにて測定した。なお、IL−8の測定には、RayBiotech社のHuman IL-8 ELISA、CCL−2の測定にはRayBio Human MCP-1 ELISA kitを使用した。
<線維芽細胞の培養>
ヒト由来正常真皮線維芽細胞を、2×104cell/mLになるように10%FBSを含むD−MEM培地(Invitrogen社製Gibco)に懸濁し、6ウェル細胞培養プレートに2mLずつ播種した。5%のCO2下、37℃のインキュベーター内で培養した。
24時間後、培地を除去し、Epi−100LLMM(MatTek社製 クラボウ)培地3mLを加えた。さらに24時間培養し、その後培地にメラノソームを100μL添加した。なお、用いたメラノソームを5倍希釈した溶液100μLのAbs405nmは0.123であった。このとき、メラノソームを添加していない線維芽細胞をコントロールとした。
ケラチノサイトおよびメラノサイトを含む3次元皮膚モデルであるMEL−300−A(MatTek社製クラボウ)の皮膚モデルカップを0.9mLのEpi−100−LLMM培地を加えた6ウェル細胞培養プレートに置き、1時間プレインキュベートした。
プレインキュベート後、5mLのEpi−100−LLMM培地とステンレスワッシャーが入った6ウェル細胞培養プレートを準備し、そこに皮膚モデルカップを移した。37℃、5%CO2条件下で48時間培養した。
共培養は37℃、5%CO2条件下で行い2〜3日ごとに培地交換しながら3週間行った。また、線維芽細胞は単層で培養しているため長期間正常な機能を持ったまま維持することが難しいと考えられたため、1週間ごと播種し、メラノソーム添加を繰り返した。
共培養終了後、皮膚モデルカップをPBS(−)で洗浄した。
皮膚モデルカップから細胞を剥離し、1.5mLチューブに移した。そこに2N NaOHを400μL加え、細胞を破砕した。破砕後、溶液が均一になるように10分加熱し、10秒ボルテックスした。さらに200μLのNaOHを加え、10分加熱することで均一な溶液を得た。冷却後、96ウェルプレートにそれぞれのサンプルを300μL移した。プレートリーダーにて405nm,655nmの吸光度を測定した。
皮膚モデルカップに含まれていたメラニン量はAbs405nm−655nmで計算することで算出した。
ヒト由来正常真皮線維芽細胞を、1.25×104cell/mLになるように10%FBSを含むD−MEM培地(Invitrogen社製Gibco)に懸濁し、6ウェル細胞培養プレートに2mLずつ播種した。その後、37℃、5%CO2条件下で48時間培養した。培養後、新しい培地に交換し、メラノソームを100μL添加した。なお、用いたメラノソームを5倍希釈した溶液100μLのAbs405nmは0.094であった。
ヒト由来メラノーマ(HM3KO)をCell Culture Insert(6ウェル用、0.4μm、Falcon)に6×104cell/mLになるように10%FBS入りD−MEM培地(Invitrogen社製Gibco)に懸濁し、1mL播種した。その後、37℃、5%CO2条件下で24時間培養した。
24時間経過後、線維芽細胞を培養している6ウェル細胞培養プレートにインサートとしてCell Culture Insertを移した。この時、ウェルに含まれている培地は4mLになるように調製し、被験物質を添加することで共培養を開始した。37℃、5%CO2条件下で72時間培養した。
72時間培養後、培地を捨て、インサートをPBS(−)で洗浄した。400μLの2N NaOHを添加し、細胞を剥離させた。この溶液を1.5mLチューブに回収し、15分間煮沸した。細胞が完全に溶解したことを確認し、96ウェルプレートに350μLずつ移し、プレートリーダーにて405nmの吸光度を測定した。
Claims (7)
- シミ改善成分のスクリーニング方法であって、
培養線維芽細胞にメラノソームを添加する工程を含み、
被験物質を評価する際に、次の(1)及び/又は(2)を用いる方法。
(1)前記工程を経た培養線維芽細胞
(2)前記工程を経た培養線維芽細胞の培養上清と培養線維芽細胞以外の皮膚細胞 - シミ改善成分のスクリーニング方法のために使用する指標であって、
(1) メラノソームを培養線維芽細胞に添加する工程
(2) 前記培養線維芽細胞がメラノソームを取り込むことに起因して、当該細胞中の遺伝子発現量が増加する遺伝子及び/又は、それに対応するタンパク質を選択する工程
(3) (2)の工程で選択されたものの内、メラニン産生への関与が既知である遺伝子及び/又はタンパク質を選択する工程
を含んでなる指標の決定方法。 - 請求項2記載の方法で選択された遺伝子及び/又はタンパク質を指標とする請求項1記載の方法。
- シミ改善成分のスクリーニング方法であって、
(1) 培養線維芽細胞にメラノソームを添加する工程、
(2) 被験物質を添加する工程、
(3) IL−8、CCL−2、CXCL−1から選択される1種以上の遺伝子及び/又はIL−8、CCL−2、CXCL−1から選択されるタンパク質の1種以上を指標として、発現抑制効果のある被験物質を選定する工程
を含んでなる請求項1又は3記載の方法。 - シミ改善成分のスクリーニング方法であって、
(1) 培養線維芽細胞にメラノソームを添加する工程、
(2) メラノソームを取り込ませた培養線維芽細胞の培養上清を培養皮膚細胞に添加する工程
又は
メラノソームを取り込ませた培養線維芽細胞と線維芽細胞以外の培養皮膚細胞を共培養する工程、
(3) 被験物質を添加する工程、
(4) 前記培養上清の添加又は前記共培養に起因して、前記培養皮膚細胞中の遺伝子発現量及び/又はタンパク質の発現量が上昇しているものの内、既知のメラニン産生関連遺伝子及び/又はタンパク質を指標として被験物質を評価し、発現抑制効果のある物質を選定する工程
を含んでなる方法。 - シミ改善成分のスクリーニング方法であって、
(1)培養線維芽細胞にメラノソームを添加する工程、
(2)メラノソームを取り込ませた培養線維芽細胞の培養上清を培養メラノサイトに添加する工程
又は
メラノソームを取り込ませた培養線維芽細胞と培養メラノサイトを共培養する工程
(3)被験物質を添加する工程、
(4)培養メラノサイトにおけるメラニン産生量を指標に、被験物質を評価し、メラニン産生抑制効果のある物質を選定する工程
を含んでなる方法。 - シミ改善成分のスクリーニング方法であって、
(1)培養線維芽細胞にメラノソームを取り込ませたときに発現量が上昇する遺伝子及び/又はタンパク質の内メラニン産生への関与が既知である遺伝子及び/又はタンパク質を培養皮膚細胞に添加する工程、
(2)被験物質を添加する工程、
(3)前記遺伝子及び/又はタンパク質の受容体もしくは前記遺伝子及び/又はタンパク質によって誘導される既知のメラニン関連因子の発現を指標として被験物質を評価し、発現抑制効果のある成分を選定する工程を含んでなる方法。
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