ES2269178T3 - Dipeptidil peptidasas. - Google Patents

Abstract

Un péptido formado por: (a) una secuencia como la mostrada en el ID. de SEC. Núm.: 1; o (b) las secuencias aminoacídicas: His736GlyTrpSerTyr- GlyGlyTyrLeu; Leu816AspGluAsnValHisPheAlaHis; Glu847ArgHis- SerIleArg y Phe255ValLeuGlnGluGluPhe; y que es capaz de hidrolizar un enlace peptídico en posición C-terminal res- pecto de la prolina en cualquiera de los siguientes com- puestos: H-Ala-Pro-pNA; H-Gly-Pro-pNA; y H-Arg-Pro-pNA; o (c) una secuencia que posee una identidad de por lo menos el 60 % con la secuencia mostrada en el ID. de SEC. Núm.: 1 y que es capaz de hidrolizar un enlace peptídico en posición C-terminal respecto de la prolina en cualquiera de los siguientes compuestos: H-Ala-Pro-pNA; H-Gly-Pro-pNA; y H-Arg-Pro-pNA.

Description

Dipeptidil peptidasas.

Campo de la invención

La invención se refiere a una dipeptidil peptidasa, a una molécula de ácido nucleico que la codifica y a diversas aplicaciones de la peptidasa.

Antecedentes de la invención

La familia de genes del tipo dipeptidil peptidasa IV es una familia de moléculas con estructura y función proteica relacionadas [1-3]. La familia génica incluye las siguientes moléculas: DPPIV (CD26), una proteína del tipo dipeptidil aminopeptidasa (DPP6) y la proteína activadora de fibroblastos (FAP) [1, 2, 4, 5]. Otro posible miembro es DPPIV-\beta [6].

Las moléculas de la familia de genes del tipo dipeptidil peptidasa IV son serinproteasas, son miembros de la familia de peptidasas S9b y, junto a la propil endopeptidasa (S9a) y la acilaminoacil peptidasa (S9c), se incluyen en la familia de las prolil oligopeptidasas [5, 7].

DPPIV y FAP tienen ambas actividad postprolina dipeptidil aminopeptidasa similar. No obstante, contrariamente a DPPIV, FAP tiene, además, actividad gelatinasa [8, 9].

Los sustratos de DPPIV incluyen quimiocinas, como RANTES, eotaxina, quimiocina derivada de los macrófagos y factor 1 derivado de células del estroma; factores de crecimiento, como glucagón y los péptidos de tipo glucagón 1 y 2; neuropéptidos, incluyendo el neuropéptido Y y la sustancia P; y péptidos vasoactivos [10-12].

DPPIV y FAP tienen, además, actividad no catalítica; DPPIV se une a la adenosín desaminasa y FAP se une a las integrinas \alpha_{3}\beta_{1} y \alpha_{5}\beta_{1} [13-14].

En vista de las actividades anteriores, los miembros de la familia de tipo DDPIV parecen jugar un papel en el procesamiento intestinal y renal de péptidos que contienen prolina, en la adhesión celular, en el metabolismo peptídico (incluyendo el metabolismo de las citocinas, neuropéptidos, factores de crecimiento y quimiocinas) y en procesos inmunológicos, especialmente la estimulación de células T [3, 11, 12].

Consecuentemente, los miembros de la familia de tipo DDPIV parecen estar involucrados en la patología de las enfermedades, incluyendo, por ejemplo, el crecimiento y la biología tumorales, la diabetes tipo II, la cirrosis, la autoinmunidad, el rechazo de injertos y la infección por VIH [3, 15-18].

Se ha demostrado que los inhibidores de DDPIV suprimen la artritis y que prolongan la supervivencia del alotransplante cardiaco en modelos animales in vivo [19,20]. Algunos inhibidores de DDPIV han sido descritos como inhibidores de la infección por HIV [21]. Se anticipa que los inhibidores de DDPIV serían útiles en otras aplicaciones terapéuticas, incluyendo la diarrea tratable, déficit de hormona del crecimiento, niveles bajos de glucosa en la diabetes mellitus no insulinodependiente y otros trastornos, que incluyen intolerancia a la glucosa, potenciación de la regeneración de mucosa y como inmunosupresores [3, 21-24].

Existe una necesidad de identificar miembros de la familia de genes de tipo DDPIV, ya que esto permitirá la identificación de un inhibidor(es) con especificidad para un miembro(s), en particular, de la familia, que pueden administrarse con el propósito de tratar la enfermedad. Alternativamente, el miembro identificado puede por sí mismo ser útil para tratar la enfermedad.

El núm. de acceso AA417787 de la base de datos EMBL proporciona un clon de cDNA de Homo sapiens IMAGEN:746184 5' similar a la dipeptidil peptidasa IV TR:G577284.

El núm. de acceso AA278625 de la base de datos EMBL proporciona un clon de cDNA de Homo sapiens IMAGEN:703652 5' similar a la dipeptidil peptidasa IV SW:DPP4_Rat P14740.

El núm. de acceso AA496257 de la base de datos EMBL proporciona un clon de cDNA de Homo sapiens IMAGEN:814187 3' similar a la proteína SW:DPP6_human P42658 de tipo dipeptidil peptidasa IV.

La presente invención busca referirse a la necesidad identificada anteriormente y, en un primer aspecto, proporciona un péptido acorde con la Reivindicación 1.

Este péptido tiene especificidad de sustrato para los compuestos siguientes: H-Ala-Pro-pNA, H-Gly-Pro-pNA y H-Arg-Pro-pNA. Por ello, es una prolil oligopeptidasa y una dipeptidil peptidasa, porque es capaz de hidrolizar el enlace peptídico en posición C-terminal respecto de la prolina en cada uno de estos compuestos.

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El péptido es homólogo a la DPPIV humana y, de forma importante, se observa identidad entre las secuencias de DPPIV y el ID. de SEC. Núm.: 1, en la región en la que DPPIV contiene la tríada de residuos catalíticos y los dos residuos de glutamato del dominio \beta-propeller, esencial para la actividad enzimática de DPPIV. La observación de homología de secuencia de aminoácidos significa que el péptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en el ID. de SEC. Núm.: 1 es un miembro de la familia de genes de tipo DDPIV. De acuerdo con esto, el péptido fue nombrado DPPIVL1 de forma provisional y ahora se llama y describe aquí como DPP8.

Las siguientes secuencias de la secuencia aminoacídica del DPPIV humano son importantes para la actividad catalítica de DPPIV. (i) Tyr^{627}GlyTrpSerTyrGlyGlyTyrVal; (ii) Ala^{707}AspAspAsnValHisPhe; (iii) Glu^{738}AspHisGlyIleAlaGln y (iv) Tyr^{201}ValTyrGluGluGluVal [25-28]. Como se describe aquí, el alineamiento de las siguientes secuencias de DPP8: His^{736}GlyTrpSerTyrGlyGlyTyrLeu; Leu^{816}AspGluAsnValHisPheAla; Glu^{847}ArgHisSerIleArg y Phe^{255}ValLeu
GlnGluGluPhe con las secuencias (i) a (iv) anteriores, respectivamente, sugiere que estas secuencias de DPP8 parecen conferir la actividad catalítica de DPP8. Así, en un segundo aspecto, la invención proporciona un péptido que incluye las siguientes secuencias aminoacídicas: His^{736}GlyTrpSerTyrGlyGlyTyrLeu; Leu^{816}AspGluAsnValHisPheAlaHis; Glu^{847}ArgHisSerIleArg y Phe^{255}ValLeuGlnGluGluPhe; que tienen la especificidad de sustrato de la secuencia mostrada en el Núm. de ID de SEC: 1.

También descrito aquí, utilizando el alineamiento múltiple de secuencias, se observa que DPP8 tiene una similitud aminoacídica de 55% y una identidad aminoacídica de 32% con una proteína de C. Elegans. Además, como se muestra aquí, una molécula de ácido nucleico que codifica DPP8, es capaz de hibridar específicamente con secuencias de DPP8 derivadas de especies no humanas. Conjuntamente, estos datos sugieren que DPP8 se expresa en especies diferentes a la humana. Así, en un tercer aspecto, la invención proporciona un péptido, que tiene al menos un 60% de identidad aminoacídica con la secuencia aminoacídica mostrada en Núm. de ID de SEC:1 y que tiene la especificidad de sustrato de la secuencia mostrada en el ID. de SEC. Núm.: 1. De forma preferente, la identidad aminoacídica es del 75%. De forma más preferente, la identidad aminoacídica es del 95%. La identidad aminoacídica se calcula utilizando el programa informático GAP [GCG Versión 8, Grupo de Genética Computerizada, Madison, WI, EE. UU.], como se describe además aquí. De forma típica, el DPP8 no humano comprende las secuencias siguientes: His^{736}GlyTrpSerTyrGly-GlyTyrLeu; Leu^{816}AspGluAsnValHisPheAlaHis; Glu^{847}ArgHisSerIleArg y Phe^{255}ValLeuGlnGluGluPhe.

En vista de la homología entre las secuencias aminoacídicas de DPPIV y DPP8, se espera que estas secuencias tengan estructura terciaria similar. Esto significa, que la estructura terciaria de DPP8 parece incluir el dominio \beta-propeller de siete aspas y el dominio \alpha/\beta hidrolasa de DPPIV. Estas estructuras en DPP8 parecen ser conferidas por las regiones que comprenden el \beta-propeller, de Gly^{180} a Asp^{606}, \alpha/\beta hidrolasa, de Ser^{607} a Ile^{882} y entre alrededor de 70 y 100 residuos en la región Arg^{39} a Gln^{179}. Como se sabe que el dominio \beta-propeller regula la proteolisis mediada por la tríada catalítica en el dominio \alpha/\beta hidrolasa de propil oligopeptidasas, [29], se espera que puedan producirse formas truncadas de DPP8 , que tengan la especificidad de sustrato de la secuencia mostrada en Núm. de ID de SEC:1, que comprende las regiones mencionadas arriba (His^{736}Gly-TrpSerTyrGlyGlyTyrLeu;Leu^{816}AspGluAsnValHisPheAla His; Glu^{847}-ArgHisSerIleArg y Phe^{255}ValLeuGlnGluGluPhe), que confieren la especificidad catalítica de DPP8. Son ejemplos de formas truncadas de DPP8, que pueden prepararse, aquellos en los que la región que confiere el dominio \beta-propeller y el dominio \alpha/\beta hidrolasa, se someten conjuntamente a un proceso de corte y empalme. Otros ejemplos de formas truncadas incluyen a aquellos que son codificados por variantes de corte y empalme del mRNA de DPP8. Así, no obstante, como se describe aquí, la caracterización bioquímica de DPP8 no contiene la secuencia consenso para la N-glicosilación. En este aspecto, DPP8 se distingue de otros miembros de la familia de genes de tipo DDPIV, que contienen entre 6 y 9 secuencias consenso para la N-glicosilación. Así, en una realización, un residuo de asparagina en el péptido del primer aspecto de la invención, no está unido a una molécula de carbohidrato.

El análisis de la expresión de DPP8 descrito aquí, muestra que es probable que DPP8 se exprese como una proteína citoplasmática. La expresión de DPP9 se distingue, por ello, de otros miembros de la familia de genes de tipo DPPIV, que se expresan en la membrana citoplasmática o, en otras palabras, la membrana de superficie celular. Así, en otra realización, el péptido del primer aspecto de la invención no se expresa en la membrana de superficie celular de una célula.

Se reconoce que DPP8 puede estar fusionado o, en otras palabras, unido a otra secuencia aminoacídica más, para formar una proteína de fusión, que tiene la especificidad de sustrato de la secuencia mostrada en el ID de SEC. Núm.: 1. Aquí se describe un ejemplo de una proteína de fusión que contiene la secuencia mostrada en el ID de SEC. Núm.: 1 que está unida a otra secuencia aminoacídica: una secuencia "identificadora" que consiste en una secuencia aminoacídica que codifica el epítopo V5 y un identificador de His (His tag). Un ejemplo de otra secuencia aminoacídica, que puede estar unida a DPP8 es un dominio glutatión S transferasa (GST) [30]. Otro ejemplo de otra secuencia aminoacídica, es una porción de CD8\alpha [8]. Así, en un aspecto, la invención proporciona una proteína de fusión, que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en ID de SEC Núm.:1, unida a otra secuencia aminoacídica, teniendo la proteína de fusión la especificidad de sustrato de la secuencia mostrada en el ID. de SEC. Núm.: 1.

También se reconoce, que el péptido del primer aspecto de la invención puede estar incluido en un polipéptido, de manera que el polipéptido tiene la especificidad de sustrato de DPP8. El polipéptido puede ser útil, por ejemplo, para alterar la susceptibilidad de DPP8 a proteasas, cuando se use en aplicaciones in vivo. Un ejemplo de un polipéptido que puede ser útil en este aspecto, sería la albúmina. Así, en otra realización, el péptido del primer aspecto se incluye en un polipéptido que tiene la especificidad de sustrato de DPP8.

Como se describe arriba, es necesaria la separación y caracterización de DPP8 para identificar inhibidores de la actividad catalítica de DPP8, lo que puede ser útil para el tratamiento de enfermedades. Un método para identificar inhibidores de la actividad catalítica de DPP8, descrito aquí, ha identificado, que varios inhibidores de DPPIV y serinproteasas, péptidos de zinc y miméticos, Ala-Pro-Gly y Lys-Pro inhiben la actividad catalítica de DPP8, pero no los inhibidores de metaloproteinasas, aspartilproteinasas o cisteinilproteinasas. Por consiguiente, en un quinto aspecto, la invención proporciona un método para identificar una molécula capaz de inhibir la escisión de un sustrato mediante DPP8, siendo un método que comprende los siguientes pasos:

(a) poner en contacto el DPP8 con la molécula;

(b) poner en contacto el DPP8 del paso (a) con un sustrato capaz de ser escindido por DPP8, en condiciones suficientes para la escisión del sustrato por DP88; y

(c) detectar el sustrato no escindido por DPP8 para identificar que la molécula puede inhibir la escisión del sustrato por DPP8.

A pesar de que los inhibidores de DPP8 también pueden inhibir DPPIV y otras serinproteasas, como aquí se describe, se admite que la alineación de la secuencia aminoacídica de DPP8 con moléculas los más estrechamente relacionadas (es decir, DPPIV) revela que el aminoácido DPP8 es distintivo, particularmente en las regiones que controlan la especificidad del sustrato. Por tanto, se espera que se puedan identificar los inhibidores que inhiben de forma específica la actividad catalítica de DPP8, que no inhiben la actividad catalítica de los miembros de la familia de los genes de tipo DPPIV u otras serinproteasas. De esta manera, en un sexto aspecto, la invención proporciona un método para identificar una molécula que sea capaz de inhibir de forma específica la escisión del sustrato por DPP8, siendo un método que consiste en los siguientes pasos:

(a) poner en contacto el DPP8 y otra proteasa con la molécula;

(b) poner en contacto el DPP8 y la otra proteasa del paso (a) con un sustrato capaz de ser escindido por DPP8 y la otra proteasa, en condiciones suficientes para la escisión del sustrato por DP88 y la otra proteasa; y

(c) detectar el sustrato no escindido por DPP8, pero sí escindido por la otra proteasa, para identificar que la molécula puede inhibir de forma específica la escisión del sustrato por DPP8.

En un séptimo aspecto, la invención proporciona un método de reducción o inhibición de la actividad catalítica de DPP8, siendo un método que comprende el paso de poner en contacto DPP8 con un inhibidor de la actividad catalítica de DPP8. Dado que aquí se muestra que varios inhibidores de la actividad catalítica de DPPIV inhiben la actividad catalítica de DPP8, se reconoce que es posible que otros inhibidores de DPPIV sean útiles para inhibir la actividad catalítica de DPP8. En [21, 32 y 33] se describen ejemplos de inhibidores adecuados para la utilización en el séptimo aspecto. Es posible identificar otros inhibidores útiles para inhibir la actividad catalítica de DPP8 mediante los métodos de los aspectos quinto o sexto de la invención, métodos que aquí se ejemplifican.

En una realización, la actividad catalítica de DPP8 se reduce o inhibe en un mamífero mediante la administración del inhibidor de la actividad catalítica de DPP8 al mamífero. Se reconoce que estos inhibidores se han utilizado para reducir o inhibir la actividad catalítica de DPPIV in vivo y, por tanto, también pueden utilizarse para inhibir la actividad catalítica de DPP8 in vivo. Los ejemplos de inhibidores útiles para este propósito se describen en los siguientes [21, 32-34].

La actividad catalítica de DPP8 en un mamífero se reduce o inhibe preferiblemente en el mamífero con el fin de tratar una enfermedad en dicho mamífero. Las enfermedades susceptibles de ser tratadas mediante un inhibidor de la actividad catalítica de DPP8 son aquellas en las que se encuentran asociados miembros de la familia de los genes de tipo DPPIV [3, 10, 11, 17, 21 y 36]. Entre ellas se incluyen por ejemplo la neoplasia, la diabetes tipo II, la cirrosis, la autoinmunidad, el rechazo del injerto y la infección por VIH. El inhibidor a utilizar en el séptimo aspecto de la invención es preferiblemente uno que inhiba la escisión de un enlace peptídico C-terminal adyacente a prolina. Tal como aquí se describe, los siguientes compuestos son ejemplos de estos inhibidores: fluoruro de 4-(2-aminoetil)benceno-sulfonilo, aprotinina, benzamidina/HCl, Ala-Pro-Gly, H-Lys-Pro-OH sal de HCl e iones de cinc como el sulfato de cinc o el cloruro de cinc. Más preferiblemente, el inhibidor es uno que inhiba de forma específica la actividad catalítica de DPP8 y que no inhiba la actividad catalítica de otras serinproteasas, incluidas DPPIV y FAP, por ejemplo.

En un octavo aspecto, la invención proporciona un método de escisión de un sustrato en el que es necesario poner en contacto el sustrato con DPP8 en condiciones suficientes para la escisión del sustrato por DPP8. Algunos ejemplos de moléculas que pueden escindirse mediante el método son H-Ala-Pro-pNA, H-Gly-Pro-pNA y H-Arg-Pro-pNA. Aquí se describen las condiciones suficientes para la escisión del sustrato. Las moléculas que son escindidas por DPPIV, incluidas RANTES, eotaxina, quimiocina derivada de macrófagos, factor 1 derivado de células estromales, glucagón y péptidos de tipo glucagón 1 y 2, neuropéptido Y, sustancia P y péptido vasoactivo, también son susceptibles de ser escindidas por DPP8 [11, 12]. En una realización, el sustrato es escindido mediante la escisión de un enlace peptídico C-terminal adyacente a prolina del sustrato. Las moléculas escindidas por DPP8 pueden contener Ala o Trp, Ser, Gly, Val o Leu en lugar de Pro en la posición P1 [11, 12].

Como se describe aquí, la expresión génica de DPP8 se encuentra regulada positivamente en líneas celulares linfocíticas y linfocitos estimulados lo que sugiere que DPP8 posiblemente desempeñe un papel funcional en la coestimulación y proliferación de las células T. Por tanto se admite que la medición de la expresión génica de DPP8 es útil para la detección de la activación de las células T. De este modo, en un noveno aspecto, la invención proporciona un método de detección de una célula T activada, siendo un método que comprende el paso de detectar el nivel de expresión génica de DPP8 en una célula T. En una realización, el nivel de expresión génica de DPP8 se detecta mediante la medición de la cantidad de mRNA de DPP8 en la célula, tal como aquí se describe.

Los inventores han descrito la secuencia de una molécula de ácido nucleico que codifica la secuencia aminoacídica mostrada en el ID. de SEC. Núm.: 1. Por tanto, en un décimo aspecto, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica la secuencia aminoacídica mostrada en el ID. de SEC. Núm.: 1.

En un undécimo aspecto, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico que consiste en la secuencia mostrada en el ID. de SEC. Núm.: 2.

Tal como aquí se describe, se observan por lo menos tres variantes de corte y empalme, "splicing", de RNA de DPP8 que poseen un marco de lectura abierto de 2,6 a 3,1 Kb de longitud. Dado que en la secuencia de estas variantes de corte y empalme no se observó una mutación de cambio de marco de lectura ni una señal de terminación, y dado que la secuencia codificante de dos de las variantes de corte y empalme incluye una secuencia que codifica la secuencia aminoacídica asociada con la actividad catalítica, se reconoce que algunos de los péptidos codificados por las variantes de corte y empalme probablemente presenten la especificidad de sustrato de DPP8. Por lo tanto, en una realización la molécula de ácido nucleico es un fragmento de la secuencia mostrada en el ID. de SEC. Núm.: 1 que tiene una longitud de unas 2,6 a 3,1 Kb y que codifica un péptido que posee la especificidad de sustrato de la secuencia mostrada en el ID. de SEC. Núm.: 1. Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico presenta una secuencia mostrada en cualquiera de los Núms. ID. de SEC.: 4, 6 y 8.

En un duodécimo aspecto, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico que es capaz de hibridar con una molécula de ácido formada por la secuencia mostrada en el ID. de SEC. Núm.: 2 en condiciones de astringencia, y que codifica un péptido que posee la especificidad de sustrato de la secuencia mostrada en el ID. de SEC. Núm.: 1. Tal como se muestra en el análisis de Northern blot aquí descrito, el RNA de DPP8 hibrida de forma específica con la secuencia mostrada en el ID. de SEC. Núm.: 2, tras un lavado en 2 x SSC/1,0% SDS a 37ºC o en 0,1 x SSC/0,1% SDS a 50ºC. Las "condiciones de astringencia" son condiciones en las que se expone la molécula de ácido nucleico a 2 x SSC/1,0% SDS. Es preferible que la molécula de ácido nucleico pueda hibridar con una molécula formada por la secuencia mostrada en el ID. de SEC. Núm.: 2 en condiciones altamente astringentes. "Condiciones altamente astringentes" son aquellas en las que la molécula de ácido nucleico se expone a 0,1XSSC/0,1% SDS a 50ºC.

Los inventores, como aquí se describe, son del parecer que el gen que codifica DPP8 se encuentra situado en la banda q22 del cromosoma 15 humano. La situación del gen DPP8 se diferencia de la de genes que codifican otras prolil oligopeptidasas que se encuentran localizados en el cromosoma 2 en las bandas 2q24.3 y 2q23 o en el cromosoma 7. Así, en una realización la molécula de ácido nucleico es una capaz de hibridar con un gen que se encuentra situado en la banda q22 del cromosoma 15 humano.

Se afirma que es posible construir una molécula de ácido nucleico que codifique la secuencia aminoacídica mostrada en el ID. de SEC. Núm.: 1, o que contenga la secuencia mostrada en el ID. de SEC. Núm.: 2, produciendo el fragmento de la secuencia que se traduce mediante técnicas estándar [30, 31].

De esta manera, la molécula de ácido nucleico de una realización no contiene secuencias no traducidas 5' o 3'.

En un decimotercer aspecto, la invención proporciona un vector que contiene una molécula de ácido nucleico del décimo aspecto de la invención. En una realización, el vector es capaz de replicarse en una célula COS-7, CHO o 293T o en una E. coli. En otra realización, el vector es seleccionado del grupo formado por \lambdaTripleEx, pTripleEx, pGEM-T Easy Vector, pSecTag2Hygro, pet15b, pEE14.HCMV.gs y pCDNA3.1/V5/His.

En un decimocuarto aspecto, la invención proporciona una célula que contiene un vector del aspecto decimotercero de la invención. En una realización, la célula es una célula de E. coli. Preferiblemente, la E. coli es MC1061, DH5\alpha, JM109, BL21DE3 o pLysS. En otra realización, la célula es una célula COS-7, COS-1, 293T o CHO.

En un decimoquinto aspecto, la invención proporciona un método para generar un péptido del primer aspecto de la invención que comprende el mantenimiento de una célula según el decimocuarto aspecto en condiciones suficientes para la expresión del péptido por parte de la célula. Las condiciones suficientes para la expresión aparecen aquí descritas. En una realización, el método comprende otro paso de aislamiento del péptido.

En un decimosexto aspecto, la invención proporciona un péptido cuando se produce mediante el método del decimoquinto aspecto.

En un decimoséptimo aspecto, la invención proporciona una composición que contiene un péptido del primer aspecto y un transportador farmacéuticamente aceptable.

En un decimoctavo aspecto, la invención proporciona un anticuerpo capaz de unirse a un péptido según el primer aspecto de la invención. El anticuerpo puede prepararse mediante la inmunización de un sujeto con DPP8 purificada o un fragmento de la misma de acuerdo con las técnicas estándar [35]. Como aquí se describe, se preparó un anticuerpo mediante inmunización con células DPP8^{+} transfectadas de forma transitoria. Se afirma que el anticuerpo sirve para inhibir la actividad de DPP8, o para detectar una expresión génica de DPP8 aumentada, con el propósito de identificar una célula T activada. En una realización, el anticuerpo del octavo aspecto de la invención es generado mediante una célula de hibridoma.

En un decimonoveno aspecto, la invención proporciona una célula de hibridoma que segrega un anticuerpo del decimoctavo aspecto.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Estrategia de clonación para el aislamiento del cDNA completo de DPP8 y las variantes de corte y empalme alternativas de DPP8 observadas. Se muestra la representación de tres variantes de corte y empalme incluyendo la pérdida del lugar de reconocimiento de serina en una variante de corte y empalme (T8).

Figura 2. Secuencia nucleotídica y secuencia aminoacídica de la DPP8 humana. Se muestra la secuencia nucleotídica y la aminoacídica predicha en código de una letra. Esta secuencia no presenta ningún dominio transmembrana putativo (deducido a partir de los representaciones de hidrofobicidad) ni ningún sitio potencial de N-glicosilación. Se marcan los sitios putativos de reconocimiento de serina, ácido aspártico e histidina que forman parte de la tríada catalítica Ser-Asp-His. Los pares de bases están numerados en el margen derecho.

Figura 3. Alineación de la secuencia deducida de residuos aminoacídicos de DPP8 con el homólogo de la DPP8 de C. elegans y con DPPIV humana. Los residuos aminoacídicos está numerados en el margen derecho. Los residuos aminoacídicos que son idénticos en las tres proteínas aparecen en un recuadro. Los asteriscos señalan los residuos de tríada catalítica putativa y dos glutamatos del dominio \beta-propeller esenciales para la actividad enzimática de DPPIV. El sombreado gris denota el dominio \alpha/\beta hidrolasa de estas proteínas. Los triángulos negros unidos por líneas indican los inicios y finales de transcritos sometidos a corte y empalme alternativo: stPBMCdy3-3-10 (líneas continuas), T8 (líneas discontinuas) y T21 (líneas continuas). La alineación se realizó utilizando el programa PILEUP en GCG.

Figura 4. Análisis Northern Blot de la expresión de DPP8. Se hibridaron Northern blots de tejidos múltiples humanos (CLONTECH) que contenían 2 \mug de RNA poli A^{+} por carril con una sonda de DPP8 marcada con ^{32}P a 68ºC y se lavaron en condiciones de elevada astringencia. La autorradiografía se expuso durante un día a -70ºC con una pantalla BIOMAX MS. Los marcadores de masa molecular se indican en pares de bases en el lateral izquierdo de cada autorradiograma. Figura 4a. Se hibridó un blot Master RNA (CLONTECH) de RNA de poli A^{+} con una sonda de DPP8 marcada con ^{32}P a 65ºC y se lavó en condiciones de elevada astringencia. La autorradiografía se expuso durante tres días a -70ºC con una pantalla BIOMAX MS. Se detectó mRNA de DPP8 en todos los tejidos analizados.

Figura 5. Localización cromosómica de la DPP8 humana. Metafase que muestra FISH con la sonda de cDNA de DPP8 biotinilada. Cromosomas masculinos normales teñidos con DAPI. Los sitios de hibridación en el cromosoma 15 se indican mediante una flecha.

Figura 6. Análisis Western blot de líneas celulares transfectadas. Análisis de lisados de líneas celulares estables. La proteína DPP8 se observó en líneas celulares estables DPP8/V5/His pero no fue así en líneas celulares estables de DPP4 o exclusivamente con vector. La movilidad electroforética de la proteína no se alteró cuando se hirvieron las muestras. La banda con mayor movilidad corresponde probablemente a un producto de descomposición de DPP8 intacta.

Figura 7. Actividad enzimática de DPP8. (A) Dependencia respecto del pH de la actividad enzimática de DPP8. (B) Cinética enzimática de DPP8 y DPPIV. Se muestran las medias +/- DE del cambio de absorbancia por minuto, multiplicadas por 1000. El ajuste de la curva asume la cinética de Michaelis-Menten.

Figura 8. Análisis por RT-PCR de la expresión de DPP8. Amplificaciones por PCR con cebadores específicos para una porción de DPP8 humana que no contenía ningún corte y empalme alternativo, de Val416 a Gly 679 (parte superior de cada gel) o para gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (G3PDH) (parte inferior de cada gel). (A) Gel superior: los carriles 1-5 contienen productos de PCR a partir de cDNA de PMBC no estimulados procedentes de cinco sujetos. Gel inferior: los carriles 6 a 11 contienen productos de PCR a partir de cDNA de PMBC estimulados con OKT3 procedentes de seis sujetos. (B) Los productos de PCR proceden de cDNA de líneas celulares linfocíticas, hígado o placenta, como se indica. Las amplificaciones del control negativo contenían mezcla de reacción, enzimas y ningún molde de cDNA. Cada PCR se realizó durante 35 ciclos. Los productos de PCR se sometieron a electroforesis sobre geles de agarosa y se tiñeron con bromuro de etidio. El carril izquierdo de cada gel contiene PUC19 digeridos con HaeIII como marcadores de tamaño.

Figura 9. Análisis de Northern blot de la expresión de DPP8 murina. Se hibridó un Northern blot murino que contenía 10 \mug por carril de RNA total con una sonda de DPP8 humana marcada con ^{32}P a 60ºC y se lavó en condiciones de baja astringencia. La exposición autorradiográfica duró tres días a -70ºC con una pantalla BIOMAX MS.

Descripción detallada de la invención Ejemplos General

Las enzimas de restricción y otras enzimas utilizadas en la clonación se obtuvieron a partir de Boehringer Mannheim Roche. Se utilizaron técnicas estándar de biología molecular [31] excepto en los casos en que se indica lo contrario.

Se obtuvo un clon EST (Número de acceso en GENBANK™ AA417787) de la Colección Americana de Cultivos tipo (ATCC). El inserto de DNA de este clon se secuenció en ambas cadenas utilizando la secuenciación automática de SUPAMAC (Sydney, Australia).

Preparación de cultivos celulares y de RNA

Se aislaron monocitos humanos de sangre periférica (PMBC) mediante centrifugación en gradiente de densidad Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Uppsala, Suecia) a partir de sangre obtenida de donantes sanos. Los PMBC fueron incubados en medio AIM-V (Life Techonologies, Gaithersburg, MD, EE. UU.) complementado con L-glutamina 2 mM y estimulados con 1 \mug/mL de fitohemaglutinina (Wellcome) o bien con 100 ng/mL de OKT3 (Orthoclone, FL, EE. UU.) durante 72 h. Las líneas celulares humanas Jurkat, CCRF-CEM, Raji, Daudi y Hepg2 se cultivaron hasta su confluencia en medio Eagle modificado por Dulbecco (Trace Biosciences, NSW, Australia) complementado con suero fetal bovino al 10% y L-glutamina 2mM.

El RNA hepático y placentario se preparó a partir de tejido humano "snap-frozen" como ya se ha descrito anteriormente [37]. Sin embargo, el RNA se preparó a partir de PBMC y líneas celulares utilizando un equipo RNAeasy (Qiagen, Alemania).

Bioinformática

Los programas BLAST [38] y todas las alineaciones de secuencias múltiples se realizaron mediante el Servicio Nacional de Información Genómica de Australia (ANGIS, Sydney, NSW, Australia). Se utilizó PILEUP (GCG Versión 8, Genetics Computer Group, Madison, WI, EE. UU.) para la alineación de secuencias múltiples de proteínas.

Se realizó una búsqueda mediante BLAST en la base de datos pública de Expressed Sequence Tag (EST) utilizando las secuencias nucleotídicas completas de la DPPIV humana (número de acceso en GENBANK™ X60708) y de FAP (número de acceso U09278) como secuencias de búsqueda. Se obtuvo un clon EST (número de acceso AA417787) a partir de la Colección Americana de Cultivos Tipo. El inserto de DNA de este clon se secuenció en ambas cadenas utilizando la secuenciación automática de SUPAMAC (Sydney, NSW, Australia). Debido a su homología con DPPIV, a este nuevo gen se le denominó dipeptidil peptidasa 8 (DPP8).

Clonación de DPP8

Se utilizó ESTAA417787 para diseñar cebadores de DPP8 directos (caa ata gaa att gac gat cag gtg) y reversos (tct tga agg tag tgc aaa aga tgc) para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a partir de ESTAA417787. Las condiciones de PCR fueron las siguientes: 94ºC durante 5 min, seguido de 35 ciclos de 94ºC durante 1 min, 55ºC durante 30 s y 70ºC durante 1 min. Este producto de PCR de 484 pb se purificó en gel, se marcó con ^{32}P-\alpha utilizando el equipo de marcaje Megaprime (Amersham Pharmacia Biotec, Reino Unido) y se hibridó con un blot de RNA Master (CLONTECH, Palo Alto, CA, EE. UU.) que contenía poli A^{+} de 50 tejidos adultos y fetales inmovilizados en puntos como indican las instrucciones del fabricante. Este blot Master de RNA también se hibridó con una sonda de DPP4 para comparar la expresión en tejido del mRNA.

Los cebadores directo y reverso de DPP8 se utilizaron en la PCR para realizar un cribado de una biblioteca de placenta humana \lambda STRETCH PLUS (CLONTECH, Palo Alto, CA, EE. UU.) en busca de la presencia de cDNA de DPP8 en la biblioteca. Entonces se cribó la biblioteca mediante técnicas estándar de biología molecular [30, 31]. Después de un cribado primario se seleccionaron 23 clones para el cribado secundario tras el cual hubo 22 que siguieron dando positivo. Para el cribado terciario, los clones existentes en \lambdaTripleEx se convirtieron en plásmidos pTripleEx y se transformaron en bacterias receptoras BM25.8 E. coli. Una vez dispuestas las bacterias en placas, éstas se cribaron y se confirmó que los 22 clones eran positivos. Dos de ellos, T8 y T21, se seleccionaron para su posterior estudio.

5'RACE (amplificación rápida de extremos de cDNA)

Se empleó un equipo 5'RACE Versión 2.0 (Gibco BRL, Life technologies) sobre células T activadas (ACT) y RNA placentario del modo indicado en las instrucciones del equipo. Se utilizó la secuencia de DNA T8 para diseñar GSP 1 (TCC TTC CTT CAG CAT CAA TC) y GSP2 (CTT AAA AGT GAC TTT AGG ATT TGC TGT ACC). Los productos de PCR por 5'RACE se clonaron en un vector pGEM-T Easy® (Promega Co., Madison, WI, EE. UU.) y se secuenciaron mediante paseo de cebadores (del inglés "primer walking").

Confirmación de la identidad del producto de RACE

Se llevó a cabo una PCR mediante transcriptasa inversa sobre un RNA de ATC utilizando DPP8-pr23 (GGA AGA AGA TGC CAG ATC AGC TGG) y DPP8-pr19r (TCC GTG TAT CCT GTA TCA TAG AAG) para cubrir la unión entre el producto de RACE y los clones de EST y de la biblioteca. Se clonaron dos productos purificados en gel, ATCd3-2-1 (1603 pb) y ATC3-3-10 (1077 pb), en un vector pGEM-T Easy® (Promega Co., Madison, WI, EE. UU.) y se secuenciaron.

Subclonación de cDNA de DPP8 en un Vector de Expresión pcDNA3.1/V5/His

El producto de RACE en ATC, el fragmento de la unión ATCd3-2-1 (1603 pb) y el clon de biblioteca T21 se juntaron y se clonaron en el vector de expresión pcDNA3.1/V5/His A (Invitrogen, Holanda) para formar un cDNA de DPP8 de 3,1 Kb con un marco de lectura abierto de 882 aa. El primer constructo se generó siguiendo tres pasos de clonación secuenciales. Para empezar, se ligó un fragmento Eco RV/Xba I de T21 (que contiene DPP8 en 3', un codón de parada y una región 3' no traducida en el cDNA de DPP8) en el vector pcDNA3.1/V5/His A que había sido digerido con Eco RV/Xba I. A continuación, a este constructo digerido con Eco RI/Eco RV se le añadió un fragmento Eco RI/Eco RV de ATCd3-2-1. Finalmente, el producto de RACE se cortó con Eco RI y se clonó en el sitio de Eco RI del constructo previo para formar el cDNA de DPP8 de 3,1 kb completo. Este constructo pcDNA3.1-DPP8 expresaba proteína sin un identificador detectable. Además, el codón de parada en el constructo de expresión de DPP8 en pcDNA3.1/V5/His V5 se alteró genéticamente mediante PCR para dar lugar a una fusión C-terminal con el identificador V5 e His que contenía el vector. A este costructo se le denominó pcDNA3.1-DPP8/V5/His. Se verificaron todos los constructos de expresión subclonados en pcDNA3.1/V5/His mediante análisis de secuencia completa.

Expresión génica de DPP8 mediante Northern Blot

Se prehibridaron Northern blots de tejidos múltiples humanos (CLONTECH), que contenían 2 \mug de RNA de poli A^{+}, en solución de Hibridación Express (CLONTECH) durante 30 min a 68ºC. Tanto el producto de DPP8 de 484 pb como el producto de 5' RACE en ATC se marcaron sometieron a radiomarcaje utilizando un equipo Megaprime Labeling (Amersham Pharmacia Biotech) y [^{32}P]dCTP (NEN Dupont).

El marcador no incorporado se eliminó mediante una columna NICK (Amersham Pharmacia Biotech) y la sonda desnaturalizada se incubó durante dos horas a 68ºC en solución de Hibridación Express. Los lavados se realizaron en condiciones de elevada astringencia y los blots se expusieron a una película BIOMAX MS durante toda la noche con una pantalla BIOMAX MS a -70ºC.

Expresión génica de DPP8 en ratones mediante Northern blot

Se realizó un Northern blot que contenía 10 \mug de RNA hepático total por carril mediante métodos estándar [31]. El RNA se obtuvo a partir de ratones macho y hembra de dos cepas, c57Bl6 y Balb/c. El Northern blot se prehibridó en solución de Hibridación Express (CLONTECH, Palo Alto, EE. UU.) durante una hora a 60ºC. Un cDNA de DPP8 humana de 2,4 kb (producto de PCR) se sometió a radiomarcaje utilizando el equipo Megaprime Labeling (Amersham Pharmacia Biotech) y [^{32}P]dCTP (NEN Dupont). El marcador no incorporado se eliminó mediante una columna NICK (Amersham Pharmacia Biotech) y la sonda desnaturalizada se incubó durante dos horas a 68ºC en solución de Hibridación Express. Los lavados se realizaron en condiciones de baja astringencia (2 x SSC/0,05% SDS durante 1 h a 37ºC seguido de 0,1 x SSC/0,1% SDS durante 30 min a 40ºC) y los blots se expusieron a una película BIOMAX MS durante tres días con una pantalla BIOMAX MS a -70ºC.

Expresión de DPP8 en hígado murino utilizando rtPCR

Se sometió a transcriptasa inversa RNA de hígado murino utilizando el equipo de enzimas Superscript II (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) como se descrito previamente [42]. El cDNA se diluyó 1:4 y se conservó en alícuotas a -70ºC. Se utilizó una PCR con DPP8murina-pr1F (atg att acc acc cag gaa ggcg) como cebador directo y DPP8murina-pr2R (atc tcc gac atc ttg aaa gtg acc) como cebador reverso para detectar el mRNA de la DPP8 murina.

Se amplificó 1 \mul de cDNA diluido en una reacción de PCR de 50 \mul que contenía lo siguiente: dNTP 0,2 mM, 1 \mul de 50 x Advantage 2 Polymerase Mix (Clontech), 1 x tampón de PCR Advantage 2 (Clontech) y 100 ng de cada cebador. La PCR implicaba un paso inicial de 95ºC durante 1 min para inactivar el anticuerpo TaqStart. A este paso le siguieron 35 ciclos; desnaturalización a 95ºC durante 30 s, 68ºC durante 1 min, seguido de un paso final de 68ºC durante 1 min. Los productos amplificados se analizaron mediante electroforesis de 10 \mul de reacción de PCR en un gel Nusieve 3:1 (FMC Bioproducts, Rockville, MD) más 0,5 \mug/ml de bromuro de etidio en tampón TAE (acetato de Tris 0,04 M, EDTA 0,001 M, pH 8.0). A continuación se realizó un Southern blot del gel utilizando técnicas estándar [31]. El Southern blot se hibridó a 60ºC durante 2 h con la sonda de cDNA de DPP8 humana de 2,4 kb preparada del modo antes descrito. Los lavados se realizaron en condiciones de baja astringencia (2 x SSC/0,05% SDS durante 1 h a 37ºC seguido de 0,1 x SSC/0,1% SDS durante 40 min a 50ºC). El blot se expuso a película XAR5 Kodak durante 30 min a temperatura ambiente.

Expresión de DPP8 mediante RT-PCR

Se llevó a cabo una PCR asociada a transcriptasa inversa sobre RNA de ATC humanas, RNA placentario humano y RNA hepático humano utilizando cebadores TED, DPP8/pr3 (GCA CTA CCT TCA AGA AAA CCT TGG) Y DPP8/pr20R (TAT GGT AT GCT GGG TCT CTC AGG), para proporcionar un producto de 293 pb.

Transfección, Western blot, inmunocitoquímica, citoquímica y citometría de flujo

Se cultivaron células de fibroblastos renales de mono (COS-7)(Colección Americana de Cultivos Tipo, CRL-1651) y se transfectaron del modo descrito anteriormente [39]. Con la finalidad de generar líneas celulares estables se añadió Geneticina (G418; Gibco-BRL) al medio comenzando 24 h después de la transfección. Se prepararon extractos de células COS mediante sonicación seguida de una centrifugación diferencial y no se hirvieron ni se redujeron antes del paso a SDS/PAGE (gel al 10%) y a la transferencia a nitrocelulosa, como se ha descrito anteriormente [40, 9]. La presencia DPP8 fusionada con el epítopo V5 se detectó utilizando un anticuerpo monoclonal (AcM) anti-V5 (Invitrogen). Se fijaron monocapas de células COS en etanol frío previamente al marcaje con el AcM anti-V5 [39, 41 y 9]. Algunas monocapas se fijaron en paraformaldehído al 4% y se permeabilizaron con Tritón X-100 al 0,1% [35]; después se sometieron a una tinción doble con aglutinina de germen de trigo para marcar el aparato de Golgi y con IgG de cabra antiratón para marcar DPP8, conjugadas respectivamente con Alexa Fluor 488 y Alexa Fluor 594 (Molecular Probes, Eugene, OR, EE. UU.). La citometría de flujo y la microscopía confocal de barrido mediante un microscopio confocal Leica TCS-NT ya se han descrito antes.

Purificación de DPP8/V5/His y DPPIV/V5/His recombinantes

Se sonicaron en tampón nativo (fosfato sódico 50 mM, NaCl 300 mM) células (1 x 10^{7}) que expresaban cada proteína y a continuación se trataron con 700 U de desoxirribonucleasa durante 20 min temperatura ambiente. Puesto que DPPIV se expresa en la superficie celular se utilizó Tritón X-100 al 1% para solubilizar DPPIV/V5/His. El material insoluble se eliminó por centrifugación. El sobrenadante se incubó con 1 mL de resina Talon® Metal Affinity Resin (Clontech) siguiendo las instrucciones del fabricante para un procedimiento de flujo de gravedad/batch. La resina se lavó con fosfato sódico 50 mM, que contenía NaCl 300 mM y imidazol 5 nM, y las proteínas se eluyeron utilizando el mismo tampón con imidazol 150 mM. La actividad enzimática se empleó para hacer el seguimiento de las fracciones eluidas.

Ensayos enzimáticos

Los ensayos enzimáticos se realizaron del modo antes descrito [1]. Tanto extracto celular clarificado de 1 x 10^{4} células COS-7 sonicadas como proteína purificada derivada de 1 x 10^{5} células se incubaron con sustrato en 70 \mul de tampón fosfato, pH 7,4, durante 30 min a 37ºC, excepto en los casos que se indica lo contrario. Se analizaron los sustratos de DPPIV específicos Gly-Pro-toluenosulfonato, H-Gly-Pro-p-nitroanilida (NA)/HCl (Sigma, St Louis, MO, EE. UU) y Gly-Pro-7-amino-4-trifluorometilcoumarina (Calbiochem, San Diego, CA, EE. UU). Otros sustratos sometidos a ensayo fueron los siguientes provenientes de Bachem (Suiza): H-Ala-Pro-pNA/HCl, sal de H-Arg-Pro-pNA acetato, H-Lys-Ala-pNA.2HCl, H-Asp-Pro-pNA, H-Ala-Ala-pNA/HCl, H-Ala-Ala-Pro-pNA/HCl, H-Ala-Ala-Phe-pNA, succinil-Ala-Pro-pNA, H-Ala-Phe-Pro-pNA y Z-Ala-Pro-p-NA. Se realizaron ensayos para comprobar la capacidad de los compuestos que se nombran a continuación de teñir células transfectadas no fijadas: H-Ala-Pro-4-metoxi\betaNA/HCl, sal Z-Lys-Pro-4-metoxi\betaNAformato, H-Lys-Pro-4-metoxi\betaNA/HCl, Z-Ala-Pro-4-metoxi\betaNA, H-Gly-Pro-\betaNA y sal de H-His-Ser-4-metoxi\betaNAacetato (Bachem).

Todos los inhibidores (véase la Tabla 2) se incubaron en tampón fosfato, pH 7,4, con cada enzima purificada durante 15 min previamente a la adición del sustrato. Una vez añadido el sustrato H-Ala-Pro-pNA 1 mM en el caso de DPP8 purificada y el sustrato H-Gly-Pro-pNA 1 mM en el caso de DPPIV, las muestras se incubaron durante 60 min a 37ºC. Todos los ensayos enzimáticos se realizaron por triplicado.

Localización cromosómica de DPP8 mediante análisis de Hibridación por Fluorescencia in situ (FISH)

La localización de DPP8 se realizó utilizando dos sondas diferentes, el EST de DPP8 y el clon de T8. Se realizó un marcaje por desplazamiento de mella "nick-translation" de las sondas con biotina-C14-dATP y se hibridaron in situ a una concentración final de 10 ng/\mul con metafases de dos machos normales. El método FISH se modificó respecto del antes descrito [37] en que los cromosomas se tiñeron antes del análisis tanto con yoduro de propidio (como contratinción) como con DAPI (para la identificación cromosómica). Se consiguieron imágenes de preparaciones en metafase mediante una cámara CCD enfriada utilizando el sistema de obtención y mejora de imágenes Cyto Vision Ultra (Applied Imaging International Ltd). Las señales de FISH y el patrón de bandas de DAPI se combinaron para la preparación de la figura.

Expresión de DPP8 en líneas celulares y linfocitos humanos

Se sometió a transcripción inversa 1 \mug de RNA utilizando el equipo enzimático Superscript II (Gibco-BRL) tal como ya se ha descrito [42]. Se utilizó una PCR con DPP8-pr18 (CTGTGACGCCACTAATTATCTATG) como cebador directo y DPP8-pr26R (CCTAGAGAGGCTAGGGTATTCAAG) como cebador reverso para detectar el mRNA completo de DPP8. El grupo de cebadores de control de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (G3PDH)fue G3PDH para (ACCACAGTCCATGCCATCAC) y G3PDHrev (TCCACCACCCTGTTGCTGTA) para proporcionar un producto de 470 pb.

Se amplificó cDNA (diluido 1:4; 1 \mug) en una mezcla de PCR de 25 \muL que contenía: dNTP 0,2 mM, 0,125 unidades de enzima Amplitaq Gold (Perkin-Elmer), 1 x tampón II (Perkin-Elmer), MgCl 1,5 mM y 100 ng/mL de cada cebador. La PCR de 35 ciclos se realizó de la siguiente forma: desnaturalización a 94ºC durante 1 min, hibridación de cebadores a 55ºC durante 30 s y paso de extensión a 72ºC durante 1 min. Los productos amplificados se analizaron mediante electroforesis de 15 \muL de mezcla de PCR en un gel Nusieve 3:1 (FMC Bioproducts, Rockville, MD, EE. UU.) más 0,5 \mug/mL de bromuro de etidio en tampón EDTA/acetato/Tris (Tris/acetato 0,04 M, EDTA 0,001 M, pH 8,0).

Anticuerpo antipéptido

Los métodos que se siguieron aparecen descritos en Current Protocols in Immunology [35]. Se escogieron dos péptidos mediante el programa informático MacVector para predecir la antigenicidad. Los dos péptidos se sintetizaron por encargo (Auspep, Melbourne) y se conjugaron con la toxina de la difteria (Auspep, Melbourne). Se inmunizaron conejos con ambos péptidos y se tomaron muestras de suero al inicio y después de cada inyección (IMVS, Adelaide).

Los dos péptidos utilizados fueron:

Nombre del PÉPTIDO:

\hskip0.5cm

TEDDA-N

SECUENCIA:

\hskip0.5cm

CTGYTERYMGHPDQNEQG-NH2

Esto corresponde a los aminoácidos 773 a 789, además de una Cys en el extremo N-terminal.

Nombre del PÉPTIDO:

\hskip0.5cm

TEDDR-C

SECUENCIA:

\hskip0.5cm

GKPYDLQIYPQERHSC-NH2

Esto corresponde a los aminoácidos 836 a 850, además de una Cys en el extremo c-terminal.

Estas secuencias se tomaron a partir de la porción C-terminal de DPP8.

Anticuerpo monoclonal contra DPP8

Para la producción de anticuerpos se utilizaron métodos estándar [35]. Se inmunizaron ratones con 2 x 10^{7} células COS-7 (Riñón de mono verde africano) vivas que habían sido transfectadas de forma transitoria con el cDNA de DPP8 en el vector pcDNA3. La inmunización final se realizó con células CHO (ovario de hámster chino) transfectadas de forma estable con cDNA de DPP8 en el vector pEE14. Se fusionaron células del bazo con células de mieloma x63Ag8, las células estándar de fusión. Se realizaron ensayos con sobrenadantes de cultivo de hibridomas mediante histoquímica de inmunoperoxidasa sobre monocapas de la línea celular de CHO transfectadas con DPP8 y utilizando como control negativo células CHO no transfectadas. Aquellos hibridomas que produjeron actividad de anticuerpo se clonaron.

Resultados Clonación molecular y análisis de secuencias de DPP8

El inserto en ATTC EST AA417787 tenía una longitud de 795 pb, contenía 527 pb de secuencia codificadora, un codón de parada TAA y 258 pb de secuencia no codificante 3' (Figura 1).

La hibridación de la transferencia de RNA Master mostró que el gen que contenía ESTAA417787 presenta una expresión tisular ubicua con elevados niveles de expresión en testículos y placenta. Basándose en este patrón de expresión, se cribó una biblioteca de cDNA placentario con un producto de PCR de 484 pb generado por los cebadores directo y reverso de DPP8. El análisis de homología de secuencias mostró que solo dos de 23 clones contenían secuencia 5' adicional a la secuencia de ESTAA417787. Estos clones de cDNA fueron designados como T8 y T21 y tenían una longitud de 1669 y 1197 pb respectivamente (Figura 1). Además, l comparación de esas secuencias con ESTAA417787 permitió conocer que el cDNA de T8 carecía de una región de 153 pb (51 aa) que sí estaba presente en T21 y ESTAA417787. Esta deleción daría lugar a la pérdida de la serina catalítica (GWSYGG) en el cDNA de T8. Muchos de los otros clones caracterizados parecían contener secuencias no relacionadas que probablemente son secuencias intrónicas causadas por un corte y empalme incompleto.

La técnica 5'RACE se empleó tanto con el RNA de ATC como con el RNA placentario para obtener el extremo 5' del gen DPP8. El producto de RACE obtenido a partir del RNA de células T activadas fue 0,2 kb más largo que el procedente del RNA placentario, aunque por lo demás fue idéntico (Figura 1). La primera metionina en una secuencia Kozak se encontró a 214 pb del extremo 5' del producto de RACE de células T activadas. Esta región 5' de 211 pb era rica en GC en un 75% y contenía una cantidad de elementos promotores e intensificadores potenciales (sitios Sp1, Ap1 y ETF) por lo que se dedujo que se trataba de la región flanqueante 5' del gen DPP8. Para poder confirmar la identidad del producto de 5'RACE como extremo 5' de DPP8, se llevó a cabo una RT-PCR para cubrir la unión entre el producto de RACE y el clon de biblioteca de cDNA T8. La RT-PCR sobre RNA de ATC dio lugar a dos clones ATCd3-2-1 y ATC3-3-10 (Figura 1). Comparados con T8 y T21, ambos clones presentaban una región inserto adicional de 144 pb (48 aa) inmediatamente adyacente al sitio de corte y empalme de T8. El análisis de homología de secuencias de esta región inserto adicional encontró una región homóloga en el homólogo de C. elegans y en DPP4. Esto demostró claramente que los clones de biblioteca T8 y T21 constituían variantes de corte y empalme de DPP8. También se encontró que el clon menor ATCd3-3-10 constituía otra variante de DPP8 ya que contenía una deleción de 516 pb en el extremo 5' que daría lugar a una deleción de 175 aa.

Se creó un clon completo de DPP8 utilizando el mayor producto de RACE, ATC3-2-1 y el clon de biblioteca T21. Esto generó un cDNA de DPP8 putativo de 3,1 kb (incluidas las regiones no traducidas 5' y 3') con un marco de lectura abierto de 882 aa para el posterior análisis de secuencias y para examinar la función de DPP8. Esta proteína 882 de DPP8 putativa no contenía ningún sitio de N-glicosilación y el análisis de hidrofobicidad Kyte-Doolittle mostró que carecía de un dominio transmembrana, a diferencia de DPP4, FAP y DPP6. Por tanto, es probable que DPP8 sea una proteína citoplasmática (Figura 2). La proteína DPP8 predicha compartía una similitud de aminoácidos del 51% y una identidad de aminoácidos del 27% con la DPP4 humana; los extremos C-terminales de estas proteínas mostraron la mayor homología (Figura 3).

Distribución hística de DPP8 determinada por RNA Master y Northern blot

Se sondó un master RNA blot con un producto de PCR de 484 nt producido por los cebadores directo y reverso de DPP8 del modo anteriormente mencionado. La expresión hística de mRNA de DPP8 fue ubicua en todos los tejidos adultos y fetales humanos. Al utilizar el cDNA de DPP4 como sonda se observó un patrón de expresión ubicuo similar (no se muestran los datos). Sin embargo, una valoración visual mostraba que los mayores niveles de expresión utilizando cada sonda específica de gen se dieron en diferentes tejidos. Las señales más intensas utilizando la sonda de DPP8 tuvieron lugar en testículos seguido de placenta, mientras que las señales más intensas utilizando la sonda de DPP4 aparecieron en glándula salival y glándula prostática, seguidos de placenta (datos no mostrados). Las sondas no se unieron a ninguno de los controles negativos de la transferencia.

Se llevó a cabo el análisis por Northern blot de mRNA procedente de tejidos humanos diferentes (Figura 49). Dos sondas específicas para DPP8 indicaron la presencia de transcritos en todos los tejidos examinados. Un transcrito con un tamaño, de 3,0 kb aproximadamente, acorde con el tamaño esperado aproximado del mensaje de DPP8 solamente se detectó en testículos. Sin embargo, hubo dos transcritos, de 8,0 y 5,0 kb respectivamente, se encontraron en niveles elevados en testículos, bazo, leucocitos de sangre periférica y ovario; en niveles moderados en próstata, intestino delgado y mucosa del colon; y en niveles menores en el timo. También se realizó un sondaje del Northern blot de tejidos múltiples con una sonda radiomarcada de \beta-actina humana y se observó en todos los tejidos un transcrito común de 2,0 kb (Figura 4).

Expresión de DPP8 en ratones determinada por Northern blot y rtPCR

La secuencia de cDNA de la DPP8 humana se sometió a hibridación cruzada con RNA hepático procedente de ratón. El Northern blot que contenía el RNA total de hígado murino se hibridó con una sonda de DPP8 humana, demostrando que el mRNA de la DPP8 se expresa en el hígado de ratón (Figura 9A). Había presentes dos transcritos de mRNA de la DPP8 murina. Se trata de un patrón similar al observado en el caso de la DPP8 humana. Estos transcritos representan probablemente regiones 5' y 3' no traducidas de diferentes longitudes del gen DPP8 murino. También se demostró la presencia de mRNA de DPP8 en el hígado de ratón utilizando rt-PCR. Los cebadores ensayados generaron un producto de PCR de 537 pb. Un Southern blot de este producto confirmó que la DPP8 murina presenta hibridación cruzada con la DPP8 humana (Figura 9B).

Expresión y actividad funcional de DPP8

Para poder valorar la función de la proteína DPP8, se clonó el cDNA de la DPP8 completa de 3,1 kb en el sitio para Xba I del vector de expresión pcDNA3.1A/V5/His para generar dos constructos. El primero de ellos, pcDNA3.1-DPP8, expresaba solamente proteína DPP8 mientras que el segundo. pcDNA3.1-DPP8/V5/His expresaba una proteína con el epítopo V5 y el identificador para His fusionados al extremo C-terminal de DPP8 para facilitar el análisis de la expresión proteica. Se transfectaron de forma estable constructos de expresión en mamíferos en células COS-7 y se prepararon sonicados celulares. Mediante un Western blot de células de expresión de DPP8/V5/His estables se detectó un monómero de 100 kDa coherente con el peso molecular predicho a partir de la secuencia aminoacídica (Figura 6). Mediante el uso del AcM anti-V5 se detectó proteína DPP8/V5/His en el compartimiento citoplasmático, pero no fue así en la superficie de células COS de expresión de DPP8/V5/His estables fijadas en etanol.

La DPP8 es una dipeptidil peptidasa

La homología de secuencias entre DPPIV y DPP8 sugería la presencia de similitudes funcionales. Por esta razón, se examinaron lisados celulares de células transfectadas con DPP8 en busca de actividad peptidasa específica de prolina. Los controles positivos eran células COS-7 que expresaban DPPIV con o sin el identificador V5/His, mientras que los controles negativos los constituían células COS-7 transfectadas solamente en vector. Los extractos de células COS-7 transfectadas con DPP8 hidrolizaban H-Ala-Pro-pNA y H-Arg-Pro-pNA, pero no H-Gly-Pro-pNA, H-Gly-Arg-pNA, H-Gly-Pro-toluenosulfonato o H-Gly-Pro-7-amino-4-trifluorometil-coumarina, por encima de los niveles mostrados por las células COS-7 no transfectadas (datos no mostrados). El pH óptimo para la actividad enzimática de DPP8 era de 7,4 (Fig. 5A), similar al pH 7,8 óptimo para la actividad enzimática de DPPIV [43, 44]. La DPP8 mostró poca actividad por a pH inferiores a 6,3, lo que sugiere que no se trata de una enzima del compartimiento lisosomal/endosomal. De todos los sustratos ensayados con las monocapas celulares, solamente Ala-Pro-4M\betaNA/HCl tiñó células COS transfectadas con DPP8 y células CHO (datos no mostrados).

Tanto la DPP8/V5/His recombinante purificada como la DPPIV/V5/His recombinante purificada hidrolizaban H-Ala-Pro-pNA, G-Gly-Pro-pNA y H-Arg-Pro-pNa. Es posible que la transfección con DPP8 cause una actividad aumentada dipeptidasa, tripeptidasa y endopeptidasa, de forma similar a un efecto de la transfección de DPPIV en células de melanoma [18]. De hecho, nuestros resultados mostraron que las células COS-7 transfectadas con DPP8, pero no DPP8 recombinante purificado, muestran actividad tripeptidil peptidasa utilizando el sustrato H-Ala-Ala-Pro-pNA y actividad endopeptidasa utilizando el sustrato Z-Ala-Pro-pNA (datos no mostrados). Esto se investigó en más profundidad y ninguno de los sustratos para la tripeptidil peptidasa H-Ala-Ala-Phe-pNa o H-Ala-Phe-Pro-pNA [45] ni de los sustratos para la prolil endopeptidasa Z-Ala-Pro-pNA o succinil-Ala-Pro-pNA fueron escindidos por la DPP8 purificada. Nuestros datos demostraron claramente que la DPP8 es una dipeptidil peptidasa y que carece de actividad tripeptidil peptidasa o endopeptidasa.

La naturaleza del mecanismo catalítico de DPP8 se investigó con más detalle utilizando diversos inhibidores. La actividad enzimática de DPP8 se vio inhibida significativamente por inhibidores de la serina proteinasa y fue insensible a los inhibidores de metaloproteinasas, aspartil proteinasas o cisteína proteinasas. La actividad enzimática de DPP8 fue inhibida de forma significativa por cinc, que inhibe completamente la actividad enzimática de DPPIV [46]. Los péptidos Ala-Pro-Gly y Lys-Pro imitan a sustratos para DPP8 y probablemente ejercían una inhibición competitiva sobre DPP8.

Localización cromosómica de DPP8

Se utilizaron dos sondas para el análisis mediante FISH, ESTAA417787 y el clon T8 de la biblioteca placentaria. Se examinó la señal fluorescente en diecisiete metafases procedentes del primer macho normal. Todas estas metafases mostraron señal en una o ambas cromátidas del cromosoma 15 en la banda q22 (Figura 5). En estas metafases se observó un total de dos puntos de ruido de fondo no específicos. Se obtuvo un resultado similar de la hibridación de la sonda con 15 metafases procedentes del segundo macho normal (datos no mostrados).

Análisis de la expresión génica de DPP8 mediante RT-PCR

DPPIV es expresada por la mayor parte de linfocitos y líneas celulares linfocíticas, pero se encuentra regulado positivamente en los linfocitos activados [41, 47, 48, 49]. Ya que cabe la posibilidad de que las diversas variantes de corte y empalme de DPP8 no codifiquen proteína funcional, la PCR se diseñó para detectar solo el mRNA que contuviera la secuencia completa (Fig. 1). A los 35 ciclos, se observó fácilmente producto de amplificación del tamaño esperado (783 pb) en PBMC estimuladas con OKT3 (seis de seis sujetos; Fig. 8), pero no se observó en las PBMC no estimuladas de la mayoría de sujetos (cuatro de cinco, Fig. 8A). Esto sugiere que se expresa más mRNA de DPP8 en células T activadas que en PBMC no estimuladas. Se obtuvieron datos de RT-PCR similares a partir de PBMC estimuladas con fitohemaglutinina (datos no mostrados). Además, se expresó mRNA de DPP8 en todas las líneas de células B y T examinadas y tanto en placenta como en hígado (Fig. 8B).

Anticuerpo antipéptido

Se hicieron análisis mediante ELISA del suero de dos conejos en pocillos recubiertos de péptidos. Ambos sueros se unieron a ambos péptidos, mientras que las muestras de suero de preinmunización no mostraron unión específica. Los Western blots con extractos de líneas celulares, líneas celulares transfectadas con cDNA de DPP8 y linfocitos humanos activados mostraron que un antisuero de conejo contra las dos DPP8 se une a una banda de 100 kDa, el mismo tamaño que la DPP8. (No se muestran los datos).

TABLA 1 Valores K_{m} y V_{máx} para DPP8 y DPPIV

1

TABLA 2 Inhibición de la actividad peptidasa de DPP8 en comparación con DPPIV.

Se incubaron inhibidores de la proteinasa comunes de varios tipos enzimáticos con las peptidasas purificadas previamente al ensayo con los sustratos H-Ala-Pro-pNA sobre DPP8 o H-Gly-Pro-pNA sobre DPPIV. AEBSF: fluoruro de 4-(2-aminoetil)bencenosulfonilo.

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Discusión

Describimos la clonación, la expresión recombinante, la bioquímica y la expresión tisular de una nueva peptidasa postprolina relacionada con la DPPIV humana que hemos denominado DPP8. La DPP8 mostraba actividad dipeptidil aminopeptidasa, pero no actividad tripeptidil peptidasa ni endopeptidasa. De igual forma que con la DPPIV, se encontró que la DPP8 mostraba una expresión de mRNA significativa en células T activadas. Los datos de secuenciación y localización obtenidos proporcionaron indicios claros de que la DPP8 es una proteína monomérica, no glicosilada, soluble y citoplasmática, características que coinciden con las de PEP pero no con las de DPPIV, FAP o DPP6. La actividad enzimática de DPP8 presentaba un óptimo de pH neutro lo que sugiere que no se encuentra activa en el compartimiento ácido lisosómico/endosómico.

Por homología con DPPIV, DPP8 es un miembro de la familia de los genes de tipo DPPIV, un miembro de la familia S9b de la prolil oligopeptidasa y un miembro del clan enzimático SC. Los residuos de DPP8 que forman potencialmente el sistema de desplazamiento de carga son Ser739, Asp817 y His 849 (Fig. 2). La actividad dipeptidil peptidasa de la DPP8 y la ausencia de actividad detectable tripeptidil peptidasa o endopeptidasa en DPP8 purificada apoyan aún más su adjudicación a la familia S9b. Además, la especificidad por el sustrato de la DPP8 era indistinguible de la de las peptidasas relacionadas estructuralmente DPPIV y FAP.

El papel de DPPIV en los linfocitos humanos se ha estudiado en profundidad utilizando inhibidores enzimáticos [49, 50-54]. Los inhibidores específicos de DPPIV suprimen tanto la síntesis de DNA como la producción in vitro de citocinas [48, 49, 52]. Además, los inhibidores específicos de DPPIV provocan la disminución de la fosforilación en tirosina inducida por forbol miristato acetato en linfocitos humanos, lo que también sugiere un papel de la actividad enzimática de DPPIV en la activación linfocítica [54]. In vivo, los inhibidores de DPPIV suprimen la artritis [20] y prolongan la supervivencia del aloinjerto cardiaco en modelos animales [55]. La capacidad de DPP8 para escindir sustratos de DPPIV indica que los inhibidores de DPPIV quizás también puedan inhibir a DPP8 y que los estudios con inhibidores quizás requieran una interpretación más extensa. De hecho, es posible que la DPP8 sea responsable de algunas de las funciones fisiológicas que se le han asignado a DPPIV.

FAP y DPPIV son glicoproteínas integrales de membrana y requieren su dimerización para la actividad catalítica [9, 56, 57]. Por el contrario, DPP8 y PEP son proteínas citosólicas no glicosiladas que están catalíticamente activas en forma de monómeros [58] y escinden enlaces Pro-Xaa [43, 59]. Sin embargo, la especificidad por el sustrato de PEP es diferente de la de DPP8. PEP es una endopeptidasa que no escinde si una \alpha-amina libre se encuentra en situación N-terminal respecto a la prolina (p. ej. no escinde H-Ala-Pro). Hemos propuesto recientemente que la estructura terciaria de DPPIV es similar a la de PEP en cuanto que presenta un dominio \beta-propeller de siete aspas y un dominio \alpha/\beta-hidrolasa [3, 39, 1]. El parecido significativo entre las secuencias de DPP8 y DPPIV indica que las estructuras terciarias de las dos son similares. Sin embargo, DPP8 contiene 110 aminoácidos más que DPPIV, de modo que podría tener un elemento adicional de estructura terciaria como por ejemplo una octava hoja de propeller.

Las relaciones ancestrales entre DPP8, DPPIV y FAP se reflejan en su localización cromosómica. Mientras que DPPIV y FAP se han localizado en el brazo largo del cromosoma 2, 2q24.3 [60] y 2q23 [61] respectivamente, DPP8 se localizó en 15q22. Los genes relacionados DPP6 y PEP se han localizado en el cromosoma 7 [62] y 6q22, respectivamente [63].

Dos loci de enfermedades humanas se han localizado en 15q22. Estos loci son un locus de sordera recesiva [64] y una forma del síndrome de Bardet-Biedl, tipo 4 [65]. Dos de las manifestaciones clínicas del síndrome de Bardet-Biedl son la obesidad y la diabetes. La atractina [66] y DPPIV desempeñan funciones en la obesidad [67] y en la diabetes [22. 68, 15], respectivamente, y, dado que la especificidad por el sustrato de ambas se superpone con la de DPP8, es posible que DPP8 esté involucrada en el síndrome de Bardet-Biedl.

La DPPIV se expresa en la superficie de las células T y se trata de una molécula coestimuladora denominada CD26 [3]. Las líneas celulares negativas para CD26 presentan una actividad enzimática residual de DPPIV y las PBMC presentan una actividad no derivada de DPPIV contra los sustratos Ala-Pro [69], lo que indica la existencia de otra/s peptidasa/s con actividad de tipo DPPIV. La DPPIV-\beta muestra una actividad peptidasa similar a la DPPIV, pero se trata de una glicoproteína de superficie de membrana de 70-80 kDa [70] y por tanto es diferente de DPP8.

Se desconoce la importancia biológica de las tres variantes de corte y empalme de DPP8 que hemos descubierto. Ninguna de estas variantes da lugar a un cambio en el marco de lectura o a una terminación proteica prematura (Fig. 1). Dos de las variantes de corte y empalme contienen todos los residuos de la tríada catalítica predichos y por lo tanto producen de forma potencial proteínas con actividad peptidasa. También se han observado formas alternativas de corte y empalme del mRNA de FAP [71, 72]. Cabe la posibilidad de que se utilice la expresión de variantes de corte y empalme para regular los niveles de proteína activa. Los Northern blot de DPP8 revelaron una serie de transcritos de diferente tamaño. Los tamaños predichos de las variantes de corte y empalme de DPP8 oscilaban entre 2,6 y 3,1 kb, mientras que los grandes transcritos observados en la mayor parte de los tejidos examinados en los Northern blot medían 8,5 y 5,0 kb, respectivamente. De forma similar, DPPIV y DPP6, otros dos miembros de la familia de los genes de tipo DPPIV, muestran en Northern transcritos de RNA que son mucho mayores que el tamaño del cDNA [60, 61]. Los autores proponemos que los transcritos de mayor tamaño para mRNA de DPP8 y sus variantes de corte y empalme se encuentran dentro de la banda de 5 kb, mientras que el transcrito/s de 8,5 kb quizás contengan secuencias adicionales 5' y 3' no traducidas. Parece ser que DPP8 es igual a DPPIV en que por Northern blot presenta un patrón de expresión de mRNA ubicuo cuando está siendo regulado positivamente en células T activadas. Las similitudes entre DPP8 y DPPIV sugieren que a lo mejor DPP8, igual que DPPIV, desempeña un papel en la coestimulación y proliferación de las células T. El desarrollo de anticuerpos o inhibidores específicos para DPP8 facilitará el trabajo en esta área.

En resumen, se ha identificado y caracterizado una nueva dipeptidil aminopeptidasa humana DPP8 con similitudes estructurales y funcionales con DPPIV y FAP. Puesto que se han sugerido numerosos y diversos papeles biológicos para DPPIV, en particular en el sistema inmunitario, y los roles que desempeña FAP en el crecimiento tumoral y en las hepatopatías, será interesante investigar los papeles de este nuevo miembro de la familia de los genes de tipo DPPIV en estos sistemas. Posteriores estudios para comprender esta nueva proteína y el descubrimiento de inhibidores y sustratos fisiológicos permitirán identificar las funciones específicas de miembros concretos de esta familia de genes.

Referencias

1. Abbott CA, McCaughan GW & Gorrell MD. Two highly conserved glutamic acid residues in the predicted beta propeller domain of dipeptidyl peptidase IV are required for its enzyme activity. FEBS Letters. 1999; 458: 278-84.

2. Abbott CA, Yu DMT, McCaughan GW & Gorrell MD. Post proline peptidases having Dp IV like enzyme activity. Advances in Experimental Medicine and Biology. 2000; 477: 103-9.

3. McCaughan GW, Gorrell MD, Bishop GA, Abbott CA, Shackel NA, McGuinness PH, Levy MT, Sharland AF, Bowen DG, Yu D, Slaitini L, Church WB & Napoli J. Molecular pathogenesis of liver disease: an approach to hepatic inflammation, cirrhosis and liver transplant tolerance. Immunological Reviews. 2000; 174: 172-91.

4. Scanlan MJ, Raj BK, Calvo B, Garin-Chesa P, Sanz-Moncasi MP, Healey JH, Old LJ & Rettig WJ. Molecular cloning of fibroblast activation protein alpha, a member of the serine protease family selectively expressed in stromal fibroblasts of epithelial cancers. Proceedings of the National Academy of Sciences United States of America. 1994; 91: 5657-61.

5. Handbook of Proteolytic Enzymes. Barrett AJ, Rawlings ND & Woess JF. 1998; London: Academic Press. 1666.

6. Jacotot E, Callebaut C, Blanco J, Krust B, Neubert K, Barth A & Hovanessian AG. Dipeptidyl peptidase IV-beta, a novel form of cell-surface-expressed protein with dipeptidyl-peptidase IV activity. European Journal of Biochemistry. 1996; 239: 248-58.

7. Rawlings ND & Barrett AJ. MEROPS: the peptidase database Nucleic Acids Research. 1999; 27: 325-31.

8. Park JE, Lenter MC, Zimmermann RN, Garin-Chesa P, Old LJ & Rettig WJ. Fibroblast activation protein: A dual-specificity serine protease expressed in reactive human tumor stromal fibroblasts. Journal of Biological Chemistry. 1999; 274: 36505-12.

9. Levy MT, McCaughan GW, Abbott CA, Park JE, Cunningham AM, Muller E, Rettig WJ & Gorrell MD. Fibroblast activation protein: A cell surface dipeptidyl peptidase and gelatinase expressed by stellate cells at the tissue remodelling interface in human cirrhosis. Hepatology. 1999; 29: 1768-78.

10. De Meester I, Korom S, Van Damme J & Scharpé S. CD26, let it cut or cut it down. Immunology Today. 1999; 20: 367-75.

11. Natural substrates of dipeptidyl peptidase IV. De Meester I, Durinx C, Bal G, Proost P, Struyf S, Goossens F, Augustyns K & Scharpé S. 2000, in Cellullar Peptidases in Immune Functions and Diseases II, Langner J & Ansorge S, Editor. Kluwer: New York. p. 67-88.

12. Mentlein R. Dipeptidyl-peptidase IV (CD26): role in the inactivation of regulatory peptides. Regulatory Peptides. 1999; 85: 9-24.

13. Morrison ME, Vijayasaradhi S, Engelstein D, Albino AP & Houghton AN. A marker for neoplastic progre-
ssion of human melanocytes is a cell surface ectopeptidase. Journal of Experimental Medicine. 1993; 177: 1135-43.

14. Mueller SC, Ghersi G, Akiyama SK, Sang QXA, Howard L, Pineiro-Sanchez M, Nakahara H, Yeh Y & Chen WT. A novel protease-docking function of integrin at invadopodia. Journal of Biological Chemistry. 1999; 274: 24947-52.

15. Holst JJ & Deacon CF. Inhibition of the activity of dipeptidyl-peptidase IV as a treatment for type 2 diabetes. Diabetes. 1998; 47: 1663-70.

16. Marguet D, Baggio L, Kobayashi T, Bernard AM, Pierres M, Nielsen PF, Ribel U, Watanabe T, Drucker DJ & Wagtmann N. Enhanced insulin secretion and improved glucose tolerance in mice lacking CD26. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2000; 97: 6874-9.

17. Ohtsuki T, Tsuda H & Morimoto C. Good or evil: CD26 and HIV infection. Journal of Dermatological Science 2000; 22: 152-60.

18. Wesley UV, Albino AP, Tiwari S & Houghton AN. A role for dipeptidyl peptidase IV in suppressing the malignant phenotype of melanocytic cells. Journal of Experimental Medicine. 1999; 190: 311-22.

19. Korom S, De Meester I, Stadlbauer THW, Chandraker A, Schaub M, Sayegh MH, Belyaev A, Haemers A, Scharpé S & Kupiecweglinski JW. Inhibition of CD26/dipeptidyl peptidase IV activity in vivo prolongs cardiac allograft survival in rat recipients. Transplantation. 1997; 63: 1495-500.

20. Tanaka S, Murakami T, Horikawa H, Sugiura M, Kawashima K & Sugita T. Suppression of arthritis by the inhibitors of dipeptidyl peptidase IV. International Journal of Immunopharmacology. 1997; 19: 15-24.

21. Augustyns K, Bal G, Thonu G, Belyaev A, Zhang XM, Bollaert W, Lambeir AM, Durinx C, Goossens F & Haemers A. The unique properties of dipeptidyl-peptidase IV (DPP IV/CD26) and the therapeutic potential of DPP IV inhibitors. Current Medicinal Chemistry. 1999; 6: 311-27.

22. Hinke SA, Pospisilik JA, Demuth HU, Mannhart S, Kuhn-Wache K, Hoffmannn T, Nishimura E, Pederson RA & McIntosh CHS. Dipeptidyl peptidase IV (DPIV/CD26) degradation of glucagon - Characterization of glucagon degradation products and DPIV-resistant analogs. Journal of Biological Chemistry. 2000; 275: 3827-
34.

23. Korom S, De Meester I, Coito A, Graser E, Volk HD, Schwemmle K, Scharpe S & Kupiec-Weglinski JW. Immunomodulatory influence of CD26 dipeptidylpeptidase IV during acute and accelerated rejection. Langenbecks Archives of Surgery. 1999; 1: 241-5.

24. Tavares W, Drucker DJ & Brubaker PL. Enzymatic- and renal-dependent catabolism of the intestinotropic hormone glucagon-like peptide-2 in rats. American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 2000; 278: E134-E9.

25. David F, Bernard AM, Pierres M & Marguet D. Identification of serine 624, aspartic acid 702, and histidine 734 as the catalytic triad residues of mouse dipeptidyl-peptidase IV (CD26). A member of a novel family of nonclassical serine hydrolases. J Biol Chem. 1993; 268: 17247-52.

26. Ogata S, Misumi Y, Tsuji E, Takami N, Oda K & Ikehara Y. Identification of the active site residues in dipeptidyl peptidase IV by affinity labeling and site-directed mutagenesis. Biochemistry. 1992; 31: 2582-7.

27. Dipeptidyl peptidase IV (DPPIV/CD26): biochemistry and control of cell-surface expression. Trugnan G, Ait-Slimane T, David F, Baricault L, Berbar T, Lenoir C & Sapin C. 1997, in Cell-Surface Peptidases in Health and Disease, AJ Kenny & CM Boustead, Editor. BIOS Scientific Publishers: Oxford. p. 203-17.

28. Steeg C, Hartwig U & Fleischer B. Unchanged signaling capacity of mutant CD26/dipeptidylpeptidase IV molecules devoid of enzymatic activity. Cell Immunol. 1995; 164: 311-5.

29. Fülop V, Bocskei Z & Polgar L. Prolyl oligopeptidase - an unusual beta-propeller domain regulates proteolysis. Cell. 1998; 94: 161-70

30. Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA & Struhl K, ed. Current Protocols in Molecular Biology. 1998, John Wiley & Sons: USA.

31. Molecular cloning: a laboratory manual. Sambrook J, Fritsch EF & Maniatis T. 1989. 2nd ed., Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

32. Augustyns KJL, Lambeir AM, Borloo M, Demeester I, Vedernikova I, Vanhoof G, Hendriks D, Scharpe S & Haemers A. Pyrrolidides -synthesis and structure- activity relationship as inhibitors of dipeptidyl peptidase IV. European Journal of Medicinal Chemistry. 1997; 32: 301-9.

33. Stockel-Maschek A, Mrestani-Klaus C, Stiebitz B, Demuth HU & Neubert K. Thioxo amino acid pyrrolidides and thiazolidides: new inhibitors of proline specific peptidases. Biochimica et Biophysica Acta - Protein Structure & Molecular Enzymology. 2000; 1479: 15-31.

34. Schön E, Born I, Demuth HU, Faust J, Neubert K, Steinmetzer T, Barth A & Ansorge S. Dipeptidyl peptidase IV in the immune system. Effects of specific enzyme inhibitors on activity of dipeptidyl peptidase IV and proliferation of human lymphocytes. Biological Chemistry Hoppe Seyler. 1991; 372: 305-11.

35. Coligan JE, Kruisbeek AM, Margulies DH, Shevach EM & Strober W, eds. Current Protocols in Immunology. 1998, John Wiley & Sons: USA.

36. Fibroblast activation protein. Rettig WJ. 1998, in Handbook of Proteolytic Enzymes, AJ Barrett, ND Rawlings & JF Woessner, Editor. Academic Press: San Diego. p. 387-9.

37. McCaughan GW, Siah CL, Abbott C, Wickson J, Ballesteros M & Bishop GA. Dipeptidyl peptidase IV is down-regulated in rat hepatoma cells at the mRNA level. J Gastroenterol Hepatol. 1993; 8, 142-5.

38. Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW & Lipman DJ. Basic local alignment search tool. J Mol Bio. 1990; 215, 403-410.

\newpage

33. Callen DF, Baker E, Eyre HJ, Chernos JE, Bell JA & Sutherland GR. Reassessment of two apparent deletions of chromosome 16p to an ins(11,16) and a t(1; 16) by chromosome painting. Annales De Genetique. 1990; 33, 219-21.

39. Abbott CA, McCaughan GW, Levy, MT, Church WB & Gorrell MD. Binding to human dipeptidyl peptidase IV by adenosine deaminase and antibodies that inhibit ligand binding involves overlapping, discontinuous sites on a predicted beta propeller domain. Eur. J. Biochem. 1999; 266, 798-810.

40. McCaughan GW, Wickson JE, Creswick PF & Gorrell MD. Identification ot the bile canalicular cell surface molecule GP110 as the ectopeptidase dipeptidyl peptidase IV: an analysis by tissue distribution, purification and N-terminal amino acid sequence. Hepatology. 1990; 11, 534-44.

41. Gorrell MD, Wickson J & McCaughan GW. Expression of the rat CD26 antigen (dipeptidyl peptidase IV) on subpopulations of rat lymphocytes. Cell. Immunol. 1991; 134, 205-215.

42. Bishop GA, Rokahr KL, Napoli J & McCaughan GW. Intragraft cytokine mRNA levels in human liver allograft rejection analysed by reverse transcription and semiquantitative polymerase chain reaction amplification. Transplant Immunol. 1993; 1, 253-61.

43. Yoshimoto T, Fischl M, Orlowski RC & Walter R. Post-proline cleaving enzyme and post-proline dipeptidylpeptidase. J Biol Chem. 1978; 253, 3708-3716.

44. Fukasawa KM, Fukasawa K, Hiraoka BY & Harada M. Comparison of dipeptidyl peptidase IV prepared from pig liver and kidney. Biochim Biophys Acta. 1981; 657, 179-89.

45. Banbula A, Mak P, Bugno M, Silberring J, Dubin A, Nelson O, Travis J & Potempa J. Prolyl tripeptidyl peptidase from Porphyromonas gingivalis. A novel enzyme with possible pathological implications for the development of periodontitis. J Biol Chem. 1999; 274, 9246-9252.

46. Wolf GB, Scherberich JE, Fischer P & Schoeppe W. Isolation and characterization of dipeptidyl aminopeptidase IV from human kidney cortex. Clin Chim Acta. 1989; 179, 61-71.

47. Fox DA, Hussey RE, Fitzgerald KA, Acuto O, Poole C, Palley L, Daley JF, Schlossman SF & Reinherz EL. Ta1, a novel 105 KD human T cell activation antigen defined by a monoclonal antibody. J Immunol. 1984; 133, 1250-6.

48. Bühling F, Kunz D, Reinhold D, Ulmer AJ, Ernst M, Flad HD & Ansorge S. Expression and functional role of dipeptidyl peptidase IV (CD26) on human natural killer cells. Natural Immunity. 1994; 13, 270-9.

49. Bühling F, Junker U, Reinhold D, Neubert K, Jager L & Ansorge S. Functional role of CD26 on human B lymphocytes. Immunol Lett. 1995; 45, 47-51.

50. Flentke GR, Munoz E, Huber BT, Plaut AG, Kettner CA & Bachovchin WW. Inhibition of dipeptidyl aminopeptidase IV (DP-IV) by XaaboroPro dipeptides and use of these inhibitors to examine the role of Dp-IV in T-cell function. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991; 88, 1556-9.

51. Schön E, Jahn S, Kiessig ST, Demuth HU, Neubert K, Barth A, Von-Bähr R & Ansorge S. The role of dipeptidyl peptidase IV in human T lymphocyte activation. Inhibitors and antibodies against dipeptidyl peptidase IV suppress lymphocyte proliferation and immunoglobulin synthesis in vitro. Eur J Immunol. 1987; 17, 1821-6.

52. Schön E, Born I, Demuth HU, Faust J, Neubert K, Steinmetzer T, Barth A & Ansorge S. Dipeptidyl peptidase IV in the immune system. Effects of specific enzyme inhibitors on activity of dipeptidyl peptidase IV and proliferation of human lymphocytes. Biol Chem Hoppe Seyler. 1991; 372, 305-11.

53. Reinhold D, Hemmer B, Gran B, Born I, Faust J, Neubert K, McFarland HF, Martin R & Ansorge S. Inhibitors of dipeptidyl peptidase IV/CD26 suppress activation of human MBP-specific CD4+ T cell clones. J Neuroimmunol. 1998; 87, 203-9.

54. Kähne T, Neubert K, Faust J & Ansorge S. Early phosphorylation events induced by DPIV/CD26-specific inhibitors. Cell Immunol. 1998; 189, 60-66.

55. Korom S, De Meester I, Stadlbauer THW, Chandraker A, Schaub M, Sayegh MH, Belyaev A, Haemers A, Scharpé S & Kupiecweglinski JW. Inhibition of CD26/dipeptidyl peptidase IV activity in vivo prolongs cardiac allograft survival in rat recipients. Transplantation. 1997; 63, 1495-1500.

56. Bednarczyk JL, Carroll SM, Marin C & McIntyre BW. Triggering of the proteinase dipeptidyl peptidase IV (CD26) amplifies human T lymphocyte proliferation. J Cell . Biochem. 1991; 46, 206-18.

57. De Meester I, Vanhoof G, Hendriks D, Demuth HU, Yaron A & Scharpé S. Characterization of dipeptidyl peptidase IV (CD26) from human lymphocytes. Clin Chim Acta. 1992; 220, 23-34.

58. Goossens F, De Meester I, Vanhoof G, Hendriks D, Vriend G & Scharpé S. The purification, characterization and analysis of primary and secondary-structure of prolyl oligopeptidase from human lymphocytes. Evidence that the enzyme belongs to the alpha/beta hydrolase fold family. Eur J Biochem. 1995; 233, 432-441.

59. Walter R, Simmons WH & Yoshimoto T. Proline specific endo- and exopeptidases, Mol Cell Bioc. 1980; 30, 111-27.

60. Abbott CA, Baker E, Sutherland GR & McCaughan GW. Genomic organisation, exact localization, and tissue expression of the human CD26 (dipeptidyl peptidase IV) gene. Immunogenetics. 1994; 40, 331-338.

61. Mathew S, Scanlan MJ, Mohan Raj BK, Murty VV, Garin-Chesa P, Old LJ, Rettig WJ & Chaganti RS. The gene for fibroblast activation protein alpha (FAP), a putative cell surface-bound serine protease expressed in cancer stroma and wound healing, maps to chromosome band 2q23. Genomics. 1995; 25, 335-337.

62. Yokotani N, Doi K, Wenthold RJ & Wada K. Non-conservation of a catalytic residue in a dipeptidyl aminopeptidase IV-related protein encoded by a gene on human chromosome 7. Hum Mol Genet. 1993; 2, 1037-9.

63. Goossens FJ, Wauters JG, Vanhoof GC, Bossuyt PJ, Schatteman KA, Loens K & Scharpé S. Subregional mapping of the human lymphocyte prolyl oligopeptidase gene (PREP) to human chromosome 6q22. Cytogenet Cell Genet. 1996; 74, 99-101.

64. Campbell DA, McHale DP, Brown KA, Moynihan LM, Houseman M, Karbani G, Parry G, Janjua AH, Newton V, Al-Gazali L, Markham AF, Lench NJ & Mueller RF. A new locus for non-syndromal, autosomal recessive, sensorineural hearing loss (DFNB16) maps to human chromosome 15q21-q22. J Med Genet. 1997; 34, 1015-7.

65. Bruford EA, Riise R, Teague PW, Porter K, Thomson KL, Moore AT, Jay M, Warburg M, Schinzel A, Tommerup N, Tornqvist K, Rosenberg T, Patton M, Mansfield DC & Wright AF. Linkage mapping in 29 Bardet-Biedl syndrome families confirms loci in chromosomal regions 11q13, 15q22.3-q23, and 16q21, Genomics. 1997; 41, 93-9.

66. Duke-Cohan JS, Gu J, McLaughlin DF, Xu Y, Freeman GJ & Schlossman SF. Attractin (DPPT-L), a member of the CUB family of cell adhesion and guidance proteins, is secreted by activated human T lymphocytes and modulates immune cell interactions. Proc Natl Acad Sci USA. 1998; 95, 11336-11341.

67. Gunn TM, Miller KA, He L, Hyman RV, Davis RW, Azarani A, Schlossman SF, Duke-Cohan JS & Barsh GS. The mouse mahogany locus encodes a transmembrane form of human attractin. Nature. 1999; 398, 152-156.

68. Drucker DJ, Shi Q, Crivici A, Sumnersmith M, Tavares W, Hill M, Deforest L, Cooper S & Brubaker PL. Regulation of the biological activity of glucagon-like peptide 2 in vivo by dipeptidyl peptidase IV. Nature Biotechnol. 1997; 15, 673-677.

69. Smith RE, Reynolds CJ & Elder EA. The evolution of proteinase substrates with special reference to dipeptidylpeptidase IV. Histochem J. 1992; 24, 637-47.

70. Blanco J, Nguyen C, Callebaut C, Jacotot E, Krust B, Mazaleyrat JP, Wakselman M & Hovanessian AG. Dipeptidyl-peptidase IV-beta. Further characterization and comparison to dipeptidyl-peptidase IV activity of CD26. Eur J Biochem. 1998; 256, 369-78.

71. Niedermeyer J, Scanlan MJ, Garin-Chesa P, Daiber C, Fiebig HH, Old LJ, Rettig WJ & Schnapp A. Mouse fibroblast activation protein: molecular cloning, alternative corte y empalme and expression in the reactive stroma of epithelial cancers. Int J Cancer. 1997; 71, 383-9.

72. Goldstein LA & Chen WT. Identification of an alternatively spliced seprase mRNA that encodes a novel intracellular isoform. J Biol Chem. 2000; 275, 2554-2559.

73. Hough RB, Lengeling A, Bedian V, Lo C & Bucan M. Rump white inversion in the mouse disrupts dipeptidyl aminopeptidase-like protein 6 and causes dysregulation of Kit expression. Proc Natl Acad Sci USA. 1998; 95, 13800-13805.

<110> THE UNIVERSITY OF SYDNEY

\vskip0.400000\baselineskip

<120> DIPEPTIDIL PEPTIDASA

\vskip0.400000\baselineskip

<130> P37354

\vskip0.400000\baselineskip

<150> AU PQ 2762

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 1999-09-10

\vskip0.400000\baselineskip

<150> AU PQ 5709

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2000-02-18

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn versión 3.0

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 882

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<212> PRT

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<213> Homo Sapiens

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<400> 1

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4

5

6

7

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<210> 2

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<211> 3120

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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8

9

10

11

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<210> 3

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<211> 310

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

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12

13

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<210> 4

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<211> 1197

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

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14

15

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<210> 5

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<211> 465

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 5

16

17

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<210> 6

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<211> 1669

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 6

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18

19

20

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<210> 7

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<211> 360

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 7

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21

22

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<210> 8

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<211> 1083

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 8

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23

24

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LISTADO DE SECUENCIAS

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<110> THE UNIVERSITY OF SYDNEY

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<120> DIPEPTIDYL PEPTIDASE

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\vskip0.400000\baselineskip

<130> P37354

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\vskip0.400000\baselineskip

<150> AU PQ2762

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<151> 1999-09-10

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<150> AU PQ5709

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\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2000-02-18

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\vskip0.400000\baselineskip

<160> 8

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<170> PatentIn version 3.0

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<210> 1

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<211> 882

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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25

27

28

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<210> 2

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<211> 3120

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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30

31

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<210> 3

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<211> 310

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

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32

33

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<210> 4

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<211> 1197

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

34

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<210> 5

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<211> 465

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 5

35

36

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<210> 6

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<211> 1669

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 6

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38

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<210> 7

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<211> 360

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 7

39

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<210> 8

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<211> 1083

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 8

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41

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LISTADO DE SECUENCIAS

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<110> THE UNIVERSITY OF SYDNEY

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<120> DIPEPTIDYL PEPTIDASE

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<130> P37354

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<150> AU PQ2762

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<151> 1999-09-10

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<150> AU PQ2709

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<151> 2000-02-18

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<160> 8

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<170> PatentIn version 3.0

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<210> 1

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<211> 882

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

43

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<210> 2

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<211> 3120

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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48

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<210> 3

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<211> 310

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

50

51

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<210> 4

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<211> 1197

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

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52

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<210> 5

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<211> 465

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 5

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<210> 6

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<211> 1669

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 6

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56

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<210> 7

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<211> 360

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 7

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<210> 8

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<211> 1083

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 8

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Claims (25)

1. Un péptido formado por:

(a) una secuencia como la mostrada en el ID. de SEC. Núm.: 1;

o

(b) las secuencias aminoacídicas: His^{736}GlyTrpSerTyr-GlyGlyTyrLeu; Leu^{816}AspGluAsnValHisPheAlaHis; Glu^{847}
ArgHis-SerIleArg y Phe^{255}ValLeuGlnGluGluPhe; y que es capaz de hidrolizar un enlace peptídico en posición C-terminal respecto de la prolina en cualquiera de los siguientes compuestos:

H-Ala-Pro-pNA;

H-Gly-Pro-pNA; y

H-Arg-Pro-pNA;

o

(c) una secuencia que posee una identidad de por lo menos el 60% con la secuencia mostrada en el ID. de SEC. Núm.: 1 y que es capaz de hidrolizar un enlace peptídico en posición C-terminal respecto de la prolina en cualquiera de los siguientes compuestos:

H-Ala-Pro-pNA;

H-Gly-Pro-pNA; y

H-Arg-Pro-pNA.

2. Un péptido según la reivindicación 1(c), en el que la identidad aminoacídica es de al menos el 75%.

3. Un péptido según la reivindicación 1(c), en el que la identidad aminoacídica es de al menos del 95%.

4. Un fragmento de la secuencia mostrada en el ID. de SEC. Núm.: 1 que es capaz de hidrolizar un enlace peptídico en posición C-terminal respecto de la prolina en cualquiera de los siguientes compuestos:

H-Ala-Pro-pNA;

H-Gly-Pro-pNA; y

H-Arg-Pro-pNA.

5. Un péptido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que un residuo de asparagina del péptido no está unido a una molécula de carbohidrato.

6. Un péptido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el péptido no se expresa sobre la membrana de la superficie celular de una célula.

7. Una proteína de fusión que contiene la secuencia aminoacídica mostrada en el ID. de SEC. Núm.: 1, que es capaz de hidrolizar un enlace peptídico en posición C-terminal respecto de la prolina en cualquiera de los siguientes compuestos:

H-Ala-Pro-pNA;

H-Gly-Pro-pNA; y

H-Arg-Pro-pNA,

estando la proteína de fusión unida a otra secuencia aminoacídica.

8. una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 7 en la que la otra secuencia aminoacídica es seleccionada del grupo formado por: GST, epítopo V5 e identificador de His.

9. Un método de identificación de una molécula con capacidad para inhibir la escisión de un sustrato por un péptido de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende los siguientes pasos:

(a) la puesta en contacto de un péptido de acuerdo con la reivindicación 1 con la molécula;

(b) la puesta en contacto del péptido de acuerdo con la reivindicación 1 del paso (a) con un sustrato capaz de ser escindido por el péptido de acuerdo con la reivindicación 1, en condiciones suficientes para que se produzca la escisión del sustrato por parte del péptido de acuerdo con la reivindicación 1; y

(c) la detección del sustrato que no ha sido escindido por el péptido de acuerdo con la reivindicación 1, para identificar que la molécula tiene la facultad de inhibir la escisión del sustrato por péptido de acuerdo con la reivindicación 1.

10. Un método de identificación de una molécula capaz de inhibir de forma específica la escisión de un sustrato por un péptido de acuerdo con la reivindicación 1, método que comprende los siguientes pasos:

(a) la puesta en contacto de un péptido de acuerdo con la reivindicación 1 y otra proteasa con la molécula;

(b) la puesta en contacto del péptido de acuerdo con la reivindicación 1 y la otra proteasa del paso (a) con un sustrato capaz de ser escindido por el péptido de acuerdo con la reivindicación 1 y la otra proteasa, en condiciones suficientes para que se produzca la escisión del sustrato por parte del péptido de acuerdo con la reivindicación 1 y la otra proteasa; y

(c) la detección del sustrato que no ha sido escindido por el péptido de acuerdo con la reivindicación 1, pero sí por la otra proteasa, para identificar que la molécula tiene la facultad de inhibir de forma específica la escisión del sustrato por péptido de acuerdo con la reivindicación 1.

11. Un método de reducción o inhibición de la actividad catalítica de un péptido de acuerdo con la reivindicación 1, método que comprende el paso de puesta en contacto de un péptido de acuerdo con la reivindicación 1 con un inhibidor de la actividad catalítica de un péptido de acuerdo con la reivindicación 1.

12. Un método de escisión de un sustrato, que comprende el paso de puesta en contacto del sustrato con un péptido de acuerdo con la reivindicación 1 en condiciones suficientes para que se de la escisión del sustrato por parte del péptido de acuerdo con la reivindicación 1.

13. Un método de detección de una célula T activada, método que comprende el paso de medir el nivel de un péptido de acuerdo con la reivindicación 1 en una célula T.

14. Un método según la reivindicación 13, en el que el nivel de un péptido de acuerdo con la reivindicación 1 se detecta mediante la detección de la cantidad de RNA que codifica un péptido de acuerdo con la reivindicación 1.

15. Una molécula de ácido nucleico que:

(a) codifica una secuencia como la mostrada en el ID. de SEC. Núm.: 1; o

(b) consiste en una secuencia como la mostrada en el ID. de SEC. Núm.:2; o

(c) es capaz de hibridar con una molécula de ácido nucleico formada por la secuencia mostrada en el ID. de SEC. Núm.:2 en condiciones de astringencia, y codifica un péptido que es capaz de hidrolizar un enlace peptídico en posición C-terminal respecto de la prolina en cualquiera de los siguientes compuestos:

H-Ala-Pro-pNA;

H-Gly-Pro-pNA; y

H-Arg-Pro-pNA.

16. Una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 15(c), en la que la molécula tiene la capacidad de hibridar en condiciones de elevada astringencia.

17. Una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 15 que no contiene regiones no traducidas 5' o 3'.

18. Un fragmento de una molécula de ácido nucleico formado por la secuencia mostrada en el ID. de SEC. Núm.: 2 que codifica un péptido que tiene la capacidad de hidrolizar un enlace peptídico en posición C-terminal respecto de la prolina en cualquiera de los siguientes compuestos:

H-Ala-Pro-pNA;

H-Gly-Pro-pNA; y

H-Arg-Pro-pNA.

19. Un fragmento según la reivindicación 18 que consiste en la secuencia mostrada en cualquiera de los ID. de SEC. Núms.: 4, 6 u 8.

20. Un vector que contiene una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 15.

21. Una célula que contiene un vector según la reivindicación 20.

22. Una composición que contiene un péptido de acuerdo con la reivindicación 1.

23. Un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a un péptido de acuerdo con la reivindicación 1.

24. Un anticuerpo según la reivindicación 23 que es producido por una célula de hibridoma.

25. Una célula de hibridoma que tiene la capacidad de producir un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 24.