KR20070116932A - 뉴로트립신의 억제제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 한 화합물을 수성 완충 용액 중에서 뉴로트립신, 그의 변이체 또는 뉴로트립신의 프로테아제 도메인을 포함하는 단편 및 아그린을 포함하는 단백질 또는 펩티드, 그의 변이체 또는 아그린의 □- 또는 □-절단 부위를 포함하는 단편과 함께 배양하고 또 아그린의 절단 양을 측정하는 것을 특징으로 하는 화합물이 뉴로트립신 억제제인지 결정하는 방법에 관한 것이다. 부가적으로, 본 발명은 상기 방법에 의해 발견된 뉴로트립신 억제제, 특히 Hal1 및 Hal2 이 플루오르, 염소 또는 브롬인 화학식(1)의 화합물, 및 시냅스 결핍에 의해 유발된 질병, 예컨대 골격근 위축증, 정신분열병 및 인식장애를 치료 및/또는 예방하기 위한 상기 억제제의 용도에도 관한 것이다.
뉴로트립신, 프로테아제 도메인, 아그린, 절단 부위, 뉴로트립신 억제제

Description

뉴로트립신의 억제제{Inhibitors of neurotrypsin}
본 발명은 화합물이 뉴로트립신 억제제인지 여부를 결정하는 방법, 특히 뉴로트립신의 억제제, 이러한 억제제의 골격근 위축증 및 정신분열병의 치료 및/또는 예방을 위한 용도, 및 인식 향상제로서 용도에 관한 것이다.
세린 프로테아제는 광범위하게 연구된 보통의 촉매 메카니즘을 갖는 단백질분해 효소 군에 속한다. 세린 프로테아제는 바이러스, 세균 및 진핵생물에서 발견된다. 이들은 엑소펩티다아제, 엔도펩티다아제 및 올리고펩티다아제를 포함한다. 상이한 발생 기원을 갖는 몇가지의 펩티다아제에 대한 반응 메카니즘에서는 유사성이 존재한다. 촉매 잔기의 기하학적 배향은, 단백질 폴딩(protein folds)이 아주 상이함에도 불구하고, 상당히 유사하다. 활성 부위에 있는 세린, 히스티딘 및 아스파테이트 잔기의 촉매적 3요소(catalytic triad)는 펩티드 결합의 효과적인 가수분해에 관여한다. 세린 프로테아제의 예는 트롬빈, XIIa 인자, IXa 인자, Xa 인자, 플라스민, tPA, 트립신, 키모트립신 및 우로키나아제, 트립타아제, 엘라스타아제, 칼리크레인, 보체 C, 프로테아제 A, 세린 카르복시펩티다아제 II와 같은 추가의 단백질을 포함한다. 이들은 혈액 응고 및 식품 분해와 같은 다양한 중요 과정에 관여한다. 세린 프로테아제 억제제는 세포 과정, 예컨대 접착, 이동, 자유 라디칼 생 성 및 세포자멸사(apoptosis)를 억제하는 것으로 밝혀져 있다. 정맥으로 투여된 세린 프로테아제 억제제는 조직 손상으로부터 보호 효과를 제공한다. 소분자 억제제는 혈액학, 종양학, 천식, 염증, 신경학, 폐 의학 및 면역학에 관련된 상이한 질병 치료에 높은 가능성을 제공하는 것으로 나타났다. 적합한 세린 프로테아제 억제제는 혈전질환, 천식, 경화증, 관절염, 암종, 흑색종, 재협착, 죽종, 외상, 쇼크 및 재관류 손상 분야에서 기능이상 치료에 유용할 수 있다.
조사된 효소 뉴로트립신(WO 98/49322)은 키모트립신 패밀리에 속하며, 이들의 구성원은 거의 전부 동물에 한정된다. 뉴로트립신의 아미노산 서열은 크링글(Kringle) 도메인에 이어 4개(마우스의 경우 3개)의 스캐빈저(scavenger) 수용체 시스테인-리치 반복체(cystein-rich repeats) 및 세린 프로테아제 도메인으로 구성된 875개 아미노산의 모자이크 단백질을 규정한다(도 1, A 및 B). 뉴로트립신은 트롬빈, tPA, 트립신 및 일부 다른 효소처럼, 그의 S1 포킷(pocket)의 저부에 있는 아스파테이트 잔기를 함유하므로, 상기 결합 부위에서 염기성 아미노산에 대하여 특이성을 나타낸다. 혈액 응고 케스케이드와 예컨대 X 인자, IX 인자, 트롬빈, 조직 플라스미노겐 활성화제 및 플라스민과 같은 피브린분해 계의 프로테아제에 대한 뉴로트립신의 구조적 유사성은, 뉴로트립신이 신경계에서 프로테아제-구동 세포외 시그널링 메카니즘의 한 효소일 수 있음을 제시한다(Gschwend, T.P., et al., Molec. Cell Neruosci. 9: 207-219, 1997; Proba, K., et al., Biochim. Biophys. Acta 1396: 143-147, 1998).
이하에 나타낸 바와 같이, 뉴로트립신은 중앙 신경계(CNS)의 시냅스의 시냅 스전부(presynaptic) 신경 말단 및 신경근 접합부(NMJ)에 위치한다. 상기 시냅스는 메시지가 신경전달물질(transmitter)로 불리는 화학물질 형태로 소통되는 신경 세포(뉴론) 사이의 연결이다. 시냅스는 신호 방출 세포에 의해 형성된 시냅스전부 말단 및 신호 수용 세포의 시냅스후부(postsynaptic) 특수화로 구성된다. 시냅스전 부 말단으로부터 방출된 신경전달물질은 시냅스 틈을 통과하여 시냅스후부 특수화에서 신경전달물질 수용체에 결합된다. 신경전달물질의 결합시 수용체는 시냅스후부 세포에서 전기적 펄스 생성을 유도한다. 2개 뉴런 사이의 신호 전달은 신경 기능을 기본으로 한다. 뇌 기능은 다수의 뉴런이 정보 처리 네트워크에 특이적 어셈블리를 형성한 결과이다.
대다수의 시냅스는 중앙 신경계(CNS, 뇌)에서 발견되며, 매 시냅스는 2개의 뉴런을 연결한다. 이러한 양쪽(bilateral) 점 대 점 연결에 의하여, 모든 뉴런은 다른 수천개의 뉴런에 접속될 수 있다. 그러나, 시냅스는 또한 뉴런을 샘(gland) 또는 근육세포에 접속시킨다. 신경근 접합부(NMJ, 근육 종말판(end plate))는 신경세포를 가로무늬 근육세포에 접합시키는 시냅스이다. 뇌 외부, 뇌간 및 척수에 위치하는 시냅스는 말초신경계(PNS) 시냅스라 불린다. CNS 시냅스 및 PNS 시냅스는 많은 구조적 및 기능적 공통점을 나타내며 다수의 분자 성분(시냅스 분자)도 공유하고 있다. 따라서, 시냅스 표적 분자는 CNS 및 PNS의 시냅스 작용을 표적으로 하는데 유용할 수 있다.
근육량 및 강도의 손실로 정의되는 골격근 위축증(근육감소증)은 노령화에 따라 생기는 약함 및 기능 손상의 발병기전에서 주요 역할을 한다. 골격근 위축증 은 또한 근육 강도의 손실, 대사속도의 감소, 골밀도의 점진적 감소 및 호기성의 감소에도 주요 역할을 한다(Doherty, T.J., J. Appl. Physiol. 95: 1717-1727, 2003). 근육량의 손실은 노화에 따라서 근육의 횡단면적 감소로 나타나며, 근육 섬유 갯수 및 개별 잔류 섬유의 두께 모두가 감소한 효과의 조합에 기인한 것으로 판단되었다.
지난 수년간에 걸쳐, 근육량 감소에 관여하는 인자를 확인하고 특징화하는데 상당한 진보가 이루어져 왔다. 이들 과정에 관련된 중요한 유전자는 위축 근육에서 증가된 것으로 밝혀진 유비퀴틴 단백질 리가아제를 암호화한다. 비대 활성을 갖는 인자 중에서, 블록 위축증, 인슐린 유사 생장인자 1 (IGF-1)가 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. 골격근의 양을 제어하는 상술한 및 몇 개의 다른 조절 경로는 광범위하게 조사되었다(참조를 위하여 Glass, D. J., Nature Cell Biol. 5: 87-90, 2003 참조). 위축증을 초래하는 근육 퇴화를 제어하는 분자 메카니즘의 특징화 및 인슐린 유사 생장인자의 비대 효과에서의 중요한 진보에도 불구하고, 또 몇 개 회사가 근육량 증가를 유발할 수 있는 약물 개발에 매진함에도 불구하고, 지금까지 어떤 약물도 허가되지 않았다.
노인에서 발견되는 골격근 위축증(근육량 감소)의 형태학적 증거는 근육 섬유 개수의 현저한 감소이다. 수많은 독립적인 연구로부터 얻은 다수의 증거는 근육 섬유 단편에 신경자극은 노화에 따라 붕괴되어서 위축증을 초래하고 결국에는 탈신경 섬유의 소실을 초래함을 지지한다(Kamal, H.K., Nutrition Reviews 61: 157-167, 2003). 노인에서 발견되는 골격근 위축증의 다른 특징은 근육 위축증과 동시 에 운동신경세포(motoneuron) 수의 상당한 감소(Welle, S., Can. J. Appl. Physiol. 27: 19-41, 2002) 및 신경근 접합부의 현저한 구조적 변형(Tapia, J. C. et al., Abstract Viewer/Itinerary Planner, Washington DC: Society for Neuroscience)를 갖는 것이다. 이들 특징은 신경근 접합부의 구조 및 기능의 노화와 관련된 현저한 손상이 구조 및 기능 탈신경을 초래하는 과정에 대한 주요 원인 인자임을 나타낸다. 수 주 내에 보상성 재신경분포(reinnervation)을 수용하지 않는 탈신경 근섬유는 점진적으로 위축성으로 되어 결국 소멸된다.
정신분열병은 만성적이고 심각하며 무능하게 만드는 뇌질환이다. 전 세계 인구의 약 1%는 그 생애 동안 정신분열병을 발병한다. 정신분열병이 발병한 사람은 심각한 고통을 겪는다. 약 10%가 자살을 한다. 정신분열병은 여성 및 남성 모두를 동일 빈도로 영향을 주지만, 이 질병은 보통 20대 내지 30초 초반에 발병하는 여성에 비하여 남성의 경우 더 빨리, 보통 10대 후반 또는 20대 초반에서 발병된다. 정신분열병 환자는 다른 사람에게는 들리지 않는 내부 음성을 듣거나, 또는 다른 사람들이 자신의 마음을 읽거나, 자신의 생각을 조종하거나 또는 자신을 위협하는 것으로 믿는 것과 같은 고통스런 증상을 겪는다. 이들 증상은 이들을 공포스럽게 하고 외톨이로 만들 수 있다. 이들의 말과 행동은 혼란스럽기 때문에 다른 사람에게는 이해되기 어렵고 위협적일 수 있다. 현재 이용가능한 정신분열병 치료는 고통을 상당히 감소시키지만, 정신분열병에 걸린 환자의 약 2/3는 발병후 수년 내에 생활보조를 필요로 한다. 이들의 대다수는 직장이나 학교로 되돌아갈 수 없으며 사회적 상호작용이 비교적 적거나 거의 없기 때문에 정신분열병에 걸린 대부분의 사람들은 자신의 생활에 기인한 증상에도 계속 고통을 받는다. 5명 중 1명 이하가 완전히 회복되는 것으로 추산되고 있다. 따라서 정신분열병은 전세계적으로 가장 중요한 공중 건강 문제 중의 하나이며, 사회에 대한 비용은 수십억 달러에 이른다.
현재 정신분열병 환자의 뇌에서 가장 지속적인 신경병인적 발견은 중앙 신경계의 회질부에서 시냅스 수의 감소이며, 이는 신경망(시냅스 영역) 부피 감소에 의해 영향을 받는다. 신경 퇴화에 대한 어떠한 증거도 밝혀지지 않았다. 전형적으로, 뉴런 사이의 신경망 영역 사이의 시냅스 수의 선택적 감소에 의해 설명된 관찰로서 조직 영역 당 계산된 뉴런의 수는 약간 증가하지만, 신경 세포 세포체 수는 일정하게 유지되었다. 이 현상은 검시(post mortem) 물질에 대한 몇 개의 독립적인 연구에 의해 과거 20여년에 걸쳐 보고되었고 전두엽(prefrontal cortex)에서 가장 광범위하게 발견되었다. 이러한 관찰을 수록한 문헌은 Selemon, L. D. 및 Goldman-Rakic, P.S.에 의해 조심스럽게 검토되었다(Psychiatry 45: 17-25, 1999). McGlashan, T. H. 및 Hoffman, R.E. (Arch. Gen. Psychiatry 57: 637-648, 2000)은 정신분열병에서 "과도한 시냅스 가지치기" 가설 측면에서 필수적인 형태학적, 발생적, 전기생태학적 및 대사학적 관찰을 요약하고 "과도한 시냅스 가지치기" 또는 "발생학적으로 감소된 시냅스 연결성"은 정신분열병의 가장 관심을 끄는 병리학적 모델이라고 결론지었다. 이러한 모델을 기본으로 하여, 정신분열병은 임신 및 초기 어린이 시절 동안의 시냅스 생성의 발생학적 방해 및/또는 청년기 동안의 과도한 시냅스 가지치기의 결과로 시냅스 접속성의 상당한 감소를 초래한다. 이 모델은, 감소된 표현형 다산성에도 불구하고, 상기 장애의 현상학, 증상 상태, 발병, 신경 발생학적 결핍, 열화의 창문, 임상적 표시에서 성별차, 개시 연령에 의해 결정되는 경로 및 집단에서 정신분열병 유전형의 보존을 설명한다.
인식 향상제는 임상적 수준 및 준임상적 수준에서 인식 결핍을 방지, 개선 또는 치료하기 위한 약물이다. 이러한 약물은 알츠하이머 질병(경미한 인식 손상)으로는 진행하지 않은 노인들의 기억의 어려움을 치료하는데 효과적이다. 그러나, 이러한 약물은 알츠하이머 질병 또는 치매와 관련된 다른 질병의 확립된 증상을 갖는 환자에서 인식 작용의 개선 또는 외상후 인식 장애에서 인식 작용의 개선뿐만 아니라 노화 과정의 정상적인 특징으로 간주되는 인식 작용의 연령 관련된 손상의 개선을 위해 유리할 수 있다.
경미한 인식 손상은 노화 관련된 인식 장애에 대한 임상 연구에서 널리 지적되는 개념이다(Ritchie, K. and Touchon, J., The Lancet 355: 225-228, 2000). 이러한 인식 손상은 일반적으로 알츠하이머 질병을 발병할 가능성이 높은 것으로 판단되는 노인들의 기억 작용의 준임상적 불평을 지칭한다. 조기 치료 간섭 측면에서 치매 우려가 높은 사람의 판단은 중요한데, 이는 환자와 가족 모두에게 고충을 경감시키고, 사고 우려를 최소화하고 자율성을 연장시키고 또 치매로 이끄는 과정의 개시를 궁극적으로 예방하기 때문이다.
치매없이 인식 작용의 손상은 노화 과정의 불가피한 특징으로 간주되는 노인들에서 공통된다. 그럼에도 불구하고, 환자들이 매일 일상생활을 하는데 어려움을 갖기 때문에 임상적 중요성을 받아왔다. 치매없는 집단에서 보여진 손상의 범위는 아주 광범위하지만, 일부 임상 라벨은 정상적인 인식 범위의 말기(fail-end)를 기 재하는 것으로 제시되어 왔다. 가장 빠른 것 중의 하나는 노인성 양성 건망증이었다. 이것의 임상적 특징은 사소한 자세한 것을 기억하기 어려운 것, 최근 일과 대조적인 옛날일의 건망증, 및 기억 문제의 인식을 포함한다. 노화 관련 인식 감소는 광범위한 인식 작용(주의력, 기억력, 학습, 사고, 언어 및 시각공간적 작용)을 지칭하며, 노인들의 평균치를 참조하여 진단된다. 인식 향상제의 처방은 환자 개인이 자신의 매일의 일상생활을 영위하는 능력을 연장시키고 또 이들의 자율성을 연장시킬 것이다. 치매를 초래할 수 있는 인식 손상에 걸린 환자 개인과 적어도 일부 관련된 다른 장애는 파킨슨 질병, 다발 경화증, 중풍 및 머리 외상을 포함한다. 인식 향상제 약물의 처방은 이들 환자에서 인식 작용을 향상시킬 수 있을 것이다.
발명의 요약
본 발명은 뉴로트립신, 그의 변이체 또는 뉴로트립신의 프로테아제 도메인을 포함하는 단편 및 아그린(agrin)을 포함하는 단백질 또는 펩티드, 그의 변이체 또는 아그린의 □- 또는 □-절단 부위를 포함하는 단편을 수성 완충 용액에서 함께 배양하고, 아그린의 절단 양을 측정하는 것을 특징으로 하는 뉴로트립신의 촉매 활성을 측정하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 한 화합물을 수성 완충 용액 중에서 뉴로트립신, 그의 변이체 또는 뉴로트립신의 프로테아제 도메인을 포함하는 단편 및 아그린을 포함하는 단백질 또는 펩티드, 그의 변이체 또는 아그린의 □- 또는 □-절단 부위를 포함하는 단편과 함께 배양하고 또 아그린의 절단 양을 측정하는 것을 특징으로 하는, 한 화합물이 뉴로트립신 억제제인지 여부를 결정하는 방법에 관한 것이다.
부가적으로, 본 발명은 상기 방법에 의해 발견된 뉴로트립신의 억제제, 특히 하기 화학식(1)의 화합물 및 약학적으로 허용되는 그의 부가염에 관한 것이다:
Figure 112007077339617-PCT00001
식 중에서,
Hal1 및 Hal2 는 서로 독립적으로 플루오르, 염소 또는 브롬임.
본 발명은 특히 시냅스 결핍에 의해 유발되는 질병, 예컨대 골격근 위축증, 정신분열병 및 인식 장애를 치료 및/또는 예방하기 위한 의약으로서 상기 억제제의 용도, 및 골격근 위축증, 정신분열병 및 인식 장애를 치료 및/또는 예방하기 위한 의약을 제조하기 위한 상기 억제제의 용도에도 관한 것이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 뉴로트립신의 억제가 프로-시냅스(pro-synaptic)(시냅스-형성, 시냅스-분화, 시냅스-조직화, 시냅스-보호, 시냅스-강화) 활성을 허용한다는 사실을 기본으로 한다. 뉴로트립신 유전자는 척수의 운동신경세포(실시예 1)을 비롯한 중앙신경계의 다수의 뉴런에서 발현되며(Gschwend, T.P., et al., Molec. Cell Neurosci. 9: 207-219, 1997; Wolfer, D.P. et al., Molec. Cell. Neurosci. 18: 407-433, 2001), 또 뉴로트립신 단백질은 많은 CNS 시냅스(Molinari, F. et al., Science 298: 1779-1781, 2002) 뿐만 아니라 신경근 접합부(neuromuscular junction)에서 발견된다. 뉴로트립신은 균형이 잘 이루어진 시냅스 작용의 발생 및/또는 유지에 중요한 역할을 한다. 과도하게 많은 뉴로트립신(과발현)은 과도하게 적은 시냅스 접합과 관련된다. CNS 뉴런에서 뉴로트립신을 과발현하는 트랜스제닉 마우스는 기억 및 학습과 같은 인식 작용에 아주 중요한 2개의 뇌 구조인 대뇌피질 및 해마에서 시냅스 감소를 나타낸다. 마찬가지로, 척수 운동신경세포에서 뉴로트립신을 과발현하는 트랜스제닉 마우스는 근육 활성의 신경 제어를 매개하는 시냅스인 신경근 접합부(NMJ)의 감소를 나타낸다.
운동신경세포에서 뉴로트립신을 과발현하는 트랜스제닉 마우스의 횡격막의 신경근 접합부에서의 변형은 아그린 유전자의 표적화된 불활성화로부터 기인한 것과 유사하다. 프로테오글리칸(proteoglycan) 아그린은 아주 잘 특징화된 프로-시냅스제(시냅스-형성, 시냅스-분화, 시냅스-조직화, 시냅스-보호, 시냅스-강화)이다(Sanes, J. R. and Lichtman, J., Nature Rev. Neurosci. 2: 791-805, 2001). 이것은 약 220 kDa 질량의 코어 단백질이다. 아그린은 몇 개의 이소형태(isoforms)로 존재한다. 이들은 아주 짧은 N-말단 세포질 절편을 전달하는 타입 II 트랜스막 단백질 및 분비된 세포외 매트릭스 단백질을 암호화한다. 프로-시냅스 활성을 갖는 아그린 영역은 아그린의 C-말단 잔기, 특히 세 번째 라미닌 G 도메인에 위치한다(Bezakova, G. and Ruegg, M.A., Nature Rev. Molec. Cell Biol. 4: 295-308, 2003). 아그린은 뉴로트립신의 기질이다(실시예 2). 뉴로트립신은 2개 부위에서 아그린을 절단한다(실시예 25). 1개 부위(□ 부위로 명명)는 아르기닌 995 (R995)와 알라닌 996 (A966) 사이에 위치한다. 다른 부위(□ 부위로 명명)는 리신 1754 (K1754)와 세린 1755 (S1755) 사이에 위치한다. 아미노산 번호는 랫트(NP_786930)의 막-고정된 아그린 (스플라이스 변이체 A4B0)을 지칭한다. 그러나, 절단부위 □ 및 절단부위 □는 인간의 아그린을 비롯한 포유동물 아그린에서 잘 보존된다. 뉴로트립신에 의한 아그린 절단은 A996 내지 K1754 범위의 약 100 kDa (킬로달톤)의 단편 및 S1755 내지 C-말단 범위의 약 22 kDa의 단편을 생성한다. □ 및 □ 부위의 절단은 아그린의 N-말단 잔기로부터 아그린의 시냅스 구조화 활성을 분리한다. 아그린의 절단은 생체 내에서도 생긴다. 야생형 마우스에서, 아그린의 100-kDa 단편은 뉴로트립신의 발생적 발현이 그 최고조에 이르는 시기(실시예 3)인 생후 제1주 동안 가장 풍부하게 생기는 것으로 밝혀졌다. 아그린의 100-kDa 단편의 과다는 운동신경세포에서 뉴로트립신을 과발현하는 트랜스제닉 마우스에서 현저하게 증가되었다(실시예 4 및 5).
아그린은 NMJ (실시예 6) 및 CNS (실시예 14)에서 뉴로트립신의 천연 기질이다. 아그린을 절단함으로써, 뉴로트립신은 아그린의 프로-시냅스 활성을 길항작용한다. 트랜스제닉 마우스의 신경근 접합부에서 과잉 뉴로트립신은 3일 미만내에 앞서 확립된 신경근 접합부의 소실을 제어한다(실시예 4, 5, 6 및 7). 이들 관찰은 뉴로트립신을 시냅스-불안정화제 또는 항-시냅스제로서 적격이다.
프로-시냅스제 및 항-시냅스제의 공존은 신경계의 뉴런 순환이 고정 와이어 계에 비하여 다이나믹하다는 개념을 지지한다. 프로-시냅스 인자 및 항-시냅스 인자 사이의 균형을 이룬 매치는 항상성을 초래한다. 변형된 필요성을 충족시키기 위하여 시냅스 접합이 변해야 될 때 필요한 적합한 변화는 프로-시냅스력 및 항-시냅스력 사이의 균형을 제어된 방식으로 변동시킨다. 이러한 프로-시냅스력 및 항-시냅스력 사이의 긴밀하게 제어되는 상호작용은 조절장애(dysregulation)되기 쉬워 부적절한 시냅스 항상성 또는 작용기능적 요건에 대한 부적절한 적응을 초래한다. 조절장애의 정도가 임계치를 초과할 때 시냅스 질병이 유발될 수 있다.
뉴로트립신 활성의 약학적 전환은 유례없는 시냅스 작용의 조절 계기에 대한 유례없는 접속을 제공한다. 뉴로트립신 단백질 분해 활성의 억제는 항-시냅스 활성을 희생하여 프로-시냅스 활성을 강화하는 쪽으로 시냅스 균형을 변동시켜 시냅스의 수 및/또는 크기 및/또는 세기를 증가시킨다.
척수 운동신경세포에서 뉴로트립신을 과발현하는 트랜스제닉 마우스를 사용한 실험은 골격근 위축증(실시예 8 및 10) 및 시냅스 접합의 악화(실시예 9) 사이의 상관관계를 나타낸다. 뉴로트립신의 억제제는 과량의 뉴로트립신의 결과를 견제하여서 예컨대 노인 환자에서 골격근 위축증과 같은 시냅스 접합의 손실에 의해 유발된 골격근 위축증의 치료 및 예방을 가능하게 한다.
운동신경세포에서 뉴로트립신을 과발현하는 트랜스제닉 마우스 계통에서, 골격근의 놀라운 위축증은 주로 근육 섬유 수의 급격한 감소에 기인한 것으로 관찰된다(실시예 10). 운동신경세포에서 뉴로트립신의 과잉 생산 효과의 정량적 평가는 하기 표1에 수록한다. 운동신경세포에 의해 생성된 과잉 뉴로트립신은 뉴로트립신 과발현 양에 따라서 성체(adult) 마우스의 가자미근(soleus muscle)의 근육 섬유수를 18 내지 48% 범위로 감소시킨다. 뉴로트립신 과발현은 운동신경세포에만 한정되었기 때문에(실험상 자세한 내용은 실시예 4 참조), 이들 결과는 운동신경세포에 의해 발현된 뉴로트립신이 표적 근육 섬유 상의 신경근 접합부를 통하여 국소적으로 작용함을 나타낸다. 이러한 국소적 위축성 효과는, 촉매학적 불활성 형태의 뉴로트립신을 과발현하는 마우스의 근육이 정상 섬유 개수를 나타내기 때문에, 뉴로트립신의 단백질 분해 활성에 따라 달라진다.
운동신경세포에서 뉴로트립신을 과발현하는 마우스는 근육근 접합부의 현저하게 향상된 단편화를 나타낸다(실시예 9). 감소된 섬유 수와 조합된 단편화는 나이든 인간 및 동물의 골격근에서 관찰되는 두드러진 특징이다. 상술한 바와 같이, 신경근 접합부의 악화 및 근육 섬유의 손실은 촉매적으로 불활성 뉴로트립신의 과발현에 의해서는 밝혀지지 않는다. 이것은 근섬유의 신경분포를 감소시키고 궁극적으로는 이들의 손실을 유발하는 인자로서 운동신경세포 유도된 뉴트로트립신을 특징화한다. 신경분포 감소 활성을 갖는 물질은 신경근 접합부 및 중앙신경계에서 발생상의 시냅스 제거 단계 동안 중요한 역할을 하는 것으로 가정되어 왔다. 시냅스 감소 활성은 성체 생활사 동안에도 지속되며 시냅스전부(presynaptic) 및 시냅스후부(postsynaptic) 요소 사이에 균형을 유지하는 역할을 할 수 있다. 뉴로트립신 발현의 일시적 패턴은 발생적 시냅스 제거기간 동안 (마우스 및 랫트에서 생후 첫 2주) 최고조에 달한 다음 성체 기간 동안 그보다 낮은 수준으로 발현되는 가능성을 지지한다.
트랜스제닉(transgenic) 마우스의 운동신경세포에서 뉴로트립신 과발현은 신경근 접합부의 퇴화를 초래한다(실시예 7). 횡격막 및 가자미근을 비롯한 상이한 유형의 근육에서 신경근 접합부의 유지를 위한 뉴로트립신의 역할에 대한 전신적 분석에 의해 운동신경세포에서 뉴로트립신의 과발현이 신경근 접합부의 크기를 감소시킨다는 것을 밝혀내었다. 뉴로트립신의 시냅스 퇴화 효과의 결과로서, 시냅스후부 특수화없이 및/또는 구조적으로 또 기능적으로 감소된 시냅스후부 특수화를 갖는 운동 신경은 앞의 NMJ의 부위를 넘어서 생장하기 시작한다. 근육 섬유 표면 상에서 생장하는 신경은 시냅스후부 막에서 2차 접힘(folding)의 부재로부터 결론지을 수 있는 바와 같이 전자현미경 조사시 미성숙한 것으로 나타나는 소형 전위(ectopic) 시냅스를 확립한다.
트랜스제닉 마우스의 운동신경세포에서 뉴로트립신 과발현은 프로테오글리칸 아그린의 절단을 초래한다(실시예 5). 그 결과, 아그린의 C-말단 잔기가 NMJ로부터 사라진다(실시예 6). 아그린의 NMJ-보존 및 NMJ-증진 활성을 갖는 아그린 영역은 아그린의 C-말단 잔기, 특히 세번째 라미닌 G 도메인에 위치한다(Bezakova, G., Nature Reviews Molecular Cell Biology 4: 295-308, 2003). 따라서, 아그린의 C-말단 도메인을 제거하면 소위 분배인자로부터 보호되지 않는 NMJ를 남기고, 상기 NMJ는 시간이 경과함에 따라서 쇠퇴되어 사라진다. Thy-1 프로모터가 뉴로트립신 트랜스진의 발현을 개시하려고 할 때(출생후 2-5일) 운동신경세포에서 뉴로트립신의 상향조절은 수일 내에 NMJ로부터 아그린의 소실을 초래한다(실시예 6). 아그린의 소실 직후, 시냅스후부 아세틸콜린 수용체가 마찬가지로 사라진다(실시예 7). 요컨대, 이들 관찰은 이러한 일련의 일들이 운동신경세포에서 뉴로트립신의 상향조절에서부터 시작됨을 보여준다. 과도한 뉴로트립신은 NMJ에서 아그린을 절단하여서 NMJ로부터 아그린의 C-말단 잔기를 제거한다. C-말단 잔기는 아그린의 NMJ-보호 및 NMJ-증진 능력의 활성 부위를 함유하기 때문에, NMJ는 분배인자로부터 보호되지 않아서 퇴화된다.
운동신경세포에서 선택적으로 뉴로트립신을 과발현하는 마우스의 골격근에서 신경 섬유 수의 현저한 감소 관찰은 뉴로트립신이 보통 탈신경에 이어 위축증을 초래하는 종판(end-plate) 악화 및 궁극적으로 탈신경된 근섬유 상실과 관련되어 있음을 보여준다. 이들 관찰은 나이로 인해 골격근 위축증에 걸린 인간 및 동물의 근육 및 신경근 접합부에서 행해진 관찰에 따른 것이다. 이 상황에서, 나이에 따른 근섬유 상실은 다수 인자의 수렴적 작용으로 인하여 생기며, 뉴로트립신의 제어성 및 미묘한 부분적 억제는 종판 악화, 탈신경 및 근섬유 상실 과정을 방해할 수 있다. 따라서, 뉴로트립신의 억제는 나이에 따른 근섬유 탈신경, 근섬유 상실 및 골격근 위축증에 대하여 유효한 효과를 가질 것으로 기대된다.
골격근 위축증은 근육 강도의 실질적 손실을 수반하며 노화에 따라 진행되는 유약함 및 기능적 손상의 발병기전에 중요한 역할을 한다. 다리의 약함은 의자에서 일어나거나 침대에서 일어날 때 어려움, 보행 및 다른 움직임의 느린 속도 및 균형을 유지하기 어려워서 넘어지거나 상해를 초래하는 것과 같은 다수의 기능적 손상을 포함한다. 골격근 섬유 상실은, 근육이 생겨서 근육에 의한 속도가 강도를 발생할 수 있는 절대적 강도에, 음성적 효과를 갖는다.
노화는 대사율의 점진적 감소와 관련되며, 이는 더위 및 추위에 대한 내성 감소 뿐만 아니라 비만 가능성 증가를 비롯한 생리학적 예후를 갖는다. 골격근은 약 40%의 무지방(fat free) 신체 질량을 포함하고 체내 대사에 중요한 항상성 역할을 한다. 따라서, 노화에 따른 골격근 질량의 감소는 대사율 감소에 주요 원인이다. 점진적 근육 손실을 방지함으로써, 뉴로트립신의 억제는 이러한 대사 및 생리적 예후에 대항하는 작용을 한다.
노화에 따른 골격근 질량 및 강도의 점진적 상실은 노화에 따라 관찰되는 골밀도의 점진적 감소에 대한 주요 원인으로 인식되어 왔다. 근육 활동에 의해 뼈에 가해지는 힘은 뼈 형성을 자극하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 근육 수축에 의해 생성된 힘은 뼈 질의 중요한 결정원인이다. 말초 뉴로트립신 활성의 억제에 의한 근육 섬유 보호는 골격근 질에 대한 나쁜 영향을 방지하고 또 골다공증의 진행을 간접적으로 대항한다.
뉴로트립신 억제의 유효한 효과는 암, AIDS 및 패혈증을 비롯하여 근육쇠약을 수반하는 수많은 임상적 증상에서 생기는 골격근 위축증에 대해서는 예상할 수 있다.
뉴로트립신은 중앙신경계(CNS)에서 항-시냅스 작용을 또한 갖는다. 뉴로트립신 mRNA는 CNS의 회색질의 뉴런에 의해 발현되며(Gschwend, T.P., et al., Molec. Cell Neurosci. 9: 207-219, 1997) 또 뉴로트립신 단백질은 많은 뇌 영역 중의 시냅스가 풍부한 지역에서 풍부하다(Molinari, F. et al., Science 298: 1779-1781, 2002). 뉴로트립신 단백질의 특히 고농도는 대뇌 피질, 해마 및 편도의 시냅스가 풍부한 지역에서 발견된다. 그러나, 시냅스가 풍부한 다른 지역은 뉴로트립신의 풍부한 발현을 나타낸다. 더 높은 배율에서, 뉴로트립신 단백질은 시냅스전부 말단의 막, 특히 시냅스 뒷쪽의 막 영역에서 발견된다(Molinari, F. et al., Science 298: 1779-1781, 2002). 뉴로트립신에 대한 가장 강력한 면역염색은 시냅스전부 말단의 시냅스 활성 대역에 걸쳐 발견된다. 경우에 따라, 뉴로트립신 면역반응성은 시냅스전부 말단의 소포(vesicle)에서도 관찰된다. 그러나, 시냅스전부 소포의 대부분은 뉴로트립신 면역반응성을 갖지 않음에 주목해야 한다. 뉴로트립신의 시냅스 편재화에 대한 독립적인 증거는 생화학적 방법, 즉 시냅토좀(synaptosome)의 분석에 의해 얻는다. 시냅스전부 활성 대역에서의 막에서 뉴로트립신의 면역세포 화학적 편재화는 인간 및 마우스에서 동일하다. 즉, 상기 결과는 뉴로트립신이 시냅스전부 말단, 특히 시냅스전부 활성 대역에 있는 시냅스 틈 뒷쪽의 시냅스전부 막에 위치함을 나타낸다.
시냅스, 특히 시냅스전부 활성 대역에서의 편재화에 의해, 뉴로트립신은 시냅스 구조 및 작용을 제어하기 위한 전략적 위치에 위치한다. 시냅스 구조 및 작용의 조절제로서 뉴로트립신의 역할, 특히 CNS에서 항-시냅스제로서의 뉴로트립신의 작용은 CNS 뉴런에서 뉴로트립신을 과발현하는 트랜스제닉 마우스를 사용한 실험에 의해 밝혀진다(실시예 11). CNS 뉴런에 의해 생산된 뉴로트립신의 과도한 양은 중앙신경계에서 시냅스의 수 및 크기를 현저히 감소시킨다. 구조적 변화에 대한 증거는 형태학적 및 전기생리학적 방법에 의해 밝혀졌다.
시냅스 영역에서 시냅스 수를 세면 영역 당 시냅스 감소를 나타낸다(실시예 12). 염료 충전된 가지돌기를 따른 가지돌기가시의 조사는 뉴로트립신 과발현 마우스에서 척추의 크기 및 수 감소를 나타낸다(실시예 13). 이들 결과는 서로 상호합의되는데, 이는 다수의 시냅스가 가지돌기가시에서 끝나기 때문이다. 따라서 더 적은 시냅스 및 더 적은 가지돌기가시는 동일 현상에 대한 2개의 정보를 나타낸다. 통합해보면, 이들 관찰은 뉴로트립신의 항-시냅스 작용을 분명히 나타낸다.
또한 CNS에서, 뉴로트립신은 아그린의 절단을 매개한다(실시예 14 및 15). 프로테오글리칸 아그린은 신경근 접합부(Sanes, J.R. and Lichtman, J., Nat. Rev. Neurosci. 2: 791-805, 2001) 및 중앙신경계의 시냅스(Smith, M.A. and Hilgenberg, L.G., Neuroreport 13: 1485-1495, 2002; Kroger, S. and Schroder, J.E., News Physiol.Sci. 17: 207-212, 2002)에 존재한다. 야생형 마우스의 CNS 균질물에서, 아그린의 100-kDa 단편은 뉴로트립신의 발생적 발현이 그 최고조에 달하는 시기인 생후 첫 주 동안 가장 풍부하게 발견됨이 밝혀졌다(실시예 14). 아그린의 100-kDa 단편의 과다는 CNS 뉴런에서 뉴로트립신을 과발현하는 트랜스제닉 마우스에서 현저하게 증가하였다(실시예 15). 활성부위의 세린을 알라닌으로 교환함으로써 불활성화된 뉴로트립신의 존재하에서 아그린의 절단은 생기지 않는다. 따라서, 뉴로트립신의 단백질분해 활성은 아그린의 절단 및 CNS에서 아그린의 100-kDa 단편 생성을 매개한다. 이들 실험에 사용된 아그린의 형태는 막-고정된 형태이다. 아그린의 N-말단 연결된 형태는 주로 중앙신경계에서 발견되며 CNS에서 시냅스 분화를 제어하는 것으로 보고되었다(Bose, C.M. et al., J. Neurosci. 20: 9086-9095, 2000).
요컨대, 뉴로트립신은 NMJ에서 뿐만 아니라 CNS에서도 항-시냅스 작용을 갖는다. 너무 많은 뉴로트립신(과발현)은 기억 및 학습과 같은 기억 작용에 아주 중요한 2개의 뇌 구조인 대뇌 피질 및 해마에서 너무 적은 시냅스 접속과 관련이 있다. 시냅스-구조화 프로테오글리칸 아그린은 CNS에서 뉴로트립신의 생리학적 기질이다. 아그린을 절단함으로써, 뉴로트립신은 아그린의 시냅스전부 활성을 방해한다.
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CNS에서 프로-시냅스제 아그린 및 항-시냅스제 뉴로트립신의 공존 및 상호작용은 신경계의 뉴런 순환이 고정-와이어드(fixed-wired) 계라기 보다 다이나믹 계이라는 개념을 지지한다. 프로-시냅스 및 항-시냅스 인자 사이의 균형을 이룬 매칭에 의해 유지된다. 적응성 변화가 요구되는 경우, 예컨대 기억을 저장하기 위해 회로 변경이 필요한 경우, 프로-시냅스력 및 항-시냅스력 사이의 균형이 제어되는 방식으로 변동한다. 회로 변화를 달성하면, 프로-시냅스력 및 항-시냅스력 사이의 균형이 회복된다.
프로-시냅스력 및 항-시냅스력 사이의 예민하고 긴밀하게 제어되는 상호작용 은 조절장애(dysregulation)되는 경향이 있어 부적절한 시냅스 항상성 또는 작용 요건에 대한 부적절한 적응을 초래한다. 조절장애의 정도가 임계치를 초과할 때 시냅스 질병이 생길 수 있다.
뉴로트립신 활성의 약학적 전환은 시냅스 작용의 조절 수단에 대한 전례없는 접근을 제공한다. 뉴로트립신의 단백질분해 활성을 억제하는 것은 더 긴 수명을 초래하므로, 아그린의 농도를 증가시킨다. 뉴로트립신 및 아그린 사이의 이러한 연결로 인하여, 뉴로트립신 억제에 의해 유도된 감소된 항-시냅스 활성은 아그린의 프로-시냅스 활성을 증가시킨다. 따라서, 이러한 균형은 프로-시냅스 활성 향상으로 이동하여서 시냅스 수, 크기 및 세기의 증가를 초래한다.
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뉴로트립신의 항-시냅스 활성을 감소시키고 그에 의해 항-시냅스 활성을 희생하여 프로-시냅스 활성을 향상시키는 것에 의한 시냅스 전환 개념은 방해된 인식 뇌 작용 영역에서 광범위한 적용을 제공한다. 특히, 뉴로트립신의 억제는 시냅스 형성 및 기존의 시냅스의 크기 및 세기 증가를 필요로 하는 질병 및 준임상적 상황에서 유효하다.
뉴로트립신의 억제는 정신분열병의 치료에도 효과적이다. 시냅스에서 과도한 뉴로트립신은 시냅스 가지치기(synaptic pruning)를 작동시켜 정신분열병 환자의 뇌에서 발견되는 시냅스 표현형에 따른 시냅스 표현형을 생성한다. 이러한 실험 관찰은 뉴로트립신을 시냅스 가지치기를 작동시키는 인자 중의 하나로서 권한을 준다. 다중 가지치기 증진 인자의 합류 작용으로 인하여 과도한 시냅스 가지치기가 생기는 상황하에서, 뉴로트립신의 제어되는 기민하고 부분적인 억제는 시냅스 가지치기 구동을 감소시킨다. 이것은 정신분열병 시냅스 표현형으로부터 회복을 허용하며 정신분열병 증상의 경감을 초래한다. 뉴로트립신 과발현 마우스의 CNS에서 시냅스 수의 감소는 뉴로트립신의 억제가 시냅스 가지치기 정도를 적게 하여 시냅스 수 증가 및 뉴런 접합성 및 소통의 향상을 초래한다. 뉴로트립신의 효소 작용을 억제하는 본 발명에 따른 화합물은 정신분열병에서 시냅스 변환 및 정상적 시냅스 구조 및 작용을 재확립하는데 유용하므로, 정신분열병 에피소드를 중지 또는 단축시키고 새로운 에피소드로부터 보호한다.
뉴로트립신의 억제는 약한 인식 손상 및 인식 작용이 감소된 기타 임상적 및 준임상적 상태에서 인식 향상을 지지한다. 약한 인식 손상 뿐만 아니라 인식 작용이 손상된 기타 임상적 및 준임상적 상태는 몇 개의 CNS 영역에서 대뇌 조직 위축증에 대한 증거와 관련된 것으로 밝혀졌다. 뉴로트립신 과발현 마우스의 CNS에서 시냅스 수의 감소는, 뉴로트립신의 억제가 시냅스 수 증가 및 뉴런 접합성 및 소통의 향상을 초래함을 나타낸다. 뉴로트립신의 효소 작용을 억제하는 본 발명에 따른 화합물은 따라서 시냅스 수 감소 또는 시냅스 작용 감소를 포함하는 모든 임상적 및 준임상적 장애에서 시냅스 변환으로 전환 및 정상 시냅스 구조 및 작용의 재확립에 유용하다. 이렇게 함으로써, 뉴로트립신의 약학적 억제는 이질적 기원의 인식 작용이 감소된 상이한 상태에서 인식 작용을 향상시킬 수 있다.
이러한 사실을 기초로 하여, 본 발명은 시냅스 결핍에 의해 유발된 질병, 예컨대 골격근 위축증, 정신분열병 및 인식장애를 치료 및/또는 예방하기 위한 상기 및 하기한 바와 같은 화학식(1)의 뉴로트립신 억제제의 용도에 관한 것이다. 치료해야할 골격근 위축증은 특히 근육감소증, 즉 노화에 따른 골격근 위축증, 골다공증을 수반하는 골격근 위축증, 및 암, AIDS 및 패혈증과 같은 심각한 질병에 수반되는 근육소모에 기인한 골격근 위축증 및/또는 심각한 손상 또는 심각한 질병으로 인하여 움직이지 않거나 및/또는 침대에 누워 있은 결과로 인한 골격근 위축증이다. 치료할 정신분열병은 만성 정신분열병, 만성 정신분열 장애, 비특이적 장애, 다양한 증상의 급성 및 만성 정신분열병을 포함한 정신분열병 및 정신분열병 유사 질병의 전체 분야에서의 질병, 예컨대 심각한, 비완화성 "크라에펠리닉(kraepelinic)" 정신분열병 또는 정신분열병 유사 장애의 DSM-III-R-원형, 간헐적(episodic) 정신분열장애, 망상 정신분열병 유사 장애, 정신분열병 유사 인격 장애, 예컨대 약한 대증의 정신분열병 유사 인격장애, 분열병 인격장애, 정신분열병 또는 정신분열병 유사 장애의 잠재적 형태 및 비-유기성 정신병이다. 또한 본 명세서에 기재된 바와 같은 뉴로트립신 억제제는 예컨대 뇌 성능을 향상시키기 위해 또 학습 및 기억 작용을 완화시키기 위한 인식향상제로서 사용될 수 있다. 치료해야 할 인식 결핍은 예컨대 알츠하이머 질병의 가능한 초기 단계에서 약한 인식 손상, 노인에서 치매없이 인식 작용의 손상 및 알츠하이머 질병, 파킨슨 질병, 다발성 경화증, 중풍 및 머리 손상 환자에서 인식 작용의 손상이다.
마찬가지로 본 발명은 골격근 위축증, 정신분열병 및 인식 장애와 같은 시냅스 결핍에 의해 유발된 질병을 치료 및/또는 예방하기 위한 약물을 제조하기 위한 화학식(1)의 억제제의 용도에 관한 것이다. 또한 본 발명은 화학식(1)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 상기 질병에 대하여 유효량으로 그러한 치료를 필요로 하는 온혈동물에게 투여하는 것을 포함하는, 시냅스 결핍에 의해 유발된 질병, 예컨대 골격근 위축증, 정신분열병 및 인식 장애와 같은 시냅스 결핍에 의해 유발된 질병을 치료 및/또는 예방하는 방법에 관한 것이다. 화학식(1)의 화합물은 그대로 또는 약학적 조성물 형태로 그러한 치료를 필요로 하는 인간을 비롯한 온혈 동물에게 상기 질병에 대한 예방적으로 또는 치료적으로 유효량을 투여할 수 있다. 약 70 kg 체중의 개인의 경우, 매일 투여량은 약 0.05 g 내지 약 5 g, 바람직하게는 약 0.25 g 내지 약 1.5 g의 본 발명의 화합물이다.
뉴로트립신은 프롤린-리치 염기성 도메인(PB), 크링글 도메인(KR), 세 개(마우스 뉴로트립신, mNT) 또는 네 개(인간 뉴로트립신, hNT)의 스캐빈저 수용체 시스테인-리치 도메인(SRCR1, SRCR2, SRCR3 및 SRCR4) 및 프로테아제 도메인(PROT)로 구성된다(도 1). 효소원(zymogen) 활성화(ZA) 부위는 뉴로트립신의 프로테아제 도메인의 N-말단에 있는 절단 부위를 나타낸다. ZA 부위에 있는 단백질 분해 절단 부위는 뉴로트립신 단백질을 촉매적으로 불활성 형태에서 촉매적으로 활성인 형태로 전환한다. 이러한 절단에 의해, 프로테아제 도메인을 포함하는 약 55 kDa의 단편이 마우스 뉴로트립신의 경우에 생성된다. 인간 뉴로트립신의 경우, 생성된 단편은 각각 67 kDa 및 30 kDa 분자량을 갖는다.
인간 뉴로트립신의 생화학적 분석 및 뉴로트립신 억제제의 탐색은 mg 내지 g 범위의 양의 단백질을 필요로 한다. 몇 개의 진핵생물 발현 계를 마우스 골수종 세포에서 안정한 발현을 비롯한 뉴로트립신의 최적 생산 및 분비, 곤충 세포에서 배큘로바이러스 매개된 발현 및 인간 배아 신장(HEK) 세포에서 일시적 발현, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 일시적 발현 및 피치아 파스토리스(Picchia pastoris)에서 안정한 발현에 맞는지 시험하였다. 이들 계는 상청액에서 단백질 오염양을 줄이고 또 대량 생산을 도모하기 위하여 무혈청 상태에 맞게 변형될 수 있는 이점을 갖는다. 뉴로트립신의 발현은 이들 발현 계 전부에서 달성될 수 있다. 그러나, 뉴로트립신의 가장 효과적인 생산 및 분비는 실시예 16 및 17에 기재된 바와 같이 골수종 세포에서 얻을 수 있다.
진핵생물 세포에서 발현은 다르게는 다양한 진핵생물 발현 벡터(시중에서 구입하거나 자가 제조)를 이용하여 달성할 수 있다. 마찬가지로, HEK293T 및 HEK293-EBNA 세포, COS 세포, CHO 세포, HeLa 세포, H9 세포, Jurkat 세포, NIH3T3 세포, C127 세포, CV1 세포 또는 Sf 세포를 비롯한 다수의 진핵생물 세포주가 사용될 수 있다.
뉴로트립신이 생산은 뉴로트립신의 내인성 발현을 나타내는 포유동물 세포주를 기본으로 한다. 내인성 인간 뉴로트립신의 발현은 인간 비만세포주 HMC-1 (Poorafshar, M. and Hellman, L., Eur J. Biochem. 261: 244-250, 1999)에서 RNA 수준으로 관찰되었다. HMC-1 세포주는 적절하게 가공되어서 활성 인간 뉴로트립신에 대한 천연 산출 공급원을 나타낸다. 이들 세포는 현탁 배양액에서 생장할 수 있고 또 인간 뉴로트립신을 구성적으로 발현한다. HMC-1 세포로부터 발현된 단백질은 웨스턴 브럿 실험에서 크링글(Kringle) 도메인에 대하여 생성된 특이적 폴리클로날 항체에 의해 97 kDa 밴드로서 검출될 수 있다.
뉴로트립신을 정제하기 위하여 표준 단백질 정제 과정이 적용될 수 있다(실시예 18 및 19). 바람직하게는, 헤파린 칼럼 상, 이어 소수성 상호작용 칼럼 및 고정화된 금속-킬레이트 크로마토그래피 칼럼 상에서의 친화성 정제를 이용한다. 용출된 단백질은 모노 S 칼럼 상의 이온 교환 크로마토그래피에 의해 더욱 정제된다. 실험 요건에 따라서, 이온 교환(DEAE 또는 Mono Q) 칼럼 상에서의 크로마토그래피 수법 또는 겔 여과에 대한 부가적 또는 대체적 크로마토그래피 수법이 뉴로트립신 정제에 유용하다.
본 발명은 뉴로트립신, 그의 변이체 또는 뉴로트립신의 프로테아제 도메인을 포함하는 단편, 및 아그린(agrin)을 포함하는 단백질 또는 펩티드, 그의 변이체 또는 아그린의 절단 부위 □ 또는 절단 부위 □ (실시예 20 및 21)을 포함하는 단편을 함께 수성 완충 용액에서 배양하고 아그린의 절단 양을 측정(실시예 24)하는 것을 특징으로 하는 뉴로트립신의 촉매적 활성을 측정하는 방법에 관한 것이다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 아그린을 포함하는 단백질 또는 펩티드, 그의 변이체 또는 단편"은 인간 또는 기타 포유동물 또는 조류 아그린, 이러한 아그린과 1 이상, 예컨대 2 또는 3개의 다른 펩티드 또는 단백질, 특히 마커 단백질, 예컨대 녹색 형광 단백질(GFP), 향상된 녹색 형광 단백질(EGFP) 또는 8 x 히스티딘가 같은 숏 마커 펩티드와의 융합 단백질, 1 이상, 예컨대 2, 3 또는 4개의 아미노산이 결실되거나 또는 다른 아미노산으로 치환된 아그린 변이체, 상기 정의된 바와 같은 아그린 변이체의 융합 단백질, 또는 그 자체 또는 마커 펩티드 또는 단백질에 융합된 형태의 아그린의 6 이상, 특히 8 이상의 아미노산, 예컨대 아그린의 8 내지 20개 또는 400 내지 600개 아미노산을 포함하는 아그린 단편을 의미하며, 상기 아그린 변이체 또는 아그린 단편은 절단부위 □, 절단부위 □ 또는 양쪽 절단부위를 보유하며, 특히 상기 아그린 단편은 이하에 정의한 바와 같은 절단부위 □ 및/또는 절단부위 □의 콘센서스 서열을 포함한다. 이러한 "아그린을 포함하는 단백질 또는 펩티드, 그의 변이체 또는 단편"은 예컨대 이후에 기재된 바와 같이 분광학적 검출을 위한 비-펩티드성 마커를 더 함유할 수 있다.
특히, 뉴로트립신의 촉매적 활성을 측정하기 위한 방법은 전장(full length) 인간 또는 다른 포유동물 또는 조류 뉴로트립신 또는 뉴로트립신의 프로테아제 도메인, 및 전장 아그린 또는 그의 단편, 예컨대 막 결합된 아그린의 유전자조작된 변이체, 예컨대 서열번호 9의 아그린-EGFP 또는 서열번호 12의 C-말단 아그린 단편, 아그린-C45의 사용에 관한 것이다.
뉴로트립신의 촉매적 활성을 측정하기 위한 특히 바람직한 반응 조건은 Ca2 + 를 포함하는 pH 7 내지 pH 8의 완충 용액, 예컨대 10 mM MOPS, pH 7.5의 완충 용액, 또는 100-200 mM NaCl, 1-20 mM CaCl2, 특히 2-5 mM CaCl2 및 경우에 따라 0.5% 이하의 폴리에틸렌 글리콜, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 6000을 포함하는 50-100 mM 트리스-HCl, 20℃ 내지 40℃의 반응 온도, 예컨대 25℃ 근처의 반응 온도 및 1 내지 48시간, 예컨대 2 내지 16시간, 예컨대 약 3시간의 반응 시간이다. 뉴로트립신은 3시간 내에 약 80%의 기질 분해를 초래하는 농도로 사용된다. 뉴로트립신의 바람직한 농도는 0.1 내지 10 nM, 예컨대 약 1 nM이며 또 아그린의 농도는 뉴로트립신 농도의 10배 내지 5000배의 농도, 예컨대 1000배 농도이다.
아그린 유도 기질의 길이는 전장 아그린에서부터 뉴로트립신에 대한 1 이상의 절단 부위를 포함하는 소형 펩티드로 다양할 수 있다. 뉴로트립신은 2개의 분명한 발생적으로 보존되는 부위(실시예 25)에서 아그린을 절단한다. 제1 절단 부위(절단부위 □)를 포함하는 콘센서스 아미노산 서열은 ....P-P/A-I/V-E-R-A-S/T-C-Y....이며, 절단은 R995 내지 A996 잔기 사이에서 생긴다. 제2 절단부위(절단 부위 □)를 포함하는 콘센서스 아미노산 서열은 ....G/A-L/I/T-I/V-E-K-S-V/A-G....이며, 절단은 K1754 내지 S1755 잔기 사이에서 생긴다.
상기 분석은 기질 단백질 또는 펩티드로부터 단백질 또는 펩티드의 방출을 측정한다. 절단부위 □ 또는 □이 N-말단이 아미노산 서열을 함유하는 펩티드를 펩티드의 C-말단에 공유결합되는 발색성(chromogenic) 또는 형광성(fluorogenic) 기질과 함께 사용하면, 방출되는 발색성 또는 형광성 기질을 측정한다. 절단부위 □ 또는 □ 에 걸쳐 있는 숏 (short)펩티드 기질은 형광 켄칭법(fluorescence quenching method)(Le Bonniec, B.F. et al., Biochemistry 35: 7114-7122, 1996)에 의해 뉴로트립신의 단백질분해 활성을 측정하기 위해 사용될 수 있다.
절단부위 □ 또는 □를 함유하는 단백질 기질의 절단 생성물의 검출은 뉴로트립신의 단백질 분해 활성에 의해(실시예 22 및 23) 또는 형광 태그, 발색성 태그 또는 기타 태그를 아그린 또는 아그린 단편의 1개 단부 또는 다른 단부에 커플링하는 것에 의해 생성된 1개 또는 다른 단편에 대한 특정 항체를 사용하여 실시한다. 절단 생성물을 검출하기 위하여 단백질 또는 펩티드 및 이들의 절단 생성물의 검출 방법을 적용할 수 있다. 예컨대, 전장 아그린 및 아그린의 대형 단편(약 10 kDa 보다 큰)의 절단은 SDS-PAGE에 이은 웨스턴 블러팅 또는 형광적으로 또는 다르게 태깅된 단백질을 사용하여 겔에서 초기 기질의 희생하여 소형 단편의 출현으로 직접적으로 가시화하는 것에 의해 검출된다. 아그린의 소형 단편(약 10 kDa 보다 작은)은 플라스틱 표면 또는 비이드에 결합된 다음 항체에 의한 특수한 인식에 의해 또는 형광 또는 다른 검출가능한 화합물에 의해 검출될 수 있는 단편의 가용화에 의해 절단 가시화될 수 있다(Patel, D. et al., Bio Techniques 31: 1194-1203, 2001).
절단부위 □에서 뉴로트립신에 의한 아그린 분해를 연구하기 위한 1개 아그린 유래 기질은 아그린의 트랜스막 형태를 기본으로 하는 유전자조작된 아그린-EGFP이다. 이러한 분자의 가용성 분자는 트랜스막 부분을 인간의 칼시테닌-1 및 8 x 히스티딘 태그의 분비 시그널 펩티드 서열로 치환하는 것에 의해 생성된다. 이러한 단백질은 금속-치환성 크로마토그래피를 이용하여 세포 배양 상청액으로부터 정제될 수 있다. 절단부위 □를 제거하기 위하여, LG3 도메인 및 □-부위를 함유하는 EGF4 도메인과 LG3 도메인을 연결하는 루프는 숏 링커(실시예 20 참조)에 의해 연 결된 EGFP 또는 다른 단백질 도메인에 의해 교체된다. 뉴로트립신 활성 분석을 위해 유용한 작업 농도는 낮은 나노몰 내지 마이크로몰, 예컨대 1 nM 내지 10 □M이다. 이 단백질 기질 및 그의 분해 산물은 절단부위 □ (실시예 22)에서 절단에 의해 생성된 아그린의 C-말단 절단 생성물을 검출하는 항체를 사용한 웨스턴 블럿 분석법에 의해 또는 N-말단 폴리-히스티딘 태그를 통하여 단백질을 결합하고 적합한 항체를 통하여(실시예 22) C-말단 단편의 방출을 모니터링하는 ELISA 분석법에 의해 측정될 수 있다.
뉴로트립신의 단백질분해 활성을 모니터링하기 위한 다른 아그린 유도된 기질은 아그린의 절단 부위 □를 포함하는 약 45 kDa의 C-말단 아그린 단편으로 구성된다. 이것은 EGF4 및 LG3 도메인 사이에 절단부위 □를 함유하는 아그린의 LG2-EGF4와 LG3 도메인으로 구성된다. 세포 배양물에서 분비된 형태의 단백질을 생성하기 위해, 인간의 칼신테닌-1 분비 시그널 펩티드를 N-말단에 융합시킨 다음 정제 및 Ni-NTA 플레이트 결합을 용이하게 하기 위해 8 x 히스티틴 태그를 하였다. 검출 및 추가의 정제를 위하여, C-말단 스트렙태그 II를 부가할 수 있다. 이 기질(실시예 21)은 저 나노몰 내지 마이크로몰 농도, 예컨대 1nM 내지 10 □M로 뉴로트립신 활성 측정에 적합하다. 뉴로트립신 활성은 절단되지 않은 기질 및 절단 산물을 쿠마씨 블루 또는 Sypro Ruby와 같은 단백질 염료로 염색에 의해, 또는 Strep Tactin (IBA, Gottingen)를 사용한 절단 생성물의 C 말단을 검출하는 웨스턴 블럿에 의해 또는 LG3 도메인(실시예 23 참조)을 검출하는 적합한 항체에 의해 모니터링될 수 있다. 적합한 염료 또는 다른 시그널 생성 단백질에 의해 라벨링된 C-말단 EGFP 또 는 SNAP-태그 (코발리스)를 함유하는 다른 구조물은 뉴로트립신에 의한 절단시 형광 방출을 검출하는 플레이트 시험에서 높은 처리량 분석에 사용되거나, 단백질 기질의 N-말단 부분을 Ni-NTA 플레이트 또는 Ni-NTA 비이드(예컨대 Petel, D., Bio Techniques 31: 1194-1203, 2001)에 결합시키는 것에 의해 사용될 수 있다.
발색성 단백질분해성 기질은 전형적으로 3 내지 5개 천연 또는 인공 아미노산으로 구성된 천연 또는 인공 펩티드를 함유한다. 이들은 아미노펩티다아제에 의한 바람직하지 않은 분해를 감소시키기 위해 N-말단 보호될 수 있다. 이들의 C-말단에서 이들은 아미드 결합의 절단시 발색성 기 또는 형광성 기가 방출되도록 변형된다. 보호기 제거는 이탈기의 유형에 따라 다르며 광의 UV- 내지 가시 영역까지 다양할 수 있다. 다른 것은 형광 시그널을 생성한다. 대부분의 일반적으로 사용되는 기는 405 nm 파장의 광을 흡수하는 p-니트로아닐린(pNA)(Nall, T.A. et al., J. Biol. Chem. 279: 48535-48542, 2004) 및 342 nm 여기 파장 및 440 nm의 방출 파장을 갖는 형광성 7-아미노-4-메틸쿠마린(AMC)(Niyomrattanakit, P. et al., J. Virol., 78: 13708-13716, 2004)이다. 뉴로트립신 활성을 검출하기 위하여, 짧은 트리펩티드 IER-pNA가 25 내지 37℃, 분석 완충액 (150 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 0.1% PEG 6000, 20 mM MOPS, pH 7.5)중에서 20-50 □M 농도로 사용될 수 있다. 1-5 nM 농도에서 뉴로트립신에 의한 분해시, 410 nm에서 신호 세기의 증가는 분광광도계로 추적될 수 있다.
FRET 기질은, 고 처리량 스크리닝(HTS)에 적응될 수 있는 균질하고 민감한 분석법을 제공하기 때문에, 단백질분해성 분석법에 널리 사용된다. 이 방법은 고처리량 분석법 셋업에서 경쟁적 뉴로트립신 억제제에 대한 유기 화합물을 스크리닝하는 라이브러리에 특히 유용하다. FRET 분석법에서, 펩티드 기질은 2개의 형광단, 즉 형광 공여체(오르토-아미노벤조산, "Abz") 및 켄칭 수용체(에틸렌-디아민-2,4-디니트로페닐, "ED-DNP")를 사용하여 합성한다. 이들 2개 기 사이의 거리는 광 여기시 공여체(Abz) 형광 에너지가 형광 공명 에너지 전달(FERT)로 공지된 광 방출 없이 생기는 양자 메카니칼 현상을 통하여 수용체(ED-DNP)에 의해 충분히 소광되도록 선택되었다. 프로테아제에 의한 기질 펩티드의 분해시, 형광단은 켄칭 기로부터 분리되고, 공여체의 전체 형광 일드(yield)를 회복한다. 7-100배의 형광 증가는 단백질 분해율과 선형적으로 관련된다(Le Bonniec, B.F. et al., Biochemistry 35: 7114-7122, 1996).
뉴로트립신 활성을 검출하기에 유용한 1개 아그린-계 FRET 기질은 아그린의 뉴로트립신 인식 부위 □를 함유하는 아미노산 서열 Abz-PIERASCY-ED-DNP를 갖는 노나-펩티드이다(Jerini AG, 독일 베를린). 추정 절단 부위는 기질의 아미노산 4(R) 내지 5(A) 사이에 위치한다. 25 내지 37℃의 분석 완충액(150 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 0.1% PEG 6000, 20 mM MOPS, pH 7.5)중 1-40 □M 내지 1-10 nM 뉴로트립신 농도로 펩티드 절단시, 활성은 분광광도계로 320 nm 여기 파장에서 시그널 세기 및 430 nm 방출 파장에서의 시그널 세기 증가에 의해 분광광도계적으로 검출할 수 있다.
다른 FRET 기질은 2개 형광 단백질, 시안-형광 단백질(CFP) 및 향상된 황색-형광 단백질(EYFP)를 기본으로 한다. 이들 2개 단백질 사이에 뉴로트립신 인식 서열 □ (PERASCY)를 함유하는 16개 아미노산 링커 및 2개의 4 아미노산 스페이서(1개는 뉴로트립신 인식 서열의 하류측에 또 나머지 하나는 상류측에)를 도입한다(링커 서열: GAGSPIERASCYGSST). 다르게는, 절단부위 □ 주변의 상응하는 아미노산 서열도 사용될 수 있다. 뉴로트립신에 의한 민감성 링커 서열의 절단은 2개의 형광단을 분리하고 에너지 전달의 손실을 초래한다. 데이터 수집은 25 내지 37℃의 분석 완충액(150 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 0.1% PEG 6000, 20 mM MOPS, pH 7.5)에서 1- 10 nM 뉴로트립신 및 0.1-1 □M 기질을 사용하여 실시한다. 따라서, 기질의 가수분해는 공여체의 형광 세기(Em. 485 nm)의 증가 및 동시에 400-450 nm에서 여기 후 수용체의 감소하는 형광(Em 528 nm)을 측정함으로써 평가할 수 있다(Pollock, B.A. et al., Trends in Cell Biol. 9: 57-60, 1999).
본 발명은 화합물을 뉴로트립신, 특히 인간 뉴로트립신, 그의 변이체 또는 프로테아제 도메인을 포함하는 단편과 함께, 아그린을 포함하는 단백질 또는 펩티드, 그의 변이체 또는 아그린의 절단부위 □ 또는 절단부위 □를 포함하는 단편을 수성 완충 용액중에서 배양하고 아그린의 절단 양을 측정하는 것을 특징으로 하는 화합물이 뉴로트립신 억제제인지 여부를 측정하는 방법에 관한 것이다.
특히, 한 화합물이 뉴로트립신 억제제인지 여부를 측정하는 방법은 전장 인간 뉴로트립신 또는 인간 뉴로트립신의 프로테아제 도메인, 및 전장 아그린 또는 그의 단편, 예컨대 막 결합된 아그린의 유전자조작된 변이체, 예컨대 서열번호 9의 아그린-EGFP 또는 예컨대 C-말단 아그린 단편, 서열번호 12의 아그린-C45의 사용에 관한 것이다.
뉴로트립신의 억제제는 뉴로트립신의 단백질분해 활성에 대한 분석법(실시예 24) 및 후보 화합물의 활성 감소 효과에 대한 시험(실시예 26 및 27)으로 확인된다. 뉴로트립신의 단백질분해 활성을 측정하기 위하여, 정제된 뉴로트립신(실시예 18 및 19) 및 정제된 아그린, 또는 1 이상의 절단부위를 함유하는 아그린의 정제 단편(실시예 20 및 21)을 적합한 조건하에서 시험할 화합물과 함께 배양한다. 배양 기간의 말기에, 뉴로트립신의 단백질분해 활성에 의해 생성된 절단 생성물을 측정하였다. 가능성있는 뉴로트립신 억제제를 함유하는 반응에서 생성된 절단 생성물의 양을 유기 화합물을 부가하지 않는 대조 반응과 비교함으로써, 화합물의 억제 효과를 측정하였다(실시예 27). 뉴로트립신의 억제제로서 발견된 화합물의 억제 활성의 투여량 의존성은 실시예 28에 기재된 바와 같이 측정하였다. 뉴로트립신의 억제제로서 밝혀진 화합물의 특이성은 실시예 29에 기재된 바와 같이 다른 세린 프로테아제 상에서 억제 활성에 대해 시험함으로써 조사하였다.
한 화합물이 뉴로트립신 억제제인지 여부를 결정하기 위한 특히 바람직한 반응조건은 Ca2 + 이온을 포함하는 pH 7 부근의 완충 용액, 100-200 mM NaCl, 5-20 mM CaCl2, 20 mM MOPS, pH 7.5 및 경우에 따라 0.5% 폴리에틸렌 글리콜, 반응온도 20℃ 내지 40℃, 예컨대 25℃, 및 반응 시간 1 내지 48시간, 예컨대 3시간이다. 바람 직한 뉴로트립신 농도는 0.1 내지 10 nM, 예컨대 1 nM이고, 뉴로트립신의 농도의 10배 내지 5000배 농도, 예컨대 1000배 농도의 아그린이다. 시험할 화합물은 증가되는 농도, 바람직하게는 0.001 내지 500 □M 농도로 부가된다. DMSO는 시험할 화합물의 용해도를 증가시키기 위해 30% 까지 부가될 수 있다.
본 발명은 뉴로트립신, 그의 변이체 또는 뉴로트립신의 프로테아제 도메인을 포함하는 단편 및 아그린을 포함하는 단백질 또는 펩티드, 그의 변이체 또는 아그린의 절단부위 □ 또는 절단부위 □에 대한 서열을 포함하는 단편, 또는 아그린의 절단부위 □ 또는 절단부위 □의 서열과 상동인 서열을 포함하는 다른 단백질을 수성 완충 용액 중에서 함께 배양하고 절단 생성물의 양을 HTS에 적합한 과정으로 측정하는 방식으로, 뉴로트립신이 활성을 검출하는 방법 및 고처리량 스크리닝 시스템(HTS)에서 소분자 유기 화합물의 뉴로트립신에 대한 억제 효과를 측정하는 방법에 관한 것이다.
특히, 뉴로트립신의 촉매 활성을 측정하기 위한 방법에 관해 상기 기재한 모든 방법은 HTS 리드아웃(readout)을 위한 적합한 방법을 이용하여 멀티플레이트 분석법 또는 도트 블러트에 이용될 수 있다.
절단부위 □ 또는 절단부위 □와 함께 C-말단 발색성 또는 형광성 이탈기를 함유하는 소형 펩티드 기질은 적합한 파장에서 형광 또는 흡수의 증가를 측정함으로써 멀티플레이트 판독기 상에서 용이하게 판독될 수 있다. 이 방법은 단백질의 일 부분을 웰의 표면에 고정시키고 적합한 파장에서 웰의 상청액에서의 형광 또는 흡수 또는 효소활성의 생성을 측정함으로써 N-말단 또는 C-말단 친화성 태그, 예컨 대 폴리-히스티딘 태그 또는 Streptag II 또는 단백질 태그, 및 C-말단 또는 N-말단 융합된 시그널 부여 단백질 또는 단백질 도메인, 예컨대 형광 단백질, 또는 발색단(chromophore) 또는 형광단(fluorophore)으로 라벨링될 수 있는 단백질 또는 발색성 또는 형광성 반응을 촉진하는 □-갈락토시다아제 등과 같은 효소를 갖는 단백질 기질에 적용될 수 있다. HTS에서 뉴로트립신 활성시 절단 생성물의 생성은 뉴로트립신 절단에 적합한 단백질 기질에 의해 코팅된 웰의 상청액에서 절단 생성물의 양 또는시그널 생성 효소 또는 기에 결합된 적합한 항체를 갖는 비절단 기질의 잔류량을 검출하는 것에 의해 ELISA 적용으로 모니터링될 수 있다(Guitierrez, O.A. et al., Anal. Biochem. 307: 18-24, 20020).
본 발명은 HPLC(Betageri, R. et al., J. Biochem. Biophys. Methods 27: 191-197, 1993), FPLC, 질량 분광계(Mathur, S. et al., J. Biomol. Screen. 8: 136-148, 2003), SELDI (Cyphergen) 또는 기타 관련된 적용과 같은 방법에 의해 상술한 종류의 소형 펩티드 기질 또는 단백질 기질의 절단 생성물의 HTS 유사 검출에 적합한 기타 비-플레이트 분석법에 관한 것이다.
부가적으로, 본 발명은 본 발명에 의해 밝혀진 뉴로트립신의 억제제, 특히 하기 화학식(1)의 화합물, 및 약학적으로 허용되는 그의 부가염에 관한 것이다:
Figure 112007077339617-PCT00004
(1)
식 중에서,
Hal1 및 Hal2 는 서로 독립적으로 플루오르, 염소 또는 브롬이고, 특히 브롬임. Hal1 및 Hal2 의 하나가 브롬이고 다른 것은 염소 또는 플루오르인 화학식(1)의 화합물 및 그의 약학적으로 허용되는 부가 염이 바람직하다. 특히 바람직한 것은 Hal1 및 Hal2 이 브롬인 화화학식(1)의 화합물의 약학적으로 허용되는 부가염이다.
이러한 약학적으로 허용되는 염은 예컨대 유기 또는 무기산에 의해 형성된다. 적합한 무기산은 예컨대 염화수소산과 같은 할로겐산, 황산 또는 인산이다. 적합한 유기산은 예컨대 카르복시산, 포스폰산, 술폰산 또는 술팜산, 예컨대 아세트산, 프로피온산, 옥탄산, 데칸산, 도데칸산, 글리콜산, 젖산, 푸마르산, 숙신산, 아디프산, 피멜산, 수베르산, 아젤라산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 아미노산, 예컨대 글루탐산 또는 아스파탐산, 말레산, 히드록시말레산, 메틸말레산, 시클로헥산카르복시산, 아다만탄카르복시산, 벤조산, 살리실산, 4-아미노살리실산, 프탈산, 페닐아세트산, 만델산, 신남산, 메탄- 또는 에탄-술폰산, 2-히드록시에탄술폰산, 에탄-1,2-디술폰산, 벤젠술폰산, 2-나프탈렌술폰산, 1,5-나프탈렌 디술폰산, 2-, 3- 또는 4-메틸벤젠술폰산, 메틸황산, 에틸황산, 도데실황산, N-시클로헥실술팜산, N-메틸- , N-에틸- 또는 N-프로필-술팜산, 또는 기타 유기 양성자산, 예컨대 아스코르브산이다.
단리 또는 정제 목적을 위해, 약학적으로 허용되지 않는 염, 예컨대 피크레이트(picrate) 또는 퍼클로레이트를 사용할 수 있다. 치료 용도를 위해서는 오직 약학적으로 허용가능한 염 또는 유리 화합물이 사용되며(적합한 경우 약학적 제제 형태로) 또 이들은 바람직하다.
화학식(1)의 화합물은 당해 분야에 공지된 방법, 예컨대 하기 화학식(2)의 아민 또는 그의 전구체(이때, 아미딘 작용기는 보호된 형태이거나 또는 아미딘 작용기로 용이하게 전환되는 작용기로 존재)를 하기 화학식(3)의 알데히드와 축합하고 또 축합반응 후 선택적 보호기를 절단하거나 또는 작용기를 아미딘 작용기로 전환하는 것에 의해 제조한다:
Figure 112007077339617-PCT00005
Figure 112007077339617-PCT00006
특히, 본 발명은 상기 기재한 바와 같은 화학식(1)의 화합물을 포함하는 약학적 조성물 및 의약으로서 화학식(1)의 화합물의 용도에도 관한 것이다.
본 발명은 화학식(1)의 화합물을 활성성분으로 포함하고 또 언급한 질병 치료에 특히 사용될 수 있는 약학적 조성물에 관한 것이다. 온혈 동물, 특히 인간에 대한 코, 구강, 직장 또는 경구 투여와 같은 소화관내 투여 및 정맥내, 근육내 또는 피하 투여와 같은 비소화관 투여용 조성물이 바람직하다. 상기 조성물은 활성성분 단독 또는 바람직하게는 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 활성성분의 투여량은 처리할 질병 및 종, 연령, 체중 및 개별 상태, 개별 약물동태학 데이터 및 투여 형태에 따라서 달라진다.
약학적 조성물은 약 1% 내지 약 95% 활성성분을 포함하고 또 예컨대 피복되거나 피복되지 않은 정제, 앰플, 바이얼, 좌약 또는 캅셀; 또는 연고, 크림, 페이스트, 포옴, 팅크제, 드롭, 스프레이, 분산액 등이다. 그 예는 약 0.05 g 내지 약 1.0 g 활성 성분을 함유하는 캅셀이다. 본 발명의 약학적 조성물은 공지 방식으로, 예컨대 통상의 혼합, 과립화, 피복, 용해 또는 냉동건조 과정에 의해 제조된다.
활성성분의 용액의 사용이 바람직하고 또 활성성분 단독 또는 담체와 함께 포함하는 냉동건조된 조성물의 경우 현탁액 또는 분산액, 특히 등장 수용액, 분산액 또는 현탁액을 사용하기 전에 제조할 수 있다. 약학적 조성물은 멸균될 수 있고 및/또는 부형제, 예컨대 보존제, 안정화제, 습윤제 및/또는 유화제, 용해제, 삼투압을 조절하기 위한 염 및/또는 완충액을 포함할 수 있으며 공지 방법, 예컨대 통상적인 용해 및 냉동건조 방법에 의해 제조할 수 있다. 상기 용액 또는 현탁액은 점도향상제, 전형적으로 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐피롤리돈 또는 젤라틴 또는 용해화제, 예컨대 Tween 80□ (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노-올레에이트)를 포함할 수 있다.
오일 중 현탁액은 오일 성분으로서 주사 목적에 통상적인 식물유, 합성유 또는 반합성유를 포함한다.
적합한 담체는 특히 충전제, 예컨대 당, 예컨대 락토오스, 사카로오스, 만니톨 또는 소르비톨, 셀룰로오스 제제, 및/또는 칼슘 포스페이트, 예컨대 트리칼슘 포스페이트 또는 칼슘 수소 포스페이트, 및 결합제, 예컨대 녹말, 예컨대 옥수수 녹말, 밀 녹말, 쌀 녹말 또는 감자 녹말, 메틸셀룰로오스, 히드록시프로필 메틸셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 및/또는 폴리비닐피롤리돈, 및/또는 필요한 경우, 붕해제, 예컨대 상술한 녹말, 및 카르복시메틸 녹말, 가교 폴리비닐피롤리돈, 알긴산 또는 그의 염, 예컨대 나트륨 알기네이트이다. 부가적인 부형제는 특히 유동 조절제 및 윤활제, 예컨대 규산, 활석, 스테아르산 또는 그의 염, 예컨대 마그네슘 또는 칼슘 스테아레이트, 및/또는 폴리에틸렌 글리콜 또는 그의 유도 체이다.
정제 코어는 적합한, 경우에 따라 당해 분야에 공지된 장내 코팅을 제공받을 수 있다.
경구 투여용 약학적 조성물은 젤라틴으로 구성된 경질 캅셀 및 젤라틴 및 글리세롤 또는 소르비톨과 같은 가소제로 구성된 연질의 밀봉 캅셀을 포함한다. 직장 투여용 약학적 조성물은 예컨대 활성 성분 및 좌약 기제의 조합물로 구성된 조약이다. 적합한 좌약 기제는 예컨대 천연 또는 합성 트리글리세리드, 파라핀 탄화수소, 폴리에틸렌 글리콜 또는 고급 알칸올이다.
도 1은 뉴로트립신의 도메인 구조를 도시한다.
(A) hNt: 인간의 뉴로트립신.
(B) mNt: 마우스 뉴로트립신.
뉴로트립신은 프롤린 리치(proline-rich) 염기성 도메인(PB), 크링글 도메인(KR), 3개(mNt) 또는 4개(hNt) 스캐빈저 수용체 시스테인 리치 도메인(SRCR1, SRCR2, SRCR3 및 SRCR4) 및 프로테아제 도메인(PROT)으로 구성된다.
도 2는 아그린의 뉴로트립신-매개된 절단을 도시한다: 아그린 및 뉴로트립신으로 공동형질감염된(cotransfected) HEK293 세포로부터 얻은 아그린의 웨스턴 블럿 분석.
세미-콘플루언트(semi-confluent) HEK293 세포를 pcDNA3.1-뉴로트립신 또는 pcDNA3.1-아그린 또는 이들 모두로 일시적으로 형질감염시켰다. 샘플을 SDS-PAGE로 분리하였다. 막을 아그린의 C-말단 잔기에 대한 폴리클로날 항-아그린 항체와 함께 배양한 다음 2차 퍼옥시다아제-커플링된 항체와 배양하였다.
(레인 1, Ag) 아그린으로 단일 형질감염된 세포의 세제 추출물
(레인 2, Ag+hNt) 아그린 및 뉴로트립신으로 이중 형질감염된 세포의 세제 추출물. 아그린은 상당히 감소되었다.
(레인 3, Ag+hNt) 아그린 및 뉴로트립신으로 이중 형질감염된 세포의 배양 배지. 100-kDa 밴드는 아그린의 C-말단 잔기에 대한 항-아그린 항체에 의해 검출하였다.
(레인 4, Ag) 아그린으로 단일 형질감염된 세포의 배양 배지.
모든 조건하에서 뉴로트립신의 생산은 블럿(blot)을 항-뉴로트립신 항체로 다시 프로빙(reprobing)한 후 확인되었다. 배양 배지의 분석으로 이중 형질감염된 세포의 세포 추출물로부터 손실되었던 아그린 면역활성은 상층 배지로 방출되었음이 밝혀졌다. 아그린 및 촉매적으로 불활성인 뉴로트립신으로 형질감염된 HEK293 세포의 상층 배지에서는 아무런 신호가 검출되지 않았다.
도 3은 생체내 아그린 절단의 일시적 패턴이 뉴로트립신 발현의 일시적 패턴과 일치함을 도시한다.
상이한 연령의 마우스의 척수의 균질물을 SDS-PAGE 및 웨스턴 블럿 분석 처리시킨 다음 특정 항체 SZ 177 대 뉴로트립신 및 R132 대 아그린의 C-말단 100-kDa 단편을 사용하여 뉴로트립신 및 아그린의 C-말단 100-kDa 단편에 대해 프로빙하였다. □-액틴은 상이한 샘플에서 조직 균질물 동량에 대한 대조군으로 조사되었다.
도 4는 운동신경에서 뉴로트립신의 형질감염 과발현이 아그린의 절단 증가를 초래함을 도시한다.
척수 추출물의 웨스턴 블럿은 인간(hNt) 및 마우스(mNt) 뉴로트립신에 대한 항체 뿐만 아니라 아그린의 C-말단 100-kDa 단편에 대한 항체를 사용하여 조사하였다. 결과는 뉴로트립신을 과발현하는 마우스에서 아그린의 C-말단 100-kDa 단편의 발생 증가를 나타내었다.
도 5는 뉴로트립신이 신경근 접합부(NMJ)로부터 아그린을 제거함을 도시한다. 마우스의 횡격막의 NMJ는 생후 0일(P0), 4일(P4) 및 8일(P8)에 아그린으로 면역염색되었다. 운동신경세포에서 뉴로트립신을 과발현하는 형질감염된 마우스에서, 아그린은 과발현 개시한지 수시간 내지 수일내에 NMJ로부터 사라진다. P4: 전이 상태. NMJ로부터 아그린 일부 손실. 화살표는 개인의 잘 형성된 NMJ를 지적한다. 아스테리크(*)는 부분적으로 분산된 NMJ를 나타낸다. P8: NMJ로부터 아그린의 거의 완전한 손실. 화살표는 개인의 잘 형성된 NMJ를 지적한다. 아스테리크(*)는 부분적으로 분산된 NMJ를 나타낸다.
도 6은 NMJ로부터 아그린의 뉴로트립신 의존적 제거가 시냅스후부(postsynaptic) 장치의 분배에 의해 달성됨을 도시한다.
도 7에서와 동일한 마우스의 횡격막의 NMJ는 형광적으로 라벨링된 □-분가로톡신(Bungarotoxin)(□-Btx)을 갖는 아세틸콜린 수용체로 염색하였다. 아세틸콜린 수용체는 과발현 개시한지 수시간 내지 수일내에 사라진다. P4: 전이 상태. NMJ로부터 아그린 일부 손실. 화살표는 개인의 잘 형성된 NMJ를 지적한다. 아스테리 크(*)는 부분적으로 분산된 NMJ를 나타낸다. P8: NMJ로부터 아그린의 거의 완전한 손실. 화살표는 개인의 잘 형성된 NMJ를 지적한다. 아스테리크(*)는 부분적으로 분산된 NMJ를 나타낸다.
도 7은 Nt-과발현 마우스의 가자미근(soleus muscle)에서 NMJ의 단편화를 도시한다.
(A-C) 야생형 마우스의 NMJ의 □-분가로톡신(□-Btx) 염색은 전형적인 프레첼(Pretzel)과 유사한 구조를 나타낸다.
(D-F) Nt-과발현 마우스의 NMJ의 □-Btx 염색은 시냅스후부 장치의 현저한 단편화를 도시한다.
(G-I) 촉매적으로 불활성 형태의 Nt(뉴로트립신 Ser711Ala)를 과발현하는 형질감염된 마우스의 NMJ는 변경되지 않음을 도시한다.
도 8은 야생형 마우스 및 뉴로트립신 과발현 마우스의 가자미근을 통한 단면을 도시한다.
(A) 야생형 마우스
(B) 뉴로트립신 과발현 마우스.
야생형 마우스에 비하여 Nt-과발현 마우스의 근육은 근육 섬유량이 적었다. (A) 및 (B)에서 화살표는 단일 근육 섬유를 지적한다.
도 9는 해마의 CA1 영역의 방사층의 신경망에서 조직 부피 당 시냅스 개수의 정량화를 도시한다.
모든 실험 동물에서, 조직 부피당 시냅스 수는 해마의 CA1 영역의 방사층 중 의 동일 위치에서 취한 전자현미경 부위로부터 결정하였다.
wt: 야생형;
CMV-Cre: CMV 프로모터의 제어하에서 Cre 리콤비나아제(recombinase)를 발현하는 트랜스제닉 주 ;
491(불활성 Nt): 전사 중지 절편을 함유하는 불활성 트랜스진(transgene)을 갖는 트랜스제닉 주 491;
494(불활성 Nt): 전사 중지 절편을 함유하는 불활성 트랜스진(transgene)을 갖는 트랜스제닉 주 494;
DTG(Nt491/cre): 상기 주 491로부터 유도된 이중트랜스제닉 마우스, 이때 불활성 뉴로트립신 트랜스진은 Cre 리콤비나아제에서 크로싱(crossing)함으로써 활성화되었다;
DTG(Nt494/cre): 상기 주 494로부터 유도된 이중 트랜스제닉 마우스, 이때 불활성 뉴로트립신 트랜스진은 Cre 리콤비나아제에서 크로싱(crossing)함으로써 활성화되었다;
**, p < 0.01.
도 10은 CA1 피라미드 뉴런의 2차 가지돌기 상에서 척추를 도시한다.
야생형 마우스의 CA1 피라미드 뉴런의 2차 가지돌기 상에서 척추(A 및 B) 및 뉴로트립신을 과발현하는 이중트랜스제닉 마우스(C 및 D). CA1 피라미드 세포는 전기생물학적 시험관 내 연구 동안 바오사이틴(biocytin)에 의해 이온영동적으로 충전되며 애비딘-비오틴-퍼옥시다아제 조직화학을 이용하여 가시화된다. 야생형 마우 스의 가지돌기는 길고 잘 개발된 척추(대형 화살)를 가질 수 있다; 또한 다수의 짧은 그루터기 형상의 척추(소형 화살머리)도 또한 발견되었다. 뉴로트립신을 과발현하는 마우스의 가지돌기(리터메이트)는 짧은 그루터기 모양 척추(소형 화살머리)에 의해 지배되며; 길고 잘 개발된 척추(대형 화살표)는 아주 드물었다. 전체 척추 밀도 (가지돌기 길이당 척축의 수)는 뉴로트립신 과발현 마우스(C 및 D)에서 현저히 낮았다.
도 11은 정제된 전장(full-length) 인간 뉴로트립신을 도시한다.
SDS-PAGE에 이은 은 염색(A) 및 웨스턴 블럿(B)은 비-환원성 조건하에서 약 75 kDa에 상응하는 위치에서 이동하는 전장 인간 뉴로트립신(화살표로 표시)의 단일 밴드를 나타내었다. 면역검출(B)은 항-뉴로트립신 항체를 사용하여 실시하였다. 표준 분자량(kDa)은 좌측 여백에 나타낸다.
도 12는 정제된 아그린-EGFP를 도시한다.
은-염색된 SDS 겔(A) 및 웨스턴 블럿으로 도시되고 아그린(B)의 C-말단에 대해 생성된 항체에 의해 검출된 정제되고 유전자조작처리된(engineered) 아그린-EGFP(화살표로 표시)을 도시. 표준 분자량(kDa)는 좌측 여백에 나타낸다. EGFP는 절단부위 □만을 함유하지만 절단부위 □를 함유하지 않는 작제물에서 플레이스홀더(placeholder)로서만 사용된다.
도 13은 정제된 아그린-C45 단편을 도시한다.
(A) 은 염색된 SDS-PAGE 겔은 50 킬로달톤 미만으로 이동하는 정제된 아그린-C45 단편(화살표로 표시)을 도시한다. 번호는 정밀 및 단백질 표준(BIORAD)의 분 자량을 나타낸다.
(B) 웨스턴 블럿은 C-말단 스트렙 태그를 검출하기 위한 스트렙 탁틴(Strep Tactin)을 사용하여 정제된 아그린-C45 단편(화살표로 표시)을 검출한다. 번호는 정밀 및 단백질 표준(BIORAD)의 분자량을 나타낸다.
도 14는 아그린-EGFP를 기질로 사용한 뉴로트립신 활성의 분석을 도시한다.
절단부위 □ 상에서 정제된 뉴로트립신의 활성을 시험하기 위하여, 절단부위 □ (아그린-EGFP)만을 함유하는 기질을 단독으로(-) 또 뉴로트립신과 함께(+) 배양한 다음 SDS-PAGE 처리시키고, 이어 아그린의 C-말단 절단 단편에 대한 항체를 사용하여 웨스턴 블럿팅시켰다(실시예 22 참조). 레인 1은 대조군으로 뉴로트립신 처리를 갖지 않는 아그린-EGFP(화살표 표시된 Ag-EGFP로 표시)를 도시한다. 레인 2는 아그린-EGFP(화살표 표시된 Ag-EGFP로 표시) 및 뉴로트립신 활성에 의해 생성된 약 150 kDa의 C-말단 단편(화살표 표시된 Ag-CF로 나타냄)을 도시한다. 분자량 마커는 kDa(킬로 달톤)으로 나타낸다.
도 15는 기질로서 아그린-C45를 사용하는 뉴로트립신 활성 분석을 도시한다.
절단부위 □ 상에서 정제된 뉴로트립신의 활성을 시험하기 위하여, 절단부위 □ (아그린-C45)만을 함유하는 기질을 단독으로(-) 또 뉴로트립신과 함께(+) 배양한 다음 SDS-PAGE 처리시켰다.
(A) 은 염색된 SDS-PAGE 겔은 뉴로트립신없이(-) 3시간 동안 분석 완충액에서 배양된 250 ng 아그린-C45 및 뉴로트립신(+)을 부가하여 3시간 동안 분석 완충액에서 배양된 250 ng 아그린-C45를 나타낸다. 정밀 플러스 단백질 표준(BIORAD)는 좌측에 나타내고, 수자는 분자량(kDa)을 나타낸다. 아그린-C45 (화살표로 나타냄)는 50 kDa 미만에서 볼 수 있다. 절단 산물 아그린-C45는 20 내지 25 kDa (화살표로 나타냄) 사이에서 발견된다. Ag-C45-NF: 아그린-C45의 N-말단 절단 단편; Ag-C45-CF: 아그린-C45의 C-말단 절단 단편.
(B) (A)에서와 같은 샘플의 웨스턴 블럿, 이때 절단되지 않은 아그린-C45 및 아그린-C45의 절단된 C-말단 단편은 스트렙 탁틴(IBA GmhH)를 사용하여 이들의 C-말단 스트렙-태그(Strep-tag)를 통하여 검출된다. Ag-C45-CF: 아그린-C45(화살표로 나타냄)의 C-말단 절단 단편.
도 16은 아그린 기질 및 C-말단 산물의 항체 검출에 의해 뉴로트립신 억제제에 대한 웨스턴 블럿 기제 스크리닝 분석법을 도시한다.
상부 밴드는 기질로 사용된 분자량 250 내지 600 kDa의 아그린-EGFP 단백질(화살표 표시 Ag-EGFP)를 나타낸다. 하부 밴드는 시험된 억제제 분자 번호 7, 47, 48, 49, 50 및 51의 억제 활성에 따라 상이한 세기를 나타내는, 약 150 kDa (화살표 Ag-CF)의 분자량을 갖는 뉴로트립신에 의해 생성된 아그린-EGFP의 C-말단 단편을 도시한다. 히스토그램은 100%로 설정된 양성 대조군 및 0%로 설정된 음성 대조군을 갖는 아그린-EGFP의 뉴로트립신-매개된 절단에 의해 생성된 150 kDa 밴드(Ag-CF)의 상대적 세기(I)를 도시한다. 음성 대조군(-): 뉴로트립신없이 아그린-EGFP만. 양성 대조군(+): 뉴로트립신이 부가된 아그린-EGFP.
번호 7: N1-아미디노-N4-(3,5-디브로모살리실리덴)-술파닐아미드
번호 47: 4-클로로시클로헥스-4-엔-1,2-디카르복시산 N1-아미디노술파닐아미드
번호 48: N1-아미디노-N4-(4-디메틸아미노벤질리덴)-술파닐아미드
번호 49: N1-아미디노-N4-벤질리덴-술파닐아미드
번호 50: N1-아미디노-N4-(2,4-디클로로벤질리덴)-술파닐아미드
번호 51: N1-아미디노-N4-(4-메톡시벤질리덴)-술파닐아미드
도 17은 화합물번호 7에 의한 뉴로트립신 활성의 투여량 의존적 억제를 도시한다.
(A) 화합물 번호 7, N1-아미디노-N4-(3,5-디브로모살리실리덴)-술파닐아미드의 농도 의존적으로 뉴로트립신-매개된 아그린-EGFP 절단에 의해 생성된 아그린(Ag-CF)의 150 kDa C-말단 단편의 웨스턴 블럿 검출.
레인 1: 아그린-EGFP
레인 2: 아그린 + 마우스 뉴로트립신
레인 3: 아그린 + 마우스 뉴로트립신 + 25 □M 화합물 번호 7
레인 4: 아그린 + 마우스 뉴로트립신 + 37.5 □M 화합물 번호 7
레인 5: 아그린 + 마우스 뉴로트립신 + 50 □M 화합물 번호 7
레인 6: 아그린 + 마우스 뉴로트립신 + 75 □M 화합물 번호 7
레인 7: 아그린 + 마우스 뉴로트립신 + 100 □M 화합물 번호 7
(B) 억제제 화합물번호 7의 부가없이 아그린 + 마우스 뉴로트립신에 대한 I = 100% 세기를 갖는 억제제 농도에 대한 (A)로부터 얻은 세기 데이터의 그래픽 플럿.
도 18 내지 24는 화합물번호 7 N1-아미디노-N4-(3,5-디브로모살리실리덴)-술파닐아미드의 특이성 시험을 도시한다. 시험된 프로테아제 Xa, 트립신, tPA, 트롬빈, 우로키나아제, 칼리크레인 및 플라스민의 억제 없음.
그래프는 시험된 프로테아제 Xa(도 18), 트립신(도 19), tPA(도 20), 트롬빈 (도 21), 우로키나아제(도 22), 칼리크레인(도 23) 및 플라스민 (도 24)의 초기 반응 속도(V ini)를 도시하며, 화합물 번호 7 부재하(개방된 사각형) 및 존재하(개방된 삼각형)에서 기질 농도(□M)에 대해 플로팅됨. 경쟁적 억제에 대한 양성 대조군으로서 tPA(도 20) 및 우로키나아제(도 22)에 eoks 측정에서는 벤즈아미딘(BA)을 지시된 농도로 부가하였고 또 Xa(도 18) 및 플라스민(도 24)에 대한 분석에서는 파라아미노벤즈아미딘(pABA)을 부가하였다(개방된 다이아몬드).
실시예 1: 뉴로트립신은 척수의 운동신경세포에 의해 강하게 발현된다.
성체 마우스의 척수의 크라이오섹션(cryosection)에 대한 ISH(in-situ hybridization) 패턴은 회색질(gray matter)에서 뉴로트립신 mRNA의 강한 세포 발현을 나타내었다(Gschwend, T.P., et al., Molec. Cell Neurosci. 9: 207-219, 1997). 척수에서 뉴로트립신의 가장 강한 발현은 회색질의 전각(ventral horn)의 운동신경세포에서 나타났다.
척수 항체에서 뉴로트립신 단백질의 면역조직화학적 위치를 알아내기 위해 뉴로트립신의 촉매 도메인에 대한 항체를 생성하였다. 면역화를 위한 항원을 생성하기 위하여, C-말단에 His-태그를 함유하는, 인간 뉴로트립신의 촉매 도메인을 대장균에서 생성하고, Ni-NTA 칼럼 상에서 정제하고 또 리폴딩(refold)하였다. 50 □g 부분을 사용하여 염소를 면역화하였다(일차 면역화는 완전 프로인트 보조제 중에서 실시하고 또 부스터(booster) 주사는 불완전 프로인트 보조제 중에서 실시). 면역 혈청으로부터, 고정화된 단백질 G 상의 친화성 크로마토그래피에 의해 IgG를 단리하였다. 친화성 정제된 IgG는 뉴로트립신의 고정화된 단백질분해성 도메인 상에서 친화성 크로마토그래피에 의해 얻었다.
성체 (2개월 령) 마우스를 나트륨 펜토바르비탈(80 mg/kg, Abbot 제조)을 사용하여 깊게 마취시키고 경심(transcardially)적으로 10 ml의 0.9% NaCl, 이어 0.1M 포스페이트 완충액, pH 7.4 (PB) 중에 4% 파라포름알데히드(Merck제조), 0.05% 글루타르알데히드(Merck) 및 0.2% 피크르산을 함유하는 150 ml의 고정제를 재관류시켰다. 관상 뇌 부분을 60 □m에서 진동 마이크로톰(microtome) 상에서 절단하였다. 면역시약의 침투를 향상시키기 위하여, 상기 부분을 PB 중의 30% 수크로오스에서 균등화시키고, 액체 질소 중에서 급속 냉동시킨 다음 PB에서 해동시키고 0.3% 트리톤-X 100를 10분간 예비처리시켰다. 0.05M 트리스 완충된 염수(TBS; pH 7.4)중의 20% 정상 염소 혈청(NGS; Vector Labs 제조, 스위스 세르비온 소재)중, 실온(RT)에서 45분간 예비 배양한 후, 상기 부분을 4℃에서 뉴로트립신(1 □g/ml)에 대한 일차 항체와 함께 36 내지 48시간 동안 배양하였다. 이뮤노퍼옥시다아제 광 현미경에 대해, 상기 부분을 4℃에서 비오티닐화된 염소 항-토끼 IgG(1:200, Vector Labs제조)와 12시간 동안 배양한 다음 애비딘-비오틴-퍼옥시다아제 착물(Ellite ABC 제조; 1:100, Vector Labs 제조)중, 실온에서 3시간 동안 배양하였다. 0.004% H2O2 존재하의 3,3'-디아미노벤지딘(시그마 제조; TBS 중의 0.05%, pH 7.6)에서 배양함으로써 항원성 부위를 가시화하였다. 상기 부분을 젤라틴화된 슬라이드 상에 놓고, 공기 건조시키고, 탈수시킨 다음 엔텔란(Merck 제조) 중에서 커버슬립을 놓았다.
성체 마우스의 척수의 횡부분에서 이렇게 검출된 면역조직화학적 염색 패턴은 회색질에서 뉴로트립신의 존재에 대한 강한 신호를 나타내었다. 가장 강한 발현 수준은 회색질의 전각(ventral horn)의 운동신경세포에서 나타났다. 동일 과정으로 처리되었지만 제1 또는 제2 항체없이 실시한 대조용 부분은 어떠한 염색을 나타내지 않았다.
결론적으로, 이들 실험은 뉴로트립신이 척수의 회색질에서 강하게 발현됨을 분명히 보여준다. 특히 전각과 골격 근육 사이에 위치하는 운동신경세포에서 강한 발현이 발견된다.
실시예 2: 뉴로트립신은 아그린을 절단한다.
뉴로트립신 대 아그린의 단백질분해 효과는 HEK293T 세포에서 이들 2개 단백 질의 공동 발현에 의해 시험하였다. 마우스 뉴로트립신의 코딩 서열을 포함하는 2310 bp KpnI-HindIII 단편을, KpnI 및 HindIII을 통하여 진핵생물 발현 벡터 pcDnA3.1(-)(Invitrogen)에 클로닝하였다. 스플라이스 변이체 Y4 및 Z8를 함유하는 트랜스막 이소형태로 구성되어 있는 랫 아그린을 코딩하는 cDNA 클론(Ruppe, F. et al., Neuron 6: 811-823, 1991; GenBank Nr. M64780)을 KpnI 및 EcoRI를 통하여 pcDNA3 (Invitrogen)의 폴리링커에 삽입하였다. HEK293T 세포를 가습 공기중 37℃의 DMEM/10% FCS에서 10% CO2 와 함께 배양하였다. 형질감염을 위해, 유리 커버 슬립 상의 3 ml DMEM/10% FCS 에 세포를 파종해서 3 cm 접시에 두었다. 파종한지 1일 후, 40-60% 콘플루언스에 도달하면, 뉴로트립신 및 아그린을 암호화하는 cDNA(5 □g DNA 각각)에 의해 칼슘-포스페이트 석출법을 이용하여 세포를 형질감염시켰다. 형질감염된 지 4시간 후, 배지를 조심스럽게 제거하고 3 ml의 신선한 DMEM/10% FCS로 교체하였다.
뉴로트립신과 함께 공동발현될 때 아그린의 운명은 웨스턴 블러팅에 의해 분석하였다. 형질감염한지 48시간 후, 세포를 PBS로 세척하고 250 □l 완충액(20 mM 트리스-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1mM EDTA, 1% 트리톤 X-100, 프로테아제 억제제 칵테일)을 부가함으로써 용해시켰다. 추출물을 4℃에서 20분간 배양한 다음 4℃에서 15000 x g으로 20분간 원심분리하였다. 상청액을 수집하였다. 단백질 농도를 결정한 후, 상청액을 5 x Laemmli 로딩 완충액과 혼합하고 3분간 끓인 다음 원심분리하고 다음 분석에 사용하였다. 단백질을 SDS-PAGE에 의해 7.5% 아크릴아미드를 사 용하여 분리하였다. 전기영동후, 단백질을 니트로셀룰로오스 막에 전달하였다. 전달 양은 Ponceau S 염색에 의해 확인하였다. 0.1% 트윈-20 및 5% (w/v) 블로킹제(Amersham)를 함유하는 TBS를 사용하여 막을 블로킹하였다. 뒤이은 모든 단계는 0.1% 트윈-20를 갖는 TBS에서 실시하였다. 이 막을 일차 항체(SZ177, 1:1000; AGR540, 1:1000; K-17, 폴리클로날 항-아그린 항체(Santa Cruz), 1:1000)와 함께 60분간 배양하였다. 포괄적으로 세척한 후, 막을 2차 퍼옥시다아제-커플링된 항체와 함께 45분간 배양하였다. ChemiGlow (Alpha Innotech)를 이용하여 제조자의 지시에 따라 검출을 실시하였다. ChemiImager (Alpha Innotech)를 이용하여 영상을 찍었다.
단일 형질전환체의 세제 추출물(도 2, 레인 1)에서 아그린은 분명히 확인되었다. 이중 형질감염체의 추출물에서, 아그린은 강하게 감소되었다(도 2, 레인 2). 빈 벡터에 의해 형질감염된 세포에서는 아무런 아그린 시그널이 발견되지 않았다. 모든 조건하에서의 뉴로트립신의 생산은 블러트를 항-뉴로트립신 항체로 리프로빙(reprobing)한 후 확인되었다. 이들 상이한 조건의 배지의 분석은 이중 형질감염된 세포의 세포 추출물로부터 상실되었던 면역반응이 상청액 배지에 방출되었음을 나타내었다. 이중 형질감염된 HEK293T 세포의 200□l 배지에서 100 kDa 밴드는 항-아그린 항체와 함께 검출되었다(도 2, 레인 3). 이 신호는 단일 형질감염체로부터의 배지에서는 발견되지 않았다(도 2, 레인 4). 마찬가지로, 아그린 및 촉매적으로 불활성 뉴로트립신으로 형질감염된 HEK293T 세포의 배지에서는 아무런 신호가 검출되지 않았다.
요컨대, 상기 결과는 (1) HEK293T 세포에서 생산된 뉴로트립신은 촉매적 활성을 가지고, (2) 신경근 접합부 및 중앙신경계의 시냅스의 성분의 세포외 존재하는 성분인 아그린은 뉴로트립신 의존적 단백질분해에 의해 절단될 수 있고, 또 (3) 상기 뉴로트립신-의존형 절단은 아그린의 절단된 형태 및 방출된 형태의 형성을 초래함을 나타낸다. 아그린의 방출된 부분은 약 100 kDa의 겉보기 분자량을 갖는다. 아그린 검출에 사용된 항체는 아그린의 C-말단에서 항원결정기에 대한 것이기 때문에, 용해된 단편은 아그린의 C-말단을 포함한다.
실시예 3: 생체내 아그린 절단은 신경 발생 중 척수에서 뉴로트립신의 발현과 일치한다.
생체내에서 아그린의 절단을 시험하기 위하여, 발생중인 마우스 및 성체 마우스의 척수 균질물을 아그린의 Nt 및 C-말단 100-kDa 단편에 대한 특정 항체를 사용한 웨스턴 블럿에 의해 분석하였다. 생후 4, 7, 9, 10, 15 및 25일 뿐만아니라 3, 6 및 12개월된 마우스의 척수로부터 조직 균질물을 준비하였다. 도 3에 도시된 바와 같이, Nt는 첫 생후 3주내에서 가장 강하게 발현되었고, 최고 발현 수준은 7 내지 10일 사이이었다. 아그린의 항체 대 C-말단 잔기를 사용한 웨스턴 블러팅은 뉴로트립신에 의한 아그린 분해를 포함한 아주 유사한 일시적 패턴이 생체내에서 생김을 보여주었다.
실시예 4: 트랜스제닉 마우스 수법을 이용하여 운동신경세포에서 뉴로트립신의 선택적 과발현.
뉴로트립신을 Thy-1 유전자의 프로모터의 제어하에서 과발현시켰다. Thy-1 유전자는 비교적 후기 마우스의 신경 계의 뉴런에서 발현된다(위치에 따라 생후 4-10일, Gordon, J.W. et al., Cell 50: 445-452, 1987). 따라서, Thy-1 프로모터의 제어하에서 뉴로트립신의 발현은 조기 발생 단계가 과량의 뉴로트립신 존재에 의해 방해받지 않음을 확실하게 한다.
뉴로트립신-과발현 마우스는 활성화를 필요로 하는 콘디셔널 트랜스진에 의해 생성하였다. 이를 위하여, IoxP 부위와 접하는 제거가능한 전사 중지 서열을 뉴로트립신 cDNA 앞에 도입하였다. 따라서, 중지 서열은 Cre 리콤비나아제/IoxP 재조합 계(Sauer B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85: 5166-5170, 1988)를 사용하여 제거될 수 있었다. Cre (Cre-리콤비나아제) 단백질은 대장균/박테리오파아지 P1에 의해 코딩되며 DNA의 분자간- 및 분자내 재조합을 효과적으로 증진시킨다. 재조합은 IoxP라 불리는 특정 부위에서 생긴다(Hamilton, D.L. and Abermski, K., J. Mol. Biol. 178: 481-486, 1984). Cre 리콤비나아제의 이러한 특징적 특징은 IoxP 서열 사이에 특이적으로 표시된 DNA 스트링의 결실 및 삽입을 가능하게 한다. 이것은 생체내에서 특이적 작용적 돌연변이를 생성하기 위해 사용될 수 있다(Chen S. et al., Cell 51: 7-19, 1987).
조건적 뉴로트립신-과발현을 위한 작제물(construct)을 갖는 마우스를 운동신경세포에서 활성 뉴로트립신을 과발현하는 마우스를 생성하기 위하여 전사인자 HB9에 대한 유전자에 Cre-리콤비나아제 DNA를 갖는 이종접합성 마우스와 교배시켰다. HB9 프로모터는 운동신경세포 동안 생체내에서 활성이므로, 모든 운동신경세포는 HB9-구동형 Cre-리콤비나아제를 발현하므로, 불활성 트랜스진으로부터 전사 중지 서열의 제거를 초래한다.
트랜스제닉 마우스는 PCR에 의해 유전자형이 확인되었다. PCR용 DNA는 마우스의 꼬리로부터 추출하였다. PCR 프라이머의 위치는 천연 쥐 뉴로트립신 유전자의 검출이 방지되도록 선택한다. 3'-프라이머는 Thy-1 프로모터내부의 DNA 서열에 상응하고 5'-프라이머는 뉴로트립신 cDNA 내부의 서열에 상응한다. 이 DNA 단편은 뉴로트립신 트랜스진에 대하여 특징적이다. Cre 삽입물의 검출을 위한 프라이머는 Cre 유전자 내부로부터 유도된 DNA 서열에 상응하며, 이는 Cre가 보통 마우스에 존재하지 않기 때문이다. 이러한 과정에 의하여, 인간 뉴로트립신을 과발현하는 3개의 마우스 계통 및 마우스 뉴로트립신을 과발현하는 4개 계통을 생장시켰다. 트랜스진의 발현은 노던 블러팅 및 ISH(in-situ hybridization)에 의해 mRNA 수준으로 확인되었고 또 웨스턴 블러팅에 의해 단백질 수준으로 확인되었다. 전형적인 과발현은 2 내지 10배 정도이다.
촉매적 도메인에 대한 뉴로트립신 매개된 변형의 의존성은 동일 조건하, 즉 Thy-1 프로모터하에서 뉴로트립신의 촉매적으로 불활성 형태를 과발현하는 트랜스제닉 마우스를 생성하는 것에 의해 확인하였다. 불활성 뉴로트립신은 필수 활성부위 세린 711(키모트립신의 세린 195에 상응)을 알라닌으로 돌연변이시키는 것에 의해 용이하게 생성할 수 있다. 모든 세린 프로테아제에서 활성 부위 세린은 단백질분해 반응의 공유결합 중간체에 관련되기 때문에, 그의 돌연변이는 촉매적 활성의 완전한 상실을 초래한다. 뉴로트립신이 불활성 형태를 과발현하는 트랜스제닉 마우스는 건강하고 어떠한 비정상도 나타내지 않았다.
실시예 5: 뉴로트립신의 트랜스제닉 과발현은 생체내에서 아그린 절단을 향상시킨다.
조직 균질화물은 인간 뉴로트립신(hNt) 또는 마우스 뉴로트립신(mNt)을 과발현하는 성체 마우스의 척수로부터 준비하였다. 이들 마우스는 불활성 트랜스진(mNt에 대한 497, 489 및 533 주 및 hNt에 대한 493 및 494 주)을 갖는 마우스를 운동신경세포 특이적 HB9 프로모터 제어하에서 Cre 리콤비나아제를 발현하는 마우스와 교배함으로써 얻었다. 야생형 마우스를 대조군으로 사용하였다. 척수 균질물을 SDS-PAGE에 처리하고 웨스턴 블러팅시켰다. 웨스턴 블럿은 항체 대 hNt 및 mNt 뿐만 아니라 아그린의 C-말단 100-kDa 단편으로 프로빙하였다. 도 4에 도시한 바와 같이, 아그린의 C-말단 100-kDa 단편은 뉴로트립신을 과발현하는 트랜스제닉 마우스에서 강하게 증가하였다. 아그린의 C-말단 100-kDa 단편의 증가량은 상이한 트랜스제닉 마우스 계통에서 과발현 수준과 양호한 관련이 있다. 인간 및 마우스 Nt는 아그린에 대한 동일한 단백질분해 효과를 나타내었다. 이들 결과는 뉴로트립신이 농도 의존적 방식으로 생체내에서 아그린을 절단함을 보여준다.
실시예 6: 운동신경세포에서 뉴로트립신의 트랜스제닉 과발현은 NMJ로부터 아그린 제거를 수시간 내지 수일 내에 초래한다.
척추 운동신경세포에서 뉴로트립신(Nt)의 트랜스제닉 과발현의 효과는 신경근 접합부(NMJ)의 면역조직화학적 분석에 의해 조사하였다. 생후 첫주동안 트랜스제닉 Nt의 발현을 위해 사용되는 Thy-1 프로모터가 활성으로 되는 것으로 알려져 있기 때문에 생후 첫 주가 특히 중요하다(위치에 따라 일부 변동있음). 분석을 위 하여, NMJ의 표면 위치가 상기 근육이 대조적 분석을 위해 탁월한 모델로 만들기 때문에 횡격막(diaphragm)이 사용되었다. 아그린의 가시화는 아그린의 C-말단 100-kDa 단편으로부터 친화성 정제된 항체를 사용하여 면역조직학적 염색에 의해 실시하였다. 도 5에 도시한 바와 같이, 트랜스진 활성화가 개시되기 전의 시점인 P0에서 아그린 면역반응성은 야생형 및 트랜스제닉 마우스(도 5: P0)에서와 동일하였다. 양쪽 경우에서, 아그린 면역반응성은 동일 근육에 대해 도 6에 도시된 바와 같은 NMJ의 □-Btx 시그널과 분명히 매칭된다. P8에서, 아그린 면역반응성의 현격한 감소는 야생형 마우스(도 5: P8)과 비교할 때 Nt-과발현 마우스의 횡격막의 NMJ에서 발견되었다. 연령 매칭된 야생형 마우스에서 아그린 양성 NMJ에 의해 진하게 집적된 종판(end plate) 밴드는 아주 소수의 대형 NMJ 유사 아그린-양성 구조만을 나타낸다. P4 마우스의 아그린 면역반응은 전이 단계를 나타내며, 다양한 크기의 구조를 갖는 혼합된 패턴을 특징으로 하며, 잘 보존되는 NMJ에서부터 NMJ의 잔류물을 반영하는 소형 구조에 이르기 까지 다양하다(도 5: P4). 도 5에 도시된 대부분의 아그린 면역반응 구조는 도 6의 □-Btx 양성 구조에 정확하게 매칭된다. 그러나, Nt-과발현 마우스의 전이 상태 시냅스의 실제 비율에서, 아그린 시그널 및 □-Btx 시그널 사이의 비율은 P0에서 보다 더 작았다(실시예 7 참조).
이들 결과는 뉴로트립신이 생체내 NMJ에서 아그린을 절단하며 또 아그린의 C-말단 잔기는 뉴로트립신 의존적 절단 후 수시간 내지 수일 내에 NMJ로부터 사라진다. 이것은 C-말단 잔기가 아그린의 프로-시냅스 활성에 관여하는 도메인을 함유하기 때문에 특히 현저하다.
실시예 7: NMJ로부터 아그린의 뉴로트립신-유도 제거는 수시간 내지 수일 내에 NMJ의 분산을 초래한다.
운동신경세포에서 뉴로트립신(Nt) 과발현 및 NMJ로부터 아그린의 제거 효과는 시냅스후부(postsynaptic) 장치의 가시화에 의해 조사하였다. 시냅스후부 장치의 가시화는 아세틸콜린 수용체를 형광 □-분가로톡신(□-Btx)으로 염색함으로써 실시하였다. Nt 과발현 (Nt) 마우스와 야생형(wt) 마우스의 비교에서 도 6에 도시한 바와 같이, 시냅스후부 장치는 출생시에서부터(생후 0일, P0) 잘 확립되었다. 생후 첫 8주(P8)의 말기에, MNJ의 대부분의 시냅스후부 장치는 Nt 과발현 마우스에서 실질적으로 사라졌다. 소위 종판 밴드 내에서는 오직 몇 개의 잔류 NMJ만이 제조될 수 있었고, NMJ는 야생형 마우스에서 고밀도로 발견되었다. 생후 4일(P4)에, 모습을 갖춘 NMJ의 혼합물로 구성되고 부분적으로 용해된 NMJ인 이종 패턴이 발견되었다. 야생형 마우스와 비교할 때 트랜스제닉 마우스의 종판 밴드 내의 NMJ의 밀도의 감소는 상기 단계에서 Nt 과발현 마우스에서 완전히 사라졌다.
전이 상태 NMJ는 □-Btx 장식 구조내에서 아그린의 부재 또는 상당히 감소된 아그린의 존재를 특징으로 한다. 이러한 전이 상태 NMJ는 Nt 과발현 마우스에서만발견되었다. 야생형 마우스에서, Nt 과발현 마우스와 대조적으로, 아그린에 대한 면역염색은 시냅스후부 장치의 아세틸콜린 수용체의 □-Btx 염색과 잘 매칭된다.
요컨대, 상기 실험은 운동신경세포에서 Nt의 증가된 발현은 이미 확립된 NMJ의 제거를 초래함을 나타낸다. NMJ의 제거는 짧은 지연으로 트랜스제닉 상향조절 Nt를 초래한다(수시간 내지 수일). 전이 상태 시냅스 분석은 시냅스후부 장치의 제 거가 아그린의 절단 및 NMJ로부터 C-말단 100-kDa 아그린 단편의 제거를 초래함을 나타낸다. 이는 Nt가 아그린의 프로-시냅스 역할을 상쇄하여 NMJ에서 항-시냅스 역할을 하는 것을 나타낸다. 항-시냅스 작용이 운동신경세포에서 뉴로트립신의 강한 과발현으로 인하여 과도하게 향상되면, 프로시냅스제 아그린이 압도하여 NMJ는 해체된다.
실시예 8: 척수 운동신경세포에서 뉴로트립신의 발현 상승을 갖는 성체 마우스는 감소된 근육 강도와 함께 현저한 신경근 표현형을 나타낸다.
운동신경세포에서 Nt를 과발현하는 트랜스제닉 마우스는 조건적 Nt 트랜스진(실시예 4에 기재됨)을 갖는 마우스를 HB9 프로모터 제어하에서 Cre 리콤비나아제를 발현하는 마우스와 교배함으로써 생성하였다. HB9 프로모터는 척수 운동신경세포에서 Cre 리콤비나아제의 과발현을 유도하며, 전사 중지 절편의 절제에 의해 운동신경세포에서 불활성 Thy 1-Nt 트랜스진을 활성화한다. 이러한 교배로부터 유도된 이중 트랜스제닉 마우스는 운동 표현형을 나타낸다. 이들은 느리게 걷고, 보행 불안과 적은 걸음수를 나타낸다. 이들은 현저히 감소된 근육 세기를 나타낸다.
요컨대, 운동신경세포에서 Nt의 과발현은 골격 근육의 감소된 세기를 특징으로 하는 말초 운동 표현형을 초래한다.
실시예 9: 상승된 뉴로트립신 발현을 갖는 성체 마우스의 신경근 접합부는 시냅스전부 및 시냅스후부 장치의 현저한 단편화를 나타낸다.
Nt를 과발현하는 트랜스제닉 마우스 및 동일 연령의 야생형 마우스(젊은 성체)의 대조적 신경근 접합부는 Nt 과발현 마우스의 NMJ의 현저한 단편화를 나타낸 다. 야생형 마우스에서 생후 첫 3주에서 생기는 NMJ의 전형적인 프레젤 구조는 Nt-과발현 마우스에서 발견되지 않는다(도 7, D, E 및 F). Nt-과발현 마우스의 NMJ는 이들의 표적 근육 섬유의 표면 상에서 동일 면적을 점유하지만, 이들의 시냅스후부 뿐만 아니라 시냅스전부 접촉은 연속적인 구조를 형성하지 않지만, 수많은 소형 접촉 부위로 잘라진다. Nt 과발현 마우스에서 관찰된 NMJ의 단편화는 근육감소증에 걸린 고령 인간의 NMJ에서 발견되며, 노령의 사람에서 발견되는 근육 위축증의 한 형태이다.
요컨대, 운동신경세포에서 뉴로트립신의 증가된 생산은 근육감소증에 걸린 사람의 연구로부터 보고된 NMJ의 단편화와 아주 유사한 NMJ의 단편화를 초래한다.
실시예 10: 뉴로트립신 발현이 증가한 성체 마우스의 근육은 현저하게 감소된 수의 근육 섬유를 갖는다.
운동신경세포에서 Nt를 과발현하는 젊은 성체 마우스의 근육을 근육 섬유의 개수에 대하여 분석하였다. 개별 근육, 예컨대 가자미근을 단리하고 조직 부문을 근육의 중앙 절편을 통하여 근육의 장축에 수직하게 만들었다. 각 부분을 헤마톡실린-에오신으로 염색하고 섬유 수를 세었다. 도 8은 야생형 마우스(도 8A)와 Nt-과발현 마우스(도 8B)의 가자미근을 비교한 것을 도시한다. Nt 과발현 마우스의 근육은 야생형 마우스의 근육에 비하여 현저하게 더 얇았고 근육 섬유의 개수가 현저하게 더 작았다. 근육 섬유의 개수는 Nt 과발현 마우스의 상이한 4개 계통의 가자미근에서 산출하였다(표 1).
Figure 112007077339617-PCT00007
결과는 4개의 독립적인 트랜스제닉 마우스 계통의 Nt-과발현 마우스에서 섬유 개수의 현저한 감소가 나타났음을 보여준다.
요컨대, 마우스에서 섬유 개수의 정량은 운동신경세포에서 증가된 Nt가 근육 섬유 개수의 현저한 감소를 초래함을 보여준다.
실시예 11: 트랜스제닉 마우스의 CNS 뉴런에서 뉴로트립신의 과발현
실시예 4의 과정에 따라, 뉴로트립신을 조건에 따라 과발현하는 4개의 트랜스제닉 마우스를 얻었다. 이들 마우스를 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 제어하에서 Cre-리콤비나아제를 발현하는 이종 마우스와 교배하였다. CMV 프로모터는 생체내에서 연속적으로 활성이므로, Cre-리콤비나아제는 모든 시기에서 2개의 IoxP 서열에서 재조합을 증진시킨다. 이러한 과정은 불활성 트랜스진으로부터의 전사 중지 서열을 제거하고 뉴로트립신 cDNA의 전사를 허용한다. PCR 및 서던 블럿 혼성화에 의해 표현형은 실시예 4에 나타낸다.
유사하게, Thy-1 프로모터하에서 뉴로트립신의 촉매학적 불활성 형태를 과발현하는 트랜스제닉 마우스는 뉴로트립신의 활성 부위 세린(세린 711)을 알라닌으로 돌연변이시켜 생성하였다.
실시예 12: CNS 뉴런에서 뉴로트립신의 증가된 양은 시냅스 수의 감소를 초래한다.
시냅스 리치 영역의 조직 부피당 시냅스 개수를 정량하기 위하여 또 시냅스의 크기 변수를 측정하기 위하여(시냅스전부 액손 말단 영역 포함, 시냅스 후부 척추 영역, 및 시냅스의 길이 포함)(시냅스전부 및 시냅스후부 막의 동격(apposition) 길이에 의해 측정), 2개의 독립적인 뉴로트립신 과발현 계통의 마우스(N491/cre 및 Nt494/cre) 및 몇 개의 계통의 대조용 마우스(야생형 마우스, CMV-Cre 마우스 및 불활성 트랜스제닉 Nt491-불활성.Nt 및 Nt494-불활성.Nt를 갖는 트랜스제닉 양친 계통)을 조사하였다. 이들 마우스를 메티오판(SChering-Plough)을 사용하여 28일에 깊게 마취시키고 0.9% 염화나트륨을 심장에 관류시킨 다음 0.1M 포스페이트 완충액(PB), pH 7.4 중의 2% 파라포름알데히드 및 1% 글루타르알데히드로 구성된 고정액을 관류시켰다. 두개골로부터 뇌를 제거하고 비브라톰을 이용하여 100 □m 두께 부분으로 절단하였다. 이 부분을 PB 중의 1% 사산화 오스뮴에서 고정시킨 후 2% 우라닐 아세테이트로 처리하고 에탄올 및 프로필렌 옥사이드 중에서 탈수시키고 Durcupan ACM 수지(Fluka)에 매립하였다. 전자현미경 분석을 위하여, 미골부 전방(anteriocaudal) 레벨 브레그마(Bregma) - 2 mm 및 중간측면으로 1.5 mm에 있는 해마의 CA1 영역을 함유하는 부분을 절개하였다(ultrasectioned). 이러한 시냅스 샘플링 과정은 초기 배율 27,500 배에서 50 □m 거리에 있는 3개의 비연속 영역으로부터 해마 CA1 영역의 방사층의 뉴로필(neuropil)의 15 내지 23 EM 샘플로 구성된다. 전자 마이크로그래프는 90 내지 135 □m2 조직을 표시한 80,000 배의 최종 배율로 인쇄된다. 시냅스는 시냅스전부 및 시냅스후부 프로파일의 2개의 근접한 후막(thickened membrane)으로 정의되며, 시냅스전부 프로파일은 상이한 막과 근접 조합된 3개 이상의 시냅스 소포를 함유한다. 시냅스는 초미세구조 기준에 따른 축상가지돌기(axodendritic) 시냅스 및 축삭가시돌기(axospinous) 시냅스로 분류된다. 가지돌기 축은 이들의 크기 및 미토콘드리아 및 미세관(microtubules)의 존재에 의해 확인하였다. 가지돌기가시는 소형 직경이고, 미토콘드리아와 미세관을 갖지 않으며 경우에 따라 척추 장치를 함유하였다. 축삭가지돌기 시냅스는 모든 샘플에서 미미한 비율로 함유되므로 통계적 예상에서 제외된다. 모든 축삭가지돌기 시냅스는 절제 라인과 접하는 것을 제외하고는 각 마이크로그래프에서 계산되었다. 축삭돌기 단부 및 시냅스 후 척추의 단면적 및 모든 축삭돌기 척추 시냅스의 시냅스 접합부의 길이는 자성 정제(Kunrta) 및 맥스테롤로지 2.8 (Ranfurly Microsystems) 분석 프로그램을 이용하여 프린트로부터 직접 측정하였다. 시냅스의 수치밀도는 크기-빈도법 및 화학식 NV = NA/d (NA는 단위 면적당 시냅스 프로파일의 개수이고 또 d는 시냅스 접합부의 평균 길이임; DeFElipe, J., et al., Cereb. Cortex 9: 722-732, 1999)을 이용하여 얻었다.
mm3 당 시냅스의 개수를 계수하였다. 결과를 도 9에 도시한다. mm3 당 시냅스의 개수는 뉴로트립신 과발현 마우스에서 현저하게 감소되었다. 대조적으로, 대조 마우스에서 시냅스 개수, 즉 이중 트랜스제닉(DTG) 뉴로트립신 과발현 마우스(491-불활성.Nt, 494-불활성.Nt 및 CMV-Cre)를 생성하기 위해 사용되는 양친 계통은 야생형 마우스에서와 동일하였다. 따라서, 이들 결과는 뉴로트립신 과발현 마우스에서 시냅스의 현저한 감소를 나타낸다.
실시예 13: CNS 뉴런에서 뉴로트립신의 증가된 수준은 가지돌기가시(시냅스 후부 요소) 감소를 초래한다.
17 내지 32일된 뉴로트립신 과발현 마우스 및 야생형 마우스의 시상주위 해마 조각(300 ㎛)을 스테인레스강 레이저 블레이드(Electron Microscopy Science)를 이용하여 절단하고 34℃의 따뜻하고 산소화된 ACSF에 의해 충전된 배양실로 전달하고 1시간 동안 배양하여 뇌조직이 절단 손상으로부터 회복하는데 충분한 시간을 제공하였다. 이후, 상기 조각을 다음 실험에 사용하기 전까지 실온에서 보관하였다.
전체 세포 패치 클램프를 위해 상기 조각을 표준 침하 챔버(submerged chamber)에 넣고 ACSF로 초관류시켰다. 개별 뉴런을 적외선 조명을 이용하여 미분 간섭 콘트라스트 광학을 구비한 엑시오스코프(Axioscope) 현미경(Zeiss)으로 가시화하였다. 시험실은 생리적 온도와 비슷한 35-36℃로 유지하였다. 챔버를 통하여 ACSF의 유동 속도는 1-2 ml/분이었다. ASCF는 기록챔버에 들어가기 전에 옥시탄소에 의해 산소화되었다. 전체 세포 기록 피펫(3-5 M Ω)을 이용하여 기록을 실시하고, 플레이밍/브라운 풀러 상에서 잡아당기고 상기 챔버에서와 동일 용액으로 충전하였다. 형태학적 재구성을 위하여 뉴런에 115 mM KOH, 20 mM K-글루코네이트, 10 mM KCl, 10 mM HEPES (Good's 완충액), 10 mM 포스포-크레아틴, 4 mM ATP-Mg, 0.3 mM GTP 및 13.4 mM 바이오시틴의 용액을 주사하였다. 바이오시틴-라벨링된 CA1 피라미드 세포를 갖는 각 조각을 2매의 밀리포어 여과지 사이에 놓고, 0.1M 포스페이트 완충액 (PB), pH 7.4 중의 1% 글루타르알데히드, 2% 파라포름알데히드 및 약 0.2% 피크르산(picric acid)을 함유하는 고정액에 침지시켜 고정하는 동안 평탄하게 실온에서 2 내지 3시간 유지시켰다. 4℃ PB 중의 0.5% 파라포르말데히드에서 조각들을 저장하였다. PB로 몇 회 세정한 후, 조각들을 2% 과산화수소로 15분간 처리한 다음, 0.5% 트리톤 X-100 (TBST)를 함유하는 0.05M 트리스-완충된 염수(pH 7.4) 중의 20% 정상 염소 혈청 중, 실온에서 30분간 예비 배양하였다. 이어 이들을 4℃의 TBST 중의 벡타스타틴 엘리트 ABC (애비딘-비오틴-퍼옥시다아제) 시약(1:100, Vector Labs)에서 철야 배양하였다. TBST 및 트리스 완충액(TB, pH 7.6)에서 15분간 세척을 5회한 다음, 비오시틴 함유 세포를 0.0048% H2O2 존재하에서 3,3'-디아미노벤지딘(TB 중의 0.05%)에서 배양함으로써 가시화하였다. 이 반응은 TB로 몇 회 세척함으로써 중지시켰다. 부분을 조각 상에 놓고 Mowiol(Hoechst)으로 커버슬립을 덮었다.
도 10에 도시된 바와 같이, CNS 뉴런에서 과발현하는 트랜스제닉 마우스의 CA1 해마 피라미드 뉴런은 가지돌기가시의 개수 및 크깅의 현저한 감소를 나타내었다. 가지돌기가시는 이들 뉴런에서 시냅스의 시냅스전부 측면을 나타내기 때문에, 이들 결과는 독립적인 방법으로 뉴로트립신 과발현 마우스에서 시냅스 개수의 감소를 확인한다.
실시예 14: 생체내 아그린 절단은 또한 CNS 뉴런에서도 생기고 또 뉴로트립신의 발현과 일치한다.
생체 중 CNS에서 아그린의 절단부위를 시험하기 위하여, 자라고 있는 마우스 및 성체 마우스의 뇌 균질물을, 아그린의 Nt 및 C-말단 100-kDa 단편에 대한 특정 항체를 사용하여 분석하였다. 생후 4, 7, 9, 10, 15 및 25일 및 3, 6, 12개월령 마우스의 척추로부터 조직 균질액을 제조하였다. Nt는 생후 첫 3주내에서 가장 강하게 발견됨이 밝혀졌고, 최고 발현량은 7 내지 10일이었다. 아그린의 항체 대 C-말단 잔기를 사용한 웨스턴 블러팅은 아주 유사한 임시 패턴을 나타내는데, 이는 뉴로트립신에 의해 아그린 절단이 CNS 중 생체내에서 생김을 나타낸다.
실시예 15: CNS 뉴런에서 뉴로트립신의 트랜스제닉 과발현은 생체내에서 아그린 절단을 향상시킨다.
불활성 트랜스진을 갖는 마우스(mNt의 경우 497, 498 및 533 계통 및 hNt의 경우 493 및 494 계통)를 CMV 프로모터 제어하에서 Cre 리콤비나아제를 발현하는 마우스와, 또 대조군으로서 야생형 마우스와 교배함으로써 생성한 인간 뉴로트립신(hNt) 또는 마우스 뉴로트립신(mNt)를 과발현하는 성체 마우스의 뇌로부터 조직 균질물을 제조하였다. 이 뇌 균질물을 SDS-PAGE 및 웨스턴 블러팅처리하였다. 웨스턴 블럿은 항체 대 hNt 및 mNt에 의해 뿐만 아니라 아그린의 C-말단 100-kDa 단편으로 프로빙하였다. 아그린의 C-말단 100-kDa 단편은 뉴로트립신을 과발현하는 트랜스제닉 마우스에서 강하게 증가함이 밝혀졌다. 아그린의 C-말단 100-kDa 단편의 양의 증가는 상이한 트랜스제닉 마우스 계통에서 과발현되는 양과 관련이 있다. 인간 및 마우스 Nt는 아그린에 대하여 동일한 단백질분해 효과를 나타내었다. 이들 결과는 Nt가 농도 의존적 방식으로 생체내 CNS에서 아그린을 절단함을 나타낸다.
실시예 16: 재조합 뉴로트립신의 생산
뉴로트립신은 875 아미노산 길이를 갖는 분비된 멀티-도메인 단백질이며 인간 뉴로트립신의 경우 97 kDa 크기로 추정되고 또 마우스 뉴로트립신의 경우 85 kDa 크기로 추정된다(도 1, A 및 B). 활성 단백질로서 세린 프로테아제의 발현은 적절한 폴딩(folding) 및 번역 후 수식, 예컨대 인간의 경우 2 부위에서 또 마우스 단백질의 경우 3 부위에서 N-글리코실화에 따라 달라진다(Gschwend, T.P. et al., Mol. Cell, Neurosci. 9: 207-219, 1997; Proba, K. et al., Biochim. Biohphys. Acta 1396: 143-147, 1998). 또한, 뉴로트립신은 분비되는 소포체로 단백질을 보내는 시그널 펩티드를 함유한다. 뉴로트립신은 소수성 플럿에 의해 측정되는 바와 같이 트랜스막 도메인이 결여되어 있기 때문에 인테그랄 막이 아니다(Kyte, J. and Doolittle, R. F., J. Mol. Biol. 157: 105-132, 1982). 뉴로트립신의 자이모겐 활성화 부위는 tPA 중의 하나와 높은 유사성을 나타낸다(조직형 플라스미노겐 활성화제; Tate, K. M. et al., Biochemistry 26: 338-343, 1987). 프로테아제에 의한 상기 부위에서 절단은 2개 단편을 초래하며, 1개는 겉보기 분자량 약 55 kDa(마우스 뉴로트립신의 경우)또는 약 67 kDa (인간 뉴로트립신의 경우)를 갖는 비-촉매적 도메인 및 다른 1개는 약 30 kDa의 프로테아제 도메인을 함유한다.
골수종 세포에서 뉴로트립신의 생산. 골수종 세포의 안정한 형질감염을 위하여 마우스 및 인간 뉴로트립신의 코딩 영역을 특수하게 고안된 벡터(Traunecker et al., Biotchnol. 9: 109-113, 1991)에 삽입하였다. 이 벡터에 의한 발현은 Ig κ 프로모터 및 인헨서에 의해 이끌어진다. 목적하는 전사물의 3' 말단을 Ig κ 일정 도메인을 암호화하는 엑손에 접합시켜 안정한 Ig 전사물과 유사하게 하였다. 벡터는 L-히스티놀 존재하에서 안정한 형질감염체의 선택을 허용하는 히스티디놀 탈수소화제 유전자를 함유한다. L-히스티디놀은 L-히스타민의 전구체이며 단백질 합성의 억제제이다. 이 벡터는 재조합 뉴로트립신을 생산하기 위한 마우스 골수종 세포주 J558L (ECACC #88032902; European Collection of Cell Culture)로 안정하게 형질감염되었다. 원형질 융합 또는 엘렉트로포레이션에 의한 안정한 형질감염용의 다른 적합한 세포주는 마우스 P3-X63Ag8.653, 마우스 Sp2/0-Ag14, 마우스 NSO 및 YB2/0 이다(Gillies et al., Biotechnology 7: 799-804, 1989; Nakatani et al., Biotechnology 7: 805-810, 1989; Bebbington et al., Biotechnology 10: 169-175, 1992; Shitara et al., J. Immunol. Meth. 167: 271-278, 1994).
J558L 세포의 적합한 형질감염은 엘렉트로포레이션을 이용하여 달성할 수 있다. 총 106 세포를 10 □g 선형화된 또는 슈퍼코일드 벡터와 1 cm 큐벳 중의 PBS 에서 혼합하였다. 엘렉트로포레이션은 펄스 960 □F 및 170-230 V를 이용하여 Bio-Rad Gene Pulser (Bio-Rad Chemical Division)을 이용하여 실시하였다. 세포를 10% FCS 를 함유하는 50 ml DMEM에 형질감염시키고 멀티채널 피펫을 이용하여 100 ㎕/웰을 부가함으로써 5개의 96웰 플레이트 상에 플레이팅하였다.
J558L 세포의 리포좀 형질감염은 리포펙타민 및 PLUS 시약(Invitrogen)을 사용하여 실시하였다. 1 x 107 골수종 세포를 500 x g 에서 3분간 원심분리시키고 무혈청 DMEM 배지로 1회 세척하였다. 두번째 원심분리 후 세포를 3 ml 무혈청 DMEM 배지에 현탁시켰다. 형질감염을 위하여 뉴로트립신을 암호화하는 40 □g 플라스미드 DNA를 320 □l 무혈청 DMEM 및 80 □ PLUS 시약(Invitrogen)과 혼합하였다. 실온에서 15분간 배양한 후 예비혼합된 60□ 리포펙타민 형질감염 시약과 340 □l 무혈청 DMEM 을 반응에 부가하고 실온에서 15분간 배양하였다. J558L 세포를 부가하기 전에 1 ml의 무혈청 DMEM을 DNA-리포좀 혼합물에 부가하였다. 형질감염된 세포를 6 cm 조직 배양액 접시 중, 37℃에서 10% CO2 와 함께 배양하였다. 4시간 후 세포를 10% FCS를 함유하는 45 ml DMEM에서 희석시키고 멀티채널 피펫을 이용하여 100 ㎕/웰을 부가함으로써 5개의 96웰 플레이트에 플레이팅하였다.
원형질 제조를 위해 포유류 발현 벡터를 함유하는 대장균 균주 803 클론의 글리세롤 스톡을 LB 한천/암피실린 플레이트 상에 스트리크(streak)하고 37℃에서 철야로 생장시켰다(803주 ATCC #35581로부터 입수). 1개의 단일 콜로니를 50 □g/ml 암피실린을 함유하는 2 ml 예비승온된(37℃) LB 배지에 접종하였다. 250 rpm 및 37℃에서 4시간 동안 진탕한 후 100 □l의 배양액을 100 ml 새로운 배지로 전달하였다. 이 배양액이 광학 밀도 약 0.6 (600 nm에서 OD)에 도달한 후, 클로람페니콜을 최종 농도 120 ㎍/ml로 부가하고 250 rpm 및 37℃에서 철야로 생장시켰다. colE1 복제 기원을 갖는 플라스미드는 클로람페니콜(Hershfield et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71, 4355-3459, 1974) 존재하에서 증폭될 수 있다. 철야 배양액을 4℃에서 2500 x g로 10분간 원심분리하였다. 펠릿을 50 mM 트리스-HCl, pH 8.0 중의 2.5 ml 빙냉 20% (w/v) 수크로오스에 재현탁시켰다. 얼음에서 5분간 배양하기 전에 250 mM 트리스-HCl, pH 8.0 중의 500 ㎕ 빙냉 1 mg/ml 리소자임을 부가하였다. 1 ml 빙냉 250 mM EDTA, pH 8.0을 부가한 후, 얼음에서 5분간 배양한 후, 1 ml 빙냉 50 mM 트리스-HCl, pH 8.0을 부가하고 그 원형질 제제를 실온에서 10분간 배양하였다. 이 배양 기간 동안, 통상 봉형(rod-shaped) 세균으로부터 구형 원형질 형성이 현미경으로 1000 x 배율로 관찰될 수 있다. 배양 기간 말기에 약 90% 원형질이 형성되어야 한다. 이 원형질 현탁액에 10% (w/v) 수크오로스, 10mM MgCl2 및 40 □ 10 mg/ml DNaseI이 보충된 20 ml DMEM을 부가하였다. 실온에서 15분간 배양한 후 원형질 제제를 실온에서 2500 x g 로 30분간 휘저었다. 그 동안 골수종 세포 J558L을 융합을 위해 준비하였다. 골수종 세포를 10%(v/v) FCS가 보충된 DMEM 에서 생장시키고 형질감염일에 약 1 x 106 세포/ml의 높은 세포 밀도에 도달해야 한다. 원형질 융합 당 5 x 106 세포를 RT에서 10분간 500 x g으로 회전시켰다. 세포를 5 ml 예비승온된 DMEM (37℃)에 재현탁시키고 마지막 원심분리 후 원형질 펠릿 위에 서서히 층을 이루게 하였다. 원형질과 골수종 세포를 혼합하기 위하여 튜브를 RT에서 500 x g으로 10분간 회전시켰다. 상청액을 제거한 후, 튜브를 쳐서 세포를 혼합하였다. 융합을 위해 10% DMSO가 보충된 DMEM 중의 2 ml PEG 1500을 부가하고 피펫을 아래위로 몇 회 움직여서 펠릿을 재현탁시켰다. PEG 용액을 부가한지 1 내지 2분에 10%(v/v) FCS (37℃)가 보충된 10 ml 승온된 DMEM을 부가하였다. 이 세포를 RT에서 500 x g으로 10분간 원심분리하였다. 상청액을 흡입에 의해 제거하고 10%(v/v) FCS 및 100 ㎕ 50 mg/ml 카나마이신이 보충된 50 ml 예비승온된 DMEM에 펠릿을 재현탁시켰다. 마지막으로, 멀티채널 피펫을 이용하여 100 ㎕/웰을 부가함으로써 5개의 96웰 조직 배양 플레이트에서 세포를 플레이팅하였다.
형질감염된 세포를 선택하기 위하여, 48시간 후 L-히스티디놀을 5 mM 최종 농도로 부가하였다. 형질감염된 골수종 세포만이 L-히스티디놀 처리에 살아남을 것이다. 선택이 개시된 지 약 12 내지 14일에 콜로니를 볼 수 있다. 형질 융합 및 리포좀 형질감염당 평균 40 내지 50개 클론이 얻어졌다. 뉴로트립신-특이적 항체를 사용한 웨스턴 블럿에 의해 발현에 대해 모든 클론을 분석하였다. 대다수의 골수종 세포 클론은 뉴로트립신을 전혀 발현하지 않거나 아주 소량의 뉴로트립신만을 발현하는 반면에, 5-10%의 적은 비율의 골수종 세포 클론은 아주 높은 발현량을 나타내었다. 고발현량을 갖는 클론을 단일 세포 희석의 3라운드에 걸쳐 서브클로닝하여 뉴로트립신 발현의 안정성을 보장되게 하였다. 안정하게 발현하는 클론으로부터 세포 추출물 및 상청액을 수집하고 10% SDS PAGE 상에서 분리하였다. 단백질을 니트로셀룰로오스 막으로 전달하였다. 뉴로트립신의 검출은 비-촉매적 절편을 인식하는 뉴로트립신-특이적 항체 퍼옥시다아제에 결합된 이차 염소-항-토끼 항체 또는 프로테아제 도메인을 인식하는 뉴로트립신-특이적 항체 및 퍼옥시다아제에 결합된 토끼-항-염소 항체를 사용하여 실시하였다. 전장 뉴로트립신은 세포 추출물에서 우세하게 검출되지만, 비-촉매적 단편에 상응하는 65 kDa 밴드 및 단백질분해 도메인의 30 kDa 밴드는 상청액에서 검출된다.
실시예 17: 뉴로트립신의 중간 규모 생산
사용된 뉴로트립신의 공급원은 뉴로트립신을 발현하는 골수종 세포주의 배양으로부터 얻은 조절된 세포 배양액 상청액이었다. 이들 세포는 TechnoMouse 발효기(Integra Biosciences) 중의 무혈청 배지(Stoll, T. S. et al., J. Biotechnol. 45: 111-123, 1996; Ackermann, G.E. and Fent, K., Marine Environmental Research 46: 363-367, 1998)에서 생장하도록 적응되었다. 2 mM 글루타민 및 10% FCS를 함유하는 DMEM(Gibco, No. 41966-029)으로 구성된 배지로부터 시작하여, 세포는 1% FCS를 갖는 상기 배지에서 생장하도록 서서히 적응되었다. 이러한 적응은 24웰 플레이트에서 실시하였고 배지는 약 이틀에 한 번씩 교환되었다. 세포가 콘플루언시에 도달하면, 이들은 다른 웰로 나눠진다. 이러한 전체 과정을 통하여, 세포는 콘플루언시에 가까운 밀도를 유지하였다. 1% FCS를 갖는 DMEM 중의 적응된 세포 생장 웰을, 0.5% FCS가 보충된 무혈청, 단백질 함유 배지 HL-1 (Bio-Whittacker, No. 77201)로 전달하였다. HL-1 배지에서 세포는 HL-1 배지에서만(FCS 갖지 않음) 생장하도록 서서히 적응되었다. 세포를 무 단백질 배지 TurboDoma (Cell Culture Technologies GmbH, 츄리히, No. THP)에 적응시키기 위하여 HL-1 배지는 TuroDoma로 서서히 교체되었다. HL-1으로부터 TurboDoma 배지에 대한 적응 단계는 FCS의 감소와 유사하게 실시하였다.
실시예 18: 전장 뉴로트립신의 정제
상기 실시예로부터 얻은 상청액 20 리터를 1 ㎛ 폴리가드 CR 광학 필터(밀리포어 제조)를 통하여 여과하고 또 교차 유동 여과(cross-flow filtration)(SKAN AG)에 의해 5리터로 농축시켰다.
헤파린-친화성 크로마토그래피. 상기 농축된 상청액에 NaCl을 부가하여 120 ml 헤파린 칼럼(Heparin 세파로오스 6 Fast Flow XK 50/20 칼럼; Amersham Biosciences)에 걸기 전에 0.3 M 농도에 도달하였다. 이 칼럼을 20 mM MOPS, 300 mM NaCl, pH 7. 2(완충액 A)으로 평형처리시켰다. 샘플을 20℃에서 Aekta Purifier (Amersham Biosciences Europe GmbH) 상에 1 ml/분의 유동 속도로 칼럼에 로딩하였다. 이 칼럼을 완충액 A의 4 칼럼 부피(CV)로 세척하였다. 결합된 단백질을 20 mM MOPS, 1M NaCl, pH 7.2 (완충액 B)에서의 구배에 의해 용출시켰다. 구배는 다음과 같았다: 1 CV에서 0% B 내지 43% B, 3 CV에서 43% B, 2CV에서 43 내지 100% B, 및 3CV에서 100% B. 뉴로트립신은 450 mM 염화나트륨 농도에서 용출되기 시작한다. 뉴로트립신을 함유하는 용출 분획(전장 단백질 및 프로테아제 도메인)을 모으고, 균등량으로 나누고 -20℃에서 저장하였다.
소수성 상호작용 크로마토그래피는 부틸-치환된 중합체 매트릭스 (부틸 세파로오스 4 Fast Flow, Amersham Biosciences Europe GmbH) 상에서 실시하였다. 샘플을 로딩 조건에 적응시키기 위하여, 건조 염화 나트륨을 일정한 교반하에서 서서히 부가하였다. 염화나트륨 농도를 조정한 후 샘플을 Sorvall RC-5B 원심분리기 중 12000 rpm으로 4℃에서 SS34 로터에서 원심분리시켰다. Aekta Purifier 크로마토그래피 계(Amersham Bioscinces Europe GmbH) 상, 20℃에서 평형을 이룬 25 ml 칼럼 (20 mM MOPS, 1.5M 염화나트륨, pH 7.2) 상에 유동속도 1 ml/분으로 상청액을 로딩하였다. 20 mM MOPS, pH 7.2 중의 염화나트륨(1.5M-0.05M)의 감소되는 농도의 선형 구배를 1 ml/분으로 적용하여 결합된 단백질은 용출시켰다. 전장 뉴로트립신은 900 mM 염화나트륨 농도에서 용출되기 시작한다. 전장 단백질 함유 용출 분획을 모으고 -20℃에서 저장하였다.
고정-금속 치환성(IMAC) 크로마토그래피. Cu2 + 이온을 제조자의 지시에 따라 세파로오스 (킬레이팅 세파로오스 패스트 플로우, Amersham Bioscinces Europe GmbH 제조)에 결합시켰다. 고체 염화 나트륨을 샘플에 부가하여 농도를 0.5M로 증가시켰다. 샘플을 SS34 로터에서 29℃, 12000 rpm으로 30분간 Sorvall RC-5B 원섬분리처리시켰다. 생성한 상청액을 4℃, Ettan 크로마토그래피계(Amersham Bioscinces Europe GmbH 제조) 상의 1 ml 구리 세파로오스 칼럼에 유동속도 1 ml/분으로 적용하였다. 20 mM MOPS, 0.5M 염화나트륨, pH 7.2 중의 10-250 mM으로부터 이미다졸 구배를 이용하여 단백질을 용출시켰다. 구배는 다음과 같았다: 15 CV에서 0% B 내지 10% B, 5CV에서 10% B 내지 100% B, 및 10CV에서 100% B. 전장 뉴로트립신은 150 mM 이미다졸에서 용출되기 시작하였다. 전장 뉴로트립신 함유 분획을 모으고 4℃에서 저장하였다.
이온 교환 크로마토그래피. 이온 교환 크로마토그래피의 경우 샘플을 2.5배 희석시켜 최종 염화나트륨 농도 0.2 M로 만들고, SS34 로터에서 4℃, 12000 rpm으로 30분간 Sorvall RC-5B 원심분리처리시켰다. 투명한 상청액을, 20 mM MOPS, 200 mM NaCl, pH 7.2로 균형을 이룬 MonoS PC 1.6/5 칼럼 (Amersham Bioscinces Europe GmbH 제조) 상에 0.1 ml/분의 유동 속도로 적용하였다. 결합된 단백질은 염화나트륨의 선형 구배(0.05M - 1M)에 의해 용출시켰다. 전장 뉴로트립신은 300 mM 염화나트륨에서 용출되기 시작한다. 프로테아제 도메인 함유 분획을 모으고 20℃에서 저장하였다.
이렇게 하여 전장 뉴로트립신을 전기영동적으로 순수한 형태로 제조하였다. 도 11은 SDS-PAGE 겔(A) 상에서 은 염색에 의해 가시화되고 또 뉴로트립신 특이적 항체를 사용하여 웨스턴 블럿(B) 상에서 면역염색에 의해 가시화된 바와 같이 정제된 전장 뉴로트립신을 도시한다.
실시예 19: 뉴로트립신의 프로테아제 도메인의 정제
전장 단백질 및 프로테아제 도메인을 함유하는 앞의 실시예의 헤파린 치환성 크로마토그래피로부터 얻은 분획을 상기와 같이 소수성 상호작용 크로마토그래피처리시켰다. 원심분리된 용액의 상청액을 평행유지된 12 ml 칼럼(20 mM MOPS, 1.75M 염화나트륨, pH 7.2) 상에 유동 속도 1 ml/분으로 로딩하였다. 20 mM MOPS, pH7.2 중의 염화나트륨의 감소되는 선형 구배(1.75 M - 0.05M)를 1 ml/분으로 적용하여 결합 단백질을 용출시켰다. 프로테아제 도메인은 1M 염화나트륨 농도에서 용출되기 시작한다. 프로테아제 도메인 함유 분획을 모으고 -20℃에서 저장하였다.
전장 Nt에 대하여 IMAC (고정된 금속 치환성 크로마토그래피)를 실시하였다.
전장 Nt에 대하여 이온 교환 크로마토그래피도 실시하였다.
이렇게 하여, 뉴로트립신의 단리된 촉매적 도메인은 전기영동적으로 순수한 형태로 생성된다.
실시예 20: 절단 부위 □를 함유하지만 절단부위 □는 함유하지 않는 기질로 적합한 유전자조작처리(engineered)된 아그린 단백질의 클로닝, 발현 및 정제
pcDNA-아그린 SN Y4Z19는 막 결합된 아그린 형태를 코딩한다. 먼저, 분비된 용해성 아그린 변이체는 HpaI 부위를 도입하는 프라이머
Figure 112007077339617-PCT00008
Figure 112007077339617-PCT00009
(서열번호 1) 및 NotI 부위를 도입하는
Figure 112007077339617-PCT00010
Figure 112007077339617-PCT00011
(서열번호 2)를 사용하여 작성하였다. 생성한 PCR 생성물을 HpaI 및 NotI으로 절단하고 동일한 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 절단된 인간 칼신테닌-1에 대한 코딩 서열을 함유하는 pEAK8 벡터에 클로닝하였다. 앞서, 상기 벡터 내의 부가적 HpaI 부위는 quick change strategy(Stratagene)를 이용하여 제거하였다. 생성한 작제물은 번역되는 동안 절단되는 인간 칼신테닌-1의 시그널 서열을 갖는 분비된 아그린을 코딩한다. 이러한 작제물을 기본으로 하여, 아그린 유전자 중의 HpaI 및 BspHI 부위를 사용하고 프라이머
Figure 112007077339617-PCT00012
Figure 112007077339617-PCT00013
(서열번호 3) 및
Figure 112007077339617-PCT00014
Figure 112007077339617-PCT00015
(서열번호 4)를 이용하여 PCR 생성물을 클로닝함으로써 N-말단 8 x His 태그를 부가하였다. 제3 단계로, C-말단에 있는 LG3 도메인은 앞서 주형으로 기재된 작제물을 갖는 프라이머
Figure 112007077339617-PCT00016
(서열번호 5) 및
Figure 112007077339617-PCT00017
(서열번호 6) 및 주형으로 pEGFP를 갖는
Figure 112007077339617-PCT00018
Figure 112007077339617-PCT00019
(서열번호 7) 및 주형으로 pEGFP를 갖는
Figure 112007077339617-PCT00020
Figure 112007077339617-PCT00021
(서열번호 8)를 사용한 SOE PCR에서 EGFP로 치환되었다. 생성한 PCR 단편을 SOE PCR로 모으고 EcoRV 및 NotI 부위를 통하여 동일하게 절단된 벡터에 클로닝하였다. 생성한 분비된 단백질은 서열 번호 9의 서열을 갖는다.
HEK 293T 세포를 유전자조작처리된 아그린-EGFP 작제물에 의해 형질감염시키고 10% FCS가 보추된 DMEM 배지에서 생장시키고 또 6시간 동안 배양하였다. 배지를 FCS를 갖지 않는 DMEM으로 교환하고 37℃에서 50시간 동안 배양하였다. 200 ml 상청액을 원심분리(4℃, 30분, GS3, 5000 rpm)하여 세포와 불용성 물질을 제거하였다. 투명한 용액을 50 mM 트리스-HCl, 150 mM NaCl, 0.1% PEG 6000, pH 8.0에 대하여 4℃에서 철야로 1:25로 희석한 후 2회 투석시켰다. 여과후 (0.45 ㎛ 포어 크기), 용액을 크로마토그래피에 의해 더 정제시켰다.
IMAC 크로마토그래피. 50 mM 트리스-HCl, 150 mM NaCl, pH 8.0의 5 CV에 의해 평형화시킨 후, 단백질 샘플을 10 ml/분으로 로딩하였다. 칼럼을 50 mM 트리스-HCl, 150 mM NaCl, pH 8.0의 10 CV로 세척하였다. 용출을 위하여 25 CV 내의 세척액 중의 0 내지 500 mM 이미다졸 구배를 사용하였다. 아그린-EGFP는 20 -50 mM 이미다졸에서 용출되었다. 웨스턴 블러팅 및 SDS-PAGE에 의해 결정되는 바와 같은 소망하는 단백질을 함유하는 분획을 모으고 1:125로 희석시킨 다음 20mM 트리스-HCl, 150 mM NaCl, 0.1% PEG 6000, pH 8.0에 대하여 4℃에서 철야로 투석시켰다.
음이온 교환 크로마토그래피. 투석물을 로딩한 후, 8 ml POROS HQ20 칼럼을 20 mM 트리스-HCl, 150 mM NaCl, pH 8.0의 2CV로 세척하였다. 용출은 세척완충액 중의 150-2000 mM 염화나트륨 구배로 실시하였다. 아그린-EGFP는 약 900-1100 mM의 염화나트륨 농도에서 용출되었다. 웨스턴 블러팅 및 SDS-PAGE에 의해 결정된 바와 같이 소망하는 단백질을 함유하는 분획을 모으고, 1:25로 희석시킨 다음 20 mM 트리스-HCl, 150 mM NaCl, 0.1% PEG6000, pH 8.0에 대하여 4℃에서 철야로 투석하였다. 생성한 뉴로트립신은 90% 순수하고 시험관내 활성 분석에 적합하다. 단백질을 액체 질소에서 냉동시키고 -20℃에 저장하였다.
이렇게 하여 생성된 아그린-EGFP 융합 단백질은 절단부위 □를 함유하지만 절단부위 □는 함유하지 않는다. 아그린-EGFP은 250 kDa을 초과하는 분자 질량을 갖는다. 아그린-EGFP 융합 단백질의 뉴로트립신에 의한 절단은 약 150 kDa의 C-말단 단편을 생성한다. 도 12는 SDS-PAGE 겔(A) 상에서 은 염색에 의해 가시화된 바와 같이 및 웨스턴 블럿(B) 상의 아그린(실시예 22)의 C-말단부에 대한 항체를 사용하여 면역염색에 의해 가시화된 바와 같이 정제된 아그린-EGFP 융합 단백질을 도시한다. EGFP는 상술한 적용에 필수적인 것은 아니고 자리 지지자이다. EGFP를 다른 단백질로 교체하거나 또는 절단부위 □에서 돌연변이된 전장 아그린을 사용하면 상술한 생성물에 상응한다.
실시예 21: 절단부위 □를 함유하지만 절단부위 □는 함유하지 않는 기질로서 적합한 소형 C-말단 아그린 단편(아그린-C45)의 클로닝, 발현 및 정제
HpaI 부위 (HisBNterm)을 도입하는 프라이머
Figure 112007077339617-PCT00022
및 NotI 부위 (Bstreplink)를 도입하는 프라이머
Figure 112007077339617-PCT00023
및 주형으로 pcDNA3.1-아그린YOZ0를 사용하여 DNA 단편을 아그린의 마지막 2개 LG 도메인 및 마지막 EGF 유사 도메인을 코딩하도록 증폭시켰다. 이러한 전략을 사용하여, N-말단 8xHis 태그 및 C-말단 Strep 태그를 코딩하는 DNA 서열을 삽입하였다. 생성한 PCR 생성물을 제한효소 Not I 및 HpaI으로 절단하고(프라이머 서열 중의 진한 부분) 동일한 제한 효소를 사용하여 절단된 인간 칼신테닌-1의 시그널 펩티드에 대한 코딩 서열을 함유하는 pEAK8 벡터에 클로닝하였다. 생성한 작제물 pEAK8-C45 아그린은 C45 아그린에 대한 분비 시그널인 인간 칼시테닌-1의 시그널 서열의 코딩 영역을 함유한다. 클로닝은 대장균에서 실시하고 플라스미드의 증폭도 실시하였다. 발현을 위해 HEK 293 T 세포를 인산 칼슘법으로 형질감염시켰다. HEK 293T 세포에서 발현하는 동안 시그널 펩티드를 절단제거하였다. 생성한 분비된 단백질은 서열(서열번호 12)을 갖는다.
HEK 293T 세포는 10% FCS가 각각 보충된 100 ml DMEM 배지 (GIBCO)를 사용하여 7 x 500 cm2 배양 플레이트(CORNING)에서 80% 콘플루언시로 배양하였다. 형질감염을 위해 500 mM CaCl2 35 ml 및 HBS 완충액(50 mM HEPES, 140 mM NaCl, 1.5 mM Na2HPO4, pH 7.1) 35 ml를 실온으로 평형화시켰다. 2 mg의 pEAK8-아그린-C45 DNA를 CaCl2 용액에 부가하고 HBS 완충액과 혼합하였다. 형질감염 혼합물을 실온에서 30분간 배양하였다. 500 cm2 HEK 세포의 형질감염을 위해, 10 ml의 형질감염 혼합물을 배양물에 적가하고 37℃의 배양기 중, 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 형질감염 혼합물을 PBS에 의한 세척으로 제거하고 FCS를 갖지 않는 DMEM 배지를 부가하였다. 60시간 후 처리된 배지를 수집하고 Steritop 0.22□m 필터(MILLIPORE)를 이용하여 여과하였다. 용액의 pH를 1M 트리스 완충액 pH 8.5를 사용하여 pH 8.5로 조정한 후 BioCAD 재관류 크로마토그래피 계 (Persptive Biosystems) 상에서 Ni-NTA 칼럼(8 ml POROS)을 사용하여 상청액을 직접 IMAC 정제에 처리하였다. 처리된 배지를 유동속도 10 ml/분으로 로딩하고, 칼럼을 100 mM 트리스-HCl, 150 mM NaCl, pH 8.0의 20CV로 세척하였다. 용출을 위해 10CV에 대한 세척 완충액 중의 0 내지 1 M 이미다졸 선형 구배를 사용하였다. 순수한 아그린 C-45 단편을 함유하는 분획을 모으고 완충액을 NAP 25 칼럼(파마시아 제조)에 의해 100 mM 트리스-HCl, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 0.1% PEG 6000, pH 8.0으로 교환하였다. 정제된 단백질을 액체 질소에서 냉동시키고 -20℃에 저장하였다. 이러한 과정에 의해 정제된 아그린 단편은 뉴로트립신에 대한 기질로서 적합하다.
이러한 방식으로 생성된 아그린-C45 단편은 절단부위 β를 함유하지만, 절단부위 α는 함유하지 않는다. 아그린-C45 는 약 45 kDa 의 분자량을 갖는다. 아그린-C45 단백질의 뉴로트립신에 의한 절단은 약 25 kDa의 N-말단 단편 및 약 22 kDa의 C-말단 단편을 생성한다. 도 13은 SDS-PAGE 겔(A) 상의 은 염색에 의해 가시화된 와 같고 또 웨스턴 블럿(B) 상의 Strep Tactin 을 사용하여 C-말단 Strep-tag를 염색하는 것에 의해 가시화된 것과 같은 정제된 아그린-C45 단백질을 도시한다.
실시예 22: 랫트 아그린의 C-말단에 대한 폴리클로날 항체의 생성
HEK 293T 세포를 16 x 150 cm2 조직 배양 플라스크에서 80% 콘플루언시로 생장시켰다. 각 플라스크를 사용하여 4 x 500 cm2 플레이트를 접종하였다. 500 cm2 플레이트는 80 ml의 배양 배지를 함유하였고 폴리-L-리신으로 피복하였다. 세포를 2일 내에 60-80% 콘플루언시로 생장시켰다. 세포를 인산칼슘법으로 배양 배지(DMEM/10% FCS) ml 당 각 1 ㎍의 pcDNA-아그린 Y4Z8 및 pcDNA-hNT를 사용하여 형질감염시켰다. 다음 날 아침 배지를 FCS를 갖지 않는 DMEM으로 변경하였다. 세포를 37℃/10% CO2 에서 4일간 생장시켰다. 상청액을 모으고, 3000 rpm으로 4℃에서 30분간 원심분리시키고 실온에서 여과(0.45 ㎛ 포어 크기)하였다. 여액의 pH는 1M HEPES 완충액을 사용하여 7.0으로 설정하였지만, 최종 농도 20 mM을 초과하지 않았다. 헤파린 칼럼(17 ml 헤파린 세파로오스; 수용능 약 2 mg/ml 겔 매트릭스) 상에서 1ml/분으로 로딩하였다. 칼럼을 20 mM HEPS, 80 mM NaCl, pH 7.5의 5CV으로 평형화시키고 또 20 mM HEPES, 80 mM NaCl, pH 7.5의 2CV으로 세척하였다. 20 mM HEPES, pH 7.5 중의 80-1000 mM NaCl의 8CV에 대하여 선형 구배로 결합된 단백질을 용출시켰다. 100-kDa 단편은 약 400-600 mM NaCl 에서 용출되었다. 표적 단백질을 함유하는 단편을 모으고, SDS-PAGE 및 웨스턴 블럿으로 모니터링하였다. 모아진 분획을 4℃에서 20 mM HEPEs, pH 7.51:100 에 대하여 철야로 투석시켜 NaCl 농도를 5 mM 미만으로 감소시켰다. 투석물을 12000 rpm 으로 4℃에서 30분간 원심분리하고 또 20 mM 트리스, pH 8.0으로 평형화된 MonoQ 칼럼 (7.8 ml HQ POROS 칼럼, 용량; 10-20 mg/ml 매트릭스) 상에 로딩하였다. 20 mM 트리스, pH 8.0 중의 0-1000 mM NaCl의 20 CV의 선형 구배로, 결합된 단백질을 용출시켰다. 100 kDa 단편은 100-200 mM NaCl에서 용출되었다. SDS-PAGE 및 웨스턴 블럿에 의해 결정되는 바와 같이 표적 단백질을 함유하는 분획을 모았다.
면역화. 정제된 단백질을 액체 질소가 충전된 튜브에 적하하여 즉시 냉동시키고 -80℃에 저장하였다. 단백질의 50□g 부분을 사용하여 표준 과정으로 토끼를 면역화시켰다. 생성한 항체는 전장 아그린 뿐만 아니라 아그린의 C-말단을 함유하는 단편, 특히 절단 부위 □ 및 □ 사이에 위치한 아그린의 부분을 함유하는 아그린 단편 검출에 적합하다.
실시예 23: 랫트 아그린의 LG3 도메인에 대한 폴리클로날 항체의 생성
HEK 293T 세포를 10% FCS가 보충된 100 ml DMEM (GIBCO) 중의 5 x 500 cm2 배지 플레이트(CORNING)에서 80% 콘플루언시로 생장시켰다. 형질감염을 위하여, 25 ml의 500 mM CaCl2 및 25 ml의 HBS 완충액(50 mM HEPES, 140 mM NaCl, 1.5 mM Na2PO4, pH 7.1)에 1.5 mg pEAK8-아그린-C45 DNA 및 15 □g pcDNA-hNT를 보충시켰다. 형질감염 혼합물을 실온에서 45분간 배양하였다. 500 cm2 HEK 세포의 형질감염을 위하여, 10 ml의 형질감염 혼합물을 상기 배양물에 적가하고 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 형질감염 혼합물을 PBS로 3회 세척하여 제거하고 FCS를 갖지 않는 DMEM 배지를 부가하였다. 60시간 후 처리된 배지를 수집하고 Steritop 0.22□ m 필터 (MILLIPORE)를 사용하여 여과하였다. 세포를 pcDNA-hNT에 의해 공동형질감염하기 위하여, 아그린-C45 단편을 절단하고 랫트 아그린의 LG3 도메인을 방출하였다. 주요 오염물을 제거하기 위하여, 처리된 배지를 1:10으로 희석시키고 또 50 mM 트리스-HCl, 50 mM NaCl, pH 8.0에 대하여 5회 투석하고 또 음이온 교환 크로마토그래피시켰다. 투석된 배지를 BioCAD 크로마토그래피 시스템(Perspeptive Biosystems)에 접속된 4 ml MonoQ 칼럼(BioRAD가 제조한 Uno Sphere MonQ 물질에 의해 자가 충전됨, 2 x 4 cm) 상에서 10ml/분으로 로딩하였다. 칼럼을 50 mM 트리스-HCl, 50 mM NaCl, pH 8.0의 20CV로 세척하였다. 50 mM 트리스-HCl, pH 8.0 중의 50 mM NaCl 내지 2000 mM NaCl로부터의 구배를 용출에 사용하였다. (제1 단계는 Ni2+ 킬레이트 세파로오스 칼럼을 사용하여 금속 친화성 크로마토그래피에 의해 임의로 교환될 수 있다). 소망하는 단백질은 분획을 통해 발견되며 미리 50 mM 트리스-HCl, 150 mM NaCl, pH 8.0으로 평형화된 10 ml Strep Tactin 칼럼을 사용하여 친화성 크로마토그래피처리하였다. 비중 유동에서 단백질을 결합시킨 후, 칼럼을 평형화된 완충액 10CV으로 세척하였다. 용출은 2.5 mM 데스티오비오틴이 보충된 0.5C의 평형화된 완충액으로 6회 실시하였다. 용출물은 SDS-PAGE 을 사용하여 분석하였고 또 아그린-C45 단편 및 LG3 도메인을 함유하는 단편을 Centriprep 10.000 농축기 (MILLIPORE)을 이용하여 부피 200 □l로 농축시켰다. 생성한 농축물을 Superdex S75 겔여과 칼럼 (애머샴 파마시아 제조, 1.6 x 30) 상에 로딩하였다. 50 mM 트리스-HCl, 250 mM NaCl, pH 8.0을 사용하여 유동 속도 0.3 ml/분으로 크로마토그래피를 실시하였다. 용출은 SDS-PAGE로 실시하였고, 순수한 LG3 도메인을 함유하는 분획을 모아서 액체 질소에 냉동시켰다.
면역화. 폴리클로날 항체를 생성하기 위하여 아그린의 50 □g 단편의 LG3 도메인을 토끼 면역화에 사용하였다. 생성한 항체는 전장 아그린의 검출뿐만 아니라 아그린의 LG3 도메인을 함유하는 아그린 단편의 검출에도 유용하다.
실시예 24: 뉴로트립신의 단백질분해 활성에 대한 분석
뉴로트립신 활성 측정은 저단백질 결합 튜브(에펜도르프) 중, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 0.1% PEG 및 20 mM MOPS, pH 7.5 에서 실시하였다. 뉴로트립신 활성 측정은 30% 이하의 DMSO를 포함하는 동일 완충액을 사용하여 실시할 수 있다. 인간 뉴로트립신은 3시간 내에 약 80% 기질을 분해할 수 있는 농도로 사용된다. 기질로서는 0.1 내지 1 □M 아그린-EGFP 또는 0.1-3□M 아그린-C45를 사용한다. 반응 혼합물을 37℃에서 3시간 동안 배양하였다. 이 반응을 통상의 SDS-PAGE 샘플 완충액을 부가하여 중지시키고 또 70℃에서 5분간 가열하였다. 생성한 절단 생성물을 SDS-PAGE로 조사하였다.
도 14는 SDS-PAGE 및 웨스턴 블럿팅 이후 아그린-EGFP의 C-말단 절단 생성물을 검출하기 위한 아그린의 C-말단 잔기에 대한 항체 및 기질로서 유전자 조작처리된 아그린-EGP를 사용한 분석을 도시한다. 도 15는 기질로서 아그린-C45를 사용한 분석을 나타낸다. 이 경우, Streptactin (IBA GmbH)를 사용하여 C-말단 절단 생성물 검출에 사용하였다. 아그린의 LG3 도메인에 대한 항체(실시예 23에 기재된 바와 같이 생성)는 상기 목적을 위해 사용될 수 있다.
다르게는, 은 염색(도 15A), 쿠마시 블리이언트 블루와 같은 통상의 단백질 염색 방법으로 SDS-PAGE 겔을 염색하거나, Sypro ruby (BioRad)으로 정량하였다.
실시예 25: 아그린 내의 뉴로트립신에 대한 절단 부위의 측정: 절단부위 □ 및 □
절단부위 □의 정확한 절단 위치를 결정하기 위하여, 막 결합된 아그린 변이체를 인간 뉴로트립신과 함께 HEK293T 세포에서 공동발현시켰다. 배양 상청액에 나타난 생성된 100-kDa 절단 생성물을 정제하고(실시예 22 참조) 또 Procise 492 cLC 시퀀서(Applied Biosystems) 상에서 에드먼 분해에 의해 N-말단 서열결정화하였다. 결정된 서열은 ASXYNSPLGXXSGDK이며, 이때 X는 시스테인 잔기를 의미한다. 이로부터, 위치 995에 있는 아르기닌 이후의 서열 스트레치 VVTHGPPIERASCYNSPLGCCSDK에서 절단이 생긴다고 결론지을 수 있다.
몇 개의 포유동물의 아그린 서열과 닭(갈루스 갈루스)의 아그린 서열의 서열 정렬은 아그린의 절단부위 □ 측면에 이는 아미노산의 진화적 보존 정도를 나타낸다.
Figure 112007077339617-PCT00024
아그린의 절단부위 □ (아그린의 절단부위 □ 는 아르기닌 995 내지 알라민 996 사이에 위치한다)의 N-말단 측 상의 5개 아미노산 및 C-말단측에 있는 4개 아미노산은 절단부위 □ 아그린에 대한 콘센서스 서열 P-P/A-I/V-E-R-A-S/T-C-Y 를 정의한다.
절단부위 □ 의 정확한 절단 위치를 결정하기 위하여, 아그린-C45를 HEK293T 세포에서 인간 뉴로트립신과 함께 공동발현시켰다. 생성한 21-kDa 절단 생성물을 정제하고(실시예 23 참조) 또 N-말단 서열결정화하였다. 생성한 서열은 SVGDLETLAF 이었다. 이 서열은 스트레치
Figure 112007077339617-PCT00025
에서 발견되었다. 이로부터 EGF4 및 LG3 도메인 사이의 위치 1754에 있는 리신 이후에 뉴로트립신에 의해 아그린이 절단되었다고 결론지을 수 있다.
몇 개의 포유동물 아그린 서열과 닭(갈루스 갈루스)의 아그린 서열을 서열 정렬하면 아그린의 절단부위 □ 측면에 있는 아미노산의 고도의 진화적 보존을 나타낸다.
Figure 112007077339617-PCT00026
아그린의 절단부위 □ (아그린의 절단부위 □ 는 리신 1754와 세린 1755 사이에 위치한다)의 N-말단 측 상의 5개 아미노산 및 C-말단측에 있는 4개 아미노산은 절단부위 □ 아그린에 대한 콘센서스 서열
Figure 112007077339617-PCT00027
를 정의한다.
상기 결과는 생성한 절단 생성물을 PVDF 막으로 전달한 다음 N-말단을 서열결정화하는 것에 의해 정제된 인간 뉴로트립신 및 정제된 아그린 기질 변이체를 사용한 시험관내 활성 분석을 이용하여 확인할 수 있었다.
요컨대, 아그린은 2개 위치에서 뉴로트립신에 의해 절단된다. 제1 절단 부위(절단부위 □)는 위치 R995-A996 (수탁번호 NP_786930, 래트 아그린)에서 발견되며, 즉 절단은 세린-트레오닌 리치 절편 및 SEA 도메인 사이의 래트(라투스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus))의 아그린의 서열 스트레치 PPIERASCY 중의 아르기닌의 C-말단에서 생긴다. 아그린의 절단부위 □ 측면의 포유류 및 조류 서열의 대조는 아그린의 절단부위 □에 대하여 콘센서스 서열
Figure 112007077339617-PCT00028
를 정의하며, 뉴로트립신에 의한 절단은 아르기닌(R) 잔기의 C-말단에서 생긴다. 제2 절단(절단부위 □)는 위치 K1754-S1755 (수탁번호 NP_786930, 랫트 아그린)에 위치, 즉 절단은 아그린의 EGF4 및 LG3 도메인을 접속하는 절편 중의 서열 콘텍스트 LVEKSVGD 중의 리신의 C-말단에서 생긴다. 아그린의 절단부위 □의 측면과 접하는 포유류 및 조류 서열의 대조는 아그린의 절단부위 □에 대한 콘센서스 서열
Figure 112007077339617-PCT00029
을 정의하는 반면에, 뉴로트립신에 의한 절단은 리신(K) 잔기의 C-말단에서 생긴다.
실시예 26: 억제 분석용 소형 분자 화합물의 제조
화합물을 DMSO에 용해시켜 최종 농도 10 mM로 만들었다. 분석을 위하여 DMSO 중의 용액을 10 mM MOPS, pH 7.5를 사용하여 농도 500□M 및 5% DMSO(1:20 희석)로 희석하였다. 불용성 및 석출된 물질은 원심분리(15분, 16 krcf, RT)에 의해 제거하였다. 투명한 상청액은 실시예 27에 기재된 바와 같이 억제 분석에 사용하였다.
실시예 27: 소형 분자 화합물의 뉴로트립신에 대한 억제 활성을 측정하는 분석
뉴로트립신의 촉매 활성에 대한 소형 분자 화합물의 억제 활성은 0.5 ml 저 단백질-결합 에펜도르프 튜브에서 전체 부피 15□l의 150 mM NaCl, 5mM CaCl2, 5% DMSO, 0.1% PEG6000 및 20 mM MOPS, pH7.5에서 측정하였다. 인간 또는 쥐의 뉴로트립신 또는 뉴로트립신의 촉매적 활성 절단 형태를, 3시간 내에 기질의 80% 절단하는 농도에서 사용하였다. 기질로서, 유전자조작처리된 용해성 아그린, 예컨대 0.1-1□M 아그린-EGFP ( 실시예 20) 또는 0.1-3 □M 유전자조작처리된 아그린-C45(실시예 21)을 사용하였다. 5% DMSO를 함유하는 10 mM MOPS, pH 7.5 중의 억제제 용액을 25 또는 150 □M의 최종 농도로 부가하였다. 반응 혼합물을 37℃에서 3시간 동안 배양하였다. 반응 혼합물 중의 5% DMSO는 소형 무기 화합물 억제제의 용해도를 유지할 필요가 있다. 이 반응은 기질 또는 효소를 부가함으로써 개시된다. 배양 기간의 말기에, 상기 반응은 통상적인 SDS-PAGE 샘플 완충액을 부가하고 70℃에서 5분간 가열함으로써 중지되었다. 분해된 샘플은 SDS-PAGE로 분리하고 기질의 가시화후 조사하였다.
기질 가시화의 1가지 방법은 웨스턴 블러팅이다. 분석을 위하여, 단백질을 니트로셀룰로오스 막으로 전달하였다. 아그린-EGFP 의 절단에 의해 생성된 150-kDa 분해 단편 또는 아그린-C45의 절단에 의해 생성된 22-kDa 분해 단편의 세기로부터 스크리닝된 소형 분자 화합물의 뉴로트립신에 대한 억제 활성을 추정하였다. 도 16은 기질로 아그린-EGFP 및 검출을 위한 아그린의 C-말단 잔기에 대한 항체를 사용하는 웨스턴 블럿 분석에 의한 억제제 스크리닝의 전형적인 결과를 도시한다. 추정되는 억제 화합물 존재하에서 뉴로트립신-매개된 절단에 의해 생성된 아그린-EGFP 150-kDa 단편의 세기를 측정하고 상대적 세기를 도면에 나타내었다(도 16B).
화합물 번호 7 (ChemDiv(미국 캘리포니아 샌디에고)로부터의 확인번호 1672-3440, N1-아미디노-N4-(3,5-디브로모살리실리덴)-술파닐아미드, IUPAC 명칭: 아미노{[(4-{[(1E)-(3,5-디브로모-2-히드록시페닐)메틸렌]아미노}페닐)술포닐]아미노}메탄이미늄)은 뉴로트립신에 대한 중요한 억제 활성을 갖는 것이 밝혀졌다.
다르게는, 분해된 샘플의 가시화 및 정량은 은 염색, 쿠마씨 브릴리언트 블루 염색과 같은 통상적인 단백질 염색법, 또는 Sypro ruby (BioRad)에 의한 염색과 같은 정량법에 의해 겔에서 직접적으로 달성할 수 있다.
실시예 28: 억제 화합물번호 7, N1-아미디노-N4-(3,5-디브로모살리실리덴)-술파닐아미드의 투여량 의존성
0 내지 200□M의 상이한 농도의 화합물 번호 7을 유전자조작처리된 아그린-EGFP를 기질로 하여 실시예 27에 기재된 바와 같은 분석에 의해 시험하였다. 생성한 생성물은 웨스턴 블럿(도 17A)에 의해 검출하고 정량하였다(도 17B). 화합물번호 7없이 실시한 반응과 비교한 생성물의 최대량의 1/2을 약 60□M 농도에서 발견하였고, 따라서 화합물번호 7의 IC50 은 약 60 □M 범위이다.
실시예 29: 화합물 번호 7, N1-아미디노-N4-(3,5-디브로모살리실리덴)-술파닐아미드에 대한 뉴로트립신 억제의 특이성 측정
인간 뉴로트립신에 대하여 억제 효과를 갖는 것으로 밝혀진 화합물의 특이성을 확인하기 위하여, 보통의 세린 프로테아제 세트를 사용하여 표준 효소 키네틱 측정을 실시하였다. 시판되는 프로테아제 및 파라-니트로아닐리드-결합된 소형 펩티드 기질을 사용한 표준 광도측정 분석법을 이용하였다.
프로테아제:
소 혈장으로부터 활성화된 인자 Xa (6.1 mg 단백질/ml; 시그마 알드리히 케미 게엠베하 제조, 독일 데-89552 슈타인하임 소재).
돼지 췌장으로부터 얻은 트립신 (16099 U/mg; 플루카 케미 아게, 스위스 체하-9471 부크스 소재).
tPA: 액틸라이스 (10 mg; Dr Karl Thomae GmbH, 독일 데-88397 비버라흐 비르켄도르퍼 슈트라세 65).
소의 혈장으로부터 얻은 트롬빈 (50 NIH/mg, Merck, 독일 데-64271 다름슈타트 소재).
우로키나아제 HS medac (100000 I.E.: medac Gesellschaft fur klnische Spezialpraparate mbH, 독일 데-22880 베델 소재).
돼지 췌장으로부터 얻은 칼리크레인 (43 U/mg 고체; 시그마 알드리히 케미 게엠베하 제조).
인간 형장으로부터 얻은 플라스민(3.2 U/mg 고체; 시그마 알드리히 케미 게엠베하).
기질:
Bz-IEGR-pNA: S-2222, 크로모게닉스-인트루먼테이션 라보라토리 SpA, I-20128 밀리노, 이탈리아.
Bz-FVR-pNA: N-벤조일-Phe-Val-Arg-p-니트로알닐리드 HCl, 바켐 아게, 스위스 체하-4416 부벤도르프 소재.
IPR-pNA: S-2288, 크로모게닉스-인트루먼테이션 라보라토리 SpZ.
Bz-VGR-pNA: N-벤조일-Val-Gly-Arg-p-니트로아닐리드, 시그마 알드리히 케미 게엠베하.
N-토실-GPK-pNA: N-토실-Gly-Pro-Lys-p-니트로아닐리드, #90178, 플루카 케미 아게.
분석 조건:
초기 속도를 측정하기 위하여 적합한 양의 프로테아제 및 0.1배 KM 보다 작은 범위의 펩티드-p-니트로아닐리드 기질의 양을 다양하게 변화시켜 100 mM 트리스-HCl, 150 mM NaCl, 1mM CaCl2, 5% DMSO, 0.1% PEG 6000, pH 8.0에서 분석을 실시하였다. 억제 연구를 위하여 100□M 화합물번호 7을 사용하였다. 측정은 Cary 50 분광광도계(VARIAN)에서 25℃에서 실시하였다. 초기 속도는 0.1배 KM 미만의 다양한 기질 농도를 이용하여 기질 농도로부터 초기 속도의 직접적 의존성 범위로 결정되었다. 초기 속도는 후보 억제제 번호 7의 부재하 또는 존재하에서 기질 농도에 대하여 도시하였다. 화합물은 1000□M 농도로 사용되었다.
Figure 112007077339617-PCT00030
조사된 효소의 어떤 것도 100□M 농도에서 화합물 7에 의한 현저한 억제를 나타내지 않았다. 도 18 내지 24는 인자 Xa, 트립신, tPA, 트롬빈, 우로키나아제, 칼리크레인 및 플라스민 대신 화합물번호 7 존재하 및 부재하에서 효소 키네틱 측정 결과를 도시한다.
<110> University of Zurich Sonderegger, Peter <120> Neurotrypsin inhibitor <130> P330 <160> 12 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer for soluble agrin variant introducing HpaI site <400> 1 aaagttaaca aacctggaat ccacttcaca ccagc 35 <210> 2 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer for soluble agrin variant introducing NotI site <400> 2 aaaagcggcc gctcattttt cgaactgcgg gtggctccag ggagtggggc agggtcttag 60 <210> 3 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Forward primer for soluble agrin variant introducing 8xHis <400> 3 aaaagttaac catcaccatc atcaccatca ccataaacct ggaatccact tcacaccag 59 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Reverse primer for soluble agrin variant <400> 4 tttatcatga cacagtcgtt ttcatag 27 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Forward primer for soluble agrin variant replacing LG3 <400> 5 gctggatatc aacaatcagc ag 22 <210> 6 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Reverse primer for soluble agrin variant replacing LG3 <400> 6 ggtgaacagc tcctcgccct tgctcaccat ggagccaact agcccctgtt cgcagtgc 58 <210> 7 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Forward primer for soluble agrin variant introducing EGFP <400> 7 ggtgaacagc tcctcgccct tgctcaccat ggagccaact agcccctgtt cgcagtgc 58 <210> 8 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Reverse primer for soluble agrin variant introducing EGFP <400> 8 ggctgcggcc gctcattttt cgaactgcgg gtggctccag ttatctagat ccggtggatc 60 <210> 9 <211> 1981 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Fusion protein of soluble agrin variant and EGFP <400> 9 Ala Arg Val Asn His His His His His His His His Lys Pro Gly Ile 1 5 10 15 His Phe Thr Pro Ala Pro Pro Thr Pro Pro Asp Val Cys Arg Gly Met 20 25 30 Leu Cys Gly Phe Gly Ala Val Cys Glu Pro Ser Val Glu Asp Pro Gly 35 40 45 Arg Ala Ser Cys Val Cys Lys Lys Asn Ala Cys Pro Ala Thr Val Ala 50 55 60 Pro Val Cys Gly Ser Asp Ala Ser Thr Tyr Ser Asn Glu Cys Glu Leu 65 70 75 80 Gln Arg Ala Gln Cys Asn Gln Gln Arg Arg Ile Arg Leu Leu Arg Gln 85 90 95 Gly Pro Cys Gly Ser Arg Asp Pro Cys Ala Asn Val Thr Cys Ser Phe 100 105 110 Gly Ser Thr Cys Val Pro Ser Ala Asp Gly Gln Thr Ala Ser Cys Leu 115 120 125 Cys Pro Thr Thr Cys Phe Gly Ala Pro Asp Gly Thr Val Cys Gly Ser 130 135 140 Asp Gly Val Asp Tyr Pro Ser Glu Cys Gln Leu Leu Ser His Ala Cys 145 150 155 160 Ala Ser Gln Glu His Ile Phe Lys Lys Phe Asn Gly Pro Cys Asp Pro 165 170 175 Cys Gln Gly Ser Met Ser Asp Leu Asn His Ile Cys Arg Val Asn Pro 180 185 190 Arg Thr Arg His Pro Glu Met Leu Leu Arg Pro Glu Asn Cys Pro Ala 195 200 205 Gln His Thr Pro Ile Cys Gly Asp Asp Gly Val Thr Tyr Glu Asn Asp 210 215 220 Cys Val Met Ser Arg Ile Gly Ala Thr Arg Gly Leu Leu Leu Gln Lys 225 230 235 240 Val Arg Ser Gly Gln Cys Gln Thr Arg Asp Gln Cys Pro Glu Thr Cys 245 250 255 Gln Phe Asn Ser Val Cys Leu Ser Arg Arg Gly Arg Pro His Cys Ser 260 265 270 Cys Asp Arg Val Thr Cys Asp Gly Ser Tyr Arg Pro Val Cys Ala Gln 275 280 285 Asp Gly His Thr Tyr Asn Asn Asp Cys Trp Arg Gln Gln Ala Glu Cys 290 295 300 Arg Gln Gln Arg Ala Ile Pro Pro Lys His Gln Gly Pro Cys Asp Gln 305 310 315 320 Thr Pro Ser Pro Cys His Gly Val Gln Cys Ala Phe Gly Ala Val Cys 325 330 335 Thr Val Lys Asn Gly Lys Ala Glu Cys Glu Cys Gln Arg Val Cys Ser 340 345 350 Gly Ile Tyr Asp Pro Val Cys Gly Ser Asp Gly Val Thr Tyr Gly Ser 355 360 365 Val Cys Glu Leu Glu Ser Met Ala Cys Thr Leu Gly Arg Glu Ile Gln 370 375 380 Val Ala Arg Arg Gly Pro Cys Asp Pro Cys Gly Gln Cys Arg Phe Gly 385 390 395 400 Ser Leu Cys Glu Val Glu Thr Gly Arg Cys Val Cys Pro Ser Glu Cys 405 410 415 Val Glu Ser Ala Gln Pro Val Cys Gly Ser Asp Gly His Thr Tyr Ala 420 425 430 Ser Glu Cys Glu Leu His Val His Ala Cys Thr His Gln Ile Ser Leu 435 440 445 Tyr Val Ala Ser Ala Gly His Cys Gln Thr Cys Gly Glu Lys Val Cys 450 455 460 Thr Phe Gly Ala Val Cys Ser Ala Gly Gln Cys Val Cys Pro Arg Cys 465 470 475 480 Glu His Pro Pro Pro Gly Pro Val Cys Gly Ser Asp Gly Val Thr Tyr 485 490 495 Leu Ser Ala Cys Glu Leu Arg Glu Ala Ala Cys Gln Gln Gln Val Gln 500 505 510 Ile Glu Glu Ala His Ala Gly Pro Cys Glu Pro Ala Glu Cys Gly Ser 515 520 525 Gly Gly Ser Gly Ser Gly Glu Asp Asp Glu Cys Glu Gln Glu Leu Cys 530 535 540 Arg Gln Arg Gly Gly Ile Trp Asp Glu Asp Ser Glu Asp Gly Pro Cys 545 550 555 560 Val Cys Asp Phe Ser Cys Gln Ser Val Pro Arg Ser Pro Val Cys Gly 565 570 575 Ser Asp Gly Val Thr Tyr Gly Thr Glu Cys Asp Leu Lys Lys Ala Arg 580 585 590 Cys Glu Ser Gln Gln Glu Leu Tyr Val Ala Ala Gln Gly Ala Cys Arg 595 600 605 Gly Pro Thr Leu Ala Pro Leu Leu Pro Val Ala Phe Pro His Cys Ala 610 615 620 Gln Thr Pro Tyr Gly Cys Cys Gln Asp Asn Phe Thr Ala Ala Gln Gly 625 630 635 640 Val Gly Leu Ala Gly Cys Pro Ser Thr Cys His Cys Asn Pro His Gly 645 650 655 Ser Tyr Ser Gly Thr Cys Asp Pro Ala Thr Gly Gln Cys Ser Cys Arg 660 665 670 Pro Gly Val Gly Gly Leu Arg Cys Asp Arg Cys Glu Pro Gly Phe Trp 675 680 685 Asn Phe Arg Gly Ile Val Thr Asp Gly His Ser Gly Cys Thr Pro Cys 690 695 700 Ser Cys Asp Pro Arg Gly Ala Val Arg Asp Asp Cys Glu Gln Met Thr 705 710 715 720 Gly Leu Cys Ser Cys Arg Pro Gly Val Ala Gly Pro Lys Cys Gly Gln 725 730 735 Cys Pro Asp Gly Gln Val Leu Gly His Leu Gly Cys Glu Ala Asp Pro 740 745 750 Met Thr Pro Val Thr Cys Val Glu Ile His Cys Glu Phe Gly Ala Ser 755 760 765 Cys Val Glu Lys Ala Gly Phe Ala Gln Cys Ile Cys Pro Thr Leu Thr 770 775 780 Cys Pro Glu Ala Asn Ser Thr Lys Val Cys Gly Ser Asp Gly Val Thr 785 790 795 800 Tyr Gly Asn Glu Cys Gln Leu Lys Ala Ile Ala Cys Arg Gln Arg Leu 805 810 815 Asp Ile Ser Thr Gln Ser Leu Gly Pro Cys Gln Glu Ser Val Thr Pro 820 825 830 Gly Ala Ser Pro Thr Ser Ala Ser Met Thr Thr Pro Arg His Ile Leu 835 840 845 Ser Lys Thr Leu Pro Phe Pro His Asn Ser Leu Pro Leu Ser Pro Gly 850 855 860 Ser Thr Thr His Asp Trp Pro Thr Pro Leu Pro Ile Ser Pro His Thr 865 870 875 880 Thr Val Ser Ile Pro Arg Ser Thr Ala Trp Pro Val Leu Thr Val Pro 885 890 895 Pro Thr Ala Ala Ala Ser Asp Val Thr Ser Leu Ala Thr Ser Ile Phe 900 905 910 Ser Glu Ser Gly Ser Ala Asn Gly Ser Gly Asp Glu Glu Leu Ser Gly 915 920 925 Asp Glu Glu Ala Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Leu Glu Pro Pro Val 930 935 940 Gly Ser Ile Val Val Thr His Gly Pro Pro Ile Glu Arg Ala Ser Cys 945 950 955 960 Tyr Asn Ser Pro Leu Gly Cys Cys Ser Asp Gly Lys Thr Pro Ser Leu 965 970 975 Asp Ser Glu Gly Ser Asn Cys Pro Ala Thr Lys Ala Phe Gln Gly Val 980 985 990 Leu Glu Leu Glu Gly Val Glu Gly Gln Glu Leu Phe Tyr Thr Pro Glu 995 1000 1005 Met Ala Asp Pro Lys Ser Glu Leu Phe Gly Glu Thr Ala Arg Ser 1010 1015 1020 Ile Glu Ser Thr Leu Asp Asp Leu Phe Arg Asn Ser Asp Val Lys 1025 1030 1035 Lys Asp Phe Trp Ser Val Arg Leu Arg Glu Leu Gly Pro Gly Lys 1040 1045 1050 Leu Val Arg Ala Ile Val Asp Val His Phe Asp Pro Thr Thr Ala 1055 1060 1065 Phe Gln Ala Ser Asp Val Gly Gln Ala Leu Leu Arg Gln Ile Gln 1070 1075 1080 Val Ser Arg Pro Trp Ala Leu Ala Val Arg Arg Pro Leu Gln Glu 1085 1090 1095 His Val Arg Phe Leu Asp Phe Asp Trp Phe Pro Thr Phe Phe Thr 1100 1105 1110 Gly Ala Ala Thr Gly Thr Thr Ala Ala Met Ala Thr Ala Arg Ala 1115 1120 1125 Thr Thr Val Ser Arg Leu Pro Ala Ser Ser Val Thr Pro Arg Val 1130 1135 1140 Tyr Pro Ser His Thr Ser Arg Pro Val Gly Arg Thr Thr Ala Pro 1145 1150 1155 Pro Thr Thr Arg Arg Pro Pro Thr Thr Ala Thr Asn Met Asp Arg 1160 1165 1170 Pro Arg Thr Pro Gly His Gln Gln Pro Ser Lys Ser Cys Asp Ser 1175 1180 1185 Gln Pro Cys Leu His Gly Gly Thr Cys Gln Asp Gln Asp Ser Gly 1190 1195 1200 Lys Gly Phe Thr Cys Ser Cys Thr Ala Gly Arg Gly Gly Ser Val 1205 1210 1215 Cys Glu Lys Val Gln Pro Pro Ser Met Pro Ala Phe Lys Gly His 1220 1225 1230 Ser Phe Leu Ala Phe Pro Thr Leu Arg Ala Tyr His Thr Leu Arg 1235 1240 1245 Leu Ala Leu Glu Phe Arg Ala Leu Glu Thr Glu Gly Leu Leu Leu 1250 1255 1260 Tyr Asn Gly Asn Ala Arg Gly Lys Asp Phe Leu Ala Leu Ala Leu 1265 1270 1275 Leu Asp Gly Arg Val Gln Phe Arg Phe Asp Thr Gly Ser Gly Pro 1280 1285 1290 Ala Val Leu Thr Ser Leu Val Pro Val Glu Pro Gly Arg Trp His 1295 1300 1305 Arg Leu Glu Leu Ser Arg His Trp Arg Gln Gly Thr Leu Ser Val 1310 1315 1320 Asp Gly Glu Thr Pro Val Val Gly Glu Ser Pro Ser Gly Thr Asp 1325 1330 1335 Gly Leu Asn Leu Asp Thr Asn Leu Tyr Val Gly Gly Ile Pro Glu 1340 1345 1350 Glu Gln Val Ala Met Val Leu Asp Arg Thr Ser Val Gly Val Gly 1355 1360 1365 Leu Lys Gly Cys Ile Arg Met Leu Asp Ile Asn Asn Gln Gln Leu 1370 1375 1380 Glu Leu Ser Asp Trp Gln Arg Ala Ala Val Gln Ser Ser Gly Val 1385 1390 1395 Gly Glu Cys Gly Asp His Pro Cys Leu Pro Asn Pro Cys His Gly 1400 1405 1410 Gly Ala Leu Cys Gln Ala Leu Glu Ala Gly Met Phe Leu Cys Gln 1415 1420 1425 Cys Pro Pro Gly Arg Phe Gly Pro Thr Cys Ala Asp Glu Lys Ser 1430 1435 1440 Pro Cys Gln Pro Asn Pro Cys His Gly Ala Ala Pro Cys Arg Val 1445 1450 1455 Leu Ser Ser Gly Gly Ala Lys Cys Glu Cys Pro Leu Gly Arg Ser 1460 1465 1470 Gly Thr Phe Cys Gln Thr Val Leu Glu Thr Ala Gly Ser Arg Pro 1475 1480 1485 Phe Leu Ala Asp Phe Asn Gly Phe Ser Tyr Leu Glu Leu Lys Gly 1490 1495 1500 Leu His Thr Phe Glu Arg Asp Leu Gly Glu Lys Met Ala Leu Glu 1505 1510 1515 Met Val Phe Leu Ala Arg Gly Pro Ser Gly Leu Leu Leu Tyr Asn 1520 1525 1530 Gly Gln Lys Thr Asp Gly Lys Gly Asp Phe Val Ser Leu Ala Leu 1535 1540 1545 His Asn Arg His Leu Glu Phe Cys Tyr Asp Leu Gly Lys Gly Ala 1550 1555 1560 Ala Val Ile Arg Ser Lys Glu Pro Ile Ala Leu Gly Thr Trp Val 1565 1570 1575 Arg Val Phe Leu Glu Arg Asn Gly Arg Lys Gly Ala Leu Gln Val 1580 1585 1590 Gly Asp Gly Pro Arg Val Leu Gly Glu Ser Pro Lys Ser Arg Lys 1595 1600 1605 Val Pro His Thr Met Leu Asn Leu Lys Glu Pro Leu Tyr Ile Gly 1610 1615 1620 Gly Ala Pro Asp Phe Ser Lys Leu Ala Arg Gly Ala Ala Val Ser 1625 1630 1635 Ser Gly Phe Ser Gly Val Ile Gln Leu Val Ser Leu Arg Gly His 1640 1645 1650 Gln Leu Leu Thr Gln Glu His Val Leu Arg Ala Val Asp Val Ser 1655 1660 1665 Pro Phe Ala Asp His Pro Cys Thr Gln Ala Leu Gly Asn Pro Cys 1670 1675 1680 Leu Asn Gly Gly Ser Cys Val Pro Arg Glu Ala Thr Tyr Glu Cys 1685 1690 1695 Leu Cys Pro Gly Gly Phe Ser Gly Leu His Cys Glu Gln Gly Leu 1700 1705 1710 Val Gly Ser Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val 1715 1720 1725 Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys 1730 1735 1740 Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys 1745 1750 1755 Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro 1760 1765 1770 Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe 1775 1780 1785 Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser 1790 1795 1800 Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys 1805 1810 1815 Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly 1820 1825 1830 Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys 1835 1840 1845 Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn 1850 1855 1860 Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile 1865 1870 1875 Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val 1880 1885 1890 Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly 1895 1900 1905 Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala 1910 1915 1920 Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu 1925 1930 1935 Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu 1940 1945 1950 Tyr Lys Ser Gly Leu Arg Ser Arg Ala Gln Ala Ser Asn Ser Ala 1955 1960 1965 Val Asp Gly Thr Ala Gly Pro Gly Ser Thr Gly Ser Arg 1970 1975 1980 <210> 10 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer introducing HpaI site <400> 10 gcgagttaac caccatcacc atcaccatca ccatggaagc ctggctgact ttaatggctt 60 ctcctacc 68 <210> 11 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer introducing NotI site <400> 11 acctgcggcc gctcattttt cgaactgcgg gtggctccag ccagagccag agccgggagt 60 ggggcagggt cttagctc 78 <210> 12 <211> 436 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Agrin C-45 fragment containing 8 x His <400> 12 Ala Arg Val Asn His His His His His His His His Gly Ser Leu Ala 1 5 10 15 Asp Phe Asn Gly Phe Ser Tyr Leu Glu Leu Lys Gly Leu His Thr Phe 20 25 30 Glu Arg Asp Leu Gly Glu Lys Met Ala Leu Glu Met Val Phe Leu Ala 35 40 45 Arg Gly Pro Ser Gly Leu Leu Leu Tyr Asn Gly Gln Lys Thr Asp Gly 50 55 60 Lys Gly Asp Phe Val Ser Leu Ala Leu His Asn Arg His Leu Glu Phe 65 70 75 80 Cys Tyr Asp Leu Gly Lys Gly Ala Ala Val Ile Arg Ser Lys Glu Pro 85 90 95 Ile Ala Leu Gly Thr Trp Val Arg Val Phe Leu Glu Arg Asn Gly Arg 100 105 110 Lys Gly Ala Leu Gln Val Gly Asp Gly Pro Arg Val Leu Gly Glu Ser 115 120 125 Pro Val Pro His Thr Met Leu Asn Leu Lys Glu Pro Leu Tyr Ile Gly 130 135 140 Gly Ala Pro Asp Phe Ser Lys Leu Ala Arg Gly Ala Ala Val Ser Ser 145 150 155 160 Gly Phe Ser Gly Val Ile Gln Leu Val Ser Leu Arg Gly His Gln Leu 165 170 175 Leu Thr Gln Glu His Val Leu Arg Ala Val Asp Val Ser Pro Phe Ala 180 185 190 Asp His Pro Cys Thr Gln Ala Leu Gly Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly 195 200 205 Ser Cys Val Pro Arg Glu Ala Thr Tyr Glu Cys Leu Cys Pro Gly Gly 210 215 220 Phe Ser Gly Leu His Cys Glu Lys Gly Leu Val Glu Lys Ser Val Gly 225 230 235 240 Asp Leu Glu Thr Leu Ala Phe Asp Gly Arg Thr Tyr Ile Glu Tyr Leu 245 250 255 Asn Ala Val Ile Glu Ser Glu Lys Ala Leu Gln Ser Asn His Phe Glu 260 265 270 Leu Ser Leu Arg Thr Glu Ala Thr Gln Gly Leu Val Leu Trp Ile Gly 275 280 285 Lys Ala Ala Glu Arg Ala Asp Tyr Met Ala Leu Ala Ile Val Asp Gly 290 295 300 His Leu Gln Leu Ser Tyr Asp Leu Gly Ser Gln Pro Val Val Leu Arg 305 310 315 320 Ser Thr Val Lys Val Asn Thr Asn Arg Trp Leu Arg Ile Arg Ala His 325 330 335 Arg Glu His Arg Glu Gly Ser Leu Gln Val Gly Asn Glu Ala Pro Val 340 345 350 Thr Gly Ser Ser Pro Leu Gly Ala Thr Gln Leu Asp Thr Asp Gly Ala 355 360 365 Leu Trp Leu Gly Gly Leu Gln Lys Leu Pro Val Gly Gln Ala Leu Pro 370 375 380 Lys Ala Tyr Gly Thr Gly Phe Val Gly Cys Leu Arg Asp Val Val Val 385 390 395 400 Gly His Arg Gln Leu His Leu Leu Glu Asp Ala Val Thr Lys Pro Glu 405 410 415 Leu Arg Pro Cys Pro Thr Pro Gly Ser Gly Ser Gly Trp Ser His Pro 420 425 430 Gln Phe Glu Lys 435

Claims (24)

  1. 한 화합물을 수성 완충 용액 중에서 뉴로트립신, 그의 변이체 또는 뉴로트립신의 프로테아제 도메인을 포함하는 단편 및 아그린을 포함하는 단백질 또는 펩티드, 그의 변이체 또는 아그린의 □- 또는 □-절단 부위를 포함하는 단편과 함께 배양하고 또 아그린의 절단 양을 측정하는 것을 특징으로 하는, 한 화합물이 뉴로트립신 억제제인지 여부를 결정하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 인간 뉴로트립신, 그의 변이체 또는 인간 뉴로트립신의 프로테아제 도메인을 포함하는 단편이 사용되는 방법.
  3. 청구항 2에 있어서, 전장 인간 뉴로트립신이 사용되는 방법.
  4. 청구항 2에 있어서, 인간 뉴로트립신의 프로테아제 도메인을 포함하는 단편이 사용되는 방법.
  5. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서, 아그린을 포함하는 단백질 또는 펩티드, 그의 변이체 또는 단편이 마커 단백질 또는 펩티드와의 융합 단백질인 방법.
  6. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서, 아그린을 포함하는 단백질 또는 펩티드, 그의 변이체 또는 단편이 분광학적 검출을 위한 비-펩티드성 마커를 함유하는 방법.
  7. 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서, 전장 아그린을 포함하는 단백질 또는 펩티드가 사용되는 방법.
  8. 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서, 절단부위 □ 또는 절단부위 □를 포함하는 아그린 단편을 포함하는 단백질 또는 펩티드가 사용되는 방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 아그린 단편이 절단부위 □ 및/또는 절단부위 □를 함유하는 6 이상의 아미노산을 포함하는 단편인 방법.
  10. 청구항 8에 있어서, 아그린 단편이 절단부위 □의 콘센서스 서열의 8개 이상의 아미노산을 포함하는 단편인 방법.
  11. 청구항 8에 있어서, 아그린 단편이 절단부위 □의 콘센서스 서열의 8개 이상의 아미노산을 포함하는 단편인 방법.
  12. 청구항 8에 있어서, C-말단 아그린 단편 C45가 사용되는 방법.
  13. 뉴로트립신, 그의 변이체 또는 뉴로트립신의 프로테아제 도메인을 포함하는 단편을 아그린(agrin)을 포함하는 단백질 또는 펩티드, 그의 변이체 또는 아그린의 □- 또는 □-절단 부위를 포함하는 단편과 함께 수성 완충액에서 함께 배양하고, 아그린의 절단 양을 측정하는 것을 특징으로 하는 뉴로트립신의 촉매 활성을 측정하는 방법.
  14. 청구항 13에 있어서, 아그린을 포함하는 단백질 또는 펩티드, 그의 변이체 또는 단편이 마커 단백질 또는 펩티드와의 융합 단백질인 방법.
  15. 청구항 13 또는 청구항 14에 있어서, 아그린을 포함하는 단백질 또는 펩티드, 그의 변이체 또는 단편이 분광학적 검출을 위한 비-펩티드성 마커인 방법.
  16. 하기 화학식(1)의 화합물 및 약학적으로 허용되는 그의 염:
    Figure 112007077339617-PCT00031
    식 중에서, Hal1 및 Hal2 는 서로 독립적으로 플루오르, 염소 또는 브롬임.
  17. 청구항 16에 있어서, Hal1 및 Hal2 가 브롬인 화학식(1)의 화합물 및 약학적으로 허용되는 그의 염.
  18. 청구항 16 또는 청구항 17에 따른 화학식(1)의 화합물 및 약학적 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  19. 의약으로 사용하기 위한 청구항 16 또는 청구항 17에 따른 화학식(I)의 화합물.
  20. 시냅스 결핍에 의해 유발된 질병의 치료 및/또는 예방을 위한 청구항 16 또는 청구항 17에 따른 화학식(1)의 화합물의 용도.
  21. 청구항 20에 있어서, 골격근 위축증을 치료 및/또는 예방하기 위한 용도.
  22. 청구항 20에 있어서, 정신분열병을 치료 및/또는 예방하기 위한 용도.
  23. 청구항 20에 있어서, 인식장애를 치료 및/또는 예방하기 위한 용도.
  24. 시냅스 결핍에 의해 유발된 질병을 치료 및/또는 예방하기 위한 약물을 제조하기 위한 청구항 16 또는 청구항 17에 따른 화학식(1)의 화합물의 용도.
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